JPH01500037A - Ｋｂｂｌのガン治療用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 にＢ（３Ｌ　／）ガン沿疲月進 発明の背景 本願は選択した不飽和アルデヒド及びケトンとアスコルビン酸とのマイクル付加 生成物に関するものである。これはＬ−アスコルビン酸とその異性体であるＤ− アスコルビン酸の両者を包含する。Ｌ−アスコルビン酸はビタミンＣとしても知 られている０本願はまた主活性成分として上記生成物を含有する医薬組成物及び 動物の免疫応答を刺激するのにこの生成物を使用する方法に関する。

本発明の化合物は免疫調節剤として有用である。この化合物は動物及び人間への 投与に際し通常の医薬用稀釈剤と調合することができる。この化合物及びこれを 含有する組成物は罪常に低濃度で免疫ｉ１１節゛活性、特に免疫刺激性を有する 。従って、この化合物は免疫系の刺激を必要とする哺乳動物の種々の病気の治療 に有用である。たとえば化学療法や放射純療法の後の免疫系の刺激である。この 生成物はまたサツプレッサー細胞の望ましくない高濃度を特徴とするはしか、レ トロウィルス（ＩＩＬＴＶ−１ｆｆ）及び癩病の如き病気においてヘルパー細胞 の増殖を刺激するのに有用である。また、感染の初期段階においてインターロイ キン、インターフェロン及びその他の自然リンフ才力インの生産を刺激するのに 有用である。

免疫系は高等動物における病原菌及びその他の外部蛋白質に対する主要な防御の 一つである。免疫応答は特定の抗原に応答する特定の抗体蛋白質の作用によって 仲介される。抗原は個体と異なるかなり高分子量の物質、主として蛋白質である 。これはしばしば細胞の外部表面上に存在する。潜在性抗原はたとえば花粉、組 織の移植片、ある種の腫瘍細胞表面、動物の寄生虫、ウィルス及びバクテリアに 発見することができる。

人間においては、多くの潜在抗原は決して最初の二つの防御線を通過せず、した がって十分な刺激を免疫系にもたらすことができない、これらの二つの第一の防 御線は先づ皮膚、粘膜、涙及び胃酸から成り、次に特定の白血球である顆粒球及 び単球及びマクロファージから成り、このマクロファージは食作用により、即ち 、歌作用により病原菌及び他の潜在抗原を破壊し、かつ異物を破壊する。これら の白血球及びマクロファージは食細胞と呼ばれる。

病原菌や他の異物が体の第一の二つの防御線を通過するとき、免疫応答が開始す る。

免疫防御系には二つの主な部分、体液性免疫と細胞性免疫とがあり両者とも抗原 に応答する０体液性免疫は血漿蛋白質のガンマグロブリン画分中に見られる循環 抗体によるものである。血漿を高速で遠心分離するかコーン法によってエタノー ルで化学的に沈澱せしめるとその成分蛋白質は重量により分離するか、又は両分 と呼ばれる部分に充満する。抗体は通常ガンマグロブリン画分に発見されその成 分は沈降定数約７−１　Ｏ３を有しＩｇ（１，両分は約１５６．０００の分子量 を有する０体液性免疫はバクテリア及びウィルスの感染に対して長期間の保護を もたらす、細胞性免疫は一部分直接リンパ球の相互作用又はリンフ才力インと呼 ばれるその生成物との反応によるものである。この型の免疫はアレルギー反応の 遅延、異った組織の′ｆＳ植に対する拒絶及び腫瘍細胞の拒絶に関与する。この 免疫はウィルス、菌類、寄生物及び結核菌の如き小数のバクテリアによる感染に 対する主たる防御であり、このような感染からの回復の主要な役目をする。

リンパ球と呼ばれる特別の白血球は体液性及び細胞性免疫の両方の作用をする。

リンパ球前駆体は骨の形成前に胚の中で個体発生的（出生前）に造血組織として あられれる。これは先づ卵黄嚢中に卵黄血管と結合した造血細胞の小さいふさ状 のものである「血の島（ｂｌｏｏｄ　１ｓｌａｎｄｓ）　Ｊとして存在する。こ れらの島は幹細胞と称する多能性造血細胞を含有する。胚の成長とともに造血細 胞は付着茎及びこれと隣接する腹部の下垂体前部中の開業床中に入る。肝臓は腸 管上皮細胞からの外転部として開業の同じ部位に移行し、増殖して造血細胞中の 肝コードの構築を確実にする。肝臓はこのようにして分娩が近くなる迄に造血器 官となる。妊娠期間の中間期に骨腔（ｂｏｎｅ　ｃａｖｉｔｙ）は明確な造血組 織となり始める。

哺乳動物が胎児の熟成期に近づくにつれて肝臓において造血機能が低下し、骨髄 が主要な造血器官となる。

出生後、生体のリンパ器官は免疫系を特徴づける免疫適格リンパ球を収容する。

骨髄は幹細胞（すべての骨髄及びリンパ細胞要素の前駆体）を収容する。これら の幹細胞のあるものは人間及び哺乳動物の主なリンパ器官の一つである胸腺に移 行する。胸腺は胸骨の後の上部に存在する多葉器官である。ここで、幹細胞は増 殖し成熟したＴ−リンパ球に分化し、このリンパ球は次に肺臓、リンパ節、扁桃 、突起及び腸管中のバイエル板を含む循環及びシード二次リンパ器官に入る。骨 髄もまた腸管に沿って分配されている腸管付属リンパ系に前Ｂ細胞を接種する。

これらの細胞は次に抗原刺激の影響下に増殖分化し上記の同じ二次リンパ器官に 移動する。Ｔ細胞とＢ細胞とは生物学的、免疫化学的及び生化学的手段により構 造的かつ機能的に区別することができる。

体液性免疫は細胞表面上に特定の抗原に対する免疫グロブリン受容体を有するＢ −リンパ球によって仲介される。これらのリンバ球は非常に特異的であり、各型 の８９７８球はただ一つの抗原に応答する。たとえばバクテリアやウィルスがあ る器官に入ると８９７８球はバクテリアやウィルス表面上の抗原に応答してこれ と結合し、リンパ球は刺激されて分裂する。その娘細胞は形質細胞と呼ばれる特 別の細胞に分化する。これらの細胞は多量の抗体を生産し、次に一般循環系中に 分泌する。この抗体はその生産を刺激した抗原に対して特異的でありこの抗原の みと反応する。形質細胞によって抗原に対する応答として生成した抗体は細胞親 和性抗体として区別することができる。即ちこれらは細胞性抗原と結合し末端循 環系において単球、マクロファージ及び多形核顆粒球により食作用を高める。こ のような抗体は細胞障害抗体でもよく、補体の存在下細胞性抗原と結合して障害 を起こすことができる。他の抗体は特定の抗原に感受性をもたせたＴ細胞の存在 下で腫瘍細胞やウィルス感染細胞の抗体依存性細胞障害を起こすことができる。

毒素やウィルスに対して産生じた抗体は生物学的活性に対する適切な部位と結合 して毒性や感染を消失せしめることができる。更に他の抗体は抗体分子のイディ オタイプ決定基（分子の可変部）に向けることができ、かくすることにより抗体 イディオタイプ抗体又は抗抗体（抗体２）として定義されるものであり、これら は特定の抗体合成の調整や抗体レベルの保持をすることができる。後者のカスケ ードにおいては抗体を抗イデイオタイプに形成し原抗原に対して特異性を有する 新しい抗体（抗体３）を生成することができる。後者は原抗原の反応テストを受 けたことのない免疫感作された動物を用いることなしに達成することができる。

このような技術は自己免疫疾患又は悪性疾患の進行を変化させる上で価値がある 。

一度病原体が体内に入り免疫応答が始ると抗体は１０乃至１４日後に形成される 。この最初の反応は一次応答又は−次免疫感作と呼ばれる。しかし、この期間、 病原体も分裂し種々の疾患の症候を発現する。すべての病原体を除去するに充分 の抗体をつ（り出すには何日も何週間もかかるが、一度消失すると症候も消失す る。リンパ球、形質細胞及び抗体は血液中に残存し循環するので同じ病原体が二 回目に体内に入るとＢ−記憶リンパ球は速やかに応答し抗体産生を開始する。こ のような感作リンパ球の応答は二次応答と呼ばれる。二次応答により現在血漿中 を循環しているよりも高レベルの抗体産生が得られる。非常に多数の抗体が急速 に産生されるので微生物自身が樹立し、分裂することができず、後の環境の下で は発病させることができないのである。

免疫グロブリンのＩｇＥイソタイプによって産生された体液性免疫はその遠心性 応答の一つとして枯草熱の場合にみられるように予め感作した生物が数分以内に 抗原に応答するという事実から考えると即時型過敏症を有している。即時型過敏 症の他の例はアナフィラキンーショックであり、これはすでに感作された抗原に さらされたときに起り易い高度のアレルギー反応である。往々にして、この体液 性応答は死を招くことがある。

体液性免疫は自然的及び人工的に誘発することができる。能動自然免疫の場合は それぞれの８９７８球は感染後循環し抗体の産生を活性化し続ける。この能動自 然免疫は何年もの間、あるいは−生の間有効である。幼児が出生後数日以内に母 親からの初乳を飲みこれから抗体を受けるとこの抗体はその後−年間は免疫を与 える。この場合幼児は実際の抗体産生を行なっていないのでこれは受働自然免疫 として知られている。能動人工免疫は生体内に死んだあるいは弱った（弱毒）細 菌や合成抗原を注射することにより誘発される。これらの抗原は８９７８球を更 に刺激して病原体に対する抗体を産出することができる。この個体がその後ビル レント細菌にさらされるとこの個体はすでに感作されており、即時応答して抗体 を二次的（記憶）に多量に産生ずる。能動人工免疫は追加免疫により何年もの間 又は永久に続き得る。また、約１ケ月の保護を与える受動人工免疫もある。この 一時的免疫は他の人間又は動物から得た抗体を注射することにより得られる。こ れは普通、危険状態の場合又は伝染病の場合にのみ使用される。リンパ球はバイ パスされるので、抗体の産出もしないし抗原の「記憶」もせず、このことはこの 方法の一時的効力を示す。

体液性免疫と対照的に細胞性免疫においては循環する抗体を検出することはでき ない、この型の免疫を媒介するＴ−リンパ球は移植片、腫瘍、バクテリア、寄生 物又はウィルスの場合のように他の生体からの細胞上の抗原と出会うと活性化さ れる。８９７８球と同様に１９７８球は特異的であり冬型の１９７８球はただ一 つの抗原と反応する。末端循環系における１９７８球は免疫応答において異なっ たエフェクター機能を有するサブ集団に分かれる。

Ｔヘルパーインデューサーサブ集団は抗原に対する特別の受容体を有しＢ細胞に よる抗原に対する特定の抗体の産出の増大化の役目をする。Ｔヘルパーインデュ ーサーは人間においてＴ−４抗原と称する表面マーカーによって固定され単クロ ーン抗体とともに検出することができる。他のキーニー９フす球サブ集団はＴ− サブレフサ−インデューサー（Ｔ−８抗原表面マーカー）リンパ球であり、これ は特定の抗原に対する特定のＴ及びＢ細胞の応答の大きさを調節するものである 。また、標的腫瘍又は移植片又はウィルス感染細胞と直接結合してこれらを破壊 することのできるＴ−細胞障害（キラー）細胞がある。更に、Ｔ細胞は抗原に対 する応答として増殖するとき、異種抗原の除去のみならず免疫応答の調節に関与 するリンフ才力インを産出する。Ｔ細胞は腫瘍細胞、ウィルス感染細胞及びその 他の細胞性抗原に対する細胞媒介免疫に直接関与しこのような疾患状態からの回 復を助長する。また、Ｔ細胞は同種移植拒絶、遅延型皮膚過敏症（ＤＣＨ）、西 洋きづた、オークの木、スーマソク及びある種の金属に対する化学的感作の作用 を行なう、このＤＣＨ反応は抗原にさらしてから発現する迄２４−４８時間かか るのでそのように呼ばれている。新しい抗原に対する細胞性免疫は通常−次（Ｉ ｇＭ）抗体応答が哺乳動物中に起こる前二三日に生じ、長時間免疫の作用をする 記憶Ｔｔｉａ胞である。他のＴリンパ球サブ集団は自然キラー（ＮＫ）Ｔ細胞（ 大顆粒状リンパ球）であり、これらの細胞は前抗原刺激なしに作用を始める。こ れらのＮＫ細胞は腫瘍又はウィルス感染細胞に対して活性であり、インターフェ ロンによる刺激により更に高い活性度（増殖）とすることができる、これらの細 胞は癌に対する「免疫監視」における重要な役目をもたらすものと言われている 。

上述の如くＴ細胞は種々の効果を有する生物学的に活性な種々の有効な分子の総 称であるリンフ才力インを分泌する。これらのＴ細胞リンフォカインのある特定 の例としてはインターロイキン２（Ｔ細胞成長因子）、Ｂ細胞成長因子、インタ ーフェロン（ガンマ）及びマクロファージ産出リンフォリン（ＩＬ−１）がある 。

これらのリンフ才力インは免疫応答において少くとも二つの役目を果す。その一 つは免疫の調節であり、他の一つは腫瘍細胞又はウィルス感染細胞に対して直接 的細胞毒性（破壊）を示すことである。

免疫調節剤はリンパ球増殖の進行を活性化したり阻止したりする０通常のリンパ 球増殖は抗原、マクロファージ、Ｔ及びＢリンパ球間の種々の相互作用による。

更に、ある種の８９７８球はＴＩＪンパ球によって活性化することができるが、 他のものはＴリンパ球と無関係でありただ抗原のみにより直接活性化される。活 性化したＴリンパ球はマクロファージにインターロイキン２（ＩＬ−２）として 知られている分子を生成せしめることができ、これはＴ細胞を活性化し、次に他 のＴ及びＢリンパ球を刺激する。活性化したマクロファージはインターロイキン １　（ＩＬ−１）として知られる分子を生成し、これは更にＴリンパ球の活性化 を誘発する。マイトジェンと呼ばれる化学物質はＤＮＡの合成及び有糸分裂を誘 起することができ、これはＴ及びＢリンパ球における活性のしるしである。ある マイトジェンはただ一種のリンパ球のみに効果を有するが、他のものは多種のリ ンパ球に効果を存する。各種の、そして種々の量の免疫調節剤が免疫系の成分間 の相互作用に影響する０本発明の化合物及び組成物は免疫刺激剤として作用しＴ 及びＢリンパ球の両者に影響する。

免疫系は老化現象のある面と関係づけられており、癌予防に重要であると思われ ている。この系は疲労した赤血球のような細胞の変化や老化及びその次の崩壊の 認知に必要でありこの理由により正常な生体機能に非常に重要である。癌の場合 の一つの説は細胞の悪性転換はかなりしばしば起り得るが、この変化した細胞は 非自己として認められ破壊される。ある種の発癌物質は細胞自体を悪性なものに 転換することによるよりもむしろ免疫応答を抑制することにより作用する。この ことは生体はもはや自然に転換した細胞を破壊することはなく癌性成長を阻止で きず、腫瘍が発生する。このような癌の治療に免疫刺激が有効であろう。

また、人間に発現したある種の腫瘍はその成長の結果寄主の中に免疫の低下した 状態を生成する（即ち、白血病、リンパ腫、呼吸器癌及びＨＴＬＶ誘発腫瘍）。

ある種の癌治療法、たとえば外科、細胞障害による化学療法及び放射線は免疫系 の正常な機能を抑制したり著しい変化を起こしたりする０本発明の化合物及び組 成物の如き免疫刺激剤は免疫系の機能の低下により起り得る種々の感染を攻撃及 び（又は）阻止するのに非常に有効である。

発明の目的 本発明の目的は免疫調節活性、特に免疫刺激活性を有する化合物を提供すること である。

本発明の他の目的はあるものは新規なものである上記化合物の製造方法を提供す ることである。

本発明の更に他の目的は免疫疾患、特に免疫系の刺激を必要とする疾患の治療に 有効な新規組成物を提供することである。

本発明の他の目的、利点及び新規な特徴は下記の詳細な説明から明らかとなろう 。

発明の説明 アスコルビン酸とある特定のケトンとの酸触媒マイクル反応生成物が免疫調節剤 として有用であることが発見された。更に具体的に言えば、本発明の有用な反応 生成物はアスコルビン酸と炭素原子数４〜７のα、β−不飽和脂環式ケトン又は 脂肪族ケトンの飽和部分が１−５の炭素原子を有するビニル脂肪族ケトンとの反 応によって得られるものである。その脂環族及び脂肪族部分は炭素原子数４以下 のアルキルあるいは同様なハロアルキル基、特にトリフルオロメチルのようなフ ルオロアルキル基の如き種々の反応不活性置換基、特に電子性置換基で置換され ていてもよい。

本発明の好ましい化合物は下記の式で表わすことができる。

（式中Ｒは１乃至５の炭素原子を含有するアルキル基であり、ｎは２．３又は４ である）、この脂環式化合物においてＲ基はα又はβ炭素原子の何れでもあり得 ない。

本発明の範囲内の典型的な化合物としてはメチルビニルケトンとＬ−アスコルビ ン酸との反応生成物又は２−シクロヘキセノンとＬ−アスコルビン酸との反応生 成物がある。これらの化合物の構造は下記の式で表わことができる。

ＫＢＢＬ　ＫＣＢＬ これらの化合物の化学名はそれぞれ次の通りである。

２−（３−ケトブチル）−２−ヒドロキシ−３−ケト−４−ジヒドロキシエチル ブチロラクトン＜３．６＞シクロへミケタール（Ｋ　Ｂ　Ｂ　Ｌ）及び２−（３ −ケトシクロヘキシル）−２−ヒドロキシ−３−ケト−４−ジヒドロキシエチル ブチロラクトン〈３゜６〉シクロへミケタール（ＫＣＢＬ）。

本発明の範囲内で現在好ましい化合物はケトンの脂環式環が置換されておらず、 ５又は６個の炭素原子を有するもの及び脂肪族部分が１又は２個の炭素原子を有 し置換されていないものである。

これらはその活性の故に及び出発化合物が容、易にかつ経済的に入手し得る故に 好ましい、３−メチル−２−シクロヘキセノンは同じ条件ではアスコルビン酸と 反応しない、２−シクロヘプテノンは反応するが非常に遅い。

反応は水性媒体中、周囲温度で触媒量の強酸、好ましくはｇ＃Ｉ又はハロゲン酸 （好ましくは塩酸）の如き鉱酸の存在下で行なわれる。この反応は好ましくは窒 素又はヘリウムの如き不活性雰囲気中で行なわれる。

好ましい反応媒体は水であるが、他の溶剤、特に水混和性溶剤、たとえばメタノ ール、エタノールの如き低級アルカノール、テトラハイドロフランの如き環状エ ーテル又はアセトンの如きケトンを添加してもよい、これらは高分子量又は疎水 性反応体の溶解を助ける。

反応は約２０℃乃至４５℃の温度で約２乃至２４時間、行なわれる０反応時間は 臨界的ではない、これは主として反応体の量によって決まる０反応後、通常の分 析法により反応が完了したかどうか、又は反応を続けても収量が増加すると考え られな（なったかどうかを決定することができる。高速液体クロマトグラフィー が便利な手段である。

−ｉに等モル量の反応体が用いられる。しかし、ある場合には反応体の一方をモ ル過剰、たとえば約１０％迄のモル過剰で用いて反応をできるだけ完全なものと することができる。

前述の通り、反応を触媒するのに種々の強酸を用いることができる。典型的には 全反応体重量に基いて０．１％乃至１．５重量％の酸を用いる。水性媒体の場合 塩酸が好ましい、何故なれば塩酸はクロライド塩として沈澱せしめることにより 容易に除去できるからである。しかし、トリクロロ酢酸又はトリフルオロ酢酸の ような強カルボン酸を使用してもよい。

酸で触媒されるマイクル付加反応を発見したことは驚くべきことである。活性化 不飽和系に活性メチレン化合物を付加するこの種の反応は通常塩基によって触媒 する。

脂環式ケトンに暴く本発明の化合物は新規である。脂肪族ケトン基に基くものの あるものはすでに記載されている。たとえば、メチルビニルケトンとアスコルビ ン酸との反応生成物はＦｏｄｏｒ　ｅｔａｌによりｒＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　 Ｊ第３９ｔ！、第１３号、２１３７−２１４５頁（１９８３）に記載されている 。この刊行物に記載の反応は酸触媒反応ではなく、ここに記載の反応よりも著し く遅い反応である。また、この刊行物に記載の反応は非常に遅いので環状ケトン に基いて大規模に反応生成物を製造するのには実用的ではない。

本発明の化合物の免疫応答を刺激する能力は多数の公知の試験によって立証され た。

これらの試験の一つはリンパ球幼若化試験であり、これはマウスの＊臓から分離 したＴ及びＢリンパ球のＤＮＡ合成及び有糸分裂に対する被験化合物の影響力を 測定するものである。

マイトジェンはＤＮＡ合成及び有糸分裂を刺激する物質である。

これらの研究に用いるマイトジェンは赤いんげん豆から分離される植物凝集素（ ＰＨＡ）及びたちなたまめから分離されるコンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）で あった、Ｃｏｎ−Ａはマンノシル又はグリコジル部分を有する特定の受容体（糖 蛋白質）と結合してすべてのマウスのＴ細胞を刺激してＤＮＡを合成し、リンフ 才力インを分裂及び放出する。可溶形のＣｏｎ−Ａはマウス中のＴ細胞とＢ細胞 とを区別する。何故ならばＴ細胞及びＢ細胞ともに細胞１個につき１Ｏ−６のＣ ｏｎ−Ａ分子と結合するがこのレクチンが可溶の形で存在するときはＴ細胞のみ が刺激される。ＰＨＡはマウス中のＴ細胞のサブ集団、Ｔ−２細胞のみを刺激す る０人間の場合、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方がおそらく刺激される。Ｐ）ＩＡによ るＢ細胞の活性化は間接的であってＰＨＡ活性化Ｔ細胞から可溶性メディエータ −を放出することにより媒介される。

リンパ球幼若化試験は免疫適格Ｔ細胞及びＢ細胞の多クローン性マイトジェン（ 即ち、ＰＨＡ又はＣｏｎ−Ａ）又は特定の抗原に対して応答する能力を評価する 方法である。この試験はインビボで免疫刺激剤で処理したマウスから得られたリ ンパ球について行なってもよく、あるいは全検定をインビトロで行なうこともで きる。この検定は下で述べるように増幅の現象を評価するために、幼若化（ＤＮ Ａ合成によって測定する増殖）を誘起するのに最小量の多クローン性マイトジェ ンを用いる。したがって、試験方法は正常な免疫パラメーターを回復するための 潜在的免疫刺激剤の能力をテストするように行なわれる。

リンパ球幼若化試験は下記のようにして行なわれる。

１．２匹のマウス（実験群）の頚管を脱臼させて殺す。

２、　マウスをゆるい消毒溶液（Ｐｏｖａｄｚｎｅ）に浸す。

３、肺臓を取り出しＲＰＭＩ−１６４０を５−ｌ／ウェル含有する殺菌した６ウ エルプレートに置く。

４、肺臓を歯のついた鉗子で切りきざむことにより単一の細胞懸濁液をつくる。

５、　この細胞懸濁液を殺菌した遠心分離管中に入れ１ｏ分間大きい塊りを沈降 せしめる。

６、　この単一細胞懸濁液の上ずみ液をベレットで別の殺菌した遠心分離管に入 れる。

７、コノ細胞懸濁液をＧＬＣ−２Ｂ中で１０分間１ｌ１００ＲＰで遠心分離する 。

８、無菌条件で上ずみ液を除去する。

９、細胞ボタン（ｂｕｔｔｏｎ）を５ＩＩＩｔのＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し 遠心分離する。このようにして細胞を更に２回洗浄する。

１０、熱不活化した１０−１５％のｌ（ｕｍａｎ　ＡＢ（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ 、Ｒｏｇｅｒｓ＋ＡＲ又はＢｉｏＢｅｅ、Ｈｏ５ｔｏｒ＋ＭＡ　）を含有する５ −１のＲＰＭＩ−１６４０中に細胞を再懸濁する。

１１、生理的食塩水中でつくった０、２５％トリパンブルー専用染料を用いて生 存細胞を数える。非生存細胞は青色に染色される。

１２、人間ＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で生存細胞の濃度を５．０ Ｘ１０’細胞７ｍｌに調整する。

１３、テストすべき種々の細胞懸濁液０．１ｍ１／ウエルを９６ウ工ル殺菌丸底 組織培養プレートの６つ一組のウェルに分配する。

１４、上記の同型６種の細胞にＣｏｎ−Ａを２．５．５．０又は？、５ｕｇ／ｓ ｆに加え、再びＰＨＡを１０，１５又は２０ｕｇ／ｍｊ加える。

１５、上記と同じ細胞群を含むがマイトジェンの代りに０．１　曽ｌの培地を有 する対照プレートを加える。

１６．７”レ−）の外側のウェルに培地を満たすことによりプレートを湿らせる 。

１７、５％ＣＯ２を用いて４８時間３℃で培養する。

１８．４８時間後、すべてのウェルにＣ−１４メチルチミジンの０．４マイクロ キｓ　−’Ｊ　−／　＠　１溶液をｏ、０２５ｓｌ入れ５％ＣＯ□で１８時間３ ７℃で培養する。

１９、生理的浸透圧（２８５−３２０ｍｏｓ）で？：酸塩緩衝食塩水を用いて濾 紙ディスク上にＢｒａｎｄｅｌ　Ｍ　−１２Ｃｅ１ｌ　Ｈａｒｖｅｓｔｏｒ（Ｂ ｒａｎｄｅｌ、Ｒｏｃｋｆｉｌｌｅ、　ＭＤ）により細胞を集める。

２０、この濾紙ディスクをＰａｃｈａｒｄ　ミニーシンチレーシッンバイアル中 に入れ１８時間乾燥する。

２１、乾燥後、シンチレーション級トルエン４！Ｊフ）ル、２．５−ジフェニル オキサゾール（ＰＰＯ）１６．０ｇ及び１．４−ビス（２−Ｃ５−フェニルオキ サキフリル）ベンゼン（ＰＯＰＯＰ　）０．４ｇを含有するシンチレーションカ クテル２−１をバイアルに満たす。

／バイアル各バイアルについて測定する。

ＫＣＢＬの二種の異性体についてのリンパ球幼若化試験結果を第１表及び第■表 に示す０両異性体ともにＤＮＡのＣ−１４チミジン添加に基づく１分間当りの計 数の統計的に相当な増加をもたらしたことがわかる。

第１表 ＫＣＢＬ−Ａのリンパ　−ヒテストにおけるｔ果薬剤投与量　ＲＰＭＩ　ＰＨＡ 　％　Ｃ０Ｎ−Ａ　％■／―　対照　１４ｕｇ／ｓ　１　増加　６　ｕｇ／ｓ　 ｌ　増加０　１０３．０　１？２７．０−３６１２．０　−−÷／−１４，０＋ ／−７７，０＋／−２７６，０１２，５９４，０１４５０，０−３４１２，０− 一＋／−１８，０＋／−５０，０＋／−２５１，０２５，０７７，０２１７８， ０”　２６．１　５６５７．０”　５６．６÷／−１２，０＋／−１３９，０＋ ／−４０８，０５０，０５０，０２３６９，０”　３７．１　５０５９．０”　 ４０．０÷／−８，０＋／−１３２，０÷／−４０８，０１００，０？６．０　 ２３８４．０”　３８．０　４１０４．０　１３．６＋／−９，０＋／−１７０ ．０　＋／−１２８７．０本対照（Ｐｏ、０５）に対しかなりな増加；＋／−は 標準偏差を示す。

第■表 ＫＣＢＬ−Ｂのリンパ　化テストにおける　果薬剤　ＲＰ／！／ＩＴ　ＰＨＡ１ ４．Ｏ％　Ｃ０Ｎ−Ａ　２．２５　％ｗｔ／　ｋｇ　ｕｇ／＋ｗ　１　増加　ｕ ｓ／ｍ　ｚ　増加平均０　４３．７　１５４５．８　−＋　３８８．２　−５． Ｄ、　÷／−４，２＋／−１５３，３＋／−１０２，１１２，５６７，６１７３ ３，１”　１２．１　８６５．６”　１２２．９÷／−７，７＋／−１００，０ ÷／−２７７，３２５８４，３３５１２，１”　１２７．３　１３０９．６”　 ２３７．４÷／−１３，１＋／−７７９．３　＋／−２３０，３５０５６，２２ ５４０，７°　６４．４　１１３０．６”　１９１．２＋／−７，５＋／−１２ １，７÷／−１２１．７１００　８４．９　３５１５．４”　１２７．５　１７ ３６．７”　３４７．４＋／−９，９＋／−１５１，９＋／−２６１．１２００ 　５２．０　３３０５．８”　１１４．１　２００８．０”　４１７．５＋／− ９，８＋／−１１１，０÷／−４５８，１本　対照（Ｐｏ、０５）に対するかな りな増加を示す。

＋／−標準偏差。

ＲＰＭＩは（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｌａｂｓ　％　Ｉｎｃ、Ｄｅｎｖｅｒｓ　ＰＡ ）から入手し得る半合成細胞成長培地であり、動物（ウシ）源を用いて供給され る血清成長因子を除いて哺乳動物の細胞成長に必須のすべてのアミノ酸、ビタミ ン、緩衝液及び塩から成る。

第■表はＬ−アスコルビン酸とメチルビニルケトンとのマイクル付加生成物であ るＫＢＢＬによるリンパ球幼若化テストの結果を示す、この化合物はテスト前に マウスを処理するのに用いた薬剤のすべての用量においてのみならずテストした ＰＨＡ及びＣｏｎ−Ａのすべての用量において刺激性を有することがわかる。

イエルネ溶血プラークテストはマウスを免疫感作するのに使用する抗原によって 産出する特定の抗体のＩｇＭ又はＩｇＧを測定する試験方法である。この方法は 単−Ｂリンパ球によるＴ細胞依存性抗原に基く抗体産出を示す、直接検定はＩｇ Ｍを検出し、間接検定はＩｇＧ特異抗体を検出する。

方法は次の通りである。

洗浄した肺臓細胞を羊の赤血球（Ｓ　ＲＢ　Ｃ）及びてんじくねずみの補体を含 有するアガロース（ＦＭＣ、Ｒｏｃｈｌａｎｄ％ＭＥ）合剤に加える。この混合 物の一滴を小さいペトリ皿に移し、次にこの滴の上にカバースリップを置き平ら にする。アガロース合剤を固化せしめる０次にＣＯ２インキュベーター中の調湿 室中に一晩入れる。

カバースリップの下に小さいわづかの透明な領域（プラーク）が見られるであろ う、この透明域は刺激された肺臓細胞によって放出される５ＲＢＣに特異な抗体 によって生じるものであり、補体と結合して周囲の５ＲＢＣを溶解する。これら のプラーク形成細胞（ＰＦＣ）を計数し、計算により１ｘ１０ｈ個の肺臓細胞当 りのＰＦＣの数を得る。

試剤：羊赤血球　てんじくねずみ補体 Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇａｒｏｓｅ　３０　ｍベトリ皿ＲＰＭＩ−１６４０ ２２Ｘ２２Ｘ１％カバースリップ 方法： １、標準的な方法でマウスから肺臓をとりＲＰＭｒ−１６４０中での最終濃度２ ０％に調整する。

２．５ＲＢＣをＲＰＭＩ−１６４０中で最終濃度２０％に調整する ３、凍結乾燥したＧＰＣに直接緩衝稀釈剤を加えることによりてんじくねずみ補 体（Ｇ　Ｐ　Ｃ）　（Ｈａｚｅｌｔｏｎ−Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ　Ｉｎｃ、、Ｄｅ ｎｖｅｒｓ　ＰＡ）を再構成する。０．５ｓｆの補体に３−１のＲＰＭＩ＠地を 加えることによりＲＰＭＩ−１６４０によりｌニアに稀釈する。

４．５０ｍ１の殺菌フラスコ中でアガロース０．１７５　ｇをＲＰＭＩ−１６４ ０の２５ｓｊに加えて０．７％のＳｅａ　Ｐｌａｑｕｅ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭ Ｃ，Ｒｏｃｈｌａｎｄ、　ＭＥ）を調製する。これをやや高熱におき撹拌棒によ り最低速度でゆるやかに攪拌する。沸とう前に熱を除き、直ちに３７℃水浴上に 置く。

５、すべての試剤（ＳＲＢＣ，ＧＰＣ及び肺臓細胞調剤）を１５分間水浴中に入 れ３７℃で平衡させる。

６、試験すべき各試料調剤につき、３７℃水浴中に１２Ｘ７５ｍガラス試験管を 棚にかけて入れる。各１２Ｘ７５の管に０．７ｍｌ１のアガロースを加える。

７、三つの別々のＲａｎｎ１ｎ　ｐｉｐｅｔｍａｎ（Ｇｉｌｓｏｎ、　Ｍｉｄｄ ｌｅｔｏｎ　ｓ　ＷＩ）を０．０５．０．１及び０．２ｓｆに調整する。

８、　アガロースを含有する第一の１２Ｘ７５鶴管に第一の＊＊ｍ胞ｔ［１ｉｑ ０．２ｍｚを加える０次に０．０５ａＪの補体を加える。

０．０５ｍｊ！の５ＲＢＣを加える。５ＲＢＣが均一な懸濁液となる迄よく混合 する。

９、　ベトリ皿の上面と底部の両面にラベルをつけ細胞群と対応せしめる。

１０、０．１　ｍｌのピペットを用いて０．１ｓｊ！のアガロース／細胞試料を とり出しベトリ皿のふたの中央におき、速やかにペトリ皿の底部にも同様に行な う。

１１　液滴上に四角い２２Ｘ２２ｍカバースリップを注意しておく。

アガロースが沈降し固化する造血を動かさないでおく。

１２、残りの細胞試料の各々につき６−１１の操作を繰り返す。

１３、アガロースが固化した後、小さいプラスチック製調温室に移す、３７℃で 一晩培養する。翌朝結果を調べる。

１４、各プレートにつき溶血プラークの数をかぞえて記録する。２組のプラーク 数の平均をもとめる。一群毎のプラークの平均数に２．５をかけて１００万個の 肺臓細胞当りのプラーク形成細胞の数を得る。

第■表及び第７表はＫＣＢＬの二つの異性体（Ａ、Ｂ）及びＫＢＢＬについての イエルネ試験結果を示す、三つの薬剤のすべてが対照と比較して投与量に応じた 増加を示した。

第■表 ＫＣＢＬ−Ａ　ＫＣＢＬ−Ｂ 薬剤処理　ＰＦＣ／１００万細胞　％増加　ＰＦＣ／１００万細胞　％増加ビヒ クル対照　３．７５ ＳＲＢＣ対照　５６．２５　４７．５０２００■／　ｋｇ　１７７．５０　２１ ５　１２８．７５　１７１１００　＊／ｋｇ　２３５．００　３１Ｂ　１５７． ５　２３２５０■／呟　１６５．００　１９３　１５１．２５　２１８２５■／ ｋｇ　１１５．００　１０４　６６．２５　３９１２．５■／　ｍｊ！１１２． ００　１００第Ｖ表 ＫＢＢＬのイエルネテストにおける効 処理群　ＰＦＣ／１００万細胞　％増加ビヒクル対照　０．５ ＳＲＢＣ対照　２３．５ ＫＢＢＬ２００■／眩　４８．５　１０６．４ＫＢＢＬ１００■／　４　Ｂ、　 ０　１０４．３ＫＢＢＬ５０■／ｋｇ　３６．０　？０．２本発明の生物学的に 活性な化合物は単独で投与してもよいし、薬学的に許容し得るキャリヤーと組合 せて投与してもよい、その選択は好ましい投与経路、化合物の溶解性及び標準的 な薬学的投与方法による。経口投与の場合は緩衝剤、澱粉又は乳糖のような賦形 剤を含む錠剤の形で投与することができる。緩衝したり、甘味をつけたり風味を つけてもよい水溶液及びエリキシル剤も用いることができる。関節内注射の場合 は水性懸濁液を用いることができる。この場合、種々の懸濁側及び湿潤剤を組成 物に添加して沈降し難しい懸濁液としてもよいし、あるいは貯蔵すべきびんの中 に詰めてもよい。筋肉内及び皮下投与形もまた通常の薬学的手段で調製すること ができる。

本化合物はたとえば抗生物質や抗ウィルス剤のような他の治療側と組合せて使用 してもよい、この合成免疫刺激剤をインターロイキンｌ及び２、又はインターフ ェロンあるいはその合成誘発剤（即ち、ポリＩ　Ｃ−ＬＣ等）、Ｂ細胞成長因子 又は腫瘍壊死因子のような天然免疫刺激剤と組合せて使用するのも有効である。

これらは種々の通常の筋肉内又は静脈内投与の何れによっても投与することがで きる。

患者の年令、体重及び健康状態のような要因を考慮して適切な投与法を決めるこ とができる。免疫調節的応答を刺激するのに有効な投与量は通常約１００乃至５ ０■／呟体重であるが広範囲の変更が可能である。１回投与又は数回に分けて投 与することができる。

本発明の組成物は一用量単位当り活性成分２乃至ｌを含有する用量単位形状で入 手し得る。

下記の実施例は本発明の例示のためのものであり、本発明を限定するものではな い。

スー」１−倒一」− ２−（３−ケトブチル）−２−ヒドロキシ−３−ケト−４−ジヒドロキシエチル −ブチロラクトン３．６シクロヘミケタール（Ｋ　Ｂ　Ｂ　Ｌ） Ｌ−アスコルビン酸（２２，０ｇ、０．１２５モル）を窒素で１時間脱ガスした 水８８ｗＪに加えた。得られた溶液にメチルビニルケトン（８，７５ｇ、０．１ ２５モル）を滴下し、続いて０．３ｓｆの濃塩酸を加えた０反応混合物をＨＬＰ Ｃ分析がメチルビニルケトンの完全な消費を示す迄２４時間周囲温度で攪拌した 。炭酸銀２．０ｇを加えてＨＣ１触媒を除去した。濾液を遠心分離にかけた後凍 結し凍結乾燥して２８．８０ｇ（９４％）の粗生成物を得た。

この固形物を５５０ｍｍ！の沸騰エチルアセテート中に溶解し、次に冷却すると 白色結晶性固形物１３．７４　ｇを得た。濾液を濃縮し第二の結晶性固形物３． ３５　ｇを得た０両方の固形物を一緒にし４５０ｍＪの熱エチルアセテート中で 再結晶して純粋の生成物（（１３，３０ｇ、４３．３％）、ｗｈｌ　１２４　１ ３５、（２）Ｄ−２５＝＋２３．１　（Ｃ＝１．０２、メタノール）〕を得た。

対応するエチルビニルケトン生成物を同様にして調製した。融点は６５−６７で あった。

五−ｊＬ」１−１ ＫＣＢＬの２つのジアステレオマー〇量蒸留水（７０４ｍＬ）を窒素で１時間洗 浄し、Ｌ−アスコルビン＠　（Ｍａｌｌｉｎｃｈｒｏｄｔ　ＵＳＰ　Ｇｒａｄｅ ）　（１７６，０ｇ、　１．０モル）を加えた。得られた溶液に攪拌下、２−シ クロヘキセノン（＾ｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａ＋）　（９６，０ｇ　、　１． ０モル）を滴下した。２−シクロヘキセノンの添加後半時間たったとき濃塩酸（ ２，４ｍ　Ｌ　）を加えた。

この溶液を室温で２４時間放置したところ結晶性固形物の形成が見られた。この 混合物を氷水浴中で冷却し、吸引濾過して第一の粗生成物８８．９５ｇ（３３％ ）を得た。濾液を冷蔵庫中で一晩冷却したところ更に固形物が沈澱した。この固 形物を吸引濾過して第二の粗生成物９２．７２ｇ（３４％）を得た。高圧液体ク ロマトグラフ４−　（ＨＰＬＣ）分析（ＭＣＨｌ　０カラム；溶離剤：８０％水 ／メタノール；流速：１．ＯｍＬ／分）を行なったところ第一の粗生成物は約９ ０％の異性体１　（保持時間４．５分）よりなり、第二の粗生成物は約５５％の 異性体２（保持時間４．２分）よりなっていた。

第一の粗生成物を熱水中（１８０ｍＬ）で再結晶したところ、５８．９０ｇ（２ ２％）の純粋（ＨＰ　Ｌ　Ｃニよる）の異性体１（ｍｐ１５５−１５６°、（α ）　”−４７，１°　（Ｃ＝２．０６、メタノール）、（α）”−−２，７°　 （Ｃ−１，０、’ｌ　）　７＞　’ｌｉｃ得り。

第二の粗生成物を熱水中で３回（１４７ｍＬ、１４０ｍＬ及び１００ｍＬ）で再 結晶したところ２８．７５ｇ（１１％）の純粋（ＨＰＬＣによる）の異性体２（ ｍｐ１７０−１７１°　（α）　”＝＋　２４．２°　（Ｃ＝　２．０、メタノ ール）、（α）　”＝６．５　（Ｃ−０，８、アセトン）〕が得られた。

菫ｍ級 配合：　■／錠副 側ＢＢＬ　２００．００ くえ／ｕＭ　１．００ ラクトース　３３．００ シカルシウムホスフェ−）　７０．００プルロニフク、Ｆ−６８３０，０ ラウリル硫酸ナトリウム　１５．００ ポリビニルピロリドン　１５．　ＯＯ カルボワックス１ｓｏｏ　ｓ、ｏ。

３Ａアルコ−Ｊし５０　ｍｌ、／１０００錠コーンスターチ　３０．００ 乾燥ニ ラウリル硫酸ナトリウム　３．００ ステアリン酸マグネシウム　３．００ 合計重量　３５０．００ 方法・・−ＫＢＢＬ、＜えん酸、プルロニックＦ−６８、ラウリル硫酸ナトリウ ム、ラクトース及びリン酸二カルシウムを混合する。

−６０メツシユスクリーンで篩分けする。篩分けした混合物をポリビニルピロリ ドン、カルボワックス１５００及び６０００を含有するアルコール溶液で造粒す る。必要ならば、更にアルコールを加えて粉末混合物をペースト塊とする。コー ンスターチを加えて均一な湿った粒体が形成する迄混合を続ける。湿った粒子を 隘１０スクリーンを通し、１００℃で１２−１４時間炉の中で乾燥する。１ｌｈ １６スクリーンを用いてこの乾燥粒子を篩分けしラウリル硫酸ナトリウムとステ アリン酸マグネシウムを加え、混合し、タブレヅト形成機上で圧縮して処方通り のものを得る。

大−旌一■−土 左１皇匹■ 配合：　■、／カプセル ＫＣＢＬ異性体１　１００．００ くえん酸　１．００ プルロニンクＦ−６８４０，０ ラウリル硫酸ナトリウム　２０．００ ラクトース　２３８．００ ステアリン酸マグネシウム　１．００ 方法・−ＫＣＢＬ、くえん酸、プルロニックＦ−６８、ラウリル硫酸ナトリウム 及びラクトースを混合する。１１ｍ８０スクリーンを通す、ステアリン酸マグネ シウムを加え、混合し、適当な寸法の２つの部分から成るゼラチンカプセル中に カプセル化する。

大−流一斑一立 匪径旦製剋 配合： ＫＣＢＬ異性体２　ｗ／１０ｍ１２００ヘンジ）Ｌ、　７７Ｌ／　ニア　−ル、 ＵＦ　ｑ／１０　ｗａｌｌ　５０．０メチ）Ｌｔパラヘン、ＵＳＰ　ｗ／１０　 ｍｌ　１８．０プロピルハラヘン、ＵＳＰ　ｗ／１０　ｗｒｌ　２．０水　−１ １０ 方法・−６０−７０℃でパラベンを約８．５ｍｊの水に溶解する。溶液を４０℃ に冷却しベンジルアルコールを添加する。得られる溶液を室温に冷却しＫＣＢＬ を添加する。この懸濁液を殺菌した受け器の中に入れる。ふたをゆる＜　Ｌ、た 適当な寸法のバイアルに満たし約１．５時間１１０℃（１５ｐｓｉｇ）でオート クレーブ処理する。

この製剤１ミリリツトルは有効化合物２０■を提供する。

手　続　補　正　書（方式） 昭和６３年１０月り日

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．４乃至７個の炭素原子を有するα、β−不飽和脂環式ケトンとアスコルビン 酸との酸触媒によるマイクル付加反応生成物である化合物。
2. ２．脂環式ケトンが５個又は６個の炭素原子を有する請求の範囲第１項の化合物 。
3. ３．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第１項の化合物。
4. ４．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第２項の化合物。
5. ５．脂環式ケトンのα又はβ炭素原子以外の炭素原子において反応不活性置換基 で置換されている請求の範囲第１、２、３又は４項の化合物。
6. ６．４乃至７個の炭素原子を含むα、β−不飽和脂環式ケトンとアスコルビン酸 との反応生成物である化合物とともに薬学的に許容されるキャリアーを含有する 医薬組成物。
7. ７．脂環式ケトンが５個又は６個の炭素原子を有する請求の範囲第６項の化合物 。
8. ８．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第６項の化合物。
9. ９．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第７項の化合物。
10. １０．脂環式ケトンのα又はβ炭素原子以外の炭素原子において反応不活性置換 基で置換されている請求の範囲第６、７、８又は９項の化合物。
11. １１．飽和脂肪族部分が１乃至５個の炭素原子を有する脂肪族ビニルケトン又は ４乃至７個の炭素原子を有する脂環式ケトンとアスコルビン酸との酸触媒による マイクル付加反応生成物である化合物とともに薬学的に許容し得るキャリアーを 含有する医薬組成物。
12. １２．飽和脂肪族部分が１乃至２個の炭素原子を有する請求の範囲第１１項の組 成物。
13. １３．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第１１項の組成物 。
14. １４．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第１２項の組成物 。
15. １５．飽和脂肪族部分が反応不活性置換基で置換されている請求の範囲第１１、 １２、１３又は１４項の組成物。
16. １６．脂環式ケトンが５個又は６個の炭素原子を有する請求の範囲第１１項の組 成物。
17. １７．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第１１項の組成物 。
18. １８．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第１７項の組成物 。
19. １９．脂環式ケトンのα又はβ炭素原子以外の炭素原子において反応不活性置換 基で置換されている請求の範囲第１１、１６、１７又は１８項の化合物。
20. ２０．飽和脂肪族部分が１乃至５個の炭素原子を有する脂肪族ビニルケトン又は ４乃至７個の炭素原子を有する脂環式ケトンとアスコルビン酸との酸触媒による マイクル付加反応生成物である化合物を免疫応答の刺激に有効な量投与すること から成る、必要な場合に哺乳動物の免疫応答を刺激する方法。
21. ２１．哺乳動物が人間である請求の範囲第２０項の方法。
22. ２２．哺乳動物が動物である請求の範囲第２０項の方法。
23. ２３．脂環式ケトンが５個又は６個の炭素原子を有する請求の範囲第２０項の方 法。
24. ２４．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第２０項の方法。
25. ２５．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第２３項の化合物 。
26. ２６．脂環式部分のα又はβ炭素原子以外の炭素原子において反応不活性置換基 で置換されている請求の範囲第２０、２３、２４又は２５項の方法。
27. ２７．飽和脂肪族部分が１乃至２個の炭素原子を有する請求の範囲第２０項の方 法。
28. ２８．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第２０項の方法。
29. ２９．アスコルビン酸がＬ−アスコルビン酸である請求の範囲第２７項の方法。
30. ３０．脂肪族部分が反応不活性基で置換されている請求の範囲第２０、２７、２ ８及び２９項の方法。
31. ３１．飽和脂肪族部分が１乃至５個の炭素原子を有する脂肪族ビニルケトン又は ４乃至７個の炭素原子を有する脂環式ケトンとアスコルビン酸との酸触媒による マイクル付加反応生成物である化合物とともに薬学的に許容し得るキャリアーを 含有する投与単位形の医薬組成物。