JPH074247B2 - 診断キット、プライマー組成物および核酸の複製または検出のためのそれらの使用 - Google Patents

診断キット、プライマー組成物および核酸の複製または検出のためのそれらの使用

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JPH074247B2
JPH074247B2 JP2097790A JP9779090A JPH074247B2 JP H074247 B2 JPH074247 B2 JP H074247B2 JP 2097790 A JP2097790 A JP 2097790A JP 9779090 A JP9779090 A JP 9779090A JP H074247 B2 JPH074247 B2 JP H074247B2
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イーストマン コダック カンパニー
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、プライマー組成物および診断試験キットな
らびに試験検体における標的核酸の複製または検出への
それらの使用に関する。この発明は、各種の医療および
調査研究、法医学上の捜査ならびに遺伝子疾患または感
染症の検出のような診断法において使用することができ
る。
〔従来の技術〕
研究者が試験試料中に極めて少量存在する各種の疾患、
生物体または遺伝子の特徴を検出するについて核酸プロ
ーブ法の価値を見い出したように、その方法は近年急速
に発展してきた。プローブの使用は相補性の概念に基礎
を置いている。例えば、DNAは二本鎖であり、これらの
鎖は相補的ヌクレオチド（また、ヌクレオチド対として
も知られている）間の水素結合によって相互に結合して
いる。
DNA複合体は、一般に安定であるが、水素結合が崩壊す
る条件によって分離（または変性）することができる。
遊離した一本鎖はヌクレオチドの相補的配列を有する別
の鎖とのみ再会合しうる。このハイブリッド化の進行は
溶液中または固体支持体上で起こりうる。RNAは通常一
本鎖である。これもまた、相補的なヌクレオチド配列を
有する。他の鎖またはその一部とハイブリッド化しう
る。
標的生物体または細胞のDANまたはRNAの標的核酸配列
は、鎖全体のほんの小さな部分をなすにすぎないので、
殆どの既知標識プローブを使用してその存在を検出する
ことは非常に困難である。この課題を解決するためにプ
ローブの感度の改良や核酸合成を包含する多くの研究が
行われてきた。
当該技術分野の重要な進歩は、米国特許第4,683,202号
明細書に記載される方法である。この方法に関してそれ
程詳細ではないが、それはプライマーが重合試薬（例え
ば、ポリメラーゼ）および４種のヌクレオシド三リン酸
の存在下で核酸鋳型にハイブリッド化され、次いでエク
ステンション生成物がそれらのプライマーから形成され
る増幅技法である。これらの生成物は変性されそして存
在する核酸の数と量を増幅する循環反応における鋳型と
して使用され、それに続くそれらの検出を助ける。マリ
ス（Mullis）の増幅方法は、少量の標的核酸配列から多
量の検出可能な物質を生成するのに必要なだけ何度も繰
り返えされうる。
〔発明が解決しようとする課題〕
米国特許第4,683,202号の方法では、増幅される標的核
酸の各鎖について２種のプライマーが使用されている。
増幅に関する最良のケースでは、増幅せしめられる核酸
配列が、少なくとも標的配列の３′末端近傍でプライマ
ーと完全に相補的である。従って、効果的な増幅にとっ
て鎖当たり１種のプライマーが必要とされるにすぎな
い。マリスの特許からは、少なくとも３′末端において
標的配列が完全に知られていない場合、完全に相補的で
ある少なとも１種のプライマーを有する目的で可能なす
べてのコドンの変種を有するプライマーのコレクション
を使用できることが知られている。このようなプライマ
ーは、増幅される鎖の末端と100％の「相同性」を有す
るといわれている。
この方法は、ときには目的の増幅工程が達成されるかも
知れないが、別の例では能率的でないかまたは有効でな
いかも知れない。成行き任せのプライマーコレクション
の調製は、不経済でありかつ競合性の無伸長プライマー
類の使用をもたらす。さらに、標的ヌクレオチド配列の
不安定さが大きい場合には、必要とされるプライマーコ
レクションは膨大になる。
標的配列とプライマーとの間のミスマッチは、特に標的
配列が完全に同定されえない場合には全く避けることが
できない。レトロウイルス由来のプロウイルスDNAの検
出のようなその他の例では、標的核酸は高度に可変性で
あり、完全な同一性が持続されえない。HIV-Iでは、ゲ
ノムにおける配列の多様性が生存可能なウイルスを作出
する。塩基の置換は、無傷のゲノム上でランダムにそし
てそこかしこで頻繁に起こることが知られている。従っ
て、単離物は各種の核酸配列を有するプロウイルスDNA
をもつであろう。
このようなミスマッチは、プライマーによる増幅効率を
相当低下させるであろう。言い換えれば、ミスマッチ
は、プライミング（priming）の動力学やプライマーエ
クステンションが変化してしまうので増幅工程の減退を
もたらす。最悪の場合には、標的にプライマーが付着す
るのに失敗するので全く増幅が起こらないか、またはそ
れが付着する場合でもエククテンション生成物の形成は
阻止（すなわち、「不発」プライマー）されるであろ
う。
たとえ標的配列とその配列に対する既知のプライマーと
の間でミスマッチの恐れがあろうとも核酸配列を増幅す
るための有効な手段を入手することが望まれるであろ
う。
〔課題を解決するための手段〕
前述の課題は、所定の標的核酸の増幅または複製に有用
なプライマー組成物であって、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に相補
的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｂ）標的核酸の追加の核酸配列に少なくとも実質的に
相補的である少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチ
ドプライマーであって、下記（ｉ）〜（iv）群のいずれ
かであるもの： （ｉ）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
ーよりも短く、かつ第一および追加のプライマーの５′
末端の塩基が同一であるもの、 （ii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
ーと同じ長さであり、かつ追加のオリゴヌクレオチドプ
ライマーの各々が少なくとも１つの塩基で第一オリゴヌ
クレオチドプライマーと重複するもの、 （iii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特
異的核酸配列に直接隣接するもの、または （iv）前記標的核酸の追加と核酸配列が１つ以上のヌク
レオチド塩基によって前記第一の特異的核酸配列から離
れているが、追加のプライマーがその第一の特異的核酸
配列に相補的なプライマーエクステンション生成物を形
成可能であるもの、 の水性混合物を含んでなるプライマー組成物の使用によ
って解決される。
この発明は、また、所定の標的核酸の増幅または複製に
有用な診断試験キットであって、 （ａ）前記第一プライマー、および （ｂ）前記のような少なくとも１種の追加のプライマ
ー、 を含んでなる診断試験キットを提供する。
更に、所定の標的核酸の検出方法は、 A.標的核酸を含有することが予測される被検体を、前記
プライマー組成物と接触させて、プライマーと標的核酸
とのハイブリッド生成物の混合物を形成させる段階、 B.少なくとも１つのハイブリッド生成物についての第一
のプライマーエクステンション生成物を形成させ、その
第一プライマーエクステンション生成物をプライミング
および伸長させ、そして第一プライマーエクステンショ
ン生成物を増幅させる段階、 C.得られたプライマーエクステンション生成物を分離
し、次いでそれらを検出可能なオリゴヌクレオチドプロ
ーブと接触させて、検出可能な相補的生成物を形成せし
める段階、および D.被検体中における標的核酸の存在の指標として、前記
検出可能な相補的生成物を測定する段階、 を含んでなる標的核酸の検出方法を提供する。
この発明によれば、また、所定の標的核酸の増幅方法で
あって、 A.複製する所定の標的核酸を含有する被検体を調製する
段階、 B.調製した被検体を、前記プライマー組成物と接触させ
て、プライマーと標的核酸とのハイブリッド生成物の混
合物を形成させる段階、 C.少なくとも１つのハイブリッド生成物についての第一
プライマーエクステンション生成物を形成させ、その第
一プライマーエクステンション生成物をプライミングお
よび伸長させる段階、 を含んでなる標的核酸の増幅方法も提供される。
以下、この発明をより具体的に説明する。
この発明は、試験検体における１種以上の標的核酸中に
存在する１種以上の特異的な核酸配列の複製、増幅また
は検出に向けられる。このような試料としては、細胞ま
たはウイルス体、毛髪、体液または検出されうる遺伝子
DNAもしくはRNAを含有する他の物質を挙げることができ
る。検出の主要な目的が事実上診断にあるとはいえ、こ
の発明はクローニングDNAもしくはメッセンジャーRNAの
能力の改良または化学合成で得られる核酸混合物から目
的の配列を多量に得る目的にも使用することができる。
この発明は、含まれる反応工程の数に比例して指数的量
で少なくとも１種の特異的核酸配列を生成するための連
鎖反応と組み合わされた場合に特に有用である。この生
成物は、使用される特異的なプライマーの末端に対応す
る末端を有する個々の二つに相補的に結合した核酸（核
酸duplex）であるであろう。精製されているかまたはさ
れていないどのような核酸源も提供される出発原料とし
て利用することができ、それは検出の目標とされる特異
的核酸配列を含むかまたは含むことが予測される。必要
により、核酸混合物を使用することができる。複製せし
める配列は断片または完全な核酸であることができる。
さらに、１種の核酸配列をより多くを、特殊な１セット
のプライマーの使用によって同時に増幅することがで
き、そして増幅せしめる各配列についてプローブで標識
することができる。これらの配列は、同一または相違す
る核酸であってよい。
核酸は、プラスミド、いずれかの起源（例えば、酵母、
ウイルス、植物および高等動物、ヒト）に由来する天然
のDNAまたはRNAを含む各種起源から得ることができる。
それは血液、末梢血単核細胞（PBMC）、組織物質または
既知方法を使用する当該技術分野で既知の他の起源を含
む各種組織から抽出されうる。この発明は、ゲノムDN
A、細菌DNA、ウイルスDNAまたは細菌もしくはウイルス
感染細胞に見い出されるDNAもしくはRNAのようなウイル
スまたはすべての生物体細胞に見い出される核酸配列の
検出に有用である。就中、この発明はHIV-Iまたは他の
レトロウイルスによって感染された細胞に由来するウイ
ルスDNAの検出に有用である。
本明細書で使用される場合、検出されるためのプライマ
ー、プローブまたはオリゴマー断片に関連する「オリゴ
ヌクレオチド」の語は、２個以上好ましくは３個以上の
デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから
なる分子をいう。正確なサイズは限定的でないが、その
オリゴヌクレオチドの主な用途または機能を含む多くの
因子に依存する。オリゴヌクレオチドは、合成的または
当該技術分野で既知の他の方法によって得ることができ
る。
「プライマー」の語は、核酸鎖に相補的なプライマーエ
クステンション生成物の合成が誘導される条件下に置か
れた場合に合成の開始点として作用しうる天然または合
成的に生成されるオリゴヌクレオチドをいう。このよう
な条件には、ヌクレオチド（例えば、４種の標準的なデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸）およびDNAポリメラ
ーゼのような重合用試薬、ならびに適当な温度およびpH
の存在が包含される。
この発明の組成物は、標的核酸の第一の核酸配列に実質
的に相補的である第一オリゴヌクレオチドプライマーを
有する。「実質的に相補的」とは、プライマーが標的核
酸の第一の核酸配列とハイブリッドする核酸配列中の対
応する塩基とマッチするのに十分な数の塩基がプライマ
ー上に存在することを意味する。しかしながら、すべて
の塩基対がマッチしうることを意味しない。事実上、こ
の発明は、プライマーエクステンションを起こしうるこ
とが望まれる前記第一プライマーの特に、３′末端また
はその近傍において１以上のミスマッチが存在する場合
に生ずる課題を解決することが意図されている。この発
明はまた、全くミスマッチが存在しない場合にも十分に
適用できることが理解されている。このようなミスマッ
チがどこで起こりうるかは必ずしも予測できない。
この発明の実施に際し、使用されるプライマー類（第一
および追加のプライマーの両者）のいずれかは、一本鎖
領域に隣接する核酸が標識された二本鎖を含むことがで
きる。この一本鎖領域は、それとともにハイブリッド化
するための鋳型鎖に十分に相補的である核酸配列を含
む。プライマーの二本領域または尾部は、検出可能なシ
グナルを生じうるか、あるいはエクステンション生成物
を捕捉もしくは固定するのに利用しうる検出可能な成分
で標識することができる。
別の好ましい態様では、プライマーが完全に一本鎖であ
る。好ましくは、プライマーが一本鎖オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドである。各プライマーの正確なサイズ
は、考慮されている使用、標識配列の複雑さ、反応温度
およびプライマー起源により大きく変りうる。一般に、
この発明で使用されるプライマーは、15〜50個のヌクレ
オチド、好ましくは20〜30個のヌクレオチドを有するで
あろう。
この発明で使用されるプライマー類は、増幅せしめる各
特異的配列のそれぞれの鎖に対して「実質的」に相補的
となるように選ばれる。このことは、それらがそれらの
個々の鎖とハイブリッドして目的のハイブリッド化生成
物を形成するのに十分相補的であらねばならないことを
意味する。理想的な状況下では、標的核酸に対して的確
な相補性を有するであろう。しかしながら、多くの状況
下では的確な相補性は可能でないかおそらく不可能であ
り、そしてそのプライマーが不十分なハイブリッド化を
引き起こすか、またはたとえプライムされたとしても、
エクステンション生成物の形成において非常に能率が悪
い（すなわち、エクステンション中のプライマーへの第
一の塩基が付着する速度が遅い）かもしくは全く起こら
ないか、のいずれかを引き起こしうる１以上のミスマッ
チが存在する可能性がある。
この発明で利用できるプライマーは、数多くの供給源か
ら入手できるか、あるいは既知の技法および装置、例え
ば、ABI DNA Synthesizer（Applied Biosystemsから入
手可）またはBiosearch 8600 Seriesもしくは8800 Seri
es Synthesizer（Milligen-Biosearch,Inc.より入手
可）およびこれらの使用についての既知の方法を使用し
て調製することができる。生物学的起源から単離された
天然由来のプライマー類（例えば、制限エンドヌクレア
ーゼ消化物）もまた使用可能である。
この発明の実施には、前述の第一プライマーを含むプラ
イマー組成物および１種以上の追加のオリゴヌクレオチ
ドプライマーの使用を必要とする。これらの追加のプラ
イマーは、特定の第一プライマーに対する核酸に関連す
る核酸配列と実質的に相補的である。言い換えれば、第
一プライマーは第一の配列に相補的である。４種の追加
のプライマーが存在する場合には、それらは一定の態様
（後述する）に関連する４種の追加の核酸配列に対して
実質的に相補的である。
これらの追加のプライマーは、前述のように誘導または
調製することができ、所期の目的について適当なサイズ
を有する。いくつかの態様（より詳細については後述す
る）では、プライマーのサイズを、特に第一プライマー
に関して設計してもよい。
追加のプライマーが相補的である核酸配列は、１以上の
次の関係において第一プライマーの核酸配列と関連付け
られる。
ｉ）第一の特異的核酸配列の一部のみを含むか、 ii）その第一の特異的核酸配列に直接隣接するか、ある
いは iii）１以上のヌクレオチド塩基によって前記第一の特
異的核酸配列から離れているが、追加のプライマーがそ
の第一の特異的核酸配列に相補的なプライマーエクステ
ンションを形成しうる。
また、この発明の実施に際して前記（ｉ）〜（iii）の
各カテゴリーの１以上を含む多様な追加のプライマーも
使用することができる。
第一プライマーに対する追加のプライマーのこれらの関
係は、第１〜６図を参照することによってよく理解する
ことができる。これらの全ての図面において、核酸は不
定の長さを有する水平の直線（ヌクレオチドについて）
で簡単に示され、垂直線によって反復核酸主鎖から伸び
る個々の塩基が示される。このような垂直線は、個々の
塩基または塩基対（二本鎖もしくはプライムされた一本
鎖が示される場合）を示すことができる。プライマー
は、３′末端からのプライマーエクステンションの方向
を表す破線矢印で簡単に示されている。まず最初に、第
１図は、米国特許第4,683,202号明細書により詳細に記
載されている既知の増幅工程を非常に単純化した略図的
に図示したものであることに注意しなければならない。
一般に、この方法では、各鎖に対して、迅速かつ効率的
な増幅を得るのに、目的の核酸配列に実質的に相補的で
ある１種のプライマーが必要であるにすぎない。
第２〜６図は、この発明の数種の態様を略図的に図示す
る。別の態様も可能であり、そしてこの発明の範囲内に
包含されることを理解しなければならない。さらに、図
示された標的核酸配列とプライマーは、相当短く示して
いるが、それらは単に例示であって、それらがいずれか
適当な長さのヌクレオチド塩基であってもよい。
第２図は、前述のカテゴリー（ｉ）の態様を図示してお
り、こごでは追加のプライマー類が第一の核酸配列の一
部とのみ相補的である。この例では、追加のプライマー
類が第一プライマーと同様にそれらの５′末端近傍に同
一の塩基配列を有するが、相互の間で２つの塩基による
長さが相異する。この塩基の変動はこの略図において任
意である。それらは、１個、３個または他の数の塩基に
よっておそらく変りうるであろう。各プライマーの５′
末端における塩基は、この態様において同一である。好
ましい態様では、これらのプライマーが前記第一の配列
の範囲内に完全に入る核酸配列に相補的である。
第３図は、前述のカテゴリー（ｉ）のもう一つの態様を
図示しており、ここでは追加のプライマー類が第一プラ
イマーと同一の長さを有するが、それらは第一の核酸配
列の一部と相補的であるにすぎない。さらに、それらは
少なくとも１個の塩基で第一プライマーと重複する。図
示された追加のプライマー類は、３個の塩基によってそ
れぞれ他のものから移動されているように示されている
が、第一プライマーと少なくとも１個の塩基の重複が存
在する限りいくらか別の数の塩基によってそれらが同様
に移動していてもよい。好ましい態様では、単一の塩基
によって移動される配列と各追加のプライマーが相補的
である。
第４図では、前述のカテゴリー（ii）の態様を図示して
おり、ここでは追加のプライマーが第一プライマーに関
する配列に「直接隣接する」核酸配列と相補的である。
その略図に記載されるように、この意味は、追加のプラ
イマーの３′末端が第一プライマーの５′末端と相補的
な塩基から一塩基離れた標的配列の塩基と相補的な一の
塩基を有する。それらの全てが３′末端で同一塩基を有
する限り１を越える追加のプライマーを使用することが
できる（図示していない）。
第５図は、前述のカテゴリー（iii）に入るさらなる態
様を図示している。これらの１以上の追加のプライマー
は、１以上の塩基が前記第一配列から除去された核酸配
列と相補的である。しかし、たとえ数個の塩基が除去さ
れている場合であっても、これらの追加のプライマーの
少なくとも１つは、未だ第一の核酸配列に相補的なプラ
イマーエクステンション生成物を形成しうる。一般に、
このことは少なくとも１つの追加のプライマーが第一プ
ライマーの核酸配列から50キロダルトン未満離れた核酸
配列に相補的でありうることを意味する。これらの追加
のプライマーの選択は、予期されたミスマッチ上でエク
ステンション生成物を形成しうるものを見い出すために
幾つかの日常実験が必要であるかも知れない。しかしな
がら、このような実験は当業者の範囲内で周知であろ
う。第５図における二重破断線は、追加のプライマーが
具体的に示された３個の塩基より多く離れていることを
示す。
第６図では、前述の３つのカテゴリー（ｉ）〜（iii）
全てに由来する追加のプライマーを利用する態様が図示
されている。追加のプライマーのあるものは第一の配列
の一部に重複する核酸配列に相補的であり、図示された
プライマーの一つは「隣接」配列を有し、そしてさらに
もう一つは３つの塩基で離れた配列を有する。追加のプ
ライマーの他の混合物は、本明細書の教示によって設計
しそして使用することができる。
この発明の好ましい組成物は、第２図または第３図に図
示されるようなもののいずれかである。
この発明の組成物および方法において、第一プライマー
および追加のプライマーそれぞれの濃度は、0.001〜99.
999モル％で変動しうる。組成物におけるこれらのプラ
イマーの正確な濃度は、それらのプライマーの具体的な
関係に依存する。例えば、第２図に示される組成物で
は、最も短いプライマーは最大濃度で存在せしめること
が好ましい。従って、より大きなプライマーがエクステ
ンション生成物を効率的に形成する場合であっても、よ
り短いプライマーが後の増幅サイクルにとって利用でき
るであろうし、こうすることでこの方法の能率は一層改
良される。一般に、他の態様では、前記プライマー類が
等しい濃度で存在する。
この発明の組成物は、所定の核酸の複製にとって有用で
ある。このような手順の最初の工程は、複製のための標
的核酸を含有する被検体を調製するものである。通常、
このことは被検体から適当な方法によって不要なタンパ
ク質および細胞物質を除去することを意味する。Laure
らによってThe Lancet,538〜540ページ（1988年９月３
日）やGross-BellandらによってEur.J.Biochem.,36,32
ページ（1973）に記載されるものを含む多様な方法が当
該技術分野で既知である。
被検体が調製されたならば、プライマーのハイブリッド
化生成物と標的核酸との混合物が形成されるような条件
下でそれがこの発明の組成物と接触される。このような
条件は、米国特許第4,683,202号明細書に記載されるよ
うな増幅のために通常使用されるものである。次に、プ
ライマーエクステンション生成物が少なくとも１つのハ
イブリッド化した生成物によって形成され、次いで追加
のプライミングおよびエクステンション生成物の形成が
なされる。変性（すなわち、相補的生成物の分離）後、
複製された標的核酸が反応混合物から標準的な方法およ
び装置を使用して単離されうる。
好ましい態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（下記に詳述
する）を使用して標的核酸のさらなる増幅を含む。標的
核酸の複製は、遺伝子もしくは遺伝子断片の調製または
ゲノムDNAの配列決定にとって有用であるかも知れな
い。
この発明はまた、２つの相補鎖を有する特異的核酸の検
出にとっても有用である。目的の核酸配列の殆どはほぼ
二本鎖（例えば、DNAに見られるもの）である。しかし
ながら、mRNAのような一本鎖核酸配列は、それが逆転写
酵素を用いて二本鎖配列に転換された後に容易に検出さ
れうる。
特異的核酸配列は、鋳型としてその配列を含有する核酸
を使用して生成される。その酸が２つの鎖を含む場合に
は、別々の工程としてかまたはプライマーエクステンシ
ョン生成物の形成と同時にそれらの鎖を分離することが
必要である。変性は、従来技術文献に記載されるような
いずれか適当な物理的、化学的または酵素的手段を使用
して行うことができる。適当な温度まで加熱することが
好ましい手段である。
分離された鎖が使用にとって利用可能になれば、追加の
核酸の鎖の合成は、一般にpH7〜９に緩衝化された水性
溶液中で、この発明のプライマー組成物を使用して実施
することができる。相補的なDNA鎖に対するプライマー
もまた含めることもできる。好ましくは、過剰モル濃度
のプライマーが緩衝液に加えられ、具体的量は従来技術
文献（例えば、米国特許第4,683,202号明細書）で教示
されている。デオキシリボヌクレオシド三リン酸類dAT
P,dCTP,dGTPおよびdTTPもまた適当な量で前記合成混合
物に添加され、得られた溶液は90〜100℃で10分未満、
好ましくは１〜４分間加熱される。この加熱後、溶液
は、好ましくは室温まで冷却され、次いでプライマーエ
クステンション生成物の形成も誘導する（または触媒す
る）のに適する試薬が導入される。当該技術分野でこの
誘導試薬は、重合試薬として一般に知られている。これ
らの生成物を形成するための反応は、既知の条件（一般
に、室温からもはや重合が起こらなくなるまでの温度）
下で行われる。
重合試薬は、酵素〔例えば、E.コリー（E.coli）DNAポ
リメラーゼＩ、T4 DNAポリメラーゼ、Klenowポリメラー
ゼ、逆転写酵素および当該技術分野で既知の他の酵素〕
を包含するプライマーエクステンション生成物の合成を
行うように作用しうるいずれかの化合物または試薬の組
み合わせであることができる。特に有用な酵素は、クロ
ーン化または天然起源の熱安定性酵素、例えば各種のサ
ーマル（Thermus）属細菌種から得られるものである。
他の重合試薬は米国特許第4,683,202号明細書に記載さ
れている。
好ましい熱安定性酵素は、ヨーロッパ特許公開第258017
号公報に記載されるようなサーマス・アクアティクス
（Thermus aquaticus）由来のDNAポリメラーゼである。
他の有用な酵素は、RossiらによってSyst.Appl.Microbi
ol.７（2-3）,337〜341ページ、1986に記載されてい
る。多くの有用なポリメラーゼは市販されている。一般
に、エクステンション生成物の合成は各プライマーの
３′末端で開始され、合成が停止されるまで鋳型に沿っ
て５′から３′の方向に進められるであろう。幾つかの
重合試薬（例えば、逆転写酵素）は、鋳型に沿って３′
から５′の方向に進める場合もある。
新に合成された鎖とそれらの個々のプライマーを含んで
なる新に形成されたプライマーエクステンション生成物
は、この方法の次の工程で使用される最初の標的鎖を有
する二本鎖分子を形成する。次に、前述のようにこれら
の鎖を変性することにより分離して一本鎖分子を提供
し、前述のようにこれによって新な核酸を合成する。場
合によって追加の試薬が増幅工程の進行を持続するため
に必要であるかも知れない。この工程後、殆どのエクス
テンション生成物はプライマー類によって結合された特
異的核酸配列（すなわち、相補的生成物）から成るであ
ろう。
鎖の分離とエクステンション生成物合成工程は、必要に
よってしばしば繰り返えされて、使用、例えば検出に必
要な目的量の特異的核酸を生成することができる。一般
的に、一連の工程は最低１度は繰り返えされ、好ましく
は最低10〜50回繰り返えされる。
第一の核酸またはそれらの混合物に由来する１より多く
の特異的核酸を生成することが望まれる場合には、前述
の一般的方法において適当な数組のプライマーが使用さ
れる。
少なくとも１個のプライマーエクステンション生成物が
生じた後、この発明の方法のいずれかの時点でその生成
物は検出可能に標識されたプローブ（後述）とハイブリ
ッド化されうる。プローブとエクステンション生成物の
この接触は、この方法と期間中のいずれか適当な時期に
起こりうる。
一般的に、目的の核酸配列の所定量が生じたならば、最
終的な時期にこれらのプライマーエクステンション生成
物が分離され、第一プライマーエクステンション生成物
（すなわち、この発明のプライマー組成物を使用して形
成されるもの）が、検出の目的で標識されそして生成物
を形成するようにそれらに相補的である。オリゴヌクレ
オチドと接触される。このプローブは、標的核酸配列と
相補的である核酸配列である。これらのプローブはいず
れか適当な長さの核酸であることができるが、好ましく
は、それらは15〜40個の核酸を有する。それらは、いず
れか適当な（直接的にかまたは間接的に）検出可能な物
質で（通常、５′末端において）標識される。標識を付
着し、そしてプローブを調製する方法は、例えばAgrawa
lらによってNucleic Acid Res、，14,6227〜45ページ
（1986）やプライマーに特異的にバインドするリガンド
を付着する前記引例に記載されるような従来技術で周知
である。利用可能な標識としては、放射線同位体、電子
稠密体、発色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよ
び他の磁性粒子、化学発光成分ならびに酵素（このもの
が好ましい）が挙げられる。有用な酵素としては、グル
コースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、
アルカリホスファターゼおよび当該技術分野で既知の他
の酵素が挙げられる。このような酵素に対する基質や色
素生成組成物は周知である。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであ
り、アッセイのある時点で過酸化水素と適当な色素生成
組成物が加えられて検出可能な色素を提供する。例えば
有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジジン
やその誘導体、ならびに米国特許第4,089,747号明細書
に記載されるトリアリールイミダゾールロイコ染料のよ
うなロイコ染料またはペルオキシダーゼと過酸化水素の
存在下で反応して色素を供給する他の化合物が挙げられ
る。特に有用な色素生成組成物は、特開平１−100453号
公報に記載されている。
相補的生成物中に存在するプローブの存在の検出は、適
切かつ既知の検出装置および手順を使用して達成するこ
とができる。特定のプローブは検出装置を使用すること
なく目視できる。適当な容器中で実施することもこの方
法にとって有用である。最も簡単な容器は、試験管、フ
ラスコまたはビーカーであるがより精巧な容器はこの方
法を行うための自動化手順を促進するように形造られて
いる。例えば、方法を実施する間一定の温度特性を提供
するように構成されたキュベットは、1989年10月24日付
で公開された特開平１−266858号公報に記載され特許請
求されている。他の有用な容器は、この発明の方法の自
動化または一回使用を目的に作製することができる。
相補的生成物中のプローブを検出するためには、反応媒
体中の他の物質から相補的生成物を分離することがしば
しば重要になる。これは、この方法で複製されるプライ
マーエクステンション生成物およびそれにプローブが付
着したものを試薬混合物から除去するようにプライマー
上に捕捉する手段を含む各種方法のいずれかによって行
われる。プライマーは適当な方法で不溶性材料に付着す
ることができるか、あるいはそれらか捕捉されるように
設計することができる（すなわち、この方法のある時点
で捕捉手段と反応する）。
有用な捕捉手段の１つは、不溶性材料に適当な方法で結
合されている受容体分子（例えば、アビジン、抗原体ま
たは糖）に特異的にバインディングしうるプライマーに
付着した特異的バインディングリガンド（例えば、ビオ
チン、抗体またはレクチン）を有するプライマーを使用
する。得られる不溶化複合生成物は、未複合物質から濾
過、遠心または適当な分離技術によって分離することが
できる。
特に有用な分離手段は、ポリアミド膜のような微孔質濾
過膜である。それらは、未被覆であるかまたは界面活性
剤もしくは分析手順を促進する他の物質で予備被覆され
ていてもよい。
これらの膜は、アッセイの他の工程を実施するのに適す
る容器と共に分離支持体として使用することができる。
しかしながら、好ましくは、前述したように試験装置の
一部としてそれらが固定される。米国特許第3,825,410
号、同3,888,629号、同3,970,429号および同4,446,232
号明細書に記載されるものを含む各種の試験装置が当該
技術分野で知られている。特に有用な装置は、1988年９
月18日付で出願した特願昭63−234692号明細書に記載さ
れている。
微量滴定板、試験管、ビーカー、ビーズ、フィルム、メ
ンブラン・フィルター、瀘紙、ゲル、磁性粒子またはガ
ラスウールを包含するいずれかの有用な固体支持体を検
出のための生成物分離に使用することができる。それ
は、ガラス、セラミックス、金属、天然または合成ポリ
マー、セルロース材、濾過材および当業者に容易に明ら
かとなる他の材料を包含する数多くの材料で作製するこ
とができる。特に有用な固体支持体材料は、一般に平均
して0.1〜10μｍの粒子サイズを有するポリマー粒子で
ある。有用なモノマー類、それらの製造方法および受容
体分子の取り付けを包含する前記の好ましいポリマー粒
子についてのより詳細は、1989年３月１日付で公開され
た特開昭64-54258号公報に示されている。
本明細書に記載される方法を使用して、感染症、遺伝子
疾患またはガンのような細胞性疾患に付随する特異的核
酸の検出または特性決定に供することができる。それは
また、法医学捜査およびDNA類別化に使用されるかも知
れない。この発明の目的とする遺伝子疾患としては、鎌
状赤血球貧血、嚢胞性線維症、α−サラセミア、β−サ
ラセミアおよび当業者に容易に明らかとなる他の疾患の
ような、いずれかの生物体に由来するヒトのゲノムDNA
の特異的な欠損または変異が挙げられる。ヒト白血球抗
原（HLA）の存在はこの発明によって検出できる。各種
感染症は、生物体（それが酵母、細菌またはウイルスで
あるかどうかにかかわらず）を特性付ける少量の特異的
なDNA配列を有する細胞の存在によって診断することが
できる。このような検出されうる細菌としては、限定さ
れるものでないが、サルモネラ（Salmonella）、クラミ
ジア（Chlamydia）、ゴノローエ（Gonorrhea）、シゲラ
（Shigella）およびリステリア（Listeria）が挙げられ
る。検出可能なウイルスとしては、限定されるものでな
いが、ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン
−バールウイルス、肝炎ウイルスならびにHTLV-1および
HIV-Iのようなレトロウイルスが挙げられる。原生動物
寄生体、酵母およびカビもまた検出可能である。他の検
出可能な種は、当業者にとって容易に明らかであろう。
この発明は、ウイルスDNAの存在を検出することによっ
て試験試料中のHIV-Iのようなレトロウイルスの検出に
とって特に有用である。
この発明の診断試験キットは概括的に前述してきた。キ
ットの主要な構成要素には、前述される第一オリゴヌク
レオチドプライマーおよび１種以上の追加のプライマー
が含まれる。このキットは、目的の各核酸配列に対する
一組のプライマー類を含んでもよい。
好ましくは、このキットはまた、DNAポリメラーゼ（例
えば、サーマス・アクアティクス由来のポリメラーゼ）
のようなプライマーの重合用試薬、４種のデオキシリボ
ヌクレオシド三リン酸（dATP,dCTP,dGTPおよびdTTP）、
検出可能なプローブ、プローブが酵素または前述のよう
な不溶性支持体で標識される場合には色素生成組成物を
独立した容器に通常それぞれ入れられる。
このキットの構成要素は、適当な形態で梱包され、多数
の任意の構成要素、例えば、ピペット、キュベット、説
明書、緩衝剤、洗液、希釈剤ならびに、この発明の実施
に際して利用できる他の試薬、材料および備品を含むこ
とができる。これらの追加の構成要素は当該技術分野で
周知である。
〔実施例〕
以下の例は、この発明の実施を具体的に説明するための
ものであって、この発明をいずれかの方法に限定するこ
とを意味しない。
例２で使用されるDNAポリメラーゼは市販されていた。
それは、サーマス・アクアティクス（Thermas aquaticu
s）から単離されたものであって、2.5単位／μｌの活性
を有していた。ここで、１単位は、74℃にて30分以内で
10ミリモル濃度のdNTPがプライマーエクステンション生
成物に取り込まれるために必要とされる量を表す。
電気泳動に使用される「移動相緩衝剤」（pH8）は、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（89ミリモル濃
度）、ホウ酸（89ミリモル濃度）およびエチレンジアミ
ン四酢酸（２ミリモル濃度）からなる。
試料調製 HIV-Iウイルスを保有する恐れのある患者から採取した
全血試料（100μｌ）を水性デキストラン溶液（250μ
ｌ、24,000の分子量を有するデキストラン３重量％）を
含有する試験管に加え、この試験管を反転させることに
よって混合した。室温で５分後、上澄を別の試験管に移
し、100℃で５分間加熱した。次に、この混合物を数秒
間遠心し、増幅に使用する目的で用意した別の試験管へ
上澄を移した。この方法は、同時係属中の特許出願明細
書（1989年４月17日付の米国特許出願第339,437号およ
び1989年９月17日付の部分継続出願第406,222号明細書
に対応）で詳細に記載されるように標的ウイルスDNAを
抽出した。
例１ HIV-I DNA検出のためのプライマー組成物 例２で使用する目的でこの発明の２種のプライマー組成
物を下記のように調製した。これらの組成物は各５個の
プライマーの２セットからなっていた。
各５個のプライマーの２セットを標的DNAの２つの鎖用
として調製した。これらの相同性プライマーセットは、
A,A1,A2,A3およびA4、ならびにB,B1,B2,B3およびB4とし
て下記に特定される。ＡプライマーとＢプライマーの配
列は、LaureらのThe Lancet（前述）から入手した。当
該技術分野で標準とされているように、個々のヌクレオ
チド塩基は略号で特定した。すなわち、アデニン
（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン
（Ｃ）である。これらのプライマーは次のヌクレオチド
配列を有していた： プライマーＡ（＋）、25塩基:5′−TGGGAAGTTCAATTAGGA
ATACCAC−３′ 追加のプライマー（＋）:A1、24塩基:5′−TGGGAAGTTCA
ATTAGGAATACCA−３′ A2、23塩基:5′−TGGGAAGTTCAATTAGGAATACC−３′ A3、22塩基:5′−TGGGAAGTTCAATTAGGAATAC−３′ A4、21塩基:5′−TGGGAAGTTCAATTAGGAATA−３′ プライマーＢ（−）、26塩基:5′−CCTACATACAAATCATCC
ATGTATTC−３′ 追加のプライマー（−）:B1、25塩基:5′−CCTACATACAA
ATCATCCATGTATT−３′ B2、24塩基:5′−CCTACATACAAATCATCCATGTAT−３′ B3、23塩基:5′−CCTACATACAAATCATCCATGTA−３′ B4、22塩基:5′−CCTACATACAAATCATCCATGT−３′ これらのプライマー類は、以下の方法を使用して調製し
た： 自動合成方法 ジイソプロピルホスホラミジト（American Bionetics由
来）を、Milligen/Biosearch由来のBiosearch 8700 DNA
Synthesizerを使用して核酸誘導化調整多孔質ガラス支
持体に連続的に縮合させた。
この手順は、ジクロロメタン中ジクロロ酢酸を使用する
脱トリメチル化、活性プロトン供与体として５−メチル
チオテトラゾールを使用する縮合および酢酸無水物とテ
トラヒドロフラン中Ｎ−メチルイミダゾール／ピリジン
によるキャッピングを含ませた。周期は約６分であっ
た。各段階における収率は98％を越え、これらは脱トリ
チル化中に放出されるジメトキシトリチルアルコールの
収集と分光学的な試験によって測定された。
オリゴヌクレオチドの脱保護および精製工程 カラムから固体支持体を取り出し、６〜18時間55℃で濃
水酸化アンモニウム2mlにさらした。次に、支持体を濾
去し、溶液上に窒素を流すことによってアンモニア溶液
を1mlになるまで蒸発させた。
試料（0.1モル濃度のトリエチルアミンアセテート緩衝
液、pH6.9中）を、NAP-10カラム（Pharmacia AB）を通
過させ、次いでBiosearch製品文献に記載されるような
標準的なトリチル・オン（trityl on）／トリチル・オ
フ（trityl off）法によりPRP-1カラム（Hamilton C
o.）を用いるHPLCでさらに精製するか、または脱トリチ
ル化後直接使用した。トリチル基の脱離は、20〜25℃で
１時間100ミリモル濃度の酢酸で処理し、引き続きトリ
エチルアミンで中和しそして２度目のHAP-10カラムの通
過によって達成した。
オリゴヌクレオチド類の特性決定 塩基組成は、蛇素ホスホジエステラーゼを使用してオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドをヌクレオチド成分まで消
化し、次いで逆相HPLCカラムと移動相アセトニトリル／
酢酸アンモニウムを使用して誘導されたヌクレオチド類
を分離し定量することによって決定した。
例2:HIV-I標的DNAの検出 この発明は、標的HIV-IウイルスDNAの増幅および検出に
おいて例１のプライマー組成物を使用して例証された。
この発明は、単にプライマーＡとＢを使用する同一標的
を検出するための試みと比較された。
以下の試験増幅溶液（100μｌ）を調製した： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝剤
（pH8、10ミリモル濃度）と塩化マグネシウム（10ミリ
モル濃度）とを含有する緩衝液を、前述したプライマー
組成物（＋および−）（プライマーA,A1,A2およびA3の
各10％とプライマーA4の60％、ならびに前記Ｂプライマ
ー組成物を同様に有する、100ピコモル濃度）およびデ
オキシヌクレオシド三リン酸（dNTP、各1500ピコモル濃
度）と共に混合した。次に、標的DNA（0.1ピコモル濃
度）を添加し、引き続きDNAポリメラーゼ（2.5単位）を
加えた。
試験と対照（単にプライマーＡとＢだけ）溶液をそれぞ
れ微量遠心管に入れ、下記のような30回の連続的サイク
ルでポリメラーゼ連鎖反応を実施した： １分かけて94℃に加熱、 30秒間持続、 80秒かけて50℃まで温度を低下、 30秒間持続、 45秒かけて70℃まで温度を上昇、そして１分間持続し
た。
アリコート（５μｌ）を抜き取り、４％アガロースゲル
〔３％NuSieve（商品名）および１％SeaKem（商品
名）、FMC Bio Productsから入手可〕にかけた。このゲ
ルは、エチジウムブロミド水溶液（10mg/ml）４μｌで
予め染色されていた。前記「移動相緩衝剤」（600μ
ｌ）はエチジウムブロミド24μｌを含んでいた。このゲ
ルを１時間160ボルト/cmで電気泳動し、次いで写真をと
りそして得られたバンドを可視化した。
この発明のプライマー組成物を含有する試験混合物はゲ
ル中に非常によく見えるバンドを与えた。対照混合物
（プライマーＡとＢのみを含有）はゲル中に観察できる
バンドを全く示さなかった。
〔発明の効果〕
この発明は、試験検体中に非常に少量存在する核酸配列
を迅速、かつ正確に複製、増幅または検出するための手
段を提供する。さらに、これらの方法は、実施者がプラ
イムしたいと考える標的配列とプライマーとの間の相補
性にミスマッチが存在する場合でさえも実施することが
できる。このことは、レトロウイルスのように単離から
単離までに変化するゲノム配列を検出する上で相当効率
のよい方法となるであろう。
これらの利点は、プライマーの３′末端またはその近傍
において標的配列とのミスマッチを有するかまたは有さ
ないかも知れない第一プライマーを含むプライマー組成
物を使用することによって達成される。ミスマッチが存
在しない場合には、プライミングとその後の工程は効率
よく実施される。しかしながら、１以上のミスマッチが
存在する場合でも第一プライマーは未だその配列をプラ
イムしうるが、ミスマッチが起こる場所によってはエク
ステンション生成物の形成が遅くなるかまたは完全に阻
止されるかも知れない。この発明は、少なくとも１つは
所期のエクステンション生成物を適切にプライムしそし
て提供しうる追加のプライマー１種以上を組成物中に含
めることによって前記課題を解決する。これらの追加の
プライマーは、第一プライマーに比るといろいろな数の
ヌクレオチドを含みうるが、以下により詳細に記載され
るように第一プライマーとなお特有な態様で関連付けら
れている。この発明のプライマー組成物におけるプライ
マーのセットは、本明細書において「相同性」プライマ
ーのセットとして特定されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は標的核酸に向けられる常法のプライミングと増
幅技法を示す略図であり、 第２図〜第６図は標的核酸に向けられるプライマーセッ
トを使用するこの発明の具体的な態様を示す略図であ
る。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】所定の標的核酸の増幅または複製に有用な
    プライマー組成物であって、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に相補
    的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｂ）標的核酸の追加の核酸配列に少なくとも実質的に
    相補的である少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであって、下記（ｉ）〜（iv）群のいずれ
    かであるもの： （ｉ）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーよりも短く、かつ第一および追加のプライマーの５′
    末端の塩基が同一であるもの、 （ii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーと同じ長さであり、かつ追加のオリゴヌクレオチドプ
    ライマーの各々が少なくとも１つの塩基で第一オリゴヌ
    クレオチドプライマーと重複するもの、 （iii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特
    異的核酸配列に直接隣接するもの、または （iv）前記標的核酸の追加の核酸配列が１つ以上のヌク
    レオチド塩基によって前記第一の特異的核酸配列から離
    れているが、追加のプライマーがその第一の特異的核酸
    配列に相補的なプライマーエクステンション生成物を形
    成可能であるもの、 の水性混合物を含んでなるプライマー組成物。
  2. 【請求項２】所定の標的核酸の増幅または複製に有用な
    診断試験キットであって、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に相補
    的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｂ）標的核酸の追加の核酸配列に少なくとも実質的に
    相補的である少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであって、下記（ｉ）〜（iv）群のいずれ
    かであるもの： （ｉ）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーよりも短く、かつ第一および追加のプライマーの５′
    末端の塩基が同一であるもの、 （ii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーと同じ長さであり、かつ追加のオリゴヌクレオチドプ
    ライマーの各々が少なくとも１つの塩基で第一オリゴヌ
    クレオチドプライマーと重複するもの、 （iii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特
    異的核酸配列に直接隣接するもの、または （iv）前記標的核酸の追加の核酸配列が１つ以上のヌク
    レオチド塩基によって前記第一の特異的核酸配列から離
    れているが、追加のプライマーがその第一の特異的核酸
    配列に相補的なプライマーエクステンション生成物を形
    成可能であるもの、 を含んでなる診断試験キット。
  3. 【請求項３】所定の標的核酸の検出方法であって、 A.標的核酸を含有することが予測される被検体を、 （ａ）標的核酸の第一の特異的核酸配列に実質的に相補
    的である第一オリゴヌクレオチドプライマー、および （ｂ）標的核酸の追加の核酸配列に少なくとも実質的に
    相補的である少なくとも１種の追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーであって、下記（ｉ）〜（iv）群のいずれ
    かであるもの： （ｉ）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーよりも短く、かつ第一および追加のプライマーの５′
    末端の塩基が同一であるもの、 （ii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特異
    的核酸配列の一部のみを含み、追加のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーの各々が第一オリゴヌクレオチドプライマ
    ーと同じ長さであり、かつ追加のオリゴヌクレオチドプ
    ライマーの各々が少なくとも１つの塩基で第一オリゴヌ
    クレオチドプライマーと重複するもの、 （iii）前記標的核酸の追加の核酸配列が前記第一の特
    異的核酸配列に直接隣接するもの、または （iv）前記標的核酸の追加の核酸配列が１つ以上のヌク
    レオチド塩基によって前記第一の特異的核酸配列から離
    れているが、追加のプライマーがその第一の特異的核酸
    配列に相補的なプライマーエクステンション生成物を形
    成可能であるもの、 の水性混合物を含んでなるプライマー組成物と接触させ
    て、プライマーと標的核酸とのハイブリッド生成物の混
    合物を形成させる段階、 B.少なくとも１つのハイブリッド生成物についての第一
    プライマーエクステンション生成物を形成させ、その第
    一プライマーエクステンション生成物をプライミングお
    よび伸長させ、そして第一プライマーエクステンション
    生成物を増幅させる段階、 C.得られたプライマーエクステンション生成物を分離
    し、次いでそれらを検出可能なオリゴヌクレオチドプロ
    ーブと接触させて、検出可能な相補的生成物を形成せし
    める段階、および D.被検体中における標的核酸の存在の指標として、前記
    検出可能な相補的生成物を測定する段階、 を含んでなる、標的核酸の検出方法。
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