FR2600342A1 - Procede pour le depistage, chez les individus seropositifs, des sequences d'adn du retrovirus htlv iii-lav et coffret pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE, BASE SUR LA TECHNIQUE GENERALE D'HYBRIDATION MOLECULAIRE, POUR LE DEPISTAGE, CHEZ LES INDIVIDUS SEROPOSITIFS, DES SEQUENCES D'ADN DU RETROVIRUS HTLV III-LAV. ELLE A EGALEMENT POUR OBJET UN COFFRET POUR LA MISE EN OEUVRE DU PROCEDE. APPLICATION AU DEPISTAGE DU SIDA CHEZ LES INDIVIDUS SEROPOSITIFS.
Description
La présente invention concerne d'une façon généra
le un procédé de révélation des séquences d'ADN du rétrovi
rus HTLV III-LAV au niveau de l'ADN des lymphocytes T4, par une utilisation particuliĂšre de la technique classique d'hybridation molĂ©culaire. Un tel procĂ©dĂ© est applicable Ă
la détection en routine des séquences correspondantes chez
les individus séropositifs. Le procédé selon I invention permet de prouver la présence (ou l'absence) directe du virus - sous forme libre ou ses conformations - dans le génome des lymphocytes T4 et des individus correspondants.
le un procédé de révélation des séquences d'ADN du rétrovi
rus HTLV III-LAV au niveau de l'ADN des lymphocytes T4, par une utilisation particuliĂšre de la technique classique d'hybridation molĂ©culaire. Un tel procĂ©dĂ© est applicable Ă
la détection en routine des séquences correspondantes chez
les individus séropositifs. Le procédé selon I invention permet de prouver la présence (ou l'absence) directe du virus - sous forme libre ou ses conformations - dans le génome des lymphocytes T4 et des individus correspondants.
L'invention a également pour objet- un coffret permettant la mise en oeuvre du procédé en question.
Des publication récentes ont étudié le rétrovirus
HTLV III-LAV et ont montré qu'il était responsable de la maladie du SIDA. A titre l'exemple de référence bibliographique pertinente dans ce domaine, on peut citer l'article de SHAW, G.M., HAHN B.H., ARYA S.K., GROOPMAN J.E., GALLO
R.C. et tONG-STAAL, F. (1984) Molecular characterization of human cell leukemia virus type III in the acquired immune deficiency syndrome, Science, 226 - 1165-1171.
HTLV III-LAV et ont montré qu'il était responsable de la maladie du SIDA. A titre l'exemple de référence bibliographique pertinente dans ce domaine, on peut citer l'article de SHAW, G.M., HAHN B.H., ARYA S.K., GROOPMAN J.E., GALLO
R.C. et tONG-STAAL, F. (1984) Molecular characterization of human cell leukemia virus type III in the acquired immune deficiency syndrome, Science, 226 - 1165-1171.
Bien que le rétrovirus HTLV III-LAV soit un virus à ARN, il est déjà établi (HIRSCH M.S. et KAPLAN J.C. (1985)
Prospects of therap-y for infections with human T-lymphotropic virus Type III. Annals of Internal Medicine, 103, 750755) qu'au moment de son intégration dans le lymphocyte T4
il passe, grùce à son enzyme transcriptase inverse, à l'état d'ADN simple, puis double-brin (on ne sait cependant encore pas de façon trÚs précise s'il existe à ce niveau sous forme
libre ou intégrée dans le génome de l'hÎte).
Prospects of therap-y for infections with human T-lymphotropic virus Type III. Annals of Internal Medicine, 103, 750755) qu'au moment de son intégration dans le lymphocyte T4
il passe, grùce à son enzyme transcriptase inverse, à l'état d'ADN simple, puis double-brin (on ne sait cependant encore pas de façon trÚs précise s'il existe à ce niveau sous forme
libre ou intégrée dans le génome de l'hÎte).
Il a déjà été suggéré de détecter la présence du virus à cet instant par la technique d'hybridation moléculaire ADN-ADN, beaucoup plus facile à mettre en oeuvre que celle entre molécules d'ARN. Cependant, la vérification de
la prĂ©sence des sĂ©quences virales par cette technique ne peut pas ĂȘtre rĂ©alisĂ©e dans la pratique d'une maniĂšre suffi samnent sĂ»re. Il a dĂ©jĂ Ă©tĂ© Ă©tabli que des rĂ©sultats positifs n'ont Ă©tĂ© dĂ©terminĂ©s que dans un trĂšs petit nombre de cas hautement particuliers : I cas sur 16 individus atteints de SIDA pour ce qui concerne la dĂ©tection au niveau des cel
lules mononuclées du sang périphérique (SHAW G.M., HAHN
B.H., GROOPMAN J.E., BRODER S., U0NG-STAAL F. et GALLO R.C.
la prĂ©sence des sĂ©quences virales par cette technique ne peut pas ĂȘtre rĂ©alisĂ©e dans la pratique d'une maniĂšre suffi samnent sĂ»re. Il a dĂ©jĂ Ă©tĂ© Ă©tabli que des rĂ©sultats positifs n'ont Ă©tĂ© dĂ©terminĂ©s que dans un trĂšs petit nombre de cas hautement particuliers : I cas sur 16 individus atteints de SIDA pour ce qui concerne la dĂ©tection au niveau des cel
lules mononuclées du sang périphérique (SHAW G.M., HAHN
B.H., GROOPMAN J.E., BRODER S., U0NG-STAAL F. et GALLO R.C.
(1985) Molecular characterization of HTLV III DNA sequences
in fresh tissue (abstract, Colloque International sur le
SIDA Atlanta).
in fresh tissue (abstract, Colloque International sur le
SIDA Atlanta).
L'idée qui est à la base de la présente invention est d'utiliser la technique générale d'hybridation moléculaire chez les individus séropositifs, en l'adaptant pour
la rendre utilisable de maniĂšre sĂ»re pour les besoins pratiques. On sait, en effet, que lorsqu'un individu a Ă©tĂ© en contact avec le virus, sans pour autant ĂȘtre atteint du
SIDA, il devient sĂ©ropositif et cet Ă©tat comporte des risques car les Ă©tudes les plus rĂ©centes montrent qu'il peut y avoir alorsune Ă©volution lente et progressive vers la mala die proprement dite du SIDA. Pour les besoins de la prĂ©vention, il est donc hautement souhaitable de disposer d'un procĂ©dĂ© de diagnostic et de dĂ©pistage du virus HTLV III-LAV chez les individus sĂ©ropositifs.On dispose dĂ©jĂ de tests devenus classiques, permettant d'Ă©tablir si un indiyidu est, ou non, sĂ©ropositif. Mais, Ă la connaissance du demandeur, il n'existe pas de procĂ©dĂ© complĂ©mentaire permettant d'authentifier la prĂ©sence du virus lui-mĂȘme chez de tels individus sĂ©ropositifs. Certes, on peut songer Ă utiliser des techniques usuelles de culture, mais ces tests sont trop longs et trop coĂ»teux et, en outre, dans le cas du virus
HTLV III-LAV, ils sont aléatoires.
la rendre utilisable de maniĂšre sĂ»re pour les besoins pratiques. On sait, en effet, que lorsqu'un individu a Ă©tĂ© en contact avec le virus, sans pour autant ĂȘtre atteint du
SIDA, il devient sĂ©ropositif et cet Ă©tat comporte des risques car les Ă©tudes les plus rĂ©centes montrent qu'il peut y avoir alorsune Ă©volution lente et progressive vers la mala die proprement dite du SIDA. Pour les besoins de la prĂ©vention, il est donc hautement souhaitable de disposer d'un procĂ©dĂ© de diagnostic et de dĂ©pistage du virus HTLV III-LAV chez les individus sĂ©ropositifs.On dispose dĂ©jĂ de tests devenus classiques, permettant d'Ă©tablir si un indiyidu est, ou non, sĂ©ropositif. Mais, Ă la connaissance du demandeur, il n'existe pas de procĂ©dĂ© complĂ©mentaire permettant d'authentifier la prĂ©sence du virus lui-mĂȘme chez de tels individus sĂ©ropositifs. Certes, on peut songer Ă utiliser des techniques usuelles de culture, mais ces tests sont trop longs et trop coĂ»teux et, en outre, dans le cas du virus
HTLV III-LAV, ils sont aléatoires.
L'invention a pour objet de rĂ©pondre- aux besoins pratiques prĂ©citĂ©s, en proposant un procĂ©dĂ© de dĂ©pistage chez les individus sĂ©ropositifs, dont les rĂ©sul-tats sont de toute Ă©vidence d'une extrĂȘme importance pour se prononcer sur l'Ă©volution de tels individus vers la maladie.
L'invention concerne donc un procédé pour le dépistage, chez les individus séropositifs, des séquences d'ADN du rétrovirus HTLV III-LAV, procédé dans lequel on applique une technique générale d'hybridation moléculaire comprenant les étapes suivantes:
a) on prélÚve le sang des individus examinés pour en isoler de maniÚre connue les cellules blanches et obtenir de l'ADN lymphocytaire, qui est utilisé en quantité unitaire égale à au moins 30
b) on traite ladite quantité d'ADN lymphocytaire par une enzyme de restriction ne coupant pas à l'intérieur de la séquence de l'AON du virus.
a) on prélÚve le sang des individus examinés pour en isoler de maniÚre connue les cellules blanches et obtenir de l'ADN lymphocytaire, qui est utilisé en quantité unitaire égale à au moins 30
b) on traite ladite quantité d'ADN lymphocytaire par une enzyme de restriction ne coupant pas à l'intérieur de la séquence de l'AON du virus.
c) on fait passer le milieu de l'étape b) qui contient le virus sous forme libre ou intégrée, sur un filtre de nitrocellulose ceable de retenir jusqu'à 80 jt,Lg d'ADN par cm2 de surface.
d) on met en contact le produit retenu par le filtre avec une sonde, qui est une sonde clonée et marquée du virus HTLV III-LAV, ladite sonde étant un fragment souscloné de l'ADN du virus qui ne comporte pas la partie codante pour la région enveloppe du virus, le marquage étant capable de donner une activité aussi proche que possible de la valeur de 5.109 cpm par 89 d'ADN de la sonde, potamment une activité de 5.108 à 1.109 cpm/ a9 d'ADN.
e) on révÚle de façon connue la présence de bandes caractéristiques du virus.
La technique d'hybridation moléculaire est connue de l'homme du métier et il n'est donc pas nécessaire de la décrire en détail. Dans le cas du rétrovirus HTLV III-LAV, on peut se reporter à l'article de SHAW et al (1985) précédemment mentionné. L'adaptation de cette technique aux besoins de la présente invention ressortira de la description qui suit et de l'exemple pratique donné ci-aprÚs pour illustrer l'invention.
Dans la premiÚre étape du procédé, on prélÚve le sang périphérique des individus examinés et on en isole de maniÚre connue les cellules blanches. AprÚs digestion avec une enzyme appropriée, telle que XbaI, on obtient l'ADN lymphocytaire. Selon une particularité de
la présente invention, on met en oeuvre les quantités d'ADN
lymphocytaire les plus Ă©levĂ©es possibles compatibles avec la charge du filtre utilisĂ© Ă l'Ă©tape c). Cette quantitĂ© unitaire est au moins Ă©gale Ă 30 9 d'ADN. Dans la pratique, des fourchettes de 30 Ă 50 /I,tg peuvent ĂȘtre utilisĂ©es. Les valeurs infĂ©rieures Ă 30 > 9 ne permettent pas d'obtenir une rĂ©ponse suffisamment sĂ»re. Par ailleurs, au delĂ de 80
il faut prélever des quantités de sang trop importantes; en outre on arrive à la limite d'utilisation du filtre de
l'Ă©tape c).Des quantitĂ©s unitaires d'ADN Iymphocytaire comprises entre 30 et SO Jig peuvent ĂȘtre facilement obtenues Ă partir d'environ 10 millions de cellules blanches du sang des individus examinĂ©s. Ainsi qu'il est usuel dans cette technique, ces quantitĂ©s unitaires sont dĂ©posĂ©es dans des puits respectifs de gel, par exemple de gel d'agarose.
la présente invention, on met en oeuvre les quantités d'ADN
lymphocytaire les plus Ă©levĂ©es possibles compatibles avec la charge du filtre utilisĂ© Ă l'Ă©tape c). Cette quantitĂ© unitaire est au moins Ă©gale Ă 30 9 d'ADN. Dans la pratique, des fourchettes de 30 Ă 50 /I,tg peuvent ĂȘtre utilisĂ©es. Les valeurs infĂ©rieures Ă 30 > 9 ne permettent pas d'obtenir une rĂ©ponse suffisamment sĂ»re. Par ailleurs, au delĂ de 80
il faut prélever des quantités de sang trop importantes; en outre on arrive à la limite d'utilisation du filtre de
l'Ă©tape c).Des quantitĂ©s unitaires d'ADN Iymphocytaire comprises entre 30 et SO Jig peuvent ĂȘtre facilement obtenues Ă partir d'environ 10 millions de cellules blanches du sang des individus examinĂ©s. Ainsi qu'il est usuel dans cette technique, ces quantitĂ©s unitaires sont dĂ©posĂ©es dans des puits respectifs de gel, par exemple de gel d'agarose.
Dans l'étape b) du procédé de l'invention, la quantité précitée d'ADN lymphocytaire est traitée par une enzyme de restriction choisie de façon telle qu'elle n'a pas, normalement, de site de reconnaissance à 1' intérieur de la séquence de l'ADN du virus. Ceci a pour effet de concentrer le signal finalement obtenu en un petit nombre de bandes autoradiographiées de grande taille, correspondant au virus Vibre et à ses différentes conformations. A titre d'enzyme convenant aux besoins du procédé de l'invention, il faut citer en premier lieu l'enzyme Xbal dont on sait qu'elle ne coupe pas à I'intérieur de la séquence virale voir HAHN B.H., SHAW G.M., ARYA S.K., POPOVIC M., GALLO
R.C., et WDNG-STAAL F., (1984) Molecular cloning and characterization of the HTLV I virus associated with AIDS. Nature, 312 . 166-169. D'autres enzymes Ă©quivalentes sont cependant utilisables.
R.C., et WDNG-STAAL F., (1984) Molecular cloning and characterization of the HTLV I virus associated with AIDS. Nature, 312 . 166-169. D'autres enzymes Ă©quivalentes sont cependant utilisables.
Dans l'Ă©tape c) du procĂ©dĂ© de l'invention, on utilise un filtre en nitrocellulose d'une grande sensibilitĂ© prĂ©sentant, par cm2 de surface, la charge la plus Ă©levĂ©e possible. Les caractĂ©ristiques de ce filtre sont compatibles avec les quantitĂ©s unitaires d'ADN lymphocytaire mises en oeuvre Ă l'Ă©tape a). Le filtre est capable de retenir au moins 30 pv9 d'ADN et de prĂ©fĂ©rence jusqu'Ă 80 ,49 d'ADN par cm2 de surface. Dans la pratique, les filtres Millipore, ou mieux le filtre Sartorius Schleicher & Schull BA85 peuvent ĂȘtre utilisĂ©s.Dans ce dernier cas, des expĂ©riences prĂ©liminaires utilisant 1 'ADN de la culture H9v3 comme test ont montrĂ© que jusqu'Ă 0,1 pg d'ADN de la sonde clonĂ©e dĂ©posĂ©e Ă©tait dĂ©tectable par la technique dĂ©crite ici; ceci revient Ă dire qu'environ 104 moiĂ©cules d'ADN sont ainsi dĂ©tectables, soit en thĂ©orie une cellule infectĂ©e sur 500.
Dans l'Ă©tape dj, on utilise une sonde qui est un fragment sous-clonĂ© de l'ADN du virus, qui ne comporte pas la partie codante pour la rĂ©gion enveloppe, variable, par nature, dans les differents isolats. Dans la pratique, les meilleurs rĂ©sultats ont Ă©tĂ© obtenus avec une sonde constituĂ©e par le fragment Sst I-5' de o\BH-10, qui ne correspond qu'Ă l'extrĂ©mitĂ© 5' et Ă la partie mĂ©diane du gĂ©nome. De telles sondes sont connues de l'homme du mĂ©tier. Op peut se rĂ©fĂ©rer Ă cet Ă©gard Ă la demande de brevet europĂ©en publiĂ©e sous le NO 0173529.Selon une autre caractĂ©ristique trĂšs importante du procĂ©dĂ© de l'invention, le marquage doit ĂȘtre capable de fournir une activitĂ© spĂ©cifique trĂšs Ă©levĂ©e, aussi proche que possible de la valeur de 5.109 cpm par d'ADN de la sonde, soit de prĂ©fĂ©rence une activitĂ© de 5.108 Ă 1.109 cpml vil9 d'ADN. Dans la pratique on obtient une tel
le activité avec un systÚme de marquage utilisant une grande quantité d'amorces de petites tailles et le marquage au dCTP utilisant la polymérase de Klenow; ou le marquage par déplacement de coupure (dit nick-translation) faisant intervenir deux radioéléments (dCTP+dATP) à 800 Cu/mole (kit froid
N5500 et marquage PB 10384 et PB10385 d'Amersham - voir exemple ci-aprĂšs).
le activité avec un systÚme de marquage utilisant une grande quantité d'amorces de petites tailles et le marquage au dCTP utilisant la polymérase de Klenow; ou le marquage par déplacement de coupure (dit nick-translation) faisant intervenir deux radioéléments (dCTP+dATP) à 800 Cu/mole (kit froid
N5500 et marquage PB 10384 et PB10385 d'Amersham - voir exemple ci-aprĂšs).
La révélation est réalisée de maniÚre connue par exposition autoradiographique. On a constaté, lors de la mise en oeuvre de l'invention, qu'une durée d'exposition de quelques jours, par exemple 4 jours, suffisait pour la lecture et, par conséquent le dépistage.
Le procédé selon l'invention, qui utilise la technique de l'hybridation moléculaire, peut en particulier comporter les principales étapes suivantes : (1) extraction de l'ADN lymphocytaire long brin par un mélange phénolchloroforme aprÚs digestion protéique par la protéinase K; (2) dosage spectrophotométrique de l'ADN obtenu, vérification de sa longueur sur minigel d'agarose, et de sa digestibilité par essai nucléasique; (3) digestion par l'enzyme de restriction XbaI, en excÚs de 5 unités par 9 d'ADN à digérer; (4) étalement des fragments de restriction sur gel d'agarose à 0,8% en tampon de transfert 10xSSC; (5) marquage de la sonde par déplacement de coupure au 32PdCTP+dATP à 800 culmmole pour 250 Ci; (6) hybridation de la sonde dénaturée avec le filtre en tampon 5xSSC, 10xDenhardt, 0,1%
SDS, 50 rrM EDTA, 50 rrM Tris-HC1 pH = 7,5 avec 10 mglml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé pendant 48,heures à 670C; (7) lavage final en tampon IxSSC et 0,1% SDS; (8) séchage du filtre et son inclusion dans une cassette comportant deux écrans renforçateurs en présence de films sensibles, I'autoradiographie étant poursuivie jusqu'à I mois à -700C; (9) révélation des bandes autoradiographiées; (10) lecture des bandes autoradiographiées sur plateforme éclairante en se servant comme échelle de taille de l'ADN du phage digéré par Hind III.
SDS, 50 rrM EDTA, 50 rrM Tris-HC1 pH = 7,5 avec 10 mglml d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé pendant 48,heures à 670C; (7) lavage final en tampon IxSSC et 0,1% SDS; (8) séchage du filtre et son inclusion dans une cassette comportant deux écrans renforçateurs en présence de films sensibles, I'autoradiographie étant poursuivie jusqu'à I mois à -700C; (9) révélation des bandes autoradiographiées; (10) lecture des bandes autoradiographiées sur plateforme éclairante en se servant comme échelle de taille de l'ADN du phage digéré par Hind III.
La Fiv. 1 du dessin annexé représente les bandes radiographiées obtenues dans le cas (1) d'un individu séropositif > O, (2) dans celui d'un individu séroposifif (O, et de la culture H9v3; dans ce dernier cas, I'accolade re présente les sites multiples d'intégration.
Ainsi, on observe chez les individus séropositifs les fragments Xbal suivants:
- un fragment géant, correspondant à l'ADN de haut poids moléculaire n'ayant pas, ou peu, pénétré dans le gel,
- un fragment à environ 13kob, correspondant au virus sous forme circulaire et coupé de façon hap lotoni que,
- un fragment à environ 9kb, correspondant au virus sous forme linéaire. Ces deux derniÚres bandes correspondent à la forme libre du virus.
- un fragment géant, correspondant à l'ADN de haut poids moléculaire n'ayant pas, ou peu, pénétré dans le gel,
- un fragment à environ 13kob, correspondant au virus sous forme circulaire et coupé de façon hap lotoni que,
- un fragment à environ 9kb, correspondant au virus sous forme linéaire. Ces deux derniÚres bandes correspondent à la forme libre du virus.
Par comparaison, l'ADN de H9v3 dans les mĂȘmes conditions donne un signal correspondant au fragment gĂ©ant, ainsi qu'un autre de grande taille dont les limites de poids, floues, indiquent les modalitĂ©s d'intĂ©gration polyclonale du virus.
La photographie de la Figure I, qui représente trois canaux de migration du gel illustre les signaux observables sur l'autoradiogramme, lesquels matérialisent les résultats du procédé de l'invention. Dans le cas de la lignée
H9v3 il existe un signal, faible, dans la région de l'ADN de haut poids moléculaire, qui pénÚtre mal dans les puits du gel; I'essentiel du signal est représenté par une tache étalée en poids (cette tache est intense, car chaque cellule de la culture comporte de l'ordre de 50 à 100 particules virales); cet étalement provient du fait que l'intégration du virus au niveau de l'ADN humain se fait de façon polyclonale (il existe des sites multiples d'insertion). Dans le cas du canal 1, celui-ci concerne un individu séropositif positif pour le signal.Trois bandes autoradiographiées sont présentes: une dans l'ADN de haut poids moléculaire, qui ne pénÚtre pas dans le puits du gel; et deux bandes autoradio- graphiées de taille approximative 13 et 9kb correspondant à la forme libre du virus, probablement sous deux conformations différentes (surenroulées et/ou relùchées). Certains individus sont fortement positifs (c'est le cas représente
Fig. 1) avec bandes nettes particuliĂšrement marquĂ©es, visibles dĂšs aprĂšs 4 jours d'autoradiographie. Dans le cas du canal 2, celui-ci concerne un individu sĂ©ropositif, mais nĂ©gatif pour le signal (mĂȘme aprĂšs exposition prolongĂ©e).
H9v3 il existe un signal, faible, dans la région de l'ADN de haut poids moléculaire, qui pénÚtre mal dans les puits du gel; I'essentiel du signal est représenté par une tache étalée en poids (cette tache est intense, car chaque cellule de la culture comporte de l'ordre de 50 à 100 particules virales); cet étalement provient du fait que l'intégration du virus au niveau de l'ADN humain se fait de façon polyclonale (il existe des sites multiples d'insertion). Dans le cas du canal 1, celui-ci concerne un individu séropositif positif pour le signal.Trois bandes autoradiographiées sont présentes: une dans l'ADN de haut poids moléculaire, qui ne pénÚtre pas dans le puits du gel; et deux bandes autoradio- graphiées de taille approximative 13 et 9kb correspondant à la forme libre du virus, probablement sous deux conformations différentes (surenroulées et/ou relùchées). Certains individus sont fortement positifs (c'est le cas représente
Fig. 1) avec bandes nettes particuliĂšrement marquĂ©es, visibles dĂšs aprĂšs 4 jours d'autoradiographie. Dans le cas du canal 2, celui-ci concerne un individu sĂ©ropositif, mais nĂ©gatif pour le signal (mĂȘme aprĂšs exposition prolongĂ©e).
Ces rĂ©sultats montrent que la lecture des rĂ©sultats procurĂ©s par le procĂ©dĂ© de l'invention peut ĂȘtre faite de maniĂšre sĂ»re et reproductible pour dĂ©celer la prĂ©sence du virus HTLVIII-LAV chez les individus sĂ©ropositifs.
Sur un total de quatorze individus examinĂ©s, neuf montrent les sĂ©quences virales. Sur ces neuf positifs, quatre d'entre eux montrent des bandes plus intenses et sont donc qualifiĂ©s de positifs intenses, les cinq autres ne montrant que faiblement les bandes, et ce, mĂȘme aprĂšs exposition prolongĂ©e; ces diffĂ©rences d'intensitĂ© sont indĂ©pendantes de la quantitĂ© d'ADN dĂ©posĂ©e dans chaque puits et reflĂštent sans doute le nombre de copies virales prĂ©sentes.
Le fait que les trois bandes observées correspondent bien aux séquences du virus est indiqué pour les raisons suivantes:
- le signal obtenu l'est aprÚs hybridation avec une sonde spécifique,
- les bandes de taille attendue sont observées,
- elles sont voisines de celles de la culture H9v3 de contrĂŽle.
- le signal obtenu l'est aprÚs hybridation avec une sonde spécifique,
- les bandes de taille attendue sont observées,
- elles sont voisines de celles de la culture H9v3 de contrĂŽle.
Dans le cas d'un ADN témoin pris au hasard dans la population et digéré par Xbal, les bandes ne sont pas visibles. Elles ne le sont pas non plus dans le cas d'un
SIDA vĂ©ritable, dans les mĂȘmes conditions; comme dĂ©jĂ signalĂ©, la dĂ©tection du virus par cette mĂ©thode n'est pas pratiquable pour les malades (dans ce cas, la quantitĂ© de cellules T4 est trĂšs abaissĂ©e, et l'essentiel du virus se trouve sous forme d'ARN).
SIDA vĂ©ritable, dans les mĂȘmes conditions; comme dĂ©jĂ signalĂ©, la dĂ©tection du virus par cette mĂ©thode n'est pas pratiquable pour les malades (dans ce cas, la quantitĂ© de cellules T4 est trĂšs abaissĂ©e, et l'essentiel du virus se trouve sous forme d'ARN).
Les bandes observées ne sont pas le résultat d'une contamination de la sonde par le phage /\. Digéré par XbaI, celui-ci donne deux fragments de restriction à 23,9 et 24,5 kb, nettement plus grands que ceux observés, comme établi dans une digestion témoin de ce type. Par contre, la présence des séquences virales livres dans l'ADN lymphocytaire des individus > O séropositifs est prouvée en faisant migrer de l'ADN de ces individus non digérés sur le gel, et hybridant les canaux correspondants avec la sonde : dans la plupart des cas, un signal est obtenu, intense, dans l'ADN non digéré (séquences intégrées), un autre, beaucoup plus faible, dans une bande de poids moléculaire ~ ßOkb (forme libre).
L'invention a également pour objet un coffret ou trousse, contenant les ingrédients nécess-aires à la mise en oeuvre du procédé. Les quantités unitaires de ces ingrédients dépendront du nombre d'échantillons qu'il est envisagé de traiter. Le coffret selon l'invention comprend essentiellement:
- une sonde HTLV III-LAV, par exemple la sonde correspondant au sous-clone nBH-5, excisée du phage A
- une préparation de l'ADN du phage A digéré par
XbaI, utilisée comme témoin,
- I'enzyme XbaI dans le tampon de conservation de l'enzyme,
- le tampon de digestion de l'enzyme.
- une sonde HTLV III-LAV, par exemple la sonde correspondant au sous-clone nBH-5, excisée du phage A
- une préparation de l'ADN du phage A digéré par
XbaI, utilisée comme témoin,
- I'enzyme XbaI dans le tampon de conservation de l'enzyme,
- le tampon de digestion de l'enzyme.
Pour le marquage, les produits utilisables sont, par exemple, ceux mis sur le marché par la Société Amersham
France, Avenue du Canada 91944 Les Ulis France tels que:
- kit froid N5500 (tampon de nick-translation et enzymes)
- q P32 dCTP (PB 10385) et P32 dATP (PB 10384) Ă 800 Ci/mmole (250 ptCi de chaque).
France, Avenue du Canada 91944 Les Ulis France tels que:
- kit froid N5500 (tampon de nick-translation et enzymes)
- q P32 dCTP (PB 10385) et P32 dATP (PB 10384) Ă 800 Ci/mmole (250 ptCi de chaque).
Une variante froide de marquage (par exemple marquage par sulfonation de base actuellement commercialisĂ© par la SociĂ©tĂ© Organics, 12 avenue du PrĂ©sident Salvador Allende 94402 Vitry-sur-Seine, France) peut Ă©galement ĂȘtre utilisĂ©e.
En variante, on peut aussi pratiquer des hybridations in situ en utilisant un marquage froid ou un marquage radioactif, par exemple H3
L'invention sera encore illustrée par un exemple
illustratif complet de mise en oeuvre.
L'invention sera encore illustrée par un exemple
illustratif complet de mise en oeuvre.
EXEMPLE:
20 ml de sang total sont prélevés sur EDTA à 5% dans l'eau physiologique. Le plasma est éliminé par aspiration à la trompe à vide aprÚs centrifugation pendant 5 minutes à 1500 rpm. La lyse des globules rouges est obtenue en ajoutant au culot frais 50 ml de tampon SLR (Tris 10 rrM, MgC12 5mM, NaCI 10 mM); une homogénéisation est obtenue jusqu'à un aspect laqué, puis une centrifugation est effectuée 5 à 10 minutes à 2000 rpm; le surnageant est ensuite aspiré à la trompe à vide. La solution de protéinase K est préparée dans le tampon TE (Tris-EDTA) à une concentration finale de 0,2 mg/ml.Le culot obtenu précédemment est redissous dans 3 ml du tampon SLR et redissous à nouveau dans 20 ml de tampon SLB (Tris 10 nM, EDTA 10 mM, NaCI 50 rrM, SDS à 0,2 et la protéinase K à 3 mg par tube; on obtient ainsi un bloc visqueux qui est homogénéisé, puis mis à agiter doucement (45 à 50 rpm au bain-marie orbital) pendant la nuit à 420C.
20 ml de sang total sont prélevés sur EDTA à 5% dans l'eau physiologique. Le plasma est éliminé par aspiration à la trompe à vide aprÚs centrifugation pendant 5 minutes à 1500 rpm. La lyse des globules rouges est obtenue en ajoutant au culot frais 50 ml de tampon SLR (Tris 10 rrM, MgC12 5mM, NaCI 10 mM); une homogénéisation est obtenue jusqu'à un aspect laqué, puis une centrifugation est effectuée 5 à 10 minutes à 2000 rpm; le surnageant est ensuite aspiré à la trompe à vide. La solution de protéinase K est préparée dans le tampon TE (Tris-EDTA) à une concentration finale de 0,2 mg/ml.Le culot obtenu précédemment est redissous dans 3 ml du tampon SLR et redissous à nouveau dans 20 ml de tampon SLB (Tris 10 nM, EDTA 10 mM, NaCI 50 rrM, SDS à 0,2 et la protéinase K à 3 mg par tube; on obtient ainsi un bloc visqueux qui est homogénéisé, puis mis à agiter doucement (45 à 50 rpm au bain-marie orbital) pendant la nuit à 420C.
Le phénol utilisé pour l'extraction est saturé en
Tris 0,2 M à pH = 7,6. Une premiÚre extraction est pratiquée dans 314 de phénol/4 de chloroforme et 1/24 d'alcool isoamylique; la phase aqueuse supérieure est éliminée à la pipette. Une seconde extraction est ensuite préparée en phénol-chloroforme; les deux phases se séparent ensuite et i 'ADN se trouve dans la phase supérieure; la phase organique inférieure est éliminée à la seringue. Une troisiÚme extraction est enfin pratiquée pour éliminer le phénol avec le chloroforme + acide isoamyl ique.
Tris 0,2 M à pH = 7,6. Une premiÚre extraction est pratiquée dans 314 de phénol/4 de chloroforme et 1/24 d'alcool isoamylique; la phase aqueuse supérieure est éliminée à la pipette. Une seconde extraction est ensuite préparée en phénol-chloroforme; les deux phases se séparent ensuite et i 'ADN se trouve dans la phase supérieure; la phase organique inférieure est éliminée à la seringue. Une troisiÚme extraction est enfin pratiquée pour éliminer le phénol avec le chloroforme + acide isoamyl ique.
Dans la phase résiduelle l'ADN est précipité par ajout de 300 F de NaCI 3M et en complétant avec 50 ml d'éthanol absolu à - 200C. L'éthanol est éliminé à la pipette et I'ADN précipité récupéré à la pipette inversée; on rince plusieurs fois à l'méthanol absolu.
L'ADN est resuspendu dans 2 à 4 ml de TE à 40C pendant plusieurs jours. Il est dosé à DO260, et le contrÎle de sa taille est effectuée en minigel d'agarose à 0,7% et coloration au bromure d'éthidium dans le tampon TEA.
La quantité indiquée d'ADN pour chaque échantillon est digérée par l'enzyme de restriction XbaI en excÚs de 5 unités par $Xg d'ADN. Les fragments de restriction sont ensuite étalés sur gel d'agarose horizontal à 0,8%.
AprÚs migration le gel est dépuriné (HCl 0,25 M), dénaturé (NaOH 0,5M en NaCI lM) et neutralisé (Tris 0,5 en
NaCI 1,5M Ă pH = 7,0). Le tampon de transfert est le 10 x
SSC, le transfert sur filtre de nitrocellulose étant réalisé pendant la nuit. Le filtre est enfin séché et l'ADN y est fixé au four à 80 C pendant 6 heures.
NaCI 1,5M Ă pH = 7,0). Le tampon de transfert est le 10 x
SSC, le transfert sur filtre de nitrocellulose étant réalisé pendant la nuit. Le filtre est enfin séché et l'ADN y est fixé au four à 80 C pendant 6 heures.
La sonde utilisée est la sonde constituée par le fragment Sst I-5' de #-BH-10. Elle est marquée par nicktranslation avec dCTP+dATP à 8000 Cu/mole.
Le filtre est préhybridé à 650C au bain marie orbital dans un sac plastique scellé contenant : 25 ml de tampon 5x SSC (1 heure), puis 5x SSC, 10xDenhardt (D),.0,1% SDS (1 heure), puis 5xSSC, 10xD, 1rrM EDTA et 0,1% SDS additionné de 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon (ss) dénaturé et soniqué (une nuit).
L'hybridation avec la sonde dénaturée est réalisée dans 10 ml: 5xSSC, 10xD, 0,1% SDS, SrrM EDTA, 50mM Tris-HCI pH =7,5 et 10 mglml d'ADN ss à 670C au bain-marie orbital pendant au moins 24 heures.
AprÚs hybridation les filtres sont lavés dans les bains successifs: (250 ml dans une bolte à 660C): 30 minutes en 5xSSC, 10xD, 0,148 SDS, 0,1% NaPPi, puis 30 minutes en 3SSC, 10xD, 1% SDS, 0,1% NaPPI, puis 15 minutes en 2xSSC, 1xD, 0,1% SDS, 0,1% NaPPi et le temps nécessaire (suivi au compteur) en tampon 1SSC, IxD, 0,1% SDS, 0,1% NaPPi.
Les filtres sont ensuite séchés sous la lampe, fixés sur papier Wathman 3Mvl et enrobés d'un film plastique, puis disposés pour autoradiographie à - 700C pendant 1 à 30 jours dans une cassette comportant deux écrans renforçateurs.
Les autoradiogrammes sont révélés pendant 5 minutes, rincés à l'eau, fixés pendant 5 minutes, relavés et séchés au séchoir. La taille des bandes autoradiographiées est calculée par rapport à celle de l'échelle de taille représentée par les fragments Hind III de l'ADN de phage 2\
L'exemple dĂ©taillĂ© cĂŹ-dessus est illustratif mais nullement limitatif du procĂ©dĂ© de l'invention. Des variantes sur le mode opĂ©ratoire peuvent ĂȘtre apportĂ©es par l'homme du mĂ©tier.
L'exemple dĂ©taillĂ© cĂŹ-dessus est illustratif mais nullement limitatif du procĂ©dĂ© de l'invention. Des variantes sur le mode opĂ©ratoire peuvent ĂȘtre apportĂ©es par l'homme du mĂ©tier.
Claims (8)
1. Procédé pour le dépistage, chez les individus séropositifs, des séquences d'ADN du rétrovirus HTLV
III-LAV, procédé dans lequel on applique une technique généra le d'hybridation moléculaire comprenant les étapes suivantes:
a) on prélÚve le sang des individus examinés pour en isoler de maniÚre connue les cellules blanches et obtenir de I'ADN lymphocytaire, qui est utilisé en quantité unitaire égale à au moins 30
b) on traite ladite quantité d'ADN lymphocytaire par une enzyme de restriction ne coupant pas à l'intérieur de la séquence de l'ADN du virus.
c) on fait passer le milieu de l'étape b) qui contient le virus sous forme libre ou intégrée, sur un filtre de nitrocellulose capable de retenir jusqu'à 80 d'ADN par cm2 de surface.
d) on met en contact le produit retenu par le filtre avec une sonde, qui est une sonde clonée et marquée du virus HTLV III-LAV, ladite sonde étant un fragment souscloné de l'ADN du virus qui ne comporte pas la partie codante pour la région enveloppe du virus, le marquage étant capable de donner une activité aussi proche que possible de la valeur de 5.109 cpm par 69 d'ADN de la sonde, notamment une activité de 5.108 à 1.109 cpm/ > 9 d'ADN.
e) on révÚle de façon connue la présence de bandes caractéritiques du virus.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction est Xba I ou une enzyme équivalente.
3. Procédé selon l-'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que la quantité unitaire d'ADN lymphocy taire est comprise entre 30 et 50 g environ.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 3, caractérisé en ce qu'on utilise une sonde correspondant au sous-clone #BH-5, excisée du phage #.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications I sà 4, caractérisé en ce que le marquage de la sonde est un marquage froid ou un marquage radioactif.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications I à 5, caractérisé en ce qu'il comporte les principales étapes suivantes : (1) extraction de I'ADN lymphocytaire long brin par un mélange phénol-chloroforme aprÚs digestion protéique par la protéinase K; (2) dosage spectrophotométrique de l'ADN obtenu, vérification de sa longueur sur minigel d'agarose, et de sa digestibilité par essai nucléasique; (3) digestion par l'enzyme de restriction XbaI, en excÚs de 5 unités par > g d'ADN à digérer; (4) étalement des fragments de restriction sur gel d'agerose à 0,8 en tampon de transfert 10xSSC; (5) marquage ce la sonde par déplacement de coupure au 32PdCTP+dATP à 800 cuimmole pour 250 ssCi; (6) hybridation de la sonde dénaturée avec le filtre en tampon 5xSSC, 10xDenhardt, 0,1% SDS, 50 rrM EDTA, 50 rrM Tris-HC1 pH = 7,5 avec 10 mglm d'ADN de sperme de saumon soniqué et dénaturé pendant 48 heures à 670C; (7) lavage final en tampon IxSSC et 0,1% SDS; (8) séchage du filtre et son inclusion dans une cassette comportant deux écrans renforçateurs en présence de films sensibles, i 'autoradiographie étant poursuivie jusqu'à I mois à -700C; (9) révélation des bandes autoradiographiées; (10) lecture des bandes autoradiographiées sur plateforme éclairante en se servant comme échelle de taille de l'ADN du phageAdigéré par Hind III.
7. Coffret ou trousse pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications I à 6, caractérisé en ce qu'il comprend partiellement:
- une sonde HTLV IIl-LAV, par exemple la sonde correspondant au sous-clone /\BH-5, excisĂ©e du phage Ă
- une préparation de I'ADN du phage # digéré par
XbaI, utilisée comme-témoin,
- I'enzyme XbaI dans le tampon de conservation de l'enzyme,
- le tampon de digestion de l'enzyme.
8. Coffret selon la revendication 7, caractérisé en ce que le marqueur est radioactif ou froid.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8608873A FR2600342B1 (fr) | 1986-06-19 | 1986-06-19 | Procede pour le depistage, chez les individus seropositifs, des sequences d'adn du retrovirus htlv iii-lav et coffret pour sa mise en oeuvre |
| EP87904056A EP0270642A1 (fr) | 1986-06-19 | 1987-06-18 | Procede pour le depistage, chez les individus seropositifs des sequences d'adn du retrovirus htlv iii-lav et coffret pour sa mise en uvre |
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Non-Patent Citations (1)
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| SCIENCE, vol. 226, 7 décembre 1984, pages 1165-1171; G.M.SHAW et al.: "Molecular characterization of human T-cell leukemia (Lymphotropic) virus type III in the acquired immune deficiency syndrome" * |
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| US20220243281A1 (en) * | 2019-05-28 | 2022-08-04 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for preserving dna methylation |
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