JPH0249580A - アセチルエステラーゼ - Google Patents
アセチルエステラーゼInfo
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- JPH0249580A JPH0249580A JP1080859A JP8085989A JPH0249580A JP H0249580 A JPH0249580 A JP H0249580A JP 1080859 A JP1080859 A JP 1080859A JP 8085989 A JP8085989 A JP 8085989A JP H0249580 A JPH0249580 A JP H0249580A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセファロスポリンＣの酵素的脱アセチル化によ
りデアセチルセファ０スポリンＣを製造するために使用
できる新規なアセチルエステラーゼに関する。さらに詳
細に述べれば、本発明はセファロスポリンＣまたはその
塩よりデアセチルセファロスポリンＣまたはその塩を製
造するために使用できる新規なアセチルエステラーゼに
関する。
りデアセチルセファ０スポリンＣを製造するために使用
できる新規なアセチルエステラーゼに関する。さらに詳
細に述べれば、本発明はセファロスポリンＣまたはその
塩よりデアセチルセファロスポリンＣまたはその塩を製
造するために使用できる新規なアセチルエステラーゼに
関する。
本発明の酵素は下記の反応式で表される脱アセチル化作
用を有する。
用を有する。
上記の方法の目的化合物（■）、即ちデアセチルセファ
ロスポリンＣは医薬として有用なセファロスポリン化合
物の合成における価値ある重要な中間体として知られて
いる。
ロスポリンＣは医薬として有用なセファロスポリン化合
物の合成における価値ある重要な中間体として知られて
いる。
種々の微生物のエステラーゼによって、セファロスポリ
ンＣから脱アセチル化によりデアセチルセファ０スポリ
ンＣが生成されることはすでに知られているが、これら
の従来の方法はこの化合物の工業的製造方法として必ず
しも満足きれるものではない。
ンＣから脱アセチル化によりデアセチルセファ０スポリ
ンＣが生成されることはすでに知られているが、これら
の従来の方法はこの化合物の工業的製造方法として必ず
しも満足きれるものではない。
本発明者らはオーレオハシデイラム属に属する菌株によ
り生産詐れるエステラーゼがセファロスポリンＣを脱ア
セチル化することによりデアセチルセファ０スポリンＣ
を良好な収率、即ち、はぼ１００％の転換率で転換する
ことができるという新知見を得、きらに鋭意研究の結果
この発明を完成した。
り生産詐れるエステラーゼがセファロスポリンＣを脱ア
セチル化することによりデアセチルセファ０スポリンＣ
を良好な収率、即ち、はぼ１００％の転換率で転換する
ことができるという新知見を得、きらに鋭意研究の結果
この発明を完成した。
本発明によれば、水性媒体中でセファロスポリンＣまた
はその塩をオーレオハシデイラム属に属する菌株のエス
テラーゼとを、実質的にすべてのセファロスポリンＣが
脱アセチル化されるまで接触させ、そしてこのように生
成きれたデアセチルセファロスポリンＣを固体として水
性媒体から単離することによりデアセチルセファロスポ
リンＣを製造することができる。
はその塩をオーレオハシデイラム属に属する菌株のエス
テラーゼとを、実質的にすべてのセファロスポリンＣが
脱アセチル化されるまで接触させ、そしてこのように生
成きれたデアセチルセファロスポリンＣを固体として水
性媒体から単離することによりデアセチルセファロスポ
リンＣを製造することができる。
セファロスポリンＣおよびデアセチルセファロスポリン
Ｃの好ましい塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナト
リウム塩、カリウム塩）またはアルカリ土類金属塩（例
えば、マグネシウム塩等）等が挙げられる。
Ｃの好ましい塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナト
リウム塩、カリウム塩）またはアルカリ土類金属塩（例
えば、マグネシウム塩等）等が挙げられる。
本発明において使用されるオーしオバシデイウム属に属
する菌株には、セファロスポリンＣの３位におけるエス
テル結合を加水分解するエステラーゼを生成するオーレ
オバシデイウム属に属するすべての微生物が含まれ、天
然に広く分布しているかあるいは菌株の保存機関に保存
されている。従って、これらの菌株は土壌試料のごとき
天然物から分離することができ、また公共の寄託機関に
おけるタイプ・カルチュアから選ぶことができる。
する菌株には、セファロスポリンＣの３位におけるエス
テル結合を加水分解するエステラーゼを生成するオーレ
オバシデイウム属に属するすべての微生物が含まれ、天
然に広く分布しているかあるいは菌株の保存機関に保存
されている。従って、これらの菌株は土壌試料のごとき
天然物から分離することができ、また公共の寄託機関に
おけるタイプ・カルチュアから選ぶことができる。
上記微生物の代表的な例としては、オーレオバシディウ
ム・プルランスＩＦＯ４４６６を挙げることができ、こ
れは寄託機関の１つである財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）から入手できる。本発明の製法ではまた、Ｘ線、紫外
線照射、変異誘起剤（例えば、亜硝ｉ１． Ｎ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）による処理
等のごとき通常使用される変異手段により上記微生物か
ら該エステラーゼ性を高める目的で得た変異株を用いて
もよい。
ム・プルランスＩＦＯ４４６６を挙げることができ、こ
れは寄託機関の１つである財団法人発酵研究所（ＩＦＯ
）から入手できる。本発明の製法ではまた、Ｘ線、紫外
線照射、変異誘起剤（例えば、亜硝ｉ１． Ｎ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）による処理
等のごとき通常使用される変異手段により上記微生物か
ら該エステラーゼ性を高める目的で得た変異株を用いて
もよい。
本発明の方法によれば、セファロスポリンＣと微生物の
エステラーゼとの接触は本方法の種々な態様で行うこと
ができ、これらは下記の説明から明らかになるであろう
。
エステラーゼとの接触は本方法の種々な態様で行うこと
ができ、これらは下記の説明から明らかになるであろう
。
本発明の方法の１態様として、セファロスポリンＣと本
発明の微生物のエステラーゼとの接触はオーしオハシデ
イウム属に属する菌株の通常の培養により得た培養物ま
たはその処理物とセファロスポリンＣとを水性媒体中で
接触きせることにより行なわれる。
発明の微生物のエステラーゼとの接触はオーしオハシデ
イウム属に属する菌株の通常の培養により得た培養物ま
たはその処理物とセファロスポリンＣとを水性媒体中で
接触きせることにより行なわれる。
本発明で使用きれる微生物の培養は一般に通常の方法で
行うことができ、そして通気攪拌下で有利に実施できる
。使用する培地としては、同化し得る炭素および窒素源
、および無機塩類を含む栄養培地が使用できる。好適な
炭素源としては、例えハ、グルコース、シュークロース
、ラフトス、グリセロールおよび澱粉が含まれる。好適
な窒素源としては有機の窒素源、例えば、肉エキス、ヘ
フトン、グルテンミール、コーンミール、綿実粕、大豆
粉、コーンスチープリカー、酵母エキス、カザミ、ノ酸
およびアミノ酸、ならびに無機の窒素源、例えば、アン
モニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム等）である。
行うことができ、そして通気攪拌下で有利に実施できる
。使用する培地としては、同化し得る炭素および窒素源
、および無機塩類を含む栄養培地が使用できる。好適な
炭素源としては、例えハ、グルコース、シュークロース
、ラフトス、グリセロールおよび澱粉が含まれる。好適
な窒素源としては有機の窒素源、例えば、肉エキス、ヘ
フトン、グルテンミール、コーンミール、綿実粕、大豆
粉、コーンスチープリカー、酵母エキス、カザミ、ノ酸
およびアミノ酸、ならびに無機の窒素源、例えば、アン
モニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニ
ウム等）である。
必要に応して金属塩、例えば、炭酸カルシウム、燐酸ナ
トリウムまたはカリウム、マグネシウム塩および銅塩、
種々なビタミン類が培地に添加される。
トリウムまたはカリウム、マグネシウム塩および銅塩、
種々なビタミン類が培地に添加される。
培地の適切なｐＨ１適切な培養温度および適切な培養時
間は使用する微生物の種類により異なる。
間は使用する微生物の種類により異なる。
好ましいｐｌ（は通常ｐｌ（５ないし８の範囲内である
。
。
温度は通常的２０℃ないし約３０６Ｃから選ばれ、好ま
しくは約２５°Ｃである。培養時間は通常１５時間ない
し７２時間から選ばれ、好ましくは２４時間ないし５０
時間である。
しくは約２５°Ｃである。培養時間は通常１５時間ない
し７２時間から選ばれ、好ましくは２４時間ないし５０
時間である。
このようにして得られた培養物自体およびその処理物が
デアセチルセファロスボリンＣの製造に使用できる。培
養物の処理物とは、酵素活性を高めるために通常使用さ
れる方法で培養物から製造したものであってセファロス
ポリンＣをデアセチルセファ０スポリンＣに脱アセチル
化しうるあらゆる加工物を意味する。
デアセチルセファロスボリンＣの製造に使用できる。培
養物の処理物とは、酵素活性を高めるために通常使用さ
れる方法で培養物から製造したものであってセファロス
ポリンＣをデアセチルセファ０スポリンＣに脱アセチル
化しうるあらゆる加工物を意味する。
このエステラーゼ活性は通常菌糸体中に存在する。従っ
て培養物の処理物としては下記の加工物を例示すること
ができる。
て培養物の処理物としては下記の加工物を例示すること
ができる。
（１）濾過および遠心分離のごとき通常の方法で培養物
から分離した生菌糸体。
から分離した生菌糸体。
（２）凍結乾燥および真空乾燥のごとき通常の方法で上
記生菌糸体を乾燥して得られた乾燥菌糸体。
記生菌糸体を乾燥して得られた乾燥菌糸体。
（３）上記の生菌糸体または乾燥菌糸体を通常の方法で
破壊（例えば、有機溶媒を用いた自己消化、アルミナ、
海砂などを用いた磨砕、または超音波による菌糸体の処
理）して得た無細胞抽出液。
破壊（例えば、有機溶媒を用いた自己消化、アルミナ、
海砂などを用いた磨砕、または超音波による菌糸体の処
理）して得た無細胞抽出液。
（４）上記の無細胞抽出液を通常の方法（例えば、カラ
ム・クロマトグラフィー）で精製又は部分精製して得ら
れた酵素溶液。
ム・クロマトグラフィー）で精製又は部分精製して得ら
れた酵素溶液。
（５）上記の菌糸体または酵素を通常の方法で固定（例
えば、アクリルアミド、ガラスピーズ、イオン交換樹脂
等を用いる方法）して製造した固定化菌糸体または固定
化酵素。
えば、アクリルアミド、ガラスピーズ、イオン交換樹脂
等を用いる方法）して製造した固定化菌糸体または固定
化酵素。
セファロスポリンＣを該エステラーゼと接触きせること
からなる反応は水または緩衝液のごとき水性媒体中で実
施できる。即ち、通常セファロスポリンＣを含有する水
または緩衝液のごとき水性媒体に培養物又はその処理物
を溶解もしくは懸濁きせることにより実施できる。
からなる反応は水または緩衝液のごとき水性媒体中で実
施できる。即ち、通常セファロスポリンＣを含有する水
または緩衝液のごとき水性媒体に培養物又はその処理物
を溶解もしくは懸濁きせることにより実施できる。
反応混合物の好ましいｐＨ、セファロスポリンＣの濃度
、反応時間および反応温度は使用されるエステラーゼを
含有する培養物またはその処理物の特性により異なる。
、反応時間および反応温度は使用されるエステラーゼを
含有する培養物またはその処理物の特性により異なる。
通常、反応はｐＨ３ないし７、好ましくはｐＨ３．５な
いし５において２０℃ないし４０℃、好ましくは２５℃
ないし３７℃で２ないし５０時間実施される。
いし５において２０℃ないし４０℃、好ましくは２５℃
ないし３７℃で２ないし５０時間実施される。
反応混合物における基質としてのセファロスポリンＣの
濃度は好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／鶴の範囲か
ら選ばれる。
濃度は好ましくは０．１ないし１００ｍｇ／鶴の範囲か
ら選ばれる。
セファロスポリンＣをエステラーゼと接触させるその他
の方法としては工業的規模の生産に便利な本方法の他の
態様を挙げることができる。即ち、セファロスポリンＣ
生産、菌の培養物中のセファロスポリンＣをそのまま培
養物からセファロスポリンＣを分離することなくオーレ
オバシデイウム属に属するエステラーゼ生産菌の培養物
中の菌糸体と直接接触させてデアセチルセファロスポリ
ンＣを生成させる。
の方法としては工業的規模の生産に便利な本方法の他の
態様を挙げることができる。即ち、セファロスポリンＣ
生産、菌の培養物中のセファロスポリンＣをそのまま培
養物からセファロスポリンＣを分離することなくオーレ
オバシデイウム属に属するエステラーゼ生産菌の培養物
中の菌糸体と直接接触させてデアセチルセファロスポリ
ンＣを生成させる。
このように反応混合物中に生成された目的化合物はセフ
ァロスポリンの化学において使用される通常の方法によ
り単離精製される。このような方法としては、適当な溶
媒による精製、減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結晶、
アニオンまたはカチオン交換樹脂またはマクロポーラス
非イオン性吸着樹脂による処理等の方法が例示できる。
ァロスポリンの化学において使用される通常の方法によ
り単離精製される。このような方法としては、適当な溶
媒による精製、減圧濃縮、凍結乾燥、結晶化、再結晶、
アニオンまたはカチオン交換樹脂またはマクロポーラス
非イオン性吸着樹脂による処理等の方法が例示できる。
上記で詳細に説明した如く、本発明者らはセファロスポ
リンＣまたはその塩と、オーレオバシディウム属に属す
る菌株、特にオーしオバシデイウム・プルランスＩＦＯ
４４６６のエステラーゼとを接触きせることからなるデ
アセチルセファロスポリンＣの新規で効果的な方法を見
出したのである。
リンＣまたはその塩と、オーレオバシディウム属に属す
る菌株、特にオーしオバシデイウム・プルランスＩＦＯ
４４６６のエステラーゼとを接触きせることからなるデ
アセチルセファロスポリンＣの新規で効果的な方法を見
出したのである。
上記の知見後、本発明者らは本発明で使用されるオーし
オバシディウム属のエステラーゼの特性の確認および関
連先行技術において公知のエステラーゼについてこのエ
ステラーゼの新規性の確認に引続き鋭意研究を行った結
果、オーレオバシディウム属のエステラーゼはセファロ
スポリンＣをデアセチルセファロスポリンＣに加水分解
しうる新しい酵素であると結論した。
オバシディウム属のエステラーゼの特性の確認および関
連先行技術において公知のエステラーゼについてこのエ
ステラーゼの新規性の確認に引続き鋭意研究を行った結
果、オーレオバシディウム属のエステラーゼはセファロ
スポリンＣをデアセチルセファロスポリンＣに加水分解
しうる新しい酵素であると結論した。
これに関しては関連先行技術として１９７５年１０月１
４日登録の米国特許第３．９１２．５８９を挙げること
ができ、これにはセファロスポリンＣをデアセチルセフ
ァロスポリンＣに加水分解しうるロドトルラ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ ）属のエステラーゼが記載されており
、そしてロドトルラ属と本発明のオーしオバンディウム
属とはそれぞれ酵母に属する微生物の１種である点にお
いてオーレオパシディウム属に近い菌である。
４日登録の米国特許第３．９１２．５８９を挙げること
ができ、これにはセファロスポリンＣをデアセチルセフ
ァロスポリンＣに加水分解しうるロドトルラ（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ ）属のエステラーゼが記載されており
、そしてロドトルラ属と本発明のオーしオバンディウム
属とはそれぞれ酵母に属する微生物の１種である点にお
いてオーレオパシディウム属に近い菌である。
下記にオーしオバシディウム属に属する代表的な菌株で
あるオーレオバシデイウム・プルランスＵＦＯ４４６６
の菌株により生産されるエステラーゼの性質および関連
事項を詳細に説明する。
あるオーレオバシデイウム・プルランスＵＦＯ４４６６
の菌株により生産されるエステラーゼの性質および関連
事項を詳細に説明する。
オーレオバンプイウムψプルランスＵＦＯ４４６６の培
養物から単離精製してエステラーゼを製造し、その製法
の詳細は下記実施例３に示されている。
養物から単離精製してエステラーゼを製造し、その製法
の詳細は下記実施例３に示されている。
実施例３から明らかなごとく、とのエステラーゼにはセ
ファロスポリンＣをデアセチルセファロスポリンＣに加
水分解しうる２つの酵素成分が含まれ、そして次の記載
から明らかなごとくとのエステラーゼは酢酸エステルを
加水分解するが酢酸エステル以外のエステルは加水分解
しない特性を特徴とする。従って、オーレオバシディウ
ム・プルランスＩＦＯ４４６６から生成されるエステラ
ーゼは、いわゆる１アセチルエステラーゼ」として命名
すべきものであり、従って本発明者らは下記の説明にお
いて便宜上本発明のエステラーゼの２つの成分をアセチ
ルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１［と命名した。
ファロスポリンＣをデアセチルセファロスポリンＣに加
水分解しうる２つの酵素成分が含まれ、そして次の記載
から明らかなごとくとのエステラーゼは酢酸エステルを
加水分解するが酢酸エステル以外のエステルは加水分解
しない特性を特徴とする。従って、オーレオバシディウ
ム・プルランスＩＦＯ４４６６から生成されるエステラ
ーゼは、いわゆる１アセチルエステラーゼ」として命名
すべきものであり、従って本発明者らは下記の説明にお
いて便宜上本発明のエステラーゼの２つの成分をアセチ
ルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１［と命名した。
アセチルエステラーゼ４４６６−１およびアセチルエス
テラーゼ４４６６− ｎは次の酵素学的性質を有してい
る。
テラーゼ４４６６− ｎは次の酵素学的性質を有してい
る。
（１）基質特異性（アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉおよび４４６６− Ｍ ） ： 加水分解し得る基質：酢酸エステル 加水分解し得ない基質：酢酸エステル以外のエステル 基質に対する特異性は下記の方法で測定した。
Ｉおよび４４６６− Ｍ ） ： 加水分解し得る基質：酢酸エステル 加水分解し得ない基質：酢酸エステル以外のエステル 基質に対する特異性は下記の方法で測定した。
下記に述べる基質（５ｍｇ）を試験管に入れ、０．０５
Ｍ酢酸緩衝液（りＨ４，５） （１ｍＱ ）中に溶解シ
タ。
Ｍ酢酸緩衝液（りＨ４，５） （１ｍＱ ）中に溶解シ
タ。
この溶液に実施例３で製造した酵素溶液Ａ（即ち、アセ
チルエステラーゼ４４６６− Ｉ ） （０，１ｍ１１
）または酵素溶液Ｂ（即ち、アセチルエステラーゼ４
４６６− ｎ ） （０，１戚）を加えた。
チルエステラーゼ４４６６− Ｉ ） （０，１ｍ１１
）または酵素溶液Ｂ（即ち、アセチルエステラーゼ４
４６６− ｎ ） （０，１戚）を加えた。
反応混合物を２５℃で１時間振とう機上で加温した後、
基質の加水分解を下記の方法で測定した。
基質の加水分解を下記の方法で測定した。
（１）分析１（薄層クロマトグラフィー）試験溶液（１
縛）および標品をそれぞれシリカゲルプレート上にスポ
ットした。このプレートを７０％水性ｎ−プロパツール
で展開し、乾燥した。
縛）および標品をそれぞれシリカゲルプレート上にスポ
ットした。このプレートを７０％水性ｎ−プロパツール
で展開し、乾燥した。
検出は紫外線吸収により行なった。
（ｉ）分析２（ガス・クロマトグラフィー）試験溶液を
下記の条件におけるガス・クロマトグラフィーで分析し
た。
下記の条件におけるガス・クロマトグラフィーで分析し
た。
カラム：５８３０１ｍ
キャリヤー・ガス二Ｎ２（１５戒／分）カラム温度＝８
０℃ 注入温度＝１２０℃ 検出温度＝８０℃ 検出器：ＦＩＤ（空気１．０ｋｇ ／ Ｃｍ２Ｇ、 Ｈ
２１、Ｏｋｇ／ａｍ２Ｇ） 結果を下記の表に示す。
０℃ 注入温度＝１２０℃ 検出温度＝８０℃ 検出器：ＦＩＤ（空気１．０ｋｇ ／ Ｃｍ２Ｇ、 Ｈ
２１、Ｏｋｇ／ａｍ２Ｇ） 結果を下記の表に示す。
（２） ｐＨの効果
（Ａ）基質：セファロスポリンＣ
（ａ）至適ｐＨ（アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉ
および４４６６−１［） ： ｐＨ４以下添付図面の第
１図に示したごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （０−０）ノ至適ｐＨおよびアセチルエステラー
ゼａ４６６− ＩＦ （△−△）の至適ｐＨはｐＨ４以
下である。
および４４６６−１［） ： ｐＨ４以下添付図面の第
１図に示したごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （０−０）ノ至適ｐＨおよびアセチルエステラー
ゼａ４６６− ＩＦ （△−△）の至適ｐＨはｐＨ４以
下である。
種々なｐ）Ｉにおける酵素活性を次の方法で測定した。
（ｉ）緩衝溶液
ｐＨ３，５−６，Ｏ： ０．０５酢酸緩衝液ｐＨ５，０
−８，Ｏ： Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０−９，５
： Ｏ，ＬＭ トリス−塩酸緩衝液（ｉ）反応 酵素溶液（０，５１１１１１）に上記のごとき種々なｐ
Ｈの加温したＣ ３０”Ｃ）緩衝液（４ｍＱ）および５
％セファロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液（ｏ
、５ｍＱ）を加えた。反応混合物を３０°Ｃで１時間振
とう機上で加温した。次いで生成したデアセチルセファ
ロスポリンＣおよび未反応のセファロスポリンＣを高速
液体クロマトグラフィーで測定した。
−８，Ｏ： Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０−９，５
： Ｏ，ＬＭ トリス−塩酸緩衝液（ｉ）反応 酵素溶液（０，５１１１１１）に上記のごとき種々なｐ
Ｈの加温したＣ ３０”Ｃ）緩衝液（４ｍＱ）および５
％セファロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液（ｏ
、５ｍＱ）を加えた。反応混合物を３０°Ｃで１時間振
とう機上で加温した。次いで生成したデアセチルセファ
ロスポリンＣおよび未反応のセファロスポリンＣを高速
液体クロマトグラフィーで測定した。
（ｂ）安定ｐＨ範囲（アセチルエステラーゼ４４６６−
■および４４６６−１［） ： ｐＨ４，０−６，０添
付図面の第２図に示したごとく、アセチルエステラーゼ
４４６６− Ｉ （ｏ７ｏ ）およびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１１ （△−△）はｐＨ４，０−６，０
の範囲において安定である。
■および４４６６−１［） ： ｐＨ４，０−６，０添
付図面の第２図に示したごとく、アセチルエステラーゼ
４４６６− Ｉ （ｏ７ｏ ）およびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１１ （△−△）はｐＨ４，０−６，０
の範囲において安定である。
この安定度試験は次の方法で実施した。
酵素溶液（１ｍＢに上記のごとき種々なｐＨの緩衝液（
９ｍＡ）を加えた。この酵素溶液（１０ｍＡ）を６０℃
で１時間加熱した。次いで、アセチルエステラーゼの残
留酵素活性を下記に述べる測定方法■に従って測定した
。
９ｍＡ）を加えた。この酵素溶液（１０ｍＡ）を６０℃
で１時間加熱した。次いで、アセチルエステラーゼの残
留酵素活性を下記に述べる測定方法■に従って測定した
。
（Ｂ）基質：酢酸エチル
至適ｐＨ（アセチルエステラーゼ４４６６−Ｉおよび４
４６６− Ｉｆ ） ： ｐＨ５，２５付近添付図面の
第５図に示すごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （ｏ−ｏ ）の至適ｐｌおよびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１［（△−△）の至適ｐＨは、酢酸エチ
ルを基質とした場合、ｐ）１５．２５付近である。
４６６− Ｉｆ ） ： ｐＨ５，２５付近添付図面の
第５図に示すごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （ｏ−ｏ ）の至適ｐｌおよびアセチルエステラ
ーゼ４４６６−１［（△−△）の至適ｐＨは、酢酸エチ
ルを基質とした場合、ｐ）１５．２５付近である。
種々なｐＨにお（する酵素活性は次の方法で測定した。
酢酸エチル（５縛）に上記のごとき種々のｐＨの加温し
た（３０°Ｃ）緩衝液（１ｍｍ）および酵素溶液（３０
０ｎ ）を加えた。この反応混合物を３０℃で１時間振
とう機上で加温した。次いで生成したエタノールと未反
応の酢酸エチルをガス・クロマトグラフィーで測定した
。
た（３０°Ｃ）緩衝液（１ｍｍ）および酵素溶液（３０
０ｎ ）を加えた。この反応混合物を３０℃で１時間振
とう機上で加温した。次いで生成したエタノールと未反
応の酢酸エチルをガス・クロマトグラフィーで測定した
。
（３）温度の影響
（ａ）至適温度（アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉ
および４４６６− Ｉ ） ： ３７°Ｃ付近添付図面
の第３図に示したごとく、アセチルエステラーゼ４４６
６− Ｉ （０−○）の至適温度およびアセチルエステ
ラーゼ４４６６− ｎ （△−△）は３７°Ｃ付近であ
る。
および４４６６− Ｉ ） ： ３７°Ｃ付近添付図面
の第３図に示したごとく、アセチルエステラーゼ４４６
６− Ｉ （０−○）の至適温度およびアセチルエステ
ラーゼ４４６６− ｎ （△−△）は３７°Ｃ付近であ
る。
種々な温度における酵素活性は次の方法で測定した。
酵素溶液（０，５ｍｍりに所定の温度に温めた０、０５
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）１４．０） （４ｍ１１ ）、およ
び５％セファロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液
（０，５ｍｍ）を加えた。この反応混合物を所定の温度
で１時間振とう機上で加温した。次いで、生成したデア
セチルセファロスポリンＣおよび未反応のセファロスポ
リンＣを高速液体クロマトグラフィーで測定した。
Ｍ酢酸緩衝液（ｐ）１４．０） （４ｍ１１ ）、およ
び５％セファロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液
（０，５ｍｍ）を加えた。この反応混合物を所定の温度
で１時間振とう機上で加温した。次いで、生成したデア
セチルセファロスポリンＣおよび未反応のセファロスポ
リンＣを高速液体クロマトグラフィーで測定した。
＜ｂ＞安定温度範囲（アセチルエステラーゼ４４６６Ｉ
および４４６６−１［） ： ６０°Ｃ以下添付図面の
第４図に示すごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （〇−〇）およびアセチルエステラーゼ４４６６
−１［（△−△）は６０℃以下で安定である。
および４４６６−１［） ： ６０°Ｃ以下添付図面の
第４図に示すごとく、アセチルエステラーゼ４４６６−
Ｉ （〇−〇）およびアセチルエステラーゼ４４６６
−１［（△−△）は６０℃以下で安定である。
この安定度試験は下記の方法で実施した。
酵素溶液（ｐＨ４，０）を所定温度で（２５−７０°Ｃ
）で１時間放置した。次いで残留酵素活性を下記に述べ
る測定方法■に従って測定した。
）で１時間放置した。次いで残留酵素活性を下記に述べ
る測定方法■に従って測定した。
２〇−
（４）Ｋｍの測定
（基質がセファロスポリンＣの場合）
アセチルエステラーゼ４４６６−１ ：Ｋｍ＝１１．５
ｍＭ アセチルエステラーゼ４４６６− ｎ ：Ｋｍ＝ １３
．７ｍＭ アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエ
ステラーゼ４４６６−１［のＫｍ値は次の方法で測定し
た。
ｍＭ アセチルエステラーゼ４４６６− ｎ ：Ｋｍ＝ １３
．７ｍＭ アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエ
ステラーゼ４４６６−１［のＫｍ値は次の方法で測定し
た。
セファロスポリンＣナトリウム・２水和物を種々な濃度
（０，２−５％）で含有する０、 ０５Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ４，０） （４，５ｍｍ ）に酵素溶液（０，ｓ＋
ｎａ）を加えた。
（０，２−５％）で含有する０、 ０５Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ４，０） （４，５ｍｍ ）に酵素溶液（０，ｓ＋
ｎａ）を加えた。
この反応混合物を３０℃で１時間振とう機上で加温した
。次いで生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび
未反応のセファロスポリンＣを高速液体クロマトグラフ
ィーで測定した。各エステラーゼのＫｍ値は常法により
計算した。
。次いで生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび
未反応のセファロスポリンＣを高速液体クロマトグラフ
ィーで測定した。各エステラーゼのＫｍ値は常法により
計算した。
（５）金属イオンの影響
アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエ
ステラーゼ４４６６− Ｉ＋の酵素活性はＣｕ２”、Ｍ
ｎ２＋Ｍ ｇ２＋、ｚｎ２＋、Ｎ１２＋、Ｃ８２＋、Ｂ
ａ２”、Ｆｅ”＋のごとき金属イオンに影響きれない。
ステラーゼ４４６６− Ｉ＋の酵素活性はＣｕ２”、Ｍ
ｎ２＋Ｍ ｇ２＋、ｚｎ２＋、Ｎ１２＋、Ｃ８２＋、Ｂ
ａ２”、Ｆｅ”＋のごとき金属イオンに影響きれない。
このアセチルエステラーゼに対する金属イオンの影響は
次の方法で測定した。
次の方法で測定した。
酵素溶液（０，５ｍ１１．）に上述のごとき金属イオン
の１つを含有する（ ５ Ｘ １０−４ｍｏｌ ） ０
．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０：ｌおよび５％セファ
ロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液（０，５ｍ１
１）を加えた。
の１つを含有する（ ５ Ｘ １０−４ｍｏｌ ） ０
．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０：ｌおよび５％セファ
ロスポリンＣナトリウム・２水和物水溶液（０，５ｍ１
１）を加えた。
この反応混合物を３０℃で１時間振とう機上で加温した
。次いで生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび
未反応のセファロスポリンＣを高速液体クロマトグラフ
ィーにより測定した。
。次いで生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび
未反応のセファロスポリンＣを高速液体クロマトグラフ
ィーにより測定した。
対照として、上述の方法において金属イオンを含まない
０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）を用いた。
０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）を用いた。
〈６〉分子量
アセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびアセチルエ
ステラーゼ４４６６−１［の分子量をゲル濾過法［カラ
ム：セファデックスＧ −２００（２，９Ｘ ４６．７
ｃｍ）、対照：テログロブリン（６６９，０００）、フ
ェノチン（４ａｏ、 ｏｏｏ ）、カタラーゼ（２３２
，０００）コにより測定を試みた結果、それらの酵素の
分子量は共に６７万ダルトン以上であり、このデータを
基に片対数グラフにより算出するとアセチルエステラゼ
４４６６− Ｉは分子量約７８万ダルトン、またアセチ
ルエステラーゼ４４６６− ｎは分子量約９２万ダルト
ンと推定される。
ステラーゼ４４６６−１［の分子量をゲル濾過法［カラ
ム：セファデックスＧ −２００（２，９Ｘ ４６．７
ｃｍ）、対照：テログロブリン（６６９，０００）、フ
ェノチン（４ａｏ、 ｏｏｏ ）、カタラーゼ（２３２
，０００）コにより測定を試みた結果、それらの酵素の
分子量は共に６７万ダルトン以上であり、このデータを
基に片対数グラフにより算出するとアセチルエステラゼ
４４６６− Ｉは分子量約７８万ダルトン、またアセチ
ルエステラーゼ４４６６− ｎは分子量約９２万ダルト
ンと推定される。
エステラーゼの酵素活性は次の方法で測定できる。
沢】しｌ友↓
（ａ）反応
酵素溶液（０，ｓｍｕ）に加温した（３０℃）０．０５
Ｍ酢酸緩衝液（４ｍＡ）およびセファロスポリンＣナト
リウム・２水和物（５０ｍｇ／ ｍＱ ）を含有する０
、０５Ｍ酢酸緩衝液（０，５１ｎＭ ）を加える。反応
混合物を３０°Ｃで１時間振とう機上で加温する。次い
で、生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび未反
応のセファロスポリンＣをそれぞれ下記の条件において
高速液体クロマトグラフィーで決定した。
Ｍ酢酸緩衝液（４ｍＡ）およびセファロスポリンＣナト
リウム・２水和物（５０ｍｇ／ ｍＱ ）を含有する０
、０５Ｍ酢酸緩衝液（０，５１ｎＭ ）を加える。反応
混合物を３０°Ｃで１時間振とう機上で加温する。次い
で、生成したデアセチルセファロスポリンＣおよび未反
応のセファロスポリンＣをそれぞれ下記の条件において
高速液体クロマトグラフィーで決定した。
固定相：ボリゴシルｓｏ ＋ｏ ｃ ｔｓ （商品名
、住友化学工業株式会社製） 移動相；メタノール、水および酢酸（１００： ９００
：５）の混合物 カラムの高さ： ３０ｃｍ カラム温度：室温 検出： ２５０ｎｍにおける紫外線吸収流速：１．Ｏｍ
Ｑ／分 酵素活性（ｍｇ／時・ｍＱまたはｍｇ）は上記の反応条
件における酵素製剤（１ｍＱｔたは１ｍｇ）当りの得ら
れたデアセチルセファロスポリンＣの量（＋ｎｇ＞で表
わされる。
、住友化学工業株式会社製） 移動相；メタノール、水および酢酸（１００： ９００
：５）の混合物 カラムの高さ： ３０ｃｍ カラム温度：室温 検出： ２５０ｎｍにおける紫外線吸収流速：１．Ｏｍ
Ｑ／分 酵素活性（ｍｇ／時・ｍＱまたはｍｇ）は上記の反応条
件における酵素製剤（１ｍＱｔたは１ｍｇ）当りの得ら
れたデアセチルセファロスポリンＣの量（＋ｎｇ＞で表
わされる。
（ｂ）比活性の計算方法
（１）蛋白含有量の決定
酵素製剤における蛋白含有量は標準サンプルとして牛血
清アルブミンを用いてロウジー（ｌａｗｒｙ ）法［ジ
ャーナル・才プ・）くイオロジカル・ケミストリー１９
３．２６５ （１９５１）参照トこ従って決定できる。
清アルブミンを用いてロウジー（ｌａｗｒｙ ）法［ジ
ャーナル・才プ・）くイオロジカル・ケミストリー１９
３．２６５ （１９５１）参照トこ従って決定できる。
（ｉ）比活性の計算
比活性は下記の式に従って計算できる。
上記で説明したごとき酵素学的性質の観察から、本発明
のアセチルエステラーゼは既知のエステラーゼと比較し
て非常に特異な性質、特にセファロスポリンＣをデアセ
チルセファロスポリンＣに加水分解する能力、非常に狭
い基質特異性（即ち、このアセチルエステラーゼは酢酸
エステルのみを加水分解するが他のエステルを加水分解
しない）および独特な至適ｐＨ（即ち、このアセチルエ
ステラーゼはかなりの酸性側に至適ｐＨを有する）を有
していてる。
のアセチルエステラーゼは既知のエステラーゼと比較し
て非常に特異な性質、特にセファロスポリンＣをデアセ
チルセファロスポリンＣに加水分解する能力、非常に狭
い基質特異性（即ち、このアセチルエステラーゼは酢酸
エステルのみを加水分解するが他のエステルを加水分解
しない）および独特な至適ｐＨ（即ち、このアセチルエ
ステラーゼはかなりの酸性側に至適ｐＨを有する）を有
していてる。
さらに、セファロスポリンＣをデアセチルセファ０スポ
リンＣに加水分解しろる既知のエステラーゼ、即ち、ロ
ドトルラ属、その代表的なものとしてロドトルラ・グル
チニスＩＦＯ１１２５により生産きれるエステラーゼと
本発明のアセチルエステラーゼを比較すれば、本発明の
アセチルエステラーゼ（以下ＡＥと称す）は、例えば次
の点においてロドトルラ属により生産されるエステラー
ゼ（以下ＲＥと称す）と全く相違する。即ち、ＡＥの至
適ｐＨはｐＨ４以下であるがＲＥのそれはｐＨ５ないし
６付近であり、ＡＥの至適温度は約３７℃であるがＲＥ
のそれは約５０℃であり、そしてＡＥの安定ｐＨ範囲は
約ｐＨ４，０〜６．０であるのに対し、ＲＥのそれは約
ｐＨ６，０である。
リンＣに加水分解しろる既知のエステラーゼ、即ち、ロ
ドトルラ属、その代表的なものとしてロドトルラ・グル
チニスＩＦＯ１１２５により生産きれるエステラーゼと
本発明のアセチルエステラーゼを比較すれば、本発明の
アセチルエステラーゼ（以下ＡＥと称す）は、例えば次
の点においてロドトルラ属により生産されるエステラー
ゼ（以下ＲＥと称す）と全く相違する。即ち、ＡＥの至
適ｐＨはｐＨ４以下であるがＲＥのそれはｐＨ５ないし
６付近であり、ＡＥの至適温度は約３７℃であるがＲＥ
のそれは約５０℃であり、そしてＡＥの安定ｐＨ範囲は
約ｐＨ４，０〜６．０であるのに対し、ＲＥのそれは約
ｐＨ６，０である。
上述の結果を鋭意研究および分析することにより、本発
明者らはアセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびア
セチルエステラーゼ−４４６６−１１は新規な酵素であ
ると結論した。
明者らはアセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよびア
セチルエステラーゼ−４４６６−１１は新規な酵素であ
ると結論した。
下記の実施例は本発明を例示する目的で示したものであ
る。
る。
実施例１
グルコース１％、ペプトン０．３％および肉エキス０．
３％を含有する水性培地（ｐＨ７，０） （１００ｍＱ
）を４本の５００賊容エーレンメーヤー・フラスコの
各々に注入し、１２０℃で２０分間滅菌した。各々の培
地にオーレオバシディウム・プルランスＩＦＩ）４４６
６の斜面培養物の１白金耳量を加え、菌を振とう機上２
５°Ｃで２日間生育させた。
３％を含有する水性培地（ｐＨ７，０） （１００ｍＱ
）を４本の５００賊容エーレンメーヤー・フラスコの
各々に注入し、１２０℃で２０分間滅菌した。各々の培
地にオーレオバシディウム・プルランスＩＦＩ）４４６
６の斜面培養物の１白金耳量を加え、菌を振とう機上２
５°Ｃで２日間生育させた。
きらに、上記と同じ水性培地（２０ｐ、）を３０！容の
ジャー・ファーメンタ−に注入し、１２０℃で２０分間
滅菌した。この培地に上記の培養物の全量を加えた。
ジャー・ファーメンタ−に注入し、１２０℃で２０分間
滅菌した。この培地に上記の培養物の全量を加えた。
菌は２５℃で２日間生育きせた。
このようにして得られた培養物を下記のデアセチルセフ
ァ０スポリンＣの製造に用いた。
ァ０スポリンＣの製造に用いた。
＜１）（オーレオバシディウム・プルランスの菌糸体を
用いたデアセチルセファ０スポリンＣの製造） 上記の培養物を遠心分離して得た湿潤菌糸体（Ｌｏｇ）
を、セファロスポリンＣナトリウム噂２水和物（２５ｍ
ｇ／ ｍＱ ）を含有する水溶液（３００ｍ１１ ）に
加えた０反応混合物を、混合物中でセファロスポリンＣ
が消失するまでｐＨ４，５および３０℃で１０時間攪拌
した。得られた混合物を濾過した。濾液をｐＨ７，０に
調節し、減圧下で濃縮して結晶を得、これを１夜５°Ｃ
で放置した。この結晶に少量の７５％水性エタノールを
加え、混合物をらいかいした。
用いたデアセチルセファ０スポリンＣの製造） 上記の培養物を遠心分離して得た湿潤菌糸体（Ｌｏｇ）
を、セファロスポリンＣナトリウム噂２水和物（２５ｍ
ｇ／ ｍＱ ）を含有する水溶液（３００ｍ１１ ）に
加えた０反応混合物を、混合物中でセファロスポリンＣ
が消失するまでｐＨ４，５および３０℃で１０時間攪拌
した。得られた混合物を濾過した。濾液をｐＨ７，０に
調節し、減圧下で濃縮して結晶を得、これを１夜５°Ｃ
で放置した。この結晶に少量の７５％水性エタノールを
加え、混合物をらいかいした。
結晶を濾過してとり出し、真空中で乾燥して結晶状のデ
アセチルセファロスポリンＣ（３，８ｇ）を得た。
アセチルセファロスポリンＣ（３，８ｇ）を得た。
上記で得られた結晶のＩＲスペクトルはテアセチルセフ
ァロスポリンＣの標品のそれと一致した。
ァロスポリンＣの標品のそれと一致した。
（２）（オーレオバシディウム・プルランスの菌糸体か
ら得た酵素抽出物を用いたデアセチルセファロスポリン
Ｃの製造）上記と同様にして得た。
ら得た酵素抽出物を用いたデアセチルセファロスポリン
Ｃの製造）上記と同様にして得た。
湿潤菌糸体（Ｌｏｇ）に少量のクロロホルムを加えた。
この混合物を室温で３０分間放置した。この混合物に蒸
留水（２０ｍ１ｌ ）を加えた。
留水（２０ｍ１ｌ ）を加えた。
室温で１日放置した後、混合物を遠心分離して酵素抽出
物（２ｏｍＱ）を得た。この酵素抽出物を、セファ０ス
ポリンＣナトリウム・２水和物（２５ｍｇ／ｍＱ）を含
む水溶液（３００ｍＱ ）に加えた。反応混合物を、混
合物中のセファロスポリンＣが消失するまでｐＨ４，５
および３０°Ｃで１０時間攪拌した。得られた混合物に
活性炭（３ｇ）を加え、混合物を濾過した。濾液をｐＨ
７，０に調節し、減圧下で濃縮して結晶を得、これに少
量の７５％水性エタノールを加え、混合物をらいかいし
た。濾過して結晶を分離し、真空中で乾燥して結晶状の
デアセチルセファロスポリンＣ（３，６ｇ）を得た。
物（２ｏｍＱ）を得た。この酵素抽出物を、セファ０ス
ポリンＣナトリウム・２水和物（２５ｍｇ／ｍＱ）を含
む水溶液（３００ｍＱ ）に加えた。反応混合物を、混
合物中のセファロスポリンＣが消失するまでｐＨ４，５
および３０°Ｃで１０時間攪拌した。得られた混合物に
活性炭（３ｇ）を加え、混合物を濾過した。濾液をｐＨ
７，０に調節し、減圧下で濃縮して結晶を得、これに少
量の７５％水性エタノールを加え、混合物をらいかいし
た。濾過して結晶を分離し、真空中で乾燥して結晶状の
デアセチルセファロスポリンＣ（３，６ｇ）を得た。
上記で得られた結晶のＩＲスペクトルはデアセチルセフ
ァロスポリンＣの標品のそれと一致した。
ァロスポリンＣの標品のそれと一致した。
（３）（固定化菌糸体を用いたデアセチルセファロスポ
リンＣの製造） 凍結し氷解したオーレオバシディウム・プルランスＩＦ
Ｏ４４６６の菌糸体（２４ｇ）をアクリルアミド（７，
５ｇ）およびＮ、Ｎ’ −メチレンビスアクリルアミド
（０，４ｇ）を含有する水溶液（２ＱｒＱｆｌ ）に加
えた。この混合物に５％Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’ −テト
ラメチルエチレンジアミン水溶液（５ｍＱ）および１％
過硫酸アンモニウム水溶液（ｓ ｍｕ ）を４℃で窒素
雰囲気中で加えた。反応混合物をガラス管中４℃で１時
間重合した。このようにして生成したポリアクリルアミ
ド・ゲルを押出し、粉砕器で砕いた。砕いたゲルをカラ
ム（１００＋ｎｌｌ容）に充填し、０．１Ｍ酢酸緩衝液
および冷水（１，１２）で洗浄した。セファロスポリン
Ｃナトリウム・２水和物（１，６ｍｇ／ ｍＱ ）を含
有する水溶液（１ρ）を上記で調製したカラムに５Ｖ＝
０．５の流速で通液した。
リンＣの製造） 凍結し氷解したオーレオバシディウム・プルランスＩＦ
Ｏ４４６６の菌糸体（２４ｇ）をアクリルアミド（７，
５ｇ）およびＮ、Ｎ’ −メチレンビスアクリルアミド
（０，４ｇ）を含有する水溶液（２ＱｒＱｆｌ ）に加
えた。この混合物に５％Ｎ、Ｎ、Ｎ’ 、Ｎ’ −テト
ラメチルエチレンジアミン水溶液（５ｍＱ）および１％
過硫酸アンモニウム水溶液（ｓ ｍｕ ）を４℃で窒素
雰囲気中で加えた。反応混合物をガラス管中４℃で１時
間重合した。このようにして生成したポリアクリルアミ
ド・ゲルを押出し、粉砕器で砕いた。砕いたゲルをカラ
ム（１００＋ｎｌｌ容）に充填し、０．１Ｍ酢酸緩衝液
および冷水（１，１２）で洗浄した。セファロスポリン
Ｃナトリウム・２水和物（１，６ｍｇ／ ｍＱ ）を含
有する水溶液（１ρ）を上記で調製したカラムに５Ｖ＝
０．５の流速で通液した。
流出液にセファロスポリンＣナトリウム・２水和物が存
在しないことが確認された後、流出液をｐＨ７，０に調
節し、減圧下で濃縮し、５℃で１夜放置した。残渣に７
５％水性エタノールを加え、充分混合して結晶を析出許
せ、結晶を分離し、真空中で乾燥して結晶状のデアセチ
ルセファロスポリンＣ（０，９ｇ）を得た。
在しないことが確認された後、流出液をｐＨ７，０に調
節し、減圧下で濃縮し、５℃で１夜放置した。残渣に７
５％水性エタノールを加え、充分混合して結晶を析出許
せ、結晶を分離し、真空中で乾燥して結晶状のデアセチ
ルセファロスポリンＣ（０，９ｇ）を得た。
この結晶のＩＲスペクトルはテアセチルセファロスポリ
ンＣの標品のそれと一致した。
ンＣの標品のそれと一致した。
実施例２
実施ＰＡ１に記載したものと実質的ｔこ同じ方法で製造
したオーレオバシディウム・プルランスＵＦＯ４４６６
の培養物（ｔｏＬ）から遠心分離で菌糸体（３ｓｏｍ＋
Ｂを採取した。この菌糸体に几容量のクロロホルムを加
えた。
したオーレオバシディウム・プルランスＵＦＯ４４６６
の培養物（ｔｏＬ）から遠心分離で菌糸体（３ｓｏｍ＋
Ｂを採取した。この菌糸体に几容量のクロロホルムを加
えた。
混合物を３０分間撹拌し、２倍量の水を混合物に加えた
。この水性混合物を２５°Ｃで２４時間放置した。
。この水性混合物を２５°Ｃで２４時間放置した。
混合物を濾過して「酵素抽出物Ｉ Ｊ （１０１００Ｏ
）を得、ｐＨ４，０に調節し、次いで濾過して不溶性の
物質を除去した。濾液を膜（分＋ＮＬ：０．１ミクロン
・カット）の限外濾過にかけて濃縮物（８０ｍＱ ）を
得、これを凍結乾燥して粗製粉末を得た。この粗製粉末
（４ｇ）を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）（２０
ｍＱ ）に溶かし、ＣＭ−セフ７デツクスＣ−２５のカ
ラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラムの内径４
０ｍｍ、カラムの高；Ｊ６７５ｍｍ）に通液し、この方
ラムを上述のものと同じ酢酸緩衝液で展開した（流速、
６４ｍＱ／時間）。目的化合物を含有する分画（４４０
ｍｍ ）を集め、ＤＥＡＥ−セフ７デツクスＡ２５のカ
ラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラム内径４０
ｍｍ、カラムの高さ７８５ｍｍ）に通液した。
）を得、ｐＨ４，０に調節し、次いで濾過して不溶性の
物質を除去した。濾液を膜（分＋ＮＬ：０．１ミクロン
・カット）の限外濾過にかけて濃縮物（８０ｍＱ ）を
得、これを凍結乾燥して粗製粉末を得た。この粗製粉末
（４ｇ）を０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）（２０
ｍＱ ）に溶かし、ＣＭ−セフ７デツクスＣ−２５のカ
ラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラムの内径４
０ｍｍ、カラムの高；Ｊ６７５ｍｍ）に通液し、この方
ラムを上述のものと同じ酢酸緩衝液で展開した（流速、
６４ｍＱ／時間）。目的化合物を含有する分画（４４０
ｍｍ ）を集め、ＤＥＡＥ−セフ７デツクスＡ２５のカ
ラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラム内径４０
ｍｍ、カラムの高さ７８５ｍｍ）に通液した。
このカラムを００５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で洗浄
し、直線傾斜法において（０，０５Ｍ −０，２５Ｍ
）酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で展開して（流速、６４ｍ
Ｑ／時間）ｒ分画Ａ Ｊ （３６０ｍｍ ）および１分
画Ｂ 、 （９８０ｍｍ ）を得た。
し、直線傾斜法において（０，０５Ｍ −０，２５Ｍ
）酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で展開して（流速、６４ｍ
Ｑ／時間）ｒ分画Ａ Ｊ （３６０ｍｍ ）および１分
画Ｂ 、 （９８０ｍｍ ）を得た。
分画Ａは分画Ｂよりも１７倍の比活性を有した。分画Ａ
および分画Ｂをそれぞれ限外濾過で濃縮し、セファロー
ス４Ｂのカラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラ
ムの内径２９ｍｍ、カラムの高ａ５３５ｍｍ）に通液し
た。各々のカラムを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨａ、ｏ
）で展開してそれぞれ分画Ａから１酵素溶液Ａ」（７２
ｍＱ）および分画Ｂから「酵素溶液Ｂ」（３２ｍＡ）を
得た。
および分画Ｂをそれぞれ限外濾過で濃縮し、セファロー
ス４Ｂのカラム（商品名、ファルマシアＡＢ社製、カラ
ムの内径２９ｍｍ、カラムの高ａ５３５ｍｍ）に通液し
た。各々のカラムを０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨａ、ｏ
）で展開してそれぞれ分画Ａから１酵素溶液Ａ」（７２
ｍＱ）および分画Ｂから「酵素溶液Ｂ」（３２ｍＡ）を
得た。
上記のごとく製造した酵素製剤のおのおのの比活性を下
記の表に相対的比活性として示す。これに関して、「相
対的比活性」は１酵素抽出物■」の活性を１とした基準
で計算された数値で示す。
記の表に相対的比活性として示す。これに関して、「相
対的比活性」は１酵素抽出物■」の活性を１とした基準
で計算された数値で示す。
酵素製剤 相対的比活性
酵素抽出物Ｉ１
分画Ａ１１０
（アセチルエステラーゼ
４４６６− Ｉ ）
分画Ｂ ６４（アセチル
エステラーゼ ４４６６−１［） 酵素溶液Ａ１６７ 酵素溶液Ｂ１０５
エステラーゼ ４４６６−１［） 酵素溶液Ａ１６７ 酵素溶液Ｂ１０５
第１図、第２図、第３図、第４図および第５図はこの発
明のアセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよび４４６
６− Ｉ［のｐＨ活性曲線（基質：セファロスボリンＣ
）、ｐＨ安定曲線、温度活性曲線、温度安定曲線および
ｐｌ（活性曲線（基質：酢酸エチル）をそれぞれ示す。 斗 Ｏ
明のアセチルエステラーゼ４４６６− Ｉおよび４４６
６− Ｉ［のｐＨ活性曲線（基質：セファロスボリンＣ
）、ｐＨ安定曲線、温度活性曲線、温度安定曲線および
ｐｌ（活性曲線（基質：酢酸エチル）をそれぞれ示す。 斗 Ｏ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記の性質を有するアセチルエステラーゼ４４６６−
I （ａ）セファロスポリンＣのデアセチルセファロスポリ
ンＣへの加水分解：加水分解し得る （ｂ）基質特異性 加水分解し得る基質：酢酸エステル 加水分解し得ない基質：酢酸エステル以外 のエステル （ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ４以下 （ｄ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ４．０−６．０ （ｅ）至適温度：約３７℃ （ｆ）安定温度範囲：６０℃以下 （ｇ）Ｋｍ値：１１．５ｍＭ （ｈ）金属イオンの影響：酵素活性はＣｕ＾２＾＋、Ｍ
ｎ＾２＾＋、Ｈｇ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＾
＋、Ｃａ＾２＾＋、Ｂａ＾２＾＋およびＦｅ＾３＾＋か
ら選ばれた金属イオンにより影響されない （ｉ）分子量：約７８万ダルトン （測定法：ゲル濾過法） ［ただし、上記（ｃ）−（ｈ）はセファロスポリンＣを
基質とした場合の性質である］ および下記の性質を有するアセチルエステラーゼ４４６
６−II （ａ）セファロスポリンＣのデアセチルセファロスポリ
ンＣの加水分解：加水分解し得る （ｂ）基質特異性 加水分解し得る基質：酢酸エステル 加水分解し得ない基質：酢酸エステル以外 のエステル （ｃ）至適ｐＨ：ｐＨ４以下 （ｄ）安定ｐＨ範囲：ｐＨ４．０−６．０ （ｅ）至適温度：約３７℃ （ｆ）安定温度範囲：６０℃以下 （ｇ）Ｋｍ値：１３．７ｍＭ （ｈ）金属イオンの影響：酵素活性はＣｕ＾２＾＋、Ｍ
ｎ＾２＾＋、Ｍｇ＾２＾＋、Ｎｉ＾２＾＋、Ｃａ＾２＾
＋、Ｂａ＾２＾＋およびＦｅ＾３＾＋から選ばれた金属
イオンにより影響されな い （ｉ）分子量：約９２万ダルトン （測定法：ゲル濾過法） ［ただし、上記（ｃ）−（ｈ）はセファロスポリンＣを
基質とした場合の性質である］ から選ばれたアセチルエステラーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8023834 | 1980-07-21 | ||
| GB8023834 | 1980-07-21 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56114306A Division JPS5739798A (en) | 1980-07-21 | 1981-07-20 | Prepartion of deacetylcephalosporin c or its salt and acetyl esterase used for it |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0249580A true JPH0249580A (ja) | 1990-02-19 |
| JPH0251594B2 JPH0251594B2 (ja) | 1990-11-07 |
Family
ID=10514925
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56114306A Granted JPS5739798A (en) | 1980-07-21 | 1981-07-20 | Prepartion of deacetylcephalosporin c or its salt and acetyl esterase used for it |
| JP1080859A Granted JPH0249580A (ja) | 1980-07-21 | 1989-03-30 | アセチルエステラーゼ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56114306A Granted JPS5739798A (en) | 1980-07-21 | 1981-07-20 | Prepartion of deacetylcephalosporin c or its salt and acetyl esterase used for it |
Country Status (7)
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| AT (1) | ATE12950T1 (ja) |
| DE (1) | DE3170118D1 (ja) |
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| DE3620801A1 (de) * | 1986-06-20 | 1988-02-25 | Pfaff Ind Masch | Naehmaschine mit einer werkstueck-ausrichtvorrichtung |
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| IT1252308B (it) * | 1990-12-21 | 1995-06-08 | Antibioticos Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati |
| US5512454A (en) * | 1994-02-03 | 1996-04-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Enzymatic acylation of 3-hydroxymethyl cephalosporins |
| US8198434B2 (en) * | 2008-05-07 | 2012-06-12 | Idexx Laboratories, Inc. | Process for preparing cefsulodin sodium |
| JP5698789B2 (ja) * | 2013-04-18 | 2015-04-08 | ファナック株式会社 | ワークを搬送するロボットの制御装置 |
| CN107915749A (zh) * | 2016-10-11 | 2018-04-17 | 伊犁川宁生物技术有限公司 | 一种纯化头孢菌素c发酵液的方法 |
| CN111850078A (zh) * | 2020-07-21 | 2020-10-30 | 伊犁川宁生物技术有限公司 | 一种头孢菌素c的发酵方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB1121308A (en) | 1964-10-30 | 1968-07-24 | Glaxo Lab Ltd | Cephalosporins |
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| US3976546A (en) * | 1974-11-08 | 1976-08-24 | Glaxo Laboratories Limited | Cephalosporins |
| GB1531212A (en) | 1974-11-08 | 1978-11-08 | Glaxo Lab Ltd | Enzymatic hydrolysis of 3-acyloxymethylceph-3-em-4-carboxylic acids or salts thereof |
-
1981
- 1981-07-16 US US06/283,962 patent/US4414328A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-07-20 EP EP81303313A patent/EP0044736B1/en not_active Expired
- 1981-07-20 DE DE8181303313T patent/DE3170118D1/de not_active Expired
- 1981-07-20 JP JP56114306A patent/JPS5739798A/ja active Granted
- 1981-07-20 AT AT81303313T patent/ATE12950T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-07-21 ES ES504166A patent/ES8302098A1/es not_active Expired
- 1981-07-21 KR KR1019810002646A patent/KR840002294B1/ko not_active Expired
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1983
- 1983-06-03 US US06/500,883 patent/US4517299A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-03-30 JP JP1080859A patent/JPH0249580A/ja active Granted
Also Published As
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| JPH0251594B2 (ja) | 1990-11-07 |
| EP0044736B1 (en) | 1985-04-24 |
| KR840002294B1 (ko) | 1984-12-15 |
| JPS5739798A (en) | 1982-03-05 |
| JPH0147158B2 (ja) | 1989-10-12 |
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| ES504166A0 (es) | 1983-01-01 |
| US4517299A (en) | 1985-05-14 |
| ATE12950T1 (de) | 1985-05-15 |
| DE3170118D1 (en) | 1985-05-30 |
| KR830006307A (ko) | 1983-09-20 |
| ES8302098A1 (es) | 1983-01-01 |
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