JPH01500003A - 光不安定結合による固形支持体上のポリヌクレオチド・プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光不安定結合による固形支持体上 のポリヌクレオチド・プローブ ＾貝夕ＪｊＩＬ１ 本発明はポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション・アッセイに関し、そして 光不安定結合によって固形支持体に結合したポリヌクレオチド・プローブを提供 する。

発明の背景 ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション・アッセイは完全なあるいはフラグ メント、または混合状態の核酸の検体中の独特、すなわち特異なポリヌクレオチ ド配列を検出しそして同定するための研究・診断手段として用いられている。種 々のハイブリダイゼーション方式が開発されている。

５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：　５０３（１９７ ５）は、放射線標識核酸プローブを用いたポリヌクレオチド・ハイブリダイゼー ション方法を開示している。この手法はプローブ／被分析物質ハイブリッドのオ ートラジオグラフィ検出およびアナライトのポリヌクレオチド配列の同定を可能 にする。しかしながら、５ｏｕｔｈｅｒｎ法および放射線標識核酸プローブを用 いたその他の診断法は極めて複雑で時間を要し、またそのほか一般に放射性物質 に関連した問題およびそれに伴なう経費、例えば関係者モニタリングおよび廃棄 処理などを必要とする。このためこのようなアッセイは基礎研究の手段の域にと どまっており、応用分野あるいは商業的分野例えば臨床診断などには一般的に用 いられていない。

１９８２年６月４日公告のＷａｒｄらによる欧州特許出願第８２３０１８０４． ９号明細書は、生物医学研究および組換えＤＮＡ技術におけるプローブとして有 用な組成物を開示しているが、プローブはポリペプチドと共に検出可能な複合物 を形成し得る部分に共有結合したプリン、７−デアザプリンまたはピリミジンを 含み、そして前記部分はプリン塩基の８位、デアザプリン塩基の７位、またはピ リミジン塩基の５位に結合して修飾ヌクレオチドを形成している。得られた修飾 ヌクレオチドはニックトランスレーション法によってＤＮＡ中に取り込まれる。

Ｒａｎｋｉおよび５ｏｄｅｒｌａｎｄによる米国特許第４，４８６，５３９号明 細書は核酸のサンドイッチ式ハイブリダイゼーション方法を開示しているが、こ の方法は微生物からの一本鎖核酸を一対の異なる核酸試薬と接触させることから なり、該対の試薬はいずれも一本鎖であり、かつ微生物由来の核酸と相補性であ り、さらに該対の一方はニトロセルロース・フィルタなどの固形担体に結合され た核酸フラグメントであり、他方は放射性マーカーで標識された核酸フラグメン トであり、それによって固形担体に結合された標識ハイブリッドが形成され、検 体中に存在する微生物または微生物群を同定する。同定の正確度は固形担体に結 合した標識ハイブリッドの形成度を検出することにより試験される。

１９８３年７月７日公告のＴｃｈｅｎらによるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＦＲ８２１ ００２２０号明細書は少なくとも１個のＮ−２−アセチルアミノフルオレン基を 核酸の塩基の一つに共有結合させることによる化学修飾された核酸プローブ組成 物を開示している。標的相同核酸配列とのハイブリダイゼーション後、かかるハ イブリダイゼーションは酵素標識抗体を用いることにより検出することができる 。

１９８３年７月７日公告のＫｏｕｒｉｌｓｋｙらによるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／Ｆ Ｒ８２１００２２３号明細書は別の分子または生成物により認識可能な化学物質 を結合するための手段を提供する、修飾リボヌクレオチドのオリゴマーまたは一 本鎖修飾リボヌクレオチドを共有結合させることにより修飾されたＤＮＡ分子を 開示している。

同時係属中で譲渡人が共通の米国特許出願第５７４，６３０号明細書は検出可能 な酵素反応カスケードを開始させるために前駆体を酵素を用いて活性化できるポ リペプチド部分を含むポリヌクレオチド・プローブ組成物を開示している。

１９８２年１１月９日特許されたＦａｌｋｏｖらによる米国特許第４Ｊ５８，５ ３５号明細書は臨床検体中の病原体の存在を該検体を不活性支持体上に沈着させ 、固定しそして標的病原体の遺伝物質を標識核酸プローブに対しハイブリッド形 成することにより検出する方法を開示している。

標識はラジオアイソトープ、リガンド、蛍光発生物質、化学発光物質、酵素また は抗体であってよい。

１９７９年１０月３１日公告のＫｏｕｒｉｌｓｋｙらによる英国特許出願第７９ １３０３１号明細書は検体中のＤＮＡフラグメントの存在を検出する方法を開示 しているが、この方法はハイブリダイゼーション反応に先立ちまたはその後で酵 素に結合されるＲ　Ｎ　Ａプローブと被探索フラグメントとをハイブリッド形成 させることからなっている。標的核酸配列の存在は色原体基質に対する酵素標識 ハイブリダイゼーション生成物の作用により明らかになる。

１９８３年１月２６日の公告のＥｅｌ　ｌｅｒらによる欧州特許出願第８２３０ ３７０１．５号明細書は発光物質標識、一本鎖ポリヌクレオチドを用いる不均質 ハイブリダイゼーション診断方法を開示している。ハイブリッド形成されなかっ た試薬を分離後、検体を曝光する。以後のすべての発光は検体中の標的ポリヌク レオチド量に関係する。標識は任意の周知の発光系であってよい。

１９８２年７月１４日の公告のＨｅ１ｌｅｒらによる欧州特許出願第８２３０３ ６９９．１号明細書は均質発光ハイブリダイゼーション・アッセイを開示してい るが、これは発光物質標識された第一および第二の一本鎖試薬セグメントを生理 学的検体から得られた相捕的な標的一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリッド形成 させて、それによってそれら２つの試薬セグメントの標識間で非放射性エネルギ ー転移を生起させるものである。それら標識のうちの少なくとも一方はアブソー バ−／エミッター型のものとし他方の光標識から吸収された光子の形のエネルギ ーが異なる波長で再発光されるようにしである。このような第二の発光はハイブ リダイゼーションが行われた場合にのみ生起し得る。

１９８５年９月１４日の公告のＡｒｎｏｌｄによるＰＣＴ／ＵＳ８４１０１３５ １号明細書はオリゴヌクレオチド合成のための全体に酸化によって開裂されたプ ライマーを特徴とするオリゴヌクレオチド合成用ポリマー支持体システムを開示 している。

０ｈｔｓｕｋａらはりボオリゴヌクレオチドの合成に有用なウリジン、アデノシ ンおよびシチジンの２’−０−（ｏ−ニトロベンジル）誘導体を開示している。

その２′−エーテルは２′を保護し、そしてかかる２′−エーテル結合は先革安 定であるため生成りボオリゴヌクレオチドを集めることができる。

発明の概要 一つの観点において、本発明は先革安定結合によって固形支持体に結合されたポ リヌクレオチド・プローブ（ＲＮＡとＤＮＡの両方）を提供する。かかる支持体 結合プローブは慣用のサンドイッチ型ハイブリダイゼーション・アッセイに用い て、ついでサンドイッチ対を測定するために光分解により分解させることができ る。あるいはまた、ハイブリッド形成されなかったプローブを光分解で分解させ た後、任意の周知のハイブリダイゼーション・アッセイ方式に用いることもでき る。

もう一つの観点において、ポリヌクレオチド・プローブを結合させた後サンドイ ッチ型ハイブリダイゼーション・アッセイに用いるための支持体結合光不安定プ ライマーが提供される。あるいはまた、かかる固形支持体プライマーを、サンド イッチ型ハイブリダイゼーション・アッセイに用いるための、あるいは次いで光 分解を行って任意の周知のハイブリダイゼーション・アッセイ方式に用いるため のポリヌクレオチド・プローブの「形成」に用いることができる。

本発明の先革安定結合は通常のハイブリダイゼーション条件に対し、そしてまた ポリヌクレオチド合成に必要な条件、例えばＤＮＡプローブ合成の際の環外アミ ノ基および５′−ヒドロキシル基の保護に伴う慣用の「保護」および「脱保護」 などに対し安定であるという長所を有光不安定結合により固形支持体に結合され た本発明のポリヌクレオチド・プローブは式 （式中、ＳＳは固形支持体であり、そして０３′はポリヌクレオチド・プローブ 中のヌクレオチド部分の３′酸素を表わす） で示される。また、そのフェニル環はニトロ基がヌクレオチド部分の３′酸素に 結合された環上にあればナフタレンであってもよい。

固形支持体は多くの重合体支持体であってよい。かかる支持体の例としてはフル オロポリマー樹脂、ポリスチレン樹脂、シリカ、ナイロン、およびグラフト共重 合体などが挙げられ、そして好ましい樹脂には、クロロメチル化およびブロモメ チル化樹脂が包含される。これらの支持体は直径０．１〜２００ミクロンのビー ズ状で用いるのが好ましい。

本発明の支持体結合光不安定プライマーは式（式中、ＳＳは前述のようなフェニ ル環に結合された固形支持体であり、モしてＸはハロゲン例えばＣａまたはＢｒ である） で示される。このプライマーは（以下に例示するような）ポリヌクレオチド・プ ローブの合成あるいは予め合成された（または天然の）ポリヌクレオチド・プロ ーブの結合に有用である。

ポリヌクレオチド・プローブが先革安定結合によって支持体に結合されると、そ れらは約２８０ｎｍ〜３５０ｎｏ＋の波長を有するＵＶ光により分解させること ができる。

下記の実施例から分かるように、分解は３′酸素と隣接ベンジル基との間の結合 で起きる。もちろん、リボヌクレオチドを用いる場合には、２′酸素を同様にこ のような結合の１こめに用いることができる。この分裂は単に後で用いるための ポリヌクレオチド・プローブを収集するために行うことができ、あるいはプロー ブを典型的サンドイッチ型ハイブリダイゼーション・アッセイにおける「捕獲（ ｃａｐｔｕｒｅ）Ｊプローブとして用いた後に行うことができる（この場合「サ ンドイッチ」が計数のために収集される）。このサンドイッチ型ハイブリダイゼ ーション・アッセイを行う方法は例えば米国特許第４，４８６，５３９号明細書 に詳述されている。また本発明は生理学的検体中の標的ポリヌクレオチド・アナ ライトの検出に有用な診断キットにも使用しうるが、そのキットは先革安定結合 により固形支持体に結合された第一のポリヌクレオチド・プローブと第二のポリ ヌクレオチド・プローブとからなり、そして第一および第二のプローブはアナラ イトの実質的に相互に排他的な一本鎖領域に対し、実質的に相補的になっている 。

本明細書中に用いられる用語「標的ポリヌクレオチド・アナライト」は、生理学 的検体中のその存在を検出および／または同定する遺伝要素に相当するヌクレオ チド塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドのセグメントを表わし；用語「実 質的に相補的」とはポリヌクレオチド・プローブとその標的アナライトの間のヌ クレオチド塩基配列相同性が安定なプローブ・アナライトハイブリッドの形成を 可能にするのに十分なことを表わし；用語「生理学的検体」とは対象とするＤＮ ＡまたはＲＮ　Ａを含む、未処理のまたは処理された血液、尿またはその他の生 物学的組織のサンプルを意味し；そして用語「実質的に相互に排他的」とは第一 および第二のプローブを各標的アナライトとハイブリッド形成した際、それら二 つのプローブがハイブリダイゼーションが妨げられる程にはアナライトの同じヌ クレオチド塩基配列をめて競合しないことを意味する。

更にまた本明細書に用いる「ポリヌクレオチド」はリボ核酸（ＲＮＡ）またはデ オキシリボ核酸（Ｄ　Ｎ　Ａ　’）の重合体を表わし、それは一本鎖または二本 鎖であってよく、所望により、ＤＮＡまたはまたＲＮＡ重合体中に取り込むこと のできる合成、非天然、または変えられたヌクレオチドを含むかまたは取り込ま れていてもよい。天然プローブ・ポリヌクレオチドの場合には、かかるプローブ は現在当業者に慣用の方法を用いてプラスミドまたはファージベクター中で標的 ポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチド配列をクローニングまたは増 幅することにより有用な量を都合よく単離することができる。

ＤＮＡ操作の大部分を記載する有用な文献はＭａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９ ８２）であり、その開示を本明細書の記載の一部として引用する。有用な量のプ ローブ・ポリヌクレオチドを製造するためのクローニング、ビヒクルの一例はプ ラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）であるが、それはＲｏｄｒｉｑｕ ｅｚ　ａｔ　ａｌ、、　５ＣＯｔｔ、　ｅｄ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｒｅｃｏａ＋ｂｉｎａｎｔ　ＤＮ Ａ　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７７）　ｐ、 ７２に詳述されている。このプラスミドは１個のＰｓｔ　Ｉ　ｓ　Ｂａａ　Ｉ、 ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩ［Ｉ、およびＳａｌ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ認識部 位および抗生物質テトラサイクリンおよびアンピシリンに対する抵抗性を付与す る遺伝子を含有する。プラスミドＤＮＡは、Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　１１０：　６６７　（１９７２）の方法に従ってクロラムフェニ コール（１７０μ９／峠）の存在下に増殖させることにより増幅可能であり；そ して適当なエンドヌクレアーゼによる消化に先立ち、Ｃｕｅｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１６：　１０６４　（１９７３）の澄明化溶解物操作 （ｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により精製することが できる。例えば、ＰｓｔＩにより消化してアンピシリン抵抗性マーカーを失活さ せ、そしてＰｓｔ　Ｉを用いて同様にして切断されたプローブ・ポリヌクレオチ ドに連結するのに適した「粘性末端」を形成させる。次いで得られた組換えプラ スミドを用いて適当な宿主細菌、例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ１２　Ｈ ＢＩＯＩを形質転換できる。クロラムフェニコールの存在下に増殖させると高い プラスミドコピー数を得ることができ、そしてその組換えプラスミドＤＮＡは前 述のように単離し精製することができる。しかしながら、プローブ・ポリヌクレ オチド産生のための特に好ましいベクターはコリファージ、Ｋ１３、（ＡＴＣＣ １５６８９−ＢＩ）であるが、これはｐＢＲ３２２と同様現在商業的に入手でき る（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂ ｏｓｔｏｎ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）。対象とする標的ＤＮＡに対し相補的な りＮＡおよびファージＤＮＡの消化により得られるＤＮＡ断片は連結し、増幅し た後、レポーター分子、例えばペルオキシダーゼなどの酵素アクチベータポリペ プチドと接合する前に精製することができる。クローニングビヒクルとしてのＫ １３フアージの使用はＭｅｓｓｉｎｇ。

Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈ、　Ｂｕｌｌ、　２　＋　４３．（ １９７９）に記載されているがその開示を本明細書の記載の一部として引用する 。

合成プローブ・ポリヌクレオチドの場合、その合成は文献に記載されている。実 際、ＤＮＡシンセサイザーが商業的に入手できる。これらの合成プローブは約１ ２〜５００ヌクレオチド部分から構成される。塩基残基はポリヌクレオチドが実 質的相補性を有する標的ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成する能力に著し く影響を与えることなく一本鎖ポリヌクレオチドに安定に取り込むことのできる 任意のプリン、修飾プリン、ピリミジンまたは修飾ピリミジン塩基であってよい 。しかしながら本発明に有用なすべての塩基残基に共通する特徴は、任意の周知 のレボ−ティングメカニズムを（好ましくは共有結合により）結合に適した部位 である。すなわち、「古典的な」塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、ウ ラシルおよびチミンのほか、その他、さほど一般的でない塩基、例えば５−メチ ルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、オロチン酸誘導体、メチル化塩基 、例えばｌ−メチルグアニンなどを所望により、本発明のプローブに取り込むこ とができる。更に、ヌクレオチドは所望により、塩基部分または糖部分に連結す ることができそして生成ポリヌクレオチドの相補的標的ポリヌクレオチドとのハ イブリッド形成能に悪影響を与えない種々の置換分を含むことができる。レボ− ティングシステムに接合するのに適した多くのヌクレオチドを含む重合体「末端 」を、一本鎖または二本鎖の３′−ヒドロキシル末端へのデオキシヌクレオチド の付加を触媒する子牛胸腺ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー ゼ（ＴｄＴ）を用いることにより、プローブ・ポリヌクレオチドに付加すること ができる（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　３：　１０１　（１９７６）参照）。

次の実施例は本発明の適用例である。

実施例 クロロメチル化樹脂のニトロ化： ０−ニトロ−クロロメチル重合体の合成を、Ｒ，Ｂ。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　 ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、　８５　：　２１４９−２１５４．１９６８ ）の手順によって行う。

乾燥クロロメチル重合体（コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン、５．０７ミ リ当量Ｃ（ｌ／　９）の５９サンプルを撹拌しながら徐々に５００峠の発煙硝酸 （−１０℃に冷却された９０％ＨＮＯ，”）に添加する。すべての樹脂を添加し 、その混合物を一５℃で１時間撹拌した後砕氷中に注ぐ。その樹脂を焼結ガラス 漏斗を通して濾過し、モして水（２×５００１ｉ２）、ジオキサン（２ｘ　３０ ０１（りおよびメタノール（２×２００１Ｃ）で洗浄する。その樹脂を２時間真 空乾燥しそしてフリーザー中Ｄｒｉｅｒｉｔｅの上で乾燥する。ニトロ化樹脂の 窒素分析を行ってクロロメチル化樹脂の適切なニトロ化を確認する。

５′−〇−ブロックされた２′−デオキシヌクレオシドの〇−ニトロークロロメ チル化樹脂への結合：リボヌクレオシドの２’　−ＯＨ基を０−ニトロベンジル ブロマイドにより保護するためのＥ、０ｈｔｓｕｋａ、　ｓ、　Ｔａｎａｋａ。

Ｍ、　Ｉｋｅｈａｒａ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　４５３−５４．　Ｊｕｌｙ　１９ ７７）の手順により５′−〇−ブロックされたヌクレオシドを０−ニトロ−クロ ロメチル化樹脂に結合させる。

水素化ナトリウム（１４，７８ｊ！ｆＩ／４４０マイクロモル）を血清を用いて 栓をした遠心分離管（１５３！１２）中で秤量し、そしてアルゴン雰囲気下に保 持する。乾燥ジメチルホルムアミド（５ＩＱ）を血清栓を通してシリンジ（５峠 ）で水素化ナトリウムに添加する。水素化ナトリウム／ジメチルホルムアミドの 懸濁液を別のシリンジを用いて抜き取り、アルゴン雰囲気下に乾燥ジメチルホル ムアミド（２峠）中の５′−〇−ブロックされた２′−デオキシヌクレオシドを 含む二頭フラスコに移す。水素ガス発生が止んだら０−ニトロクロロメチル樹脂 Ｃ３４ｘ９／４４０マイクロモル）を少量ずつ添加する。その混合物を室温で３ 時間撹拌し、次いで室温に一夜放置する。その樹脂を焼結ガラスフィルタ漏斗を 通して炉遇しモしてジメチルホルムアミド（２ｉ１２Ｘ２）、水中の９０％ジメ チルホルムアミド（２ＩＩ２×１）およびアセトニトリル（２ｘ１２Ｘ２）を用 いて順次洗浄する。次にその樹脂をデシケータ中で真空乾燥する。

プリン／ピリミジンアミノ保護基、すなわちベンゾイルおよびイソブチリルタイ プの遣損的除去：保護基がプリン／ピリミジン保護基から選択的に除去される間 、ヌクレオシドを樹脂に結合しているエーテル結合がアルカリに対して安定して いるかどうかを試験するために樹脂に結合されたジメトキシトリチルヌクレオシ ドを次の方法によって分析する： 樹脂（１〜２ｘｇ）を濃水酸化アンモニウム（１＋０で処理し、そして加熱ブロ ック内のシールされたガラスアンプル中で５５℃で一夜反応させる。その樹脂を 遠心分離し、そして上澄（水酸化アンモニウム）を別の管に移す。樹脂と上澄の 両方を何ら処理することなく、メチレンクロライド中のトリクロロ酢酸で処理し たとき（上澄はまず蒸発乾個してからメチレンクロライド中のトリクロロ酢酸で 処理する）のジメトキシトリチル陽イオンの遊離に基づくジメトキシトリチルヌ クレオシドの存在について分析する。上澄と比較して樹脂中にジメトキシトリチ ル陽イオンの大部分（９０〜９５％）が存在すると５′がジメトキシトリチルに より保護されたヌクレオシドは依然としてヌクレオシドに結合していることが裏 付けられ、またそれによってヌクレオシドと樹脂の間に形成されたエーテル結合 はプリン／ピリミジンからのアミノ保護基が選択的に除去されるアルカリ処理に 対して安定であることが確認される。

０−ニトロクロロメチル化樹脂を用いたオリゴヌクレオチドの合成： ０−ニトロクロロメチル化樹脂を用いて手操作あるいはホスホラミダイトまたは ホスホトリエステル化学を用いたＤＮＡシンセサイザーでオリゴデオキシヌクレ オチドを合成する。いずれの場合にも前述の手順を用いて合成は最初のデオキシ ヌクレオシド（３′末端）を０−ニトロクロロメチル樹脂に結合させることから 始める。次いで、次のヌクレオシドホスホジエステルまたはヌクレオシドホスホ ラミダイトをその前のヌクレオシドの５’　−ＯＨ末端に結合させることにより オリゴマーの５′末端を介して所望の長さまで鎖を段階的に延長する。所望のオ リゴマーが合成されたら、それを（５５℃で）アルカリ処理に付してプリン／ピ リミジン塩基のアミノ保護基を脱保護することができる。これらの条件下では、 オリゴマーは支持体に固定されたままである。

完全に保護された合成オリゴヌクレオチドの０−ニトロクロロメチル化樹脂への 結合： ０−ニトロ−クロロメチル化樹脂への完全に保護された（　５’　−ＯＨ基およ びプリン／ピリミジンアミノ基が保護された）オリゴヌクレオチドの結合の手順 として、前述のような樹脂への単一ヌクレオシドの結合の手順を用いる。

先革安定支持体からの合成オリゴヌクレオチドの除去： 完成したオリゴヌクレオチドまたはハイブリッド形成させた二本鎖オリゴマーの 先革安定支持体からの分解は、そのサンプルにＲＰＲ−１００装置（Ｒｙａｎｏ ｔｅ、ｔｈｅ　５ｏｕｔｈｅｒｎＣｏ、、　Ｈａｍｄｅｎ、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉ ｃｕｔ）で３２０ｎｍランプを４時間曝射することにより行うことができる。

国際調査報告 ＋ａ′″′ａ″−”−’ＰＣＴノ’：ＪＳ８７／ｎｎＡＥ０

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．光不安定結合により固形支持体に結合したポリヌクレオチド・プローブより なる組成物。
2. ２．光不安定結合により固形支持体に結合したプローブが式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＳＳは固形支持体であり、また０３′はポリヌクレオチド・プローブ中 のヌクレオチド部分の３′酸素を表わす） で示される請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．ＳＳがクロロメチル化樹脂、フルオロポリマー樹脂、ポリスチレン樹脂、シ リカ、ナイロンおよびグラフト共重合体より選択される請求の範囲第２項記載の 組成物。
4. ４．ＳＳがクロロメチル化またはブロモメチル化樹脂である請求の範囲第３項記 載の組成物。
5. ５．式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＳＳは固形支持体であり、そしてＸはハロゲンイオンである） で示される支持体に結合された光不安定プライマーよりなる組成物。
6. ６．ＸがＣｌまたはＢｒである請求の範囲第５項記載の組成物。
7. ７．ＳＳが請求の範囲第３項に定義されたものである請求の範囲第５項記載の組 成物。
8. ８．ＳＳが請求の範囲第３項に定義されたものである請求の範囲第６項記載の組 成物。
9. ９．ＳＳがクロロメチル化またはブロモメチル化樹脂である請求の範囲第７項記 載の組成物。
10. １０．ＳＳがクロロメチル化またはブロモメチル化樹脂である請求の範囲第８項 記載の組成物。
11. １１．光不安定結合により固形支持体に結合された第一のポリヌクレオチド・プ ローブと第二のポリヌクレオチド・プローブとを有し、そして第一および第二の プローブの両者がアナライトの実質的に相互に排他的な一本鎖領域に対し、実質 的に相補的である、標的ポリヌクレオチド・アナライトの検出に有用なキット。
12. １２．光不安定結合により固形支持体に結合されたポリヌクレオチド・プローブ が請求の範囲第２項に記載の式を有する請求の範囲第１１項記載のキット。