JPH01500008A - レトロウィルスｈｔｌｖ３‐ｌａｖのａｄｎ配列の、血清陽性者における追跡方法とその実施のためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウィルスＨＴＬＶＩＩ［−ＬＡＶのＡＤＮ配列の、血清陽性者における追 跡方法とその実施のためのキ７）発明の分野 本発明は一般に、従来の分子交雑技法の特別な使用によりリンパ球Ｔ４・ＡＤＮ レベルでレトロウィルスＨＴＬＶＩ［［−ＬＡＶのＡＤＮ配列を発色させる方法 に関するものである。かかる方法は血清陽性者における相当する配列のルーチン 検出作業に適用可能である。本発明に従った方法は、リンパ球Ｔ４のゲノム内及 び相当する人間における一遊離状態又はその立体配座の形での一ウィルスの直接 的存在（又は不在）を証明することを可能にする。また本発明は当該方法を実施 するためのボックスをもその目的としている。

最近の出版物では、レトロウィルスＨＴＬＶＩＩ［−ＬＡＶが研究されそれがエ イズ症の原因であることが示された。この分野での関連参考文献としては、シャ ウ　ジー。

エム、（ＳＨＡＷ、Ｇ、Ｍ、、）、バーン　ビー、エッチ。

（ＨＡＨＮ　Ｂ、Ｈ，、）、アリャ　ニス、ケイ、（ＡＲＹＡ　Ｓ、に、、）、 グルーマン　ジェイ、イー、（ＧＲｏｏＰＭＡＮ　Ｊ、Ｅ、、）、ガロ　シー、 （ＧＡＬＬＯＲ，Ｃ，、）及びウオングースタル、エフ（ＷＯＮＧ−３ＴＡＡＬ 、Ｆ、、）（１９８４年）の論文「後天性免疫不全症におけるヒトＴ細胞白血病 Ｉ［［（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）の分子による特徴づけ」サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）、’１２６−１１６５−１１７１がある。

レトロウィルスＨＴＬＶＩ［［−ＬＡＶはＲＮＡウィルスではあるが、リンパ球 Ｔ４への統合の際にこれがその逆トランスクリプターゼ酵素のおかげで単純ＡＤ Ｎの状態そして２重鎖の状！（Ｌかし今だにこのレベルでそれがホストゲノム中 遊離した形で存在するのか又は統合状態で存在するのかは非常に明確にはわかっ ていない）へと移行することは、すでに実証されている〔ヒルスチ　エム、ニス 、（ＨＩＲ３ＣＨＭ、Ｓ、）及びカブランジュー。シー、（ＫＡＰＬＡＮ　、Ｌ 、Ｃ，）共著（１９８５年）ｒヒ）Ｔ型すンパ性つィルス症■型に対する治療の 見通し」アンナルス　オブ　インターナル　メデイスン（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　 Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１０３．７５０−７５５））。

この瞬間におけるウィルスの存在を、ＲＮＡ分子間のものよりもはるかに実施し やすいものであるＡＤＮ−ＡＤＮ間分子交雑技法により検出することは、すでに 提案されてきた。しかしながらこの技法によりウィルス配列の存在を確認するこ とは、実際上充分な確実性をもって行うことができない。陽性の結果は非常に特 別な極くわずかなケースにおいてしか見極められなかったということはすでに実 証済である。すなわち末梢血単核細胞レベルでの検出に際してはエイズ感染者１ ６人のうち１人だけについて見極められたのである。〔シャウ　ジー、エム、（ ＳＨＡＷ　Ｇ、Ｍ、、）、バーン　ビー、エイチ。

（ＨＡＨＮ　Ｂ、Ｈ，、）、グローブマン　ジェー、イ＋、（ＧＲＯＯＰＭＡＮ 　Ｊ、Ｅ、、）、プロジー　ニス。

（ＢＲＯＤＥＲＳ、、）、ウオングーステール　エフ。

（ＷＯＮＧ−３ＴＡＡＬ　Ｆ、、）、及びガロ　アール。

Ｃ−、（ＧＡＬＬＯＲ，Ｃ，）、（１９８５年）フランス人組織中のＨＴＬＶＩ ［Ｉ型ＡＤＮ配列の分子による特徴づけ〕　〔アトランタ・エイズに関する国際 シンポジウム、詳録〕 本発明の基礎にある考え方は確実に実際的ニーズに対し確実な形で使用可能なも のとするよう適合をほどこしながら、一般的な分子交雑技法を血清陽性者におい て用いることである。実際、−人の人間がこのウィルスに接触した場合、エイズ を発病しないにせよ、この人物は血清陽性者となる。さらに最近の研究ではいわ ゆるエイズ症への緩慢で漸進的な進行が起こり得ることがわかっているため、こ の状態には危険性が伴っている。したがって予防の必要性から血清陽性者におけ るＨＴＬＶＩ［［−ＬＡＶウィルスの診断・追跡方法が利用可能となることが極 めて望ましい。既に、古典的なものとはなったが１人の人間が血清陽性者である か否かを立証する検査は存在する。しかし、当該出願者が知るかぎりにおいて、 かかる血清陽性者におけるウィルス事態の存在を裏づけることのできる補足的な 方法は無い、確かに通常の培養法を用いることを考えることもできるが、これら のテストはあまりにも時間と費用がかかりすぎ、さらにＨＴＬＶＩ［Ｉ−ＬＡＶ ウィルスの場合、これらは射倖的である。

発明の要旨と要約 本発明の目的は、当該疾病に向かっての血清陽性者の進行状態について判断を下 す上できわめて重要であることが明白な結果を与える血清陽性者における追跡方 法を提寓することにより、前述の実際的必要性に答えることにある。

従って本発明は以下の段階を含む一般的な分子交雑技法を適用することを特徴と するレトロウィルスＨＴＬＶＩＩＩ−ＬＡＶのＡＤＮ配列の血清陽性者における 追跡方法に関するものである。

ａ）被験者の血液を採取しここから既知の方法で白血球を分離させ、リンパ球Ａ ＤＮを得る段階、なおこのリンパ球ＡＤＨは、少なくとも３０μｇの単位量にて 用いられる。

ｂ）かかる量のリンパ球ＡＤＮを、ウィルスのＡＤＮ配列内部でニックの無い制 限酵素によって処理する段階。

Ｃ）遊離した又は統合されたかたちでウィルスを含むｂ）段階の媒質を表面積１ ｃｄあたり８０μｇのＡＤＮまで捕獲できるニトロセルロースフィルタに通過さ せる段階。

ｄ）フィルタに残った生成物を、クローニングされＨＴＬＶｎ［−ＬＡＶウィル スでマーキングされたゾンデである１つのゾンデと接触させる段階、なお、かか るゾンデはウィルスの包絡領域に対する暗号部分をもたないウィルスのＡＤＮの サブクローニングされたフラグメントであり、マーキングは、ゾンデのＡＤＨ１ μあたり５゜１０’ｃｐｍＯ値にできるかぎり近い活性、とくにＡＤＮｌ　ｐｇ あたり５−１０８〜２２−１Ｏ９ｅｐの活性を与えることができる。

ｅ）既知の方法で、ウィルスの特徴的な横縞の存在を読みとる段階。

分子交雑技法は、当該分野の専門家には既知の方法であるためここでは詳述する 必要はない、レトロウィルスＨＴＬＶＩ［１−ＬＡＶの場合、前述のシャク（Ｓ ＨＡＷ）他者の論文（１９８５年）を参照することができる。本発明のニーズに 対するこの技法の適合化は以下の説明ならびに本発明を明示するための以下の実 施例から理解できることだろう。

実施例の説明 当該方法の第１段階において被験者の末梢血を採取し、これから既知の方法で白 血球を分離する。）（ｂａ　ｉのような適当な酵素を用いて加水分解した後、リ ンパ球ＡＤＮが得られる０本発明の特徴に従うと、Ｃ）段階で用いられるフィル タの負荷と相容性あるできるだけ多量のリンパ球ＡＤＮを利用する。この単位量 はＡＤＮ３０μｇ以上である。実際上、３０〜５０μｇの範囲の量を用いること ができる。３０μｇ未満の値では充分に確実な応答を得ることができない。なお ８０μｇを越えると、あまりにも大量の血液を採取しなければならない。その上 、Ｃ）段階のフィルタの使用限界に達する。３０μｇ〜５０μｇの間のリンパ球 ＡＤＮの単位量は、被験者の血液の約１０００万個の細胞から容易に得られる。

この技法において慣用的であるようにこれらの単位量は例えばアガロースゲルの ようなそれぞれのゲル・ウェル内に沈積される。

本発明に従った方法の第ｂ）段階において、前記リンパ球ＡＤＨの一定量は、通 常ウィルスのＡＤＮ配列内部で認識部位をもたないように選ばれた制限酵素によ り処理される。このことのもつ効果は、遊離ウィルス又はそのさまざまな立体配 座に相当する。大きなサイズのオートラジオグラフィ撮影された少数の横縞に、 最終的に得られた信号を集中させることにある。本発明に従った方法のニーズに 合致する酵素の一例としては、まず、ウィルス配列内部で切断しないことがわか っているＸｂＡＩ酵素を挙げなくてはならない；バーン　ビー、エイチ。

（ＨＡＨＮ　Ｂ、Ｈ，、）、　シャク　ジー、エム、（ＳＨＡＷ　Ｇ、Ｍ、、） 、アリャ　ニス、ケイ、　（ＡＲＹＡＳ、に、、）、ポボビフク　エム、（ＰＯ ＰＯＶＩＣＭ、）ガロ　アール、シー、（ＧＡＬＬＯＲ，Ｃ，、）及びウオング ースタル　エフ、（ＷＯＮＧ−３ＴＡＡＬ　Ｆ。

、）、共著（１９８４年）「エイズに関連するＨＴＬＶＩウィルスの分子クロー ニングと特徴づけるＪ　Ｎ　ａ　ｔ　ｕｒｅ、３１２；１６６〜１６９参照、し かしながら、これに匹敵する他の酵素も使用可能である。

本発明に従った方法の第Ｃ）段階において、表面１ｄあたりできるかぎり高い負 荷を呈する感応性の高いニトロセルロース製フィルタヲ用いる。このフィルタの 特性は第ａ）段階で使用されたリンパ球ＡＤＮの単位量と相容性あるものである 。このフィルタは、表面積１ｄあたり少なくとも３０ｐｇの、できれば８０ｐｇ までのＡＤＮを捕獲することができる。実際上、ミリポル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ）フィルタ、又さらに良いのはサルトリアス　スチリソチャ　アンド　スチュル （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ）ＢＡ８５フ ィルタを用いることができる。この後者の場合、検査としてＨ９Ｖ３培養のＡＤ Ｈを用いる予備実験により、沈積されたクローニング済ゾンデのＡＤＮＯ，ｌｐ ｇまでがここに説明されている技法を用いて検出することができるということが 示されている。すなわち、ＡＤＮの分子約１０４個、つまり現論的に５００のう ち１つの感染細胞が抗して検出可能であるということになる。

第ｄ）段階においては、さまざまな分離の中で本来可変的な包絡領域についての 暗号部分をもたない、ウィルスのＡＤＮのサブクローニングされたフラグメント である１つのゾンデが用いられる。実際上、ゲノムの中央部分及び端部５′にし か相当しないλＢＨ−１０のフラグメント５ｓｔｌ−５’から成るゾンデを用い て良い結果が得られた。このようなゾンデは当該分野の専門家にとっては既知の ものである。これに関しては、第０１７３５２９号として公示されたヨーロッパ 特許出願明細書を参照するこ゛とができる０本発明に従った方法のもう一つのき わめて重要な特徴によると、マーキングは、ゾンデのＤＮＡ１μｇあたり５・ｌ Ｑ’ｃｐｍの値にできるだけ近い、できればＤＮＡ１μｇあたり５・１０”〜２ ・ｌＱ’ｃｐｍというきわめて高い比活性を提供することができな（ではならな い、実際的には、このような活性は小さなサイズの大量のインシェークを用いた マーキングシステム及びケルノー（Ｋｌｅｎｏｗ）のポリメラーゼを用いるｄＣ ＴＰマーキンによって得られる；或いは８００Ｃ！Ｊ　１モルの２つの放射性元 素（ｄＣＴＰ＋ｄＡＴＰ）を介入させるニックの移動によるマーキング〔ニック トランスレーションと呼ばれる〕によっても得られる。アメルシャム（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）の低温キットＮ５５００及びマーキングＰＢ１０３８４及びＰＢ１０ ３８５−以下の例を参照のこと）。

最も優れた結果は、３２ｐでのマーキングで単一の放射性元素（ｄＣＴＰ）を介 入させることによりインシェークとして合成オリゴヌクレオチドを用いた方法に よりゾンデをマーキングすることから得られた。ルーチン作業では市販のアメル シャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈａｍ）に相当するキットを利用して約１−２Ｘ１０ ’　ｃｐｍ／μｇの比活性が得られた。又、同様に、これらの条件においてこの 方法はきわめて少量のゾンデ（各マーキングにおいて約１００１００ｎか消費せ ず、蛋白質（含窒素有機物）の汚染物質に比ベゾンデのきわめて高い純度を必要 としないことも確認されている。このため、当該方法はより使い易く安価なもの である。

発色はオートラジオグラフイイ露出により既知の方法で行われる。本発明の実施 に際して、数日、たとえば４日間の露出期間が読みとり、ひいては追跡に充分で あることが確認されている。最も優れた結果は、超感度のオートラジオグラフィ イ・フィルム甲アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて得られた。

分子交雑の技法を用いる本発明に従った方法は特に以下のような主要な段階を含 むことができる。

（１）　蛋白質分解酵素（プロテイナーゼ）Ｋによる蛋白質分解の後のフェノー ル−クロロホルム混合物による長鎖リンパ球ＡＤＮの抽出。

（２）得られたＡＤＮの分光測度法による秤量、アガロースのミニゲル上でのそ の長さならびにヌクレアーゼ試験によるその分解性の確認。

（３）分解すべきＡＤＨ１μｇあたり５単位を越える、制限酵素Ｘｂａ　Ｉによ る加水分解。

（４）転移緩衝液１０ＸＳＳＣでの０．８％のアガロースゲル上での制限フラグ メントの展延。

（５）２５０／ｊｇのＣｉに対し１ｍｍｏｌｅあたり８００ｃｕでの３２ＰｄＣ ＴＰ＋ｄＡＴＰ又は３２　Ｐ　ｄ　ＣＴ　Ｐのみでのニックの移動によるゾンデ のマーキング。

（６）６７℃で４８時間音波処理され変性させられた鮭の精液のＡＤＮ１０ｍｇ ／ｍｆを加えたｐＨ＝７．５．５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｊ！；　５０ｍＭＥＤＴ Ａ、０゜１％ＳＤＳ、ＩＯＸデンハルド（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、５ｘｓｓｃ緩衝 液でのフィルタと変性されたゾンデの交雑。

（７）　１　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃと０．１％ＳＰＳの緩衝液での最終的洗浄。

（８）　フィルタの乾燥及び、感応フィルムがある状態で２枚の強化スクリーン を有するカセット内へのその内含。

なおオートラジオグラフィは一７０℃で行われる。

（９）オートラジオグラフィで撮影された横縞の発色。

αω　ＡＤＮのサイズの尺度として）（ｉ　ｎｄＩ［［により分解されたファー ジλを用いての、証明プラントフオーム上でのオートラジオグラフィ撮影された 横縞の読みとり。

添付の図面のうち第１図は（１）血清陽性者〉０の場合（２）血清陽性者く０の 場合及びＨ９Ｖ３培養から得られたラジオグラフィ撮影された横縞を表わしてい る：最後のケースでは（）は、多重統合部位を示している。

こうして血清陽性者において以下のような）（ｂａ　Ｉフラグメントが観察され る； −ゲル内には全く又はほとんど浸入していない分子量の高いＡＤＮに相当する巨 大フラグメント。

−環状で、単−調に切断されたウィルスに相当する約１３ｋｂのフラグメント。

−ｍ形ウィルスに相当する約９ｋｂのフラグメント。

比較すると、同一条件下で、Ｈ９Ｖ３のＡＤＮは、巨大フラグメントに相当する 信号と、ウィルスの多クローン統合方法を示す、ぼかされた重量限界をもつもう 一つの大きなサイズの信号を与える。

ゲルの３つの移動チャンネルを示す第１図の写真はオートラジオグラフィに観察 できる信号を例証しており、これらの信号は本発明に従った方法の結果を具現化 している。Ｈ９Ｖ３系列の場合、分子量の大きいＡＤＮの領域内にゲルのウェル 内に浸透しにくい弱い信号が存在する；信号の主要部分は重量に広がりのある斑 点により表わされている（この斑点は密度の高いものである。これは培養の細胞 の各々に約５０〜１００のウィルス粒子が含まれているからである。）：前記展 延は、ヒトＡＤＮレベルでのウィルスの統合が多クローン式に行われる（挿入部 位が多く存在する）という事実に起因する。チャンネル１の場合、これは、その 信号について陽性である血清陽性者に関わるものである。オートラジオグラフィ 撮影された３つの横縞が存在する；そのうち１つはゲル・ウェル内に浸透しない 分子量の大きいＡＤＮ内にあり；約１３ｋｂ及び９ｋｂのサイズのオートラジオ グラフィ撮影された２つの横縞は、おそらく２つの異なる立体配座（超巻込型及 び／又は弛緩型）の下でのウィルスの遊離形状に相当する。中にはきわめて陽性 （第１図に示されている場合がそれである）の者もおり、その横縞は明確で特に 目立ち、オートグラフィの４日間の後直ちに見える。チャンネル２の場合、これ は血清陽性者ではあるが信号に対しては陰性である（長い露出の後でさえ）者に 関するものである。

これらの結果は、本発明に従った方法により得られた結果の読みとりが、血清陽 性者におけるＨＴＬＶＩＩ［−ＬＡＶウィルスの存在を暴露させるために確実で しかも再生可能な形で行なえることを示している。

検査された合計１４人の人物のうち９名がウィルス配列を示している。これら９ 名の陽性者のうち４名はより強い横縞を示し、従って強度陽性と認められ、他の ５名は弱い横縞しか示さずしかも長い露出後であってもそうである：これらの強 さの差は各ウェル内に沈積されたＡＤＮの量とは無関係でありおそらく存在する ウィルスのコピーの数を反映していると思われる。

本発明に基づく方法の有利な派生型においては、分解されていないものと）（ｂ ａ　Ｉのような酵素により分解されたものの両方の標本をゲル上に同時に沈積さ せる。こうして得られた標準的な結果は第２図及び第３図に示されている。

第１図と似ているが分解された標本と分解されていない標本を２重に含んでいる 第２図を見ると、得られた信号がそれぞれ巨大フラグメント、ｌ　３ｋｂでの統 合フラグメント及び９ｋｂでの遊離フラグメントに相当していることがわかる。

このような実施態様では、まず、分解されていない標本内にウィルスの存在の兆 候があり、これは分解後に確認されている。

第３図はそれぞれ１０日及び１力月でのｌ　３ｋｂ及び９ｋｂの特徴的横縞につ いての露出期間の影響を示している。

２重標本（分解されていないものとされているもの）を用いた実施態様を使用し て血清陽性者である２５名の被験者に対し本発明に基づく方法を適用した。各々 の試験は２回繰返された。その結果は次の表にまとめられている。この表中 −ｒＴ４／Ｔｅ採血」という記載はリンパ球Ｔ４とリンパ球Ｔ日の比で、その測 定は採血の際に行われ、その被験者が血清陽性者であるという仮定を構成してい るということを意味する。

−ｒＨＢＳ／ＨＢＣ抗原ｊという記載は、ウィルス性肝炎に相当する抗原の有無 を意味する。

この表のその他の凡例は一般的なものである０本発明に基づく方法により、表の 結果かられかるように、１６名すなわち検査された合計数の６４％が陽性である ことを確認することができる。

血Ｍ　者２５名に対して行われた調査 観察された横縞はウィルスの配列にうまく一致するという事実は、以下の理由に より示される。

−得られた信号は特異的ゾンデとの交雑の後、前記の状態にある。

一期待されたサイズの横縞が観察されている。

−これらの横縞は対照である培養のものと類似している。

母集団内から任意にとられ、Ｘｂａ　Ｉにより分解された対照のＡＤＨの場合、 横縞はみられない。又横縞は同一条件下での真性エイズの場合でも見られない： すでに指摘したように、この方法によるウィルスの検出は患者について実践でき ない（この場合、Ｔ４細胞の量は非常に低く、ウィルスの主要部分はＲＮＡ０形 でみられる）。

観察された横縞はファージλによるゾンデの汚染の結果ではない、Ｘｂａｌによ り分解されると、ファージλは、このタイプの対照分解において実証されている ように、観察されたものよりはるかに大きい２３．９ｋｂ及び２４．５ｋｂの２ つの制限フラグメントを与える。これに対して血清陽性者〉０のリンパ球ＡＤＮ 内の遊離ウィルス配列の存在は、ゲル上に分解されていないこれらの人物のＡＤ Ｈを移動させ、相当するチャンネルとゾンデを交雑させることにより証明される ；はとんどの場合において、分解されていないＡＤＮ内に（統合配列）強い信号 が１つ得られ、はるかに弱いもう一つの信号がｙｌｏｋｂの分子量の横縞内に（ 遊離形状）得られる。

本発明は又当該方法の実施に必要な成分を含むキット、ボックス又はバッグをも その目的としている。これらの成分の単位量は処理予定の標本の数により異なる 。本発明に基づくキットには主として以下のものが含まれるニーＨＴＬＶＩＩ［ −ＬＡＶゾンデ、例えばファージλが切除されたサブクーロンλＢＨ−５に相当 するゾンデ。

一対照として用いられるＸｂａ　Ｉにより分解されたファージλのＡＤＮ製剤。

一酵素の分解用緩衝液 マーキングのため使用可能な製剤は、以下のようなアメルシャン　フランス（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ　Ｆｒａｎｃｅ）社、アベニュ　デエ　カナダ　９１９４４レス 　ユーリ　フランス（Ａｎｅｍｕ　ｄｕ　ａｎａｄａ　９１９４４Ｌｅｓ　Ｕｌ 　ｉ　ｓ　Ｆｒａｎｃｅ）、により市販されているものであるニ ー低温キットＮ５５００　にツク−トランスレーション及び酵素の緩衝液） 一αＰ韮ｄＣＴＰ　（ＰＢ１０３８５）及びαＰ３２ｄＡＴＰ　（ＰＢ１０３８ ４）　、８００ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ（各々２５０μＣｉ）。

マーキングの低温派生型（例えば、現在、オルガニス（Ｏｒｇａｎｉｃｓ）社− １２Ａアベニユー　デュ　プレジデント　サルバドール　アルンデュ（Ａｖｅｎ ｕｅｄｕ　Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ　５ａｌｖａｄｏｒ　Ａ１１ｅｎｄｅ）９４４０ ２　ビトユール　ジュール　サイン　フランス（Ｖｉｔｒｙ−ｓｕｒ−３ａｉｎ ｅ、Ｆｒａ　ｎ　ｃ　ｅ）−により商品化されている基本スルホン化によるマー キング）も同様に用いることができる。派生型としては、低温マーキング又はＨ ３のような放射性マーキングを用いた正常部位交雑を行うこともできる。

本発明は完全な実施８様によりさらに明確に例証される。

例： 生理食塩水内で５％のＥＤＴＡで合計’ｌ　Ｑ　ｍ　Ｉｔの血液を採取する。血 漿は１５００ｒｐｍ５分間の遠心分離の後、真空ポンプでの吸引により除去され る。赤血球の細胞溶解は、ＳＬＲ緩衝液５０ｍ１１．　（Ｔｒ　ｉ　ｓ　１０ｍ Ｍ、Ｍｇ（！！２　５ｍＭ、ＮａＣ１！　１０ｍＭ）を新鮮な沈澱物に加えるこ とにより得られる；溶血状態まで均質化が得られその後２０００ｒｐｍで５〜１ ０分遠心分離が行われる：その後浮きかすは真空ポンプで吸引される。

蛋白質分解酵素（ブロティナーゼ）Ｋの溶液が最終濃度０、’１ｍｇ／ｍｌでＴ Ｅ緩衝液（Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＥＤＴＡ）内で調製される。以前に得られた沈澱物 はＳＬＲ緩衝緩衝液３ｍ中に再度溶解させられ、さらに５ＬＢｌｉ衝液（Ｔｒｔ ｓ　１０ｍＭ、ＥＤＴＡｌｏｍＭ、ＮａＣｆ５０ｍＭ　５ＤＳ０．２％）及び１ 管あたり３　ｍ　ｇの蛋白質分解酵素にの中で再溶解させられる；抗して粘性の ブロックが得られ、このブロックは均質化され、次に４２℃で一晩ゆっくりと攪 拌される（軌道水溶で４５〜５０ｒｐｍ）＊ 抽出に用いられるフェノールはｐＨ＝７．６のＴｒｉｓＯ，２Ｍで飽和される。

第１の抽出は、フェノール３／４．クロロホルム１／４及び１／２４のイソアミ ルアルコール内で行われる；上部の水相はピペットで除去される０次に、第２の 抽出はフェノールクロロホルムで調製される；次に２つの相は分解しＡＤＮは上 部相にある；下部の有機相は、注射器でとり除かれる。最後に第３の抽出が、ク ロロホルムを伴うフェノール＋イソアミル酸を除去するために行われる。

残留組においてＡＤＮはＮａ０４４３Ｍを３００ａｌｌ加え一２０℃で無水エタ ノール５９ｍｌで補完することにより沈澱させられる。エタノールはピペットで 除去され、沈澱したＡＤＮは、ピペットを逆にして回収される：無水エタノール で何度も洗浄する。

ＡＤＮは数日間４℃で２〜４ｍｌのＴＥ中に再度懸濁させられる。これはＤＯ２ ６０で秤量され、そのサイズの検査は０．７％のアガロースのミニゲルで行われ 、着色はＴＥＡ緩衝液内の臭化エチジウムで行われる。

各標本について指示された量のＡＤＨがＡＤＮ１μｇあたり５単位を越える制限 酵素Ｘｂａｌにより分解される。制限フラグメントは次に０．８％の水平アガロ ース・ゲル上に展延される。

移動の後、ゲルはデブリナ（ｄｅｐｕｒｉｎｅｒ）され（Ｈ（１０，２５Ｍ）　 、変性され（ＮａＣＡＩＭにてＮａＣ／！ＩＭ）、中和されるｐＨ−７，０でＮ ａ　Ｃｆ１．５ＭにてＴｒｉ、ｓｏ、５＞、転移緩衝液は１０×ＳＳＣで、ニト ロセルロースのフィルタ上の転移は、夜間に行われる。最後にフィルタを乾燥さ せ、ＡＤＨは６時間８０℃の炉で定着させられる。

使用されたゾンデは、λ−ＢＨ−１０のフラグメント５ｓｔＩ−５’　から成る 。これは８０００Ｃｕ１モルのｄＣＴＰ＋ｄＡＴＰ又はｄＣＴＰのみでニック− トランスレーションによりマーキングされる。

フィルタは以下のものを含む密封されたプラスチック復路内の軌道水溶にて６５ ℃で予備交雑される＝２５ｍｌの緩衝液５ｘｓｓｃ　（１時間）、次に５ｘＳＳ Ｃ，１０×デンハルド（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）（Ｄ）　、０．１％ＳＤＳ　（１時 間）、次に５ＸＳＳＣ，ｌ０ＸＤ、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳに変性さ れ音波処理された鮭の精液のＡＤＮ１００μｇ　／　ｍ　１を加えたもの（１晩 ）。

変性されたゾンデとの交雑は、２４時間以上軌道水溶で６７℃でｌＱｍＡ中（５ ＸＳＳＣ１ＩＯＸＤ、　０．１％ＳＤＳ　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−Ｈ（１！　ｐＨ＝７．５及びＡＤＮ１０ｍｇ／ｍＡ）で行われる。

交雑の後、フィルタは連続して以下の港内で洗浄される：　（６６℃ケース内で ２５０ｍＡ）；　５ｘｓｓｃ、１０ＸＤ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ＮａＰＰ１ にて３０分：次に３ｘＳＳＣ，１０ｘＤ、１％ＳＤＳ、０．１％ＮａＰＰＩで３ ０分；次に２ｘＳＳＣ％ＩＸＤ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ＮａＰＰ１で１５分 そして緩衝液ｌ５ＳＣ，ＩＸＤ、０．　１％ＳＤＳ、０．　１％Ｎａ　ＰＰ　ｉ にて必要な時間だけ（計数器でフォローする）。

フィルタは次にランプの下で乾燥させられ、ファ７スマン（Ｗａ　ｔ　ｈｍａｎ ）３？ｔ１紙上に固定されプラスチックフィルムに包まれ、次に、２つの強化ス クリーンのついたカセットの中に１〜３０日間−７０℃でオートラジオグラフィ イに向けてとり置かれる。

オートラジオグラフィは５分間発色され、水洗いされて、５分間定着させられ、 再度洗浄されて、乾燥器に入れられる。オートラジオグラフィ撮影された横縞の サイズはファージλのＡＤＮのＨｉｎｄｌ［［フラグメントで表わされるサイズ 尺度のものを基準として計算される。

以上に詳述された例は、本発明に従った方法を例証するもので、制限的な意味を 持つものではない。

作業様式の派生型も、分解有り又は分解無しの実施態様（２重標本）を用いて前 述したように、当該分野の専門家によりもたらされ得るものである。

こうして、本発明は、生体内で、実際の現実的条件の下で、血清陽性者内に微量 で存在することがわかっているレトロウィルスＨＴＬＶＩＩ［−ＬＡＶを検出す ることのできる、感応性の高い方法を提供している。このような結果はひじょう に有利なものであり、専門的文献にもかかる検出方法が実際には使用不可能であ ると記されていただけに、驚くべきものである。

なお、ゾンデに関する研究作業は最適な条件下で、培養細胞について試験管内で のみ行われていた。これは生態内での応用と全く異なるものである。

第１図 第２図 １０日 第３図 国際調査報告 ＩＮＴＥＲ，’ＪＡＴｒＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ Ｅ’Ｒ８７１００２２Ｂ　（ＳＡ　１７６４１３）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の段階を含む一般的な分子交雑技法を適用することを特徴とする。レト ロウイルスＨＴＬＶＩＩＩ−ＬＡＶのＡＤＮ配列の血清陽性者における追跡方法 。 ａ）被験者の血液を採取し、ここから既知の方法で白血球を分離させリンパ球Ａ ＤＮを得る段階。なおこのリンパ球ＡＤＮは、少なくとも３０μｇの単位量にて 用いられる。 ｂ）かかる量のリンパ球ＡＤＮをウィルスのＡＤＮ配列内部でニックの無い制限 酵素によって処理する段階。 ｃ）遊離した又は統合された形でウィルスを含むｂ）段階の媒質を表面積で１ｃ ｍ２あたり８０μ８のＡＤＮまで捕獲できるニトロセルロースフィルタに通過さ せる段階。 ｄ）フィルタに残った生成物をクローニングされＨＴＬＶＩＩＩ−ＬＡＶウィル スでマーキングされたゾンデである１つのゾンデと接触させる段階。なお、かか るゾンデはウィルスの包絡領域に対する暗号部分をもたないウィルスのＡＤＮの サブクローニングされたフラグメントであり、マーキングは、ゾンデのＡＤＮ１ μｇあたり、５１０８ｃｐｍの値にできるかぎり近い活性、とくにＡＤＮ１μｇ あたり５・１０８〜２・１０９ｃｐｍの活性を与えることができる。 ｅ）既知の方法でウィルスの特徴的な横縞の存在を読みとる段階。 ２、前記制限酵素がＸｂａＩ又はこれと同等の酵素であることを特徴とする特許 請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記リンパ性ＡＤＮの単位量が約３０μｇと５０μｇの間に含まれているこ とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに記載の方法。 ４、前記ファージλが切除されたサブクローンλＢＨ−５に相当するゾンデを用 いることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれかに記載の 方法。 ５、前記ゾンデは低温マーカーあるいは放射性のマーカーであることを特徴とす る特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載の方法。 ６、前記以下のような主要な段階を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項 から第５項までのいずれかに記載の方法。 （１）蛋白質加水分解酵素Ｋによる蛋白質分解の後のフェノールークロロホルム 混合物による長鎖リンパ球ＡＤＮの抽出。 （２）得られたＡＤＮの分光測光法による秤量、アガロースのミニゲル上でのそ の長さならびにヌクレアーゼ試験によるその分解性の確認。 （３）分解すべきＡＤＮ１μｇあたり５単位を越える制限酵素ＢｂａＩによる分 解。 （４）転移緩衝液１０×ＳＳＣでの０．８％のアガロースゲル上での制限フラグ メントの展延。 （５）２５０μのＣｉに対し１ｍｍｏｌｅあたり８００ｃｕでの３２ＰｄＣＴｐ ＋ｄＡＴＰ又は３２ＰｄＣＴＰのみでのニックの移動によるゾンデのマーキング 。 （６）６７℃で４８時間音波処理され変性させられた鮭の精液のＡＤＮ１０ｍｇ ／ｍｌを加えたｐＨ＝７．５、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＤＳ、１０×デンハルド（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、５×ＳＳＣ緩衝液で の、フィルタと変性されたゾンデの交雑。 （７）１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳの緩衝液での最終的洗浄。 （８）フィルタの乾燥及び感応フィルムがある状態で２枚の強化スクリーンを有 するカセット内ヘのその内含。 なおオートラジオグラフィは−７０℃で行われる。 （９）オートラジオグラフィで撮影された横縞の発色。 （１０）ＡＤＮのサイズの尺度としてＨｉｎｄＩＩＩにより分解されたファージ λを用いての照明プラットフォーム上でのオートラジオグラフィ撮影された横縞 の読みとり。 ７、部分的に以下のものを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第６ 項までのいずれかに記載の方法の実施のためのキット、ボックス又はバッグ。 −ファージλが切除されたサブクローンλＢＨ−５に相当するゾンデのようなゾ ンデＨＴＬＶＩＩＩ−ＬＡＶ−対照として用いられるＸｂａＩにより分解された ファージλのＡＤＮの製剤。 −酵素保存用緩衝液中の酵素ＸｂａＩ。 −酵素の分解用緩衝液。 ８、前記マーカーが放射性又は低温であることを特徴とする特許請求の範囲第７ 項に記載のキット。