JPH01500146A - エレクトロ化学ルミネセンスアツセイ - Google Patents

エレクトロ化学ルミネセンスアツセイ

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JPH01500146A JP62503860A JP50386087A JPH01500146A JP H01500146 A JPH01500146 A JP H01500146A JP 62503860 A JP62503860 A JP 62503860A JP 50386087 A JP50386087 A JP 50386087A JP H01500146 A JPH01500146 A JP H01500146A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願に関する刊行Ｗはカッコ内にアラビア数字で示す。これらの参考文献の引 用一覧は請求の範囲のすぐ前の発明明＃＋Ｉｔｌ誉の最後に挙げである。これら の刊行物に関する完全な説明を記載するのは、それによって本発明に関連する技 術状況音より完全に説明できるよう本出願に参考文献を引用しているためである 。化学的、生化学的、生物学的物質ｔ−Ｗ出し定量するための速やかかつ高度に 特異的な方法が常に必要とされ需要が拡大している。特に少量の医薬品、代謝産 物、微生物やその他の診断上価値のある材料？測定するための方法は重要である 。Ｃのような材料の例としては麻薬及び毒薬、治療上の目的で投与てれる薬物、 ホルモン、病原性をもつ微生物及びウィルス、抗体、代謝産物、酵素や核酸等が 挙げられる。
このような材料の存在は高度な特異性をもつ結合法を用いて検出てれることが多 く、これによって多くの生化学及び生物学的系の％徴が明らかになっている。
頻繁に使用ちれている方法の例としては、抗原−抗体系、核酸ハイブリッド形成 法、たん白質−リガント系等がある。このような方法においては通常複雑な材料 ０１つあるいはそれ以上に目印としてつけた検出可能な「標識」の有無によって 診断上有用な複合体の存在が明らかになっている。
選択した特異的標識方法によって当該材料の検出のための特別な系の有用性及び 融通性が決まることが多い。好ましい標識物の条件としては安価であり安全であ って、多岐にわたる化学的、生化学的、生物学的材料の１要な結合特性全変化嘔 セることなしに動車よくそれらの材料に標識できることが必要である。標識物は 高度に特徴的な目印をもっていなければならず、さらに天然にはほとんど、ある いはより好ましくは全く存在していないことが必要である。標識物は安定であり 何か月にもわたる期間ｔ″経て水溶液系中で検出可能であることが要求される。
検出の除には高価な特別の設備や技術者を必要とゼす、速やかに、かつ高い感度 、及び再現性をもって標識物が検出芒れなければならない。標識物の定量に当た っては、温度や供試混合物の組成といった変化要素に比較的影響δれにくいこと が必要である。均一系、丁なわち標識材料の複合体及び非複合体を分離する必要 のない系において使用できる標識物が最も有用である。標識てれた材料が特定の 複ようにすればこれが可能である。
非常に多くの種類の標識物が開発逼れており、それぞれ長所、短所をもっている 。例えば放射性標識物はきわめて多用途に使用でき、非常に低い濃度においても 検出可能である。しかし高価で危険性もあり、その使用のためには精巧な装置と 訓練を受けた技術者とが必要である。名らに放射性標識物の感度は、標識でれた 材料において検出し得る事象というのがその本質上放射性原子轟ｆｃ９１回しか 起こらないという事実によって限定筋れてしまう。また放射性標識物は均質法に おいては使用できない。
このため非放射性の標識物に高い関心が集まっている。例えば分光測光、スピン 共鳴、ルミネセンス法によって検出可能な分子子、そのような分子ｔ−産生し得 る酵素等がそれに含まれる。有用な非放射性標識材料の中に有機金属化合物があ る。ある種の金属は生物学的系においてまれにしか存在しないため、有機金塊化 合物中の金属成分全特異的に試験する方法が有効となる。例えばＣａ１ｇ、アメ リカ特許番号４，２０５．９５２（１９８０年）は、特異的抗原を定量するのに ある種の有機金塊化合物によって標識逼れた免疫化学的活性材料を使用している 。このような標識物に対しては選択した金属全検出するのに発光、吸収、螢光分 光法、原子吸光、中性子活性化等を含む一般的手法がどれでも使用できる。これ らの方法は感度が低いという欠点をもつことが多く、均質系にはほとんど適用で きない。
ま九原子吸光に関しては時として試料の破壊を伴う。
光化学的、化学的、電気化学的手段を通じて発光するように作られた標識物は特 に興味深い。「光化学ルミネセンス」とは材料が電磁放射線を吸収した時に発光 するように作られた過程である。螢光及びりん元は光化学ルミネセンスの一種で ある。「化学ルミネセンス」過程にはエネルギーの化学的変換による発光物の産 生が伴っている。「エレクトロ化学ルミネセンス」には電気化学的に産生される 発光物が伴う。
このような発光系の１要性は増加している。例えはＮａｎａｌｌｉｌ　、アメリ カ特許番号４，３７２，７４５　（１９８３年）は免疫化学的応用分野において 化学ルミネセンス標識物を使用している。この系では標識物がＨ２Ｏ，とシュウ 酸塩と反応することによる化学的手段によって標識物を発光状態に励起嘔七てい る。この系ではＨ２Ｏ２がシュウ酸塩を酸化して高エネルギー誘導体に転換しそ の結果標識物を励起させるのである。この系は原理的には、試験における酸化灸 件下で安定であり高エネルギーシュウ酸塩誘導体によって励起ちれ得る発光物質 であれはどんな材料でも使用できる。残念なことに王な要因となってしまう。肖 該分析物を含む生物学的溶液は一般に発光の可能性をもつ物質も大量に含んでお り、ルミネセンスのバックグラウンド値を高くする原因となる。
化学ルミネセンスの免疫化学的利用法で平はり同様の欠点をもつもう１つの例は 、０ｂｅｒｈａｒａｔら、アメリカ特許番号４．２８０．８１５　（１９８１年 ）によるもので、化学ルミネセンスによって標識された免疫反応物質と非常によ く類似しているｉｎ　８１ｔｕにおける酸化剤、（例えばＨ２０□）の電気化学 的産生に関して述べている。電気的に産生でれたオキシダントが化学ルミネセン ス物質中に拡散しそれを化学的に酸化することによって１つ以上の電子を電気的 に産生嘔れたオキシダントに転移さゼる。化学ルミネセンス物質は酸化される際 に光子を放つ。これに対し本発明の対象物では、電気化学的エネルイー源から化 学ルミネセンス物質への直接の電子転移が必要であり、このため光子の連続放出 が可能となる。
本発明線エレクトロ化学ルミネセンス標識物に関するものである。適切な標識物 としては有機化合物及び有機金属化合物を含むエレクトロ化学ルミネセンス化合 物から成るものを用いる。多くの理由から、標識された材料の存在を検出する方 法としては他の方法よりもエレクトロ化学ルミネセンス法の方が適している。
特定の標識物の存在′ｔ−高度に判定でき、感度が高く、危険性が少なく、安価 であり、嘔らに応用範囲も広い。
電気化学的標識物として適切な有機化合物には例えばルブレンＪＰ９　、１０− ジフェニルアントラセン等がある。有機金属化合物の多くが電気化学的標識物と して適しているが、特にルテニウム及びオスミウム含有複合体は有用である。
このため１つの具体例として本発明では多岐にわ几る方法を用いて検出可能なル テニウム及びオスミウム含有複合体の使用について述べている。これらの標識物 は以下の文中で論するように数多くの点で有益なものである。ルテニウム及びオ スミウム含有有機金属化合物については文献中でも論じられている。Ｃａ１ｎは ルテニウムのような第８群の貴金属を含む金属元素あるいはそのような金属元素 の組み合わせであれはどれでも原子吸光法によって検出可能な有機金属標識物の 成分として適切であると述べている（　（ａｉａ、　ｉ　１列２０行）。しかし Ｃａ１ｓの文献においてはルテニウムは適切な金属と逼れておらずオスミウムに −しては特に言及されておらず、記載され九どの方法にもルテニウムまたはオス ミウムを使用した場合の有効性に関するデータは含まれていないし、適切な方法 とされている原子吸光法には試料の破壊が伴っている。
ｗｅｂｅｒ　、アメリカ特許番号４，２９３．３１０　（１９８１年）はイムノ アッセイにおける分析物の電気化学的標識物としてルテニウム及びオスミウム含 有複合体を使用することに関する報告をしている。この複合体は分析物のチオ尿 素結合を通じてアミン基に結合している。
Ｗｅｂｅｒはまた他の分析物の水酸基と標識物との間にカルボキシルエステルを 形成し得る可能性もあると述べている。
Ｗｅｂｅｒによると標識ちれた材料の存在は、消光物質と光学手段を用いた電気 化学的フローセルから成る益具、方法で検出できるとのことである。光電気化学 的に活性な標識物が励起すると、電子を消光物質分子に転移きゼる。酸化石れた 分子は続いて適当な電位に保ったフローセルの電極からの電子によって還元され る。
この電子を光電子流として抑」定するのである。系中の遊離標識分析物は光電子 原信号によって測定する。この方法は発光材料のエレクトロ化学ルミネセンス検 出の逆であることに留意すべきである。
Ｗｅｂｅｒらはその後の報告で、ルテニウム含有標識物を検出するためにこの方 法を用いる除の問題点について論じている（１）。Ｗｅｂｅｒら（１）の表２に よると、トリス（ビピリジル）ルテニウム（ｎ）の外挿検出限界は最適条件下で ＬＩ　Ｘ　１０−１０モル／１１．！：なってイル。
これらの標識物を実際に使用する除には複合体混合物の存在下で測定することに なるであろうと予想し、Ｗｅｂｅｒらはその系において考えられる妨害物につい て調査した。Ｗｅｂｅｒらの叙３ではジノナルアルキルアミン類、ＥＤＴＡ、Ｎ −メチルモルホリン、Ｎ　、　Ｎ’−ジメナルピペラジン、水酸化物、シュウ酸 塩、ブスコルビン酸塩、尿酸、血清等が、笑除の検出限界ｆｆｉ　１　、Ｉ　Ｘ １Ｏ−１０モル／７１！以上に引き上げると考えられる妨害物として挙げられて いる。
これらの研究は単純なルテニウム含有化合物を用いて行なわれている。ルテニウ ム含有標識物によって標識した複合体の検出限界に関して、またこの試験条件下 において標識逼れた材料と標識物との間のチオ尿素結合が安定であるかどうかに 関しての記述にｗｅｂｅｒ　％あるいはｗｅｂｅｒらの報告中には嘔れていなか った。
本発明における標識物はエレクトロ化学ルミネセンスに関するものである。Ｃの 標識物は電磁放射線や、シュウ酸塩−Ｈ２Ｏ２のような代表的系により産生嘔れ る化学エネルギー源に接触することで酸化あるいは還元されなくても、発光状態 にまで励起し得ることが多い。嘔らに酸化、還元を伴う電気化学的方法によって もこれらの化合物の発光を起こすことができる。
光化学ルミネセンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミネセンスの手段？ 用いてルテニウム（２゜２−ビピリジン）３２＋を検出する方法に関しての詳細 な研究が報告芒れている（２．３）。この研究ではシュウ酸イオンまたは他の有 機酸の酸化の中間体として産生嘔れた強い還元剤と共に化学的あるいは電気的に 生成てれるルテニウム（ｂｐｙ　’）ｓ”　（ｒ　ｂｐｙ　Ｊはビピリジルリガ ンドのこと）の水性反応によって明るいオレンジ色の化学ルミネセンスが得られ ると述べている。
マタ過酸化二硫酸の還元に伴い産生芒れた強い還元剤と共に電気的あるいは化学 的に生成されるルテニウム（ｂｐｙ　）３”＋の反応によって、有機溶剤−水溶 液中でルミネセンスを得ることも可能である。ルテニウム（ｂＰ７　）３２＋か らエレクトロ化学ルミネセンスを得るための３番目の機構としては、電極の電位 をルテニウム（ｂｐｙ　）３”　ｙ２産生するのに十分なマイナス電位とルテニ ウム（ｂｐｙ　）３”　ｋ産生するのに十分なプラス電位との間で振動きせると いう方法がある。以上の３種類の方法はそれぞれ「酸化還元」、「還元酸化」、 ［ルテ３＋／十 ニウム（ｂｐｙ　）３　再生系」と呼ばれている。
酸化還元法は水中で行うことができ、強く、有効で、安定なルミネセンスが得ら れ、酸素や不純物の存在に対しては比較的感受性が低い。このルテニウム（ｂｐ ｙ　）３”、＋からのルミネセンスは、シュウ酸塩や七の他ピルビン酸塩、乳酸 塩、マロン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸、そしてルテニウム（ｂｐｙ 　）３”　ｔ−酸化的に生成し得る手段が存在する場合に得られる。
この酸化はＰｂＯ２やセリウム（ＩＶ）塩のような強い酸化剤によって化学的に 起こすことができる。筐た連続的あるいは間欠的に十分にプラスである電位をか けることによって電気化学的に起こすこともできる。ルテニウム（ｂｐｙ　）ｓ ”　ｋ電気化学的に酸化嘔ゼるのに適当な電極としては、例えはプラチナ、熱分 解性グラファイト、ガラスカーボン等がある。シュウ酸塩やその他の有機酸は化 学ルミネセンスを出す過程で消費ちれてゆくが、このように消費石れてしまう材 料？過剰に脩加しておくか、反応チャンバー中に連続的に供給するかによって強 く一定した化学ルミネセンスを何時間にもわたって得ることができる。
還元酸化法は例えばアセトニトリルのような有機共溶剤を含む部分水性溶液中で 行うことができる。このルミネセンスは、過酸化二硫酸と、ルテニウム（ｂｐｙ ）３１＋を還元的に生成し得る手段とが存在する場合に得られる。この還元は例 えばマグネシウムや他の金属のような強い還元剤によって化学的に起こ丁ことが できる。また連続的あるいは間欠的に十分にマイナスである電位をかけることに よって電気化学的に起こ丁こともできる。ルテニウム（ｂｐｙ　）　３２＋を電 気化学的に還元妊セるのに適当な電極としてに、例えは光沢ガラスカーボンがあ る。酸化還元法の場合と同様、試薬を過剰に添加しておくか、反応液中に消費て れた試薬全連続的に供給するかによって連続的な強いルミネセンスを何時間にも わたって得るＣとができる。
ルテニウム（ｂｐｙ　）３３＋／＋再生系はアセトニトリルのような有機溶剤中 、または部分水性溶液中で、電極の電位をルテニウム（ｂｐｙ　）！”　を還元 するのに十分なマイナス電位とルテニウム（ｂｐＶ　）ｓ”　ｋ　酸化するのに 十・分なプラス電位の間で振動δセることによって行うことができる。このよう な再生系に適当な電極としては、例えばプラナナ電極がある。この系では化学試 薬が消費でれず、原理的には無限に続行することが可能である。
以上の３種類のルテニウム含有化合物のルミネセンスを産生さセる方法では、ル テニウム含有化合物の反複酸化還元あるいは還元酸化というのが共通点である。
このためこれらの化合物を含ひ溶液のルミネセンスは、与えられたエネルギー源 の電気的ポテンシャルに強く依存しており、そのためにルテニウム含有化合物の 存在を高感度で検出できることになる。
ＭａｎａｌｅはＣｕｒｔｉＳらの報告（４）ヲ、化学ルミネセンスの応用として 使用可能な標識物として引用している。
ｑｕｒｔｉｅらは未発表データとしてではあるがルテニウム複合体はシュウ酸塩 ／　Ｈ２Ｏ２系によって化学的に励起嘔れると発光するようになると報告してい る（　（ｕｒｔｉｓら’９−３５０　）　Ｍａｎａｌｅも（：ｕｒｔｉｓもルテ ニウム及ヒオスミウム複合体が化学ルミネセンスの応用分野として有用であるこ と、エレクトロ化学ルミネセンス系で有用であるＣとは認識していない。５ｐｒ ｉｎｔｓｃｈｎｉｋ　、Ｑう（５）ハオクタデカノールマ几はデヒドロコレステ ロールを用いてエステル化し友トリス（２、２’−ビピリジン）ルテニウム（ｎ ）について報告し、これらの界面活性剤複合体の単層フィルムを産生じた。この 複合体は光学ルミネセンスを発する。しかしフィルムを水につけその後光に当て ると、ルテニウム複合体は光学ルミネセンスを発しなくなる。これは元の存在下 でエステル基の光学的加水分解が起きるためである。
アミド結合またはアミン結合全通して多岐にわたる分析当該物及び分析当該物に 結合する化学種に対しルテニウム含有あるい猷オスミウム含有標識物を容易に標 識し得る方法を開発したので以下に報告する。このようにして標識された材料は 非常に多くの手段を用いて分析できるが、その中でも最も効率的で信頼性があり 感度も高い方法は光学ルミネセンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミネ センスを用いる方法である。またルテニウム含有及びオスミウム含有標識物のよ うなエレクトロ化学ルミネセンス標識物、ルゾレン及び９，１０−ジフェニルア ントラセンのような有機分子が特に多用途に使用でき有効であることについても 以下に述べる。このような新規標識材料を使用すること、そしてそれらを検出す る方法についての大きな利点に関しても以下で嘔らに詳しく論じる。
食品会社は長年にわ友り生の食品成分及び加工食品中の生物学的、化学的汚染物 質の存在について関心をもってきている。技術進歩によって食品中の汚染物質混 入及びその結果起こる食品起因の病気の発失は減少しつつあるが、その一方食品 汚染物質の検出及び同定のための迅速で感度の高い方法の開発における進歩はほ とんど見られていない。食品中の有害な汚染物質を検出するための既存の標準的 方法は一般に非常に時間がかかり、労力も必敦で、技術的にも困難である。分析 方法自体は適度の感受性をもつものが大部分であっても、検出を行う前の試料８ １１４８過程が長くかかるために当該汚染物質の回収率が低くなってしまうこと も多く、陰性であるとの誤判断がＴ１れることもしばしばある。
このような問題点の例となるのは、１３ａ１ｍｏｎｅｌｌａ及（）　３ｔａｐｈ ｙ１ｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシンが食品中に存在するかどうかを検出する のに現在用いられている標°準的方法の２例である。食品中の３ａ１ｍＯｎｅ１ １ａ　ｆ検出する際には、これらの細菌が食品中に存在するとしても通常少数し か生息しておらず致死寸前の損傷を受けていることも多いため、いくつかの＠縮 段階が含まれている。このため３ａ１ｍＯｎ＠Ｉｌｌ＆の検出方法は感度が高く 、損傷を受けた細胞を蘇生嘔ゼ増殖させるようなものでなくてはならない。
現在Ｓａ１ｍＯｎｅｌｌ＆の検出方法としてはアメリカ食品医薬凸周によって２ 種類が推奨されている。これらの方法はＢａＣｔｅｒｉＯｌｏｇｉＣａｌ　Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒＦｏｏａｓ　（１９８４年）第６版、 Ａ１１８０Ｃ１ａｔｉＯｎ　ｏｆＯｆｆｉｃｉａｌ　Ａｎａ１７ｔｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉ８ｔ８　、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　、　ＤＣ。
に記載されている。このうち−法は前濃縮、選択的濃縮、選択的ブレーティング を含む純粋培養技法であり、推定結果を得るのに４日間、完全な結果を得るのに ５〜７日間を要する。もう−法は選択的ＩＩ縮の後、免疫螢光検査法を用いるも のである。この方法はより迅速であるが、試験に使用する多価の抗血清が又着尺 応性ｔもつという問題点があるため、陽性であるとの誤判断か下δれることが高 率で起こり得る（６．７）。
食品中の５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕｓエンテρトキシンを検出する方法として アメリカ食品医薬凸周が推奨している方法も１３ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ 　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒＦｏｏａｓ　（１９８４年）第 ６版、Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆＯｆｆｉｃｉａｌ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ 　（ｈｅｍｉｓｔｓ　、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ。
に記載されている。この方法では大量の食品試料、例えは約１ｏｏＩｉのものの 抽出物を透析濃縮の数段階を経て約０．２ｄ程度の少量に濃縮し、マイクロスラ イド二重免疫拡散法の試料としてＶ＠製するために試料抽出物をイオン交換カラ ムによって精製する。この方法を行うためには通常−週間以上を要する。
食品中の細菌、毒素、抗生物質、農薬のような各種汚染物質を検出するより迅速 な試験方法が最近開発嘔れている。しかし多くの場合試験を実施する罰の試料調 製に依然として労力と時間を安する。ラジオイムノアｙ−ｔｔイ（ＲＩＡ　）及 ヒ酵素標識イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）　Ｋよって分析方法自体 の実施時間は短縮されたが、それでもこのような方法はやはり労力を灸するもの で、簡単に実施できるとは言い難い。さらにこれらの方法は通常特異性も感受性 も様々な多価の抗血清を使用することに基づいており、当該食品汚染物質の試験 のためには量的に不足していることが多い。
ＥＬＩＳＡ法は多価の抗血清ではなくモノクローナル抗体を用いて食品試料を分 析するために開発てれた方法である。食品汚染物質の試験系に七ツクローナル抗 体を使用することによって試薬の一定し次供給が得られるようになり、試験自体 の不変の特異性、感度が保証てれる。ＥＬＩＳＡ系でＢ　ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ 　（８）やＢｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン（９）のような食 品汚染物質を試験するのにモノクローナル抗体が用いられている。ＥＩＡ法（Ｂ ｉｏ−Ｅｎｚａｂｅａａ　５ｃｒｅｅｎ　Ｋｉｔ　、　Ｌｌｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎ ｅｔｉｃｓ）及びＤＮＡグローブ技法（Ｇｏｎｅ　−Ｔｒａｋ　、工ｎｔｅｇｒ ａｔｅｄＧｅｎｅｔ１ｃｓ　）　ｆ用いる市販のＳａ１ｍＯｎｅｌｌａ検出用製 品は、時間がかかるし労力も要する。逆受身ラテックス凝集反応（ＳＥＴ　−Ｒ ＰＬＡ　、　Ｄｅｎｋａ　３ｅｉｋｓｎ　Ｃｏ、）及びＥＩＡ法（ＳＥＴ　−Ｅ ＩＡ　、Ｄｒ、　Ｗ、　Ｂｏｍｍｅｌｉ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｆ用 いる市販の食品中Ｓｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕｇエンテロトキシン検出用製品も 同様の欠点？もっている。水質及び汚水汚染の発生全管理するための指標として 過去１００年の間細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｌ及び大腸菌型群が広く 使用てれてきた。
現在シｃｏｌｉ及び／または大腸菌型群の検出に使用てれている方法は、乳糖の 発酵による酸または気体産生り特性に基づいている。最も広く使われている方法 は、最大可能画数（ＭＰＮ　）試験と膜ろ過（ＭＦ）試験である。両方法共上水 及び下水の微生物学的検査法として環境保護庁（ＥＰＡ　）及びアメリカ公衆衛 生協会（ＡＰＨＡ　）によジ承８ちれており　（１０）、牛乳及び食品の微生物 学的検査法として食品医薬凸周（ＦＤＡ　）によっても承認ちれている（１１） 。
ＭＰＮ法は実開には３種の（１２）別個の試験から成つている（１０）。推定試 験においてはラウリル硫酸トリプトース（ＬＳＴ　）ブロスや乳糖ブロスのよう な非選択的培地を用いて、乳糖発酵による気体産生ヲ調べる。
次に気体発生陽性であった試験管についてより選択的な培地中で継代培養を行う 。大腸菌型群の培養にはブリリアントグリーン乳糖胆汁酸（ＢＧＬＢ　）ブロス を。
糞便大腸菌型群の培養にはＥ、　ｃｏｘｔ　（Ｅ　Ｃ）ブロス全使用し、気体産 生について再びＦＪ食する（確認試験）。
確認試験で陽性を呈した試料はさらにエオシンメチレンブルー（ＥＭＢ　）寒天 培地や遠藤寒天培地のような選択的鑑別培地上にブレーティングし、指標細菌の 存在を明確に証明するためにダラム染色やその他の生化学的試験を行う（完全試 験）。ＭＰＮ試験を完全に終結するには最大５日間（５）必要なので、はとんど の研究所では日常的水分析としてはＭＰＮ試験のうちの推定試験と確認試験のみ を採用しているが、それでも終了までに４８〜７２時間會要する。ＭＰＮ試験は 時間がかかり材料の面からも費用がかかるはかりでなく、陽性及び陰性であると の誤判断が発生することが多い（１５゜１６．２０）。
水の微生物学的検査法としてＭＦ法が導入嘔れたのは１９５０年代の初期である （１２）。冗長で時間のかかるＭＰＮ試験とは異なり、ＭＦ分析は２４時間で完 結しさらに確認する必要もない。ＭＦ法の基本手順は次の通りである。水試料の 一定量、通常１００ｍｔｋＯ，４５μｍ孔径のろ紙を通じてろ過し、選釈的培地 で満九した滅菌パッド上で培養する。最もよく使用でれる培地は３５°Ｃで大腸 菌型に選択的なｍ遠藤ブロスと４４．５°Ｃで糞便大腸菌型に選択的なｍＦｃブ ロスの２種類である（１０）。これらの培地が使用逼れるようになって以来、多 くの著者らがｍ遠藤及びｍＦｃブロスは共に実際に存在する指標細菌数よりも少 なく算定する傾向にあると報告してきた。これは培地の選択性、あるいは培養に 使用した高温度（４４，５°Ｃ）のどちらかによるものであろう（，２１，２２ ）。試料中の菌体が環境因子及び／または化学物質によって致死寸前の損傷を受 けている場合には、このような陰性誤判断が特に起こりやすい（１７、１８）。
最近ＥＰＡによってＭＦ試験を確認的手順を用いて補うための改良法が提案石れ ており、それによるとＭＰＮ試験におけるＢＧＬＢゾロスと同様ＬＳＴブロスを 用いて気体産生を調べるのに各ろ紙上に最低１０個のコロニーがなければならな い（１４）。この改良法を用いれば陰性及び陽性の雨具判断は減るであろうけれ ども、材料費が高くな！７ＭＦ試験に要する時間は２４時間から７２時間へと３ 倍になる。
１９８２年にＦｅｎｇとＨａｒｔｍａｎは４−メナルウンベリフエロングルクロ ニド（ＭＵＧ　）　ｉ基質として使用した旦・Ｃ０１ｉ検出のための螢光発生試 験を導入した（１３）。Ｌ匹星の糺胞がβ−グルクロニダーゼという酵素を産生 じ、それによって基質を切断して螢光を発する４−メテルウンベリフエロンラジ カルヲ放出するのである（１９）。ＭＵＧ化合物を推定試験のＬＳＴ培地に加え ることによって、ＬＳＴ　−ＭＵＧ培地の試験管１本で糞便大腸菌型に関する推 定データ（気体産生）及び確認データ（螢光）の両方が２４時間以内に得られる ようになった。ＭＵＧ試験は迅速で簡単であるが、シ。
００１１の８５〜９５チしかこの酵素を産生しないｋめ（出所による）、試験は １００％信頼性をもつわけではない。ま九この系は大腸菌型群には適用できない 。
現在１つの試料中の大腸菌型及び糞便大腸菌型を検出し計数するのに適切な試験 はない。簡単で迅速、信頼性のある検出試験が開発きれれば、経費及び時間の節 約になるばかりでなく、水道設備生食品加工、取扱いの管理がずっと効率よく行 われることになろう。
本発明の要約 本発明は予め測定場れた量の多成分液体試料において、その試料中に約１０−３ モル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための方法に関するもので、以 下の部分から構成δれている。ａ）試料を（１１試薬がくり返し放射ａ＋放出し 得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受けた時に電磁放射ａ ＋’ｔ＜り返し放出するようになる、及び（ｉ）目的分析物と結合することがで きる、ような試薬と接触芒ゼる。友だし分析物と試薬が結合するのに最適な条件 下で接触嘔ゼる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出 し得るような適切な源からの電気化学的エネルヤー一定量を与える。ただし試薬 がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与える。りこのようにし て放出嘔れた電磁放射線を検出し、それによって試料中の分析物の存在も検出す る。
また本発明は予め測定された量の多成分液体試料において、その試料中に約１０ −３モル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための競合的方法に関する ものでもあり、以下の部分から構成嘔れている。ａ）試料ヲ（１）試薬がくり返 し放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び（ｌｉ）試料中には通常 存在しない相補的材料の結合部位について目的分析物、及び相補的材料と競合し 得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と試薬が相補的材料と競合的 に結合する゛のに最適な条件下で接触嘔セる。ｂ）このようにして得た試料に、 試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルイー 一定量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件 下で与える。
Ｃ）このようにして放出ちれた電磁放射線を検出し、それによって試料中の分析 物の存在も検出する。
また予め測定δれた量の多成分液体試料において、その試料中に存在する目的分 析物の量を定量的に測定するための方法に関するものも含み、以下の部分から構 成されている。ａ）試料を既知量の（１）試薬がくり返し放射ａ＋放出し得るよ うな適切な源からの電気化学的エネルイー一定量を受けた時に電磁放射線をくり 返し放出するようになる、及び（ｉ）目的分析物と結合することができる、よう な試薬と接触嘔セる。ただし分析物と試薬が結合するのに最適な条件下で接触さ せる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出し得るよう な適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を与える。九だし試薬がくり返し ｔａ１放射線を放出し得るような最適条件下で与える。Ｃ）このようにして放出 された放射線の量を定量的に測定し、それによって試料中に存在する目的分析物 の量も定量的に測定する〇 本発明は嘔らに予め測定ちれた量の多成分液体試料において、その試料中に存在 する目的分析物の量を定量的に測定するための競合的方法に関するものも含む。
この方法は以下の部分から栴成嘔れている。ａ）試料を既知量の（＋１試薬がく り返し放射線全放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルイー一定量を 受け九時に電磁放射線ｖ＜ｐ返し放出するようになる、及び（１）試料中には通 常存在しない相補的材料の結合部位について目的分析物、及び既知量の相補的材 料と競合し得る、ような試薬と接触嘔セる。ただし目的分析物と試薬が相補的材 料と競合的に結合するのに最適な条件下で接触ａ＜る。ｂ）このようにして得九 試料に、試薬が〈シ返し放射＋ｖｉ！ｔ−放出し得るような適切な源からの電気 化学的エネルイー一定量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し得 るような最適条件下で与える。Ｃ）このようにして放出された放射線の量を定量 的に測定し、それによって試料中に存在する目的分析物の量も定量的に測定する 。
また液体食品、食品ホモジネート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する ための方法に関するものも含む。この方法は以下の部分から構成されている。
！Ｌ）液体またに固体懸濁液に浸すのに適切で多数の試薬に対して固定嘔れた診 断試薬ホルダーを゛液体食品あるいは食品ホモジネート中に浸す。几だし各試薬 は診断試薬ホルダーの明確に区別できる位置に固定し、固定された試薬−目的分 析物複合体が形成されるよう目的分析物１種類ずつと複合体を形成し得るように する。
ｂ）液体食品あるいは食品ホモジネート中から診断試薬ホルダーを取り除く。Ｃ ）適当な洗浄溶液を用いて診断試薬ホルダーを洗浄する。ｄ）固定された試薬− 目的分析物複合体を含む判断試薬ホルダーを、固定嘔れた試薬−目的分析物複合 体と複合体を形成することができ、固定嘔れた試薬−目的分析物検出試薬複合体 上形成し得るような最低１種類の検出試薬を含む検出溶液中に浸丁。ｅ）試薬が 、固定嘔れた試薬−目的分析物−検出試薬複合体として固定されている診断試薬 ホルダーの同定可能な部分を検出し、それによって液体食品あるい１グ食品ホモ ジネート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する。
本発明はまた試料中に多数存在するエンテロトキシン類を検出し同定するのに有 用なキットも含む。このキットは以下の部分から構成されている。ａ）液体また は固体懸濁液に浸すのに適切なように表面部分に連結された取っ手のつい几診断 試薬ホルダー；ただし上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつい ており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位置に別々に明確に固定でれ た各種モノクローナル抗体がつけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれ ぞれ１２１類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的なものとなっている ；ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液から成る第一洗浄溶液；Ｃ）最低一種類のモ ノクローナル抗体酵素結合から成る検出部；モノクローナル抗体は各エンテロト キシンに対する異なる抗原決定基に特異的なもので、診断試薬ホルダーにつけら れたニトロセルロース膜上に固定されている；ｄ）バッファー水溶液からなる第 ２洗浄液；ｅ）検出溶液中のモノクローナル抗体に結合された醪累と反応し得る 酵素基質；及びｆ）無色染液。
本発明には１つの試料中の細菌最低１種の存在を検出するための方法も含まれる 。この方法は以下の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で細菌種の増殖 に適する培地を含む容器中に接種する。ｂ）キャップを容器の端に連結する。こ のキャンプの面は容器に連結した時に容器の内部と接触するようになっており表 面が最低１つの細菌成分を固定するのに適切な構造となっている。Ｃ）培地中に 接種嘔れた細菌が増殖し得るような条件下で、接種芒れ几培地を培養する。ｄ） 容器の上下を適当な時間の間反転させ、培地中に存在する細菌成分が容器の内部 に面したキャップの表面上に固定されるようにする。ｅ）容器の上下全反転芒セ 正しい方向に戻す。ｆ）容器からキャンプを取りはすす。ｇ）細菌成分が固定て れているキャンプの弐面を、固定された細菌成分−試薬複合体が形成嘔れるのに 適切な条件下で、固定ちれ次細菌成分と複合体を形成し得る試薬に接触嘔セる。
ｈ）固定ちれた細菌成分−試薬複合体を検出し、それによって試料中の細菌種の 存在をも検出する。
嘔らに本発明には試料中の大腸菌型細菌の存在を検出するための方法も含まれる 。この方法は以下の部分から構成ちれている。ａ）試料を開放式で非選訳的乳糖 培地及び倒立Ｄｕｒｈａｍ　ｆ入れた容器中に接種する。
ｂ）ポリスチレン挿入物をつけたキャンプを各容器の開放側の端に連結する。Ｃ ）接種でれた培地’に３７°Ｃで最低２時間培養する。ｄ）各容器中に倒立きセ たＤｕｒｈａｍバイアル同に採取てれている細菌発酵により産生とれた気体があ るかどうか検出する。ｅ）倒立さセたｐｕｒｈａｍバイアル内に気体が採取でれ ている容器の上下を適当な時間の間反転嘔セ、培地中に存在する大腸菌型細菌が 大腸菌型−ポリスチレン複合体を形成し得るようにする。ｆ）容器の上下を反転 ａ＜正しい方向に戻す。ｇ）容器からキャップを取りはずす。ｈ）、取！ｌｌは イしたキャンプのポリスチレン挿入物を、未結合部位をふさぐのに適切な物質を 用いて処理する。１）未結合部位をふ嘔ぐのに適切な物質を用いて処理嘔れたキ ャップのポリスチレン挿入物音、抗体−大腸菌型−ホリスナレン複合体が形成し 得るような条件下で大腸菌型細菌に結合でき検出可能となる標識物によって標識 した抗大腸菌型細菌抗体最低１種類を用いて処理する。ｊ）、ｔｅ！ｊスチレン 挿入物上の抗体−大ｐＩＩ３ｔａｍ−ポリスチレン複合体の存在を検出し、それ によって試料中の大腸菌型細菌の存在をも検出する。
図の説明要約 第１図は溶液中の一種の抗原の濃度を測定する九めの均質系イムノアッセイ用に 用いられるエレクトロ化学ルミネセンス測定法について表わしたものである。
第２図は均質系ＥＣＬテオフィリン試験の結果をグラフに表わしたものである。
第３図は各種血清における均質系テオフィリン試験の結果？グラフに懺わしたも のである。
・−正常血清 ■＝溶血血清 ◆＝脂肪血症血清 口＝貧血血清 第４図はＥＣＬテオフィリン試験の結果全螢光偏光テオフィリン試験の結果と比 較しグラフに表わしたものである。
Ａ、正常血清：ｎ＝４；傾き＝　０．９８６　；　ｒ　−１，００Ｂ、溶血血清 ：ｎ＝３；傾き＝　０．８７８　；　ｒ　−１，叩Ｃ０脂肪血症血清：ｎ−５； 傾！　＝　０．８７２　；ｒ　＝　０．９９ Ｄ、黄痕血清：ｎ＝４；傾き＝　２．１４　；　ｒ　＝　１．００第５囚はＥＣ Ｌテオフィリン試験の結果を高速液体クロマトグラフィー試験の結果と比較しグ ラフに表わしたものである。
ｎ＝９；傾き＝　１．１９７　；　ｒ　＝　０．９８第６図はＥＣＬジゴキシン イムノアッセイにおいて産生されたＥＣＬ信号の調整をグラフに表わしたもので ある。
第７図ｉ　ＥＣＬジゴキシンイムノアッセイの結果全グラフに表わしたものであ る。
一二対照 ・：ジゴキシン 第８図はＭＢＩ　３８−化合物Ｉの各濃度において産生きれ７’（ＥＣＬ信号を グラフに衣わしたものである。
第９図ｉ　ＭＢＩ　３８−化合物ｌのハイブリッド形成／感受性試験の結果を示 し友ものである。
ＴＡＧ　−化合物ｌ 第１０図はＭＢＩ　３８−化合物ｌの特異性試験の結果を示したものである。
本発明の詳細 な説明は予め測定された量の多成分液体試料において、その試料中に約１０−３ モル以下の濃度で存在する目的分析物全検出するための方法に関するもので、以 下の部分から構成嘔れている。ａ）試料を（１）試薬がくり返し放射線を放出し 得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受けた時に電磁放射線 をくり返し放出するようになる、及び１０）目的分析物と結合することができる 、ような試薬と接触名セる。ただし分析物と試薬が結合するのに最適な条件下で 接触δセる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出し得 るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試薬がく り返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与える。Ｃ）このようにして 放出嘔れた電磁放射線を検出し、それによって試料中の目的分析物の存在ｔも検 出する。
本出願において「モル」とは、溶液中に１１！当たり存在する分析物の濃度１モ ルで表わしたもの、あるいは液体試料中に１１当たり存在する粒子ま友はユニッ トで粒子状物質の量全表わしたもの全意味する。例えば１１中Ｉ　Ｘ　１０２３ 個の粒子のことを１モルと表わ、す。
本発明における方法は、不均一試験すなわち結合した標識試薬に電気化学的エネ ルギーを与える前に結合した標識試薬から未結合標識試薬を分離する試験と、均 質系試験すなわち未結合標識試薬と結合した標識試薬の両方に同時に電気化学的 エネルギーを与える試験として実施嘔れるものである。本発明の均質系試験にお いては、結合した標識試薬から放出されｆｃ電磁放射線は、未結合標識試薬と比 較して結合した標識試薬から放出された電磁放射線の量が増加したか減少したか 、あるいは波長の異なる電磁放射線によって未結合標識試薬から放出てれた電磁 放射線と区別し得る。従って本発明の１つの具体例として、目的分析物と結合し ていない試薬はすべて、試料に電気化学的エネルギーを与える前に試薬と接触し た試料から分離されることになる。本発明のもう１つの具体例では、試料を試薬 と接触嘔セる前に、目的分析物を固定するために試料を処理する。目的分析物の 固定方法はその技術分野ではよく知られているものであり、試料をホリスナレン 、ニトロセルロース、ナイロンの表面に接触嘔セるか、マｆＣは全細胞、準細胞 粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク 質、リポタンパク質、リボ多糖、糖タンパク質、ペプチド、細胞代謝産物、ホル モン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビッール酸塩、アルカロイド、ステロイ ド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的＆　ＩＪママ−合成有機分子、有機金 属化合物分子、無機分子でコーティングした表面に接触させるのである。また目 的分析物が以上の物質の中のどれかであってもよい。本発明の１つの具体例では 、目的分析物がテオフィリンである。また別の具体例では目的分析物がジビキシ ンである。嘔らに別の具体例では目的分析物がヒト絨毛性ビナドトロぎン（ｈｃ ｏ　）である。また目的分析物が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビ イロイド、核酸、タンパク質、リボタン白質、リボ多糖、糖タン白質、ペプチド 、ホルモン、薬理学的試薬、非生物学的／　ＩＪママ−合成有機分子、有機金属 化合物分子、無機分子であることも可能で、試料中に約１０−１２モル以下の濃 度で存在するこれらの物質を分析できる。嘔らに目的分析物が試料中に約１０− １δモル以下の濃度で存在する全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイ ロイド、核酸であることも可能である。
試料と接触嘔セる試薬は、全細胞、準細胞粒子、ビイシス、プリオン、ビイロイ ド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、たん白質、リボタン白質、リボ多糖、糖タン白 質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビッ ール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的高 分子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子、ビオチン、アビジン、ス トレプタビジンに結合したエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学ｓ’ｔ−含 むものである。本発明の１つの具体例では試薬は抗体、抗原、ビジン、ストレプ タビジンに結合したエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種である。
エレクトロ化学ルミネセンス奮発する化学種としてはルテニウム、オスミウム、 レニウム、イリジウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、テクネ チウムから成る群から選択した金Ｊｔ％を含む有機化合物が用いられる。本発明 の１つの具体例では金属はルテニウムあるいはオスミウムを使用している。また 別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてルプレンまた は９．１０−ジフェニルアントラセンを使用している。さらに別の具体例ではエ レクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（（４、４’−カルボメト キシ’）　−２、２’−ビピリジン〕２−［３−（４−メチル−２，２′−ビピ リジン−４−１１）プロピル）−１，３−ジオキソランルテニウム（ｎ）’を使 用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種と してビス（２、２’ビピリジン）［４−（ブタン−１−ａｌ　）　−４’−メチ ル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（Ｕ）ｔ−使用している。嘔らに別の具 体例ではエレクトロ化学ルミネセンス奮発する化学種としてビス（２，２’−ビ ピリジン）（４−（４’−メチル−２，２′−ビピリジン−４’−７１）−酪酸 〕ルテニウム（ｎ）　’ｌｒ使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学 ルミネセンスを発する化学種として（２、２’−ビピリジン）〔シス−ビス（１ ，２−ジフェニルホスフィノ）ニレテン）（２−（３−（４−ノナルー２．２′ −ビピリジン−４’　−ｙｌ　）プロピル］−１，３−ジオキソラン）オスミウ ム（ｎ）ｔ−使用している。嘔らに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンス を発する化学種としてビス（２，２’−ビピリジン）　［４−（４’−メチル− ２，２′−ビピリジン）−ブチラミドルテニウム（ｎ）　’に使用している。ま た別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、 ２’−ビピリジン）〔１−プロモー４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン− ４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ｎ）　’ｔ−使用している。嘔らに別の具体例 ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、２’−ビピリ ジン）マレイミドヘキサン識、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチ ラミドルテニウム（ｎ）ヲ使用している。
試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体から得たものが使用できる。さらに水 、食品、血液、血清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た試料も 使用できる。
また試料中にア七ト二トリル、ジメナルスルフオキシド、ジメチルホルムアミド 、ｎ−メチル−ピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれていても使用で きる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含まれていても使用できる。
また本発明は予め測定でれた量の多成分液体試料において、その試料中に約１０ −３モル以下の濃度で存在する目的分析物全検出するための競合的方法に関する ものでもあり、以下の部分から構成てれている。ａ）試料を（１）試薬がくり返 し放射線全放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及びｔｉｉ）試料中には通常 存在しない相補的材料の結合部位について目的分析物、及び相補的材料と競合し 得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と試薬が相補的材料と競合的 に結合するのに最適な条件下で接触場セる。ｂ）このようにして得几試料に、試 薬がくり返し放射線全放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一 定量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線全放出し得るような最適条件下 で与える。
Ｃ）このようにして放出された電磁放射線を検出し、それによって試料中の目的 分析物の存在ｔも検出する。
試薬はエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的分析物、ある いはエレクトロ化学ルミネセンス奮発する化学種に結合した目的分析物の類似体 を用いる。また目的分析物としてテオフィリン、ジゴキシン、ｈＣＧが使用でき る。エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてはビス（（４，４’−カ ルボメトキシ）　−２、２’−ビピリジン’１２−［３−（４−メテルー２．２ ′−ビピリジン−４−ｙｌ　）プロピル−１，３−ジオキソランルテニウム（ｎ ）が使用できる。
−！た本発明の別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種とし てビス（２，２’−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ　）　−４’−メチ ル−２，２’−ビピリジン〕ルテニウム（ｕ）　’に使用している。さらに別の 具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、２’− ビピリジン）［４−（４−ノナルー２，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸 〕ルテニウム（ｎ）　’ｔ−使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学 ルミネセンス奮発する化学種として（２、２’−ビピリジン）〔シス−ビス（１ ，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン）（２−［３−（４−／ナルー２．２′ −ビピリジンー４′−イル）プロピル〕−１，６−ジオキソラン）オスミウム（ …）を使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発す る化学種としてビス（２，７−ビぎリジン）［４−（４’−メチル−２，２′− ビピリジン）−ゾテラミン〕ルテニウム（Ｉｔ）　ｋ使用している。また別の具 体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２’−ビ ピリジン）〔１−プロモー４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４−７１ ）ブタン〕ルテニウム（…）全使用している。さらに別の具体例でにエレクトロ 化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、２’−ビピリジン）マレイミ ドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４７−ブチラミドルテニウ ム（ｎ）　ｋ使用している。
プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タン白質、リボタン白質、 リボ多糖、糖タン白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精 神安定薬、バルビッール酸塩、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学 的高分子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子を使用することができ る。
本出罪の範囲内ではここに述べる方法は目的分析物を定量するために用いるもの である。従って本発明は予め測定された量の多成分液体試料において、その試料 中に存在する目的分析物の１全定量的に測定するための方法に関するものも含み 、以下の部分から構成されている５ａ）試料を既知量の（１）試薬がくり返し放 射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受けた時 に電磁放射線全くり返し放出するようになる、及び（ｉｉｌ目的分析物と結合す ることができる、ような試薬と接触嘔セる。ただし分析物と試薬が結合するのに 最適な条件下で接触芒セる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し放 射線全放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を与える。
ただし試薬がくり返し電磁放射＠全放出し得るような最適条件下で与える。Ｃ） このようにして放出された放射線の量を定量的に測定し、それによって試料中に 存在する目的分析物の童をも定量的に測定する。
本方法は不均一試験としても均一系試験としても使用できる。本発明の１つの具 体例では目的分析物と結合していない試薬は丁べて、試料に試薬がくり返し放射 線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を与える前に 、既知量の試薬と接触した試料から分離される。また本発明の別の具体例では、 試料全試薬と接触嘔セる前に、目的分析物を固定するために試料を処理する。
目的分析物としては全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、脂 質、脂肪酸、核酸、多糖、タン白質、り都タン白質、す？多糖、糖タン白質、ペ プチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビッール酸 塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的高分子、 合成有機分子、有機金風化合物分子、＃根分子であることが可能である。本発明 の１つの具体例では目的分析物がテオフィリンである。また本発明の別の具体例 では目的分析物かジゴキシンである。嘔らに本発明の別の具体例でに目的分析物 がｈＣＧである。
試料と接触δセる試薬は、全細胞、準細胞粒子、ウィルス、プリオン、ビイロイ ド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タン白質、リボタン白質、リボ多糖、糖タン白 質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビッ ール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ど リマー、合成有機分子、有機金属化合物分子、需機分子に結合したエレクトロ化 学ルミネセンスを発する化学種である。
本発明の１つの具体例では試薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンドまたは 酵素、ビオテン、アビジン、ストレプタビジンに結合したエレクトロ化学ルミネ センスを発する化学種である。
エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてはルテニウム、オスミウム、 レニウム、イリジウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、テクネ チウムから宏る群から選択しり金属を含む有機化合物が用いられる。本発明の１ つの具体例では金属はルテニウムあるいはオスミウムを使用している。また別の 具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてルプレンまｆｃは ９，１０−ジフェニルアントラセンを使用している。さらに別の具体例ではエレ クトロ化学ルミネセンス奮発する化学種としてビス（（４、４’−カルボメトキ シ）　−２、２’−ビピリジン〕２−（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ ン−４−ｙｌ　）プロピル）−１，３−ジオキソランルテニウム（ｎ）ｋ使用し ている。’ＥＦｈ別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種と してビス（２、２’−ビぎリジ／）［４−（ブタン−１−ａｌ）　−４／−メチ ル−２，２′−ビピリジン〕ルテニクム（ｎ）ｔ−使用している。嘔らに別の具 体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、２’−ビ ピリジン）［４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ）−酪酸〕 ルテニウム（ｎ）　’ｔ−使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ル ミネセンスを発する化学種として（２、２’−ビピリジン）〔シス−ビス（１， ２−１７フエニルホスフイノ）エチレン］（２−（：３−（４−メチル−２，２ ′−ビピリジン−４’−ｙｌ）プロピル）−１，３−ジオキソラン）オスミウム （…）を使用している。嘔°らに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを 発する化学種としてビス（２、２’−ビぎリジン）（４−（４’−メチル−２， ２′−ビピリジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ｎ）　ｔ−使用している。
’Ｅ７’Ｃ別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスｔ−発する化学種として ビス（２、２’−ビピリジン）〔１−プロモー４（４′−メチル−２，２′−ビ ピリジン−４−ｙｌ　）ブタン〕ルテニウム（ｎ）　’ｔ−使用している。さら に別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２， ２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン −４′−プテラミドルテニウム（Ｉｌ）　ｋ使用している。
試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体から得たものが使用できる。嘔らに水 、食品、血液、血清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た試料も 使用できる。１７を試料中にアセトニトリル、ジメチルスルフオキシド、ジメチ ルホルムアミド、ｎ−メチルピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれて いても使用できる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含まれていても使用できる 。
本発明はまた予め測定された量の多成分液体試料において、その試料中に存在す る目的分析物の量を定量的に測定するための競合的方法に関するものも含ひ。
この方法は以下の部分から構成されている。ａ）試料を既知量の（１）試薬がく り返し放射ＳＶ放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を 受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び（１１試料中には通 常存在しない相補的材料の結合部位について目的分析物、及び既知量の相補的材 料と競合し得る、ような試薬と接触嘔セる。ただし目的分析物と試薬が相補的材 料と競合的に結合するのに最適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た 試料に、試薬がくり返し放射ａｔ放出し得るような適切な源からの電気化学的エ ネルイー一定量會与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような 最適条件下で与える。Ｃ）このようにして放出嘔れた放射緋の量を定量的に測定 し、それによって試料中に存在する目的分析物の量をも定量的に測定する。
目的分析物としてテオフィリン、ジゴキシン、ｈｃＧが使用できる。
本発明の１つの具体例では試薬はエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に 結合した目的分析物、あるいはエレクトロ化学ルミネセンス奮発する化学種に結 合した目的分析物の類似体を用いている。エレクトロ化学ルミネセンスを発する 化学種としてはビス〔（４゜４′−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン〕 ２−（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−７１）プロピル）−１， ３−ジオキソランルテニウム（Ｉｔ）が使用できる。また本発明の別の具体例で はエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２、２’−ビピリジ ン）Ｃ４−Ｃブタン−１−ａｌ　）　−４’−メチル−２，２′、−ビピリジン 〕ルテニウム（ｎ）　’！ｌ−使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ 化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２’−ビピリジン）（４−（ ４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ　）−酪酸〕ルテニウム（Ｉｔ ）　’に使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発す る化学種として（２、２’−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホ スフィノ）エチレン（２−（３−（４−ノナルー２．２′−ビピリジン−４’　 −７１）プロピル）−１，３−ジオキソラン）オスミウム（ｎ）全使用している 。嘔らに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス （２，２’−ビピリジン）　（４−（４’−メチル−２，２′−ビピリジン）ブ チラミン〕ルテニウム（ｎ）　ｋ使用している。また別の具体例ではエレクトロ 化学ルミネセンスｔｉする化学種としてビス（２、２’−ビピリジン）〔１−プ ロモー４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）ブタン〕ルテニウ ム（ｎ）を使用している。嘔らに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを 発する化学種としてビス（２、２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４− メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブナラミドルテニウム（ｎ）　ｋ使用し ている。
相補的材料としては全細胞、単細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、脂 質、脂肪酸、核醒、多糖、タン白質、リボタン白質、リボ多糖、糖タン白質、ペ プチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビッール酸 塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ポリマー 、合成有機分子、有機金属化合物分子、焦機分子を使用することができる。
本発明はまた液体食品、食品ホモジネート中に多数存在する目的分析物全検出し 同定するための方法に関するものも含ひ。この方法は以下の部分から構成てれて いる。ａ）液体または固体懸濁液に浸すのに適切で多数の試薬に対して固定てれ た診断試薬ホルダー全液体食品あるい６１食品ホモジネート中に浸す。九だし各 試薬は診断試薬ホルダーの明確に区別できる位置に固定し、固定てれた試薬−目 的分析物複合体が形成式れるよう目的分析物１種類ずつと複合体を形成し得るよ うにする。ｂ）液体食品あるいは食品ホモジネート中から判断試薬ホルダーを取 り除く。Ｃ）適当な洗浄溶液を用いて判断試薬ホルダーを洗浄する。ｄ）固定さ 九た試薬−目的分析物複合体を含む判断試薬ホルダーを、固定てれ几試薬−目的 分析物複合体と複合体を形成することができ、固定された試薬−目的分析物−検 出試薬複合体を形成し得るような最低１種類の検出試薬奮含む検出溶液に浸す。
ｅ）試薬が、固定てれた試薬−目的分析物−検出試薬複合体として固定芒れてい る判断試薬ホルダーの同定可能な部分を検出し、それによって液体食品あるい（ ２食品ホモジネート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する。
目的分析物としては微生物を用いることができる。
微生物の生死に問わない。また微生物は細菌でもよい。
本方法によって検出し得る細菌の例としてはサルモネラ属、カンピロバクタ−属 、エシェリキア属、エルジニア属、バチルス属、ビゾリオ属、レジュネラ属、ク ロストリジウム属、連鎖法菌属、ブドウ球菌属が挙げられるが、これらの細菌の みに限定されるわけではない。
ま几目的分析物として抗原を用いることができる。
このような抗原としてはエンテロトキシン類及びアフラトキシン類が挙げられる が、これに限定きれるわけではない。
固定ちれる試薬及び検出試薬としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体 、モノクローナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の混 合物が使用できる。検出試薬は検出可能な標識物を用いて標識することができる 。本発明の１つの具体例では検出試薬がそれぞれ同じ検出可能標識物によって標 識でれている。このような標識物はその技術分野でよく知られているものであり 、例えばアルカリ性ホスフ・アターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコー スオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼのような酵素、例えばフル オレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンインチオシアネート、 ジクロロトリアジニラミノフルオレセイン、テキサスレッドのような螢光種、例 えばルミノール、インルミノール、アクリジニクムエステルのような化学ルミネ センス種が含まれている。また検出可能標識物として化学種が放射線を放出し得 るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受けた時に電磁放射ａｔ くり返し放出するようになるエレクトロ化学ルミネセンス化学種も使用できる。
このエレクトロ化学ルミネセンス化学種にはルテニウム、オスミウムが含まれる 。
固定試薬は、診断試薬ホルダーに取９つけたニトロセルロース膜に固定する。
本発明はまた試料中に多数存在するエンテロトキシン類を検出し同定するのに有 用なキットも含む。このキットは以下の部分から構成芒れている。ａ）液体また は固体懸濁液に浸丁のに適切なように表面部分に連結てれた取っ手のついた診断 試薬ホルダー。ただし上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつい ており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位置に別々に明確に固定され た各徨モノクローナル抗体がつけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれ ぞれ１種類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的なものとなっている。
ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液から成る第一洗浄溶液。Ｃ）最低一種類のモノ クローナル抗体酵素結合から成る検出部。モノクローナル抗体は各エンテロトキ シンに対する異なる抗原決定基に特異的なもので、診断試薬ホルダーにつけられ 九ニトロセルロース膜上に固定嘔れている。ｅ）検出溶液中のモノクローナル抗 体に結合でれた酵素と反応し得る酵素基質。ｆ）無色染液。
本発明の１つの具体例ではニトロセルロース膜に別別に明確に固定され、各種５ ｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕｓエンテロトキシン類の抗原決定基に特異的であるモ ノクローナル抗体をつけ九ニトロセルロース膜七使用している。
また本発明の別の具体例ではニトロセルロース膜に別別に明確に固定され、５ｔ ａｐｈ７１０ＣＯｃｃｕ８のエンテロトキシンＡ、ＢＳＤ、Ｅに対して特異的で ある４種のモノクローナル抗体上つけたニトロセルロース膜を使用している。ま たこのニトロセルロース膜には、膜に別別に明確に固定され、１種以上の５ｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　エンテロトキシンの１つの抗原決定基に特異的である モノクローナル抗体がつけであることもある。このエンテロトキシンｑ　５ｔａ ｐｈ７１０ＣＯＣＣｕ８のエンテロトキシン類Ｃ工＋　”２＋　Ｃ３の抗原決定 基に特異的なものである。
各５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンの抗原決定基に特異的で、ニ トロセルロース膜に固定されたモノクローナル抗体が特異性をもつ３ｔａｐｈｙ ’１ｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンに向けられたモノクローナル抗体に結合さ れるこのキットの酵素はアルカリ性ホスファターゼ等があり、この薄紫と反応し 得る酵素基質は５−ブロモ、４−クロロインドリルホスフェート、無色染液はニ トロブルーテトラゾリウムである。
本発明はまた液体あるいは固体懸濁液中に多数存在するＢｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓのエンテロトキシン類を検出し同定するための方法も含む。この方法は以 下の部分から構成嘔れている。ａ）　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕａのエンテロ トキシン類に特異的で、診断試薬ホルダーに別々に明確に固定嘔れた多数のモノ クローナル抗体のついている診断試薬ホルダーを適当な時間液体あるい（一固体 懸濁液中に浸し、固定されたモロクローナル抗体−３ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ工ンテロトキシン複合体全形成芒セる。ｂ）試料から判断試薬ホルダーを取り 除く。Ｃ）界面活性剤入り水性緩衝溶液中に判断試薬ホルダーを浸す。ｄ）界面 活性剤入り水性緩衝溶液から判断試薬ホルダーを取り除く。ｅ）モノクローナル 抗体−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートを含む検出溶液中に診断試薬ホ ルダー全適当な時間浸し、固定されたモノクローナル抗体−Ｂｔａｐｈｙｘｏｃ ｏｃｃｕｓエンテロトキシン−モノクローナル抗体−アルカリ性ホスファターゼ 複合体を形成させる。ｆ）検出溶液から診断試薬ホルダーを取り除く。ｇ）水性 緩衝溶液中に診断試薬ホルダー全没す。ｈ）水性緩衝溶液から診断試薬ホルダー を取り除く。１）５−ブロモ、４−クロロインドリルホスフェート及びニトロブ ルーテトラゾリウムを含む溶液中に診断試薬ホルダーを浸す。ｊ）青色沈澱が蓄 積したニトロセルロース膜上の同定可能な部分を肉眼で検出する。ｋ）青色沈澱 が蓄積したニトロセルロース膜上の同定可能な部分と、その部分に固定したモノ クローナル抗体が特異性を示す５ｔａｐｈｙｌＯｃｏｃｃｕθエンテロトキシン とを対応させ、それによって試料中の各種３ｔａｐｈｙｘｏｃｏｃｃｕｓエンテ ロトキシンの存在を検出し同定する。
さらに本発明には１つの試料中の細菌最低１種の存在を検出するための方法も含 まれる。この方法は以下の部分から構成ちれている。ａ）試料を開放式で細菌種 の増殖に適する培地を含む容器の最低１つに接種する。ｂ）キャップを容器の端 に連結する。このキャップの面は容器に連結した時に容器の内部と接触するよう になっており表面が最低１つの細菌成分を固定するのに適切な構造となっている 。Ｃ）培地中に接種された細菌が増殖し得るような条件下で、接種嘔れた培地ｔ ｑ養する。ｄ）容器の上下上適当な時間の間反転させ、培地中に存在する細菌成 分が容器の内部に面し九キャップの表面上に固定逼れるようにする。ｅ）容器の 上下を反転させ正しい方向に戻丁。ｆ）容器からキャップを取りはずす。ｇ）細 菌成分が固定てれているキャップの表面全１固定された細菌成分−試薬複合体が 形成てれるのに適切な条件下で、固定された細菌成分と複合体を形成し得る試薬 に接触嘔セる。ｈ）固定嘔れた細菌成分−試薬複合体を検出し、それによって試 料中の細菌種の存在をも検出する。本出願の範囲内では「細菌成分」とは全編胞 、細胞壁成分、細胞膜成分、べん毛成分を含むがこれらのみに限定されるわけで はない。
最低１つの細菌成分を固定するのに適切なキャップ表面としては、？リステレン 挿入物、ニトロセルロース膜、ナイロン膜を用いることができる。また表面をポ リクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混合物、ポリク ローナル抗体とモロクローナル抗体の混合物でコーティングしたものも用いられ る。
固定嘔れた細菌成分と複合体を形成し得る試薬にはポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体、モノクローナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクロー ナル抗体の混合物がある。また試薬１グ例えば検出可能な酵素、螢光を発する種 、化学ルミネセンスを発する種のような検出可能な標識物で標識することもでき る。嘔らに検出可能な標識物としてエレクトロ化学ルミネセンスを発する種を用 いることもできる。本発明の１つの具体例ではルテニウムマ九はオスミウムを含 むエレクトロ化学ルミネセンス種を使用している。
また本発明の別の具体例では固定ちれた細菌成分−試薬複合体を検出するのに、 固定ちれた細菌成分−試薬複合体と複合体を形成し得る検出可能標識をした第２ 試薬全使用することもできる。さらに本発明の別の具体例では試薬としてポリク ローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混合物、ポリクロー ナル抗体とモノクローナル抗体の混合物を使用し、第２試薬としてその試薬に対 する抗−抗体を検出可能なように標識したものを使用している。
細ｍｔ−検出できる試料には水及び食品も含まれる。
本発明の１つの具体例では細菌種の増殖に適する培地として非選択的乳糖培地を 使用している。また１つの具体例では培地として非選択的乳糖培地七使用し、検 出できる細菌に最低１Ｗ１類の大腸菌型である。
本発明には試料中の大腸菌型細菌の存在を検出するための方法も含まれる。この 方法に以下の部分から構成逼れている。ａ）試料′ｔ−開放式で非選択的乳糖培 地及び倒立ｐｕｒｈａｍ　ｆ入れ几容器の最低１つに接種する。
ｂ）ホリスナレン挿入物をつけたキャップを各容器の開放側の端に連結する。Ｃ ）接種ちれた培地を３７℃で最低２時間培養する。ｄ）各容器中に倒立さセたＤ ｕｒｈａｍバイアル内に採取されている細菌発酵によシ産生された気体があるか どうか検出する。ｅ）倒立さセたＤｕｒｈａｍバイアル内に気体が採取ちれてい る容器の上下？適当な時間の間反転でセ、培地中に存在する大腸菌型細菌が大腸 凹型−ボリステレン複合体を形成し得るようにする。ｆ）容器の上下を反転させ 正しい方向に戻す。ｇ）容器からキャップ？取りはすす。ｈ）取りはずしたキャ ンプのぎりスチレン挿入物を、未結合部位をふさぐのに適切な物質を用いて処理 する。
１）未結合部位をふきぐのに適切な物質を用いて処理されたキャップのポリスチ レン挿入物？、抗体−大腸菌型一ホリスナレン複合体が形成し得るような条件下 で大腸菌型細菌に結合でき検出可能となる標識物によって標識した抗大腸菌型細 菌抗体最低１種類を用いて処理する。ｊ）ポリスチレン挿入物上の抗体−大暢菌 型一？リステレン複合体の存在を検出し、それによって試料中の大腸菌型細菌の 存在をも検出する。
本発明の１つの具体例では非選択的乳糖培地はフェノールレッドブロスである。
ポリスチレン挿入物上の未結合部位上ふ烙ぐのに適切な物質としてはウシ血清ア ルブミンが使用できる。
検出可能な標識物で標識嘔れた抗大腸菌型細菌抗体としては検出可能な標識物で 標識芒れた七ツクローナル抗体が使用できる。検出可能な標識物としてはモノク ローナル抗体に結合した酵素が使用できる。本発明の１つの具体例ではこの酵素 として子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを使用している。また本発明の別の具 体例では検出可能な標識物としてモノクローナル抗体に結合した螢光奮発する種 全使用している。さらに別の具体例では検出可能な標識物としてモノクローナル 抗体に結合したエレクトロ化学ルミネセンスを発する種全使用している。エレク トロ化学ルミネセンス奮発する種にはルテニウムやオスミウムが含まれる。本発 明の１つの具体例では試料は水である。また本発明の別の具体例では試料は食品 である。
開放式の容器としてはバイアルが使用できる。ま九本試料中の大腸菌型細菌を検 出する丸めのキットも含まれる。このキットは以下の部分から構成されている。
ａ）非選択的乳糖培地の入ったバイプル最低１本、ｂ）］）ｕｒｈａｍバイアル 最低１本、ｃ）、ｔｅリステレン挿入物をつけたバイプルキャンプ最低１個、と ）ウシ血清アルブミン溶液、ｅ）抗大腸菌型細菌モノクローナル抗体−酵素結合 体、ｆ）洗浄用水性緩衝溶液、ｇ）酵素基質溶液。本発明の１つの具体例では抗 大腸菌型細菌モノクローナル抗体に結合した酵素は子ウシ腸アルカリ性ホスファ ターゼであり、酵素基質にｐ−ニトロフェニルリン翫二ナトリウムで表、る。本 発明は次の構造をもつ化合物も含み、 ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２である。
さらに本発明は次の構造をもつ化合物も含み、ｎは整数である。本発明の１つの 具体例ではｎは２である。
また本発明は次の構造をもつ化合物も含み、ｎは整数である。本発明の１つの具 体例ではｎは２である。
さらに本発明には次の構造ｔもつ化合物も含まれ、Ｒ８″［、陰イオンで、ｎは 整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２である。
この化合物は次の構造をもつ構成物上官み、ｘ−（Ｙ）ｎ−Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオナト１つ以上、同種または異楓のアミノ酸１つ以 上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体を表わし、ｎは整数、２は本発明に 含まれる化合物全表わしている。
また本発明は次の構造をもつ化合物も含み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。
本発明の１つの具体例ではｎは２である。
この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、Ｘ　−（Ｙ）ｎ　−Ｚ 又は同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種または異種のアミノ酸１つ以 上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に 含まれる化合物を表わしている。
さらに本発明には次の構造？もつ化合物も含まれ、Ｒは陰イオンで、ｎは整数で ある。本発明の１つの具この化合物は次の構造ｔもつ構成物を含み、ｘ　−（ｙ ）ｎ−ｚ 又は同種まｆｃは異種のヌクレオチド１つ以上、同種または異種のアミノ酸１つ 以上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体を表わし、ｎは整数、２は本発明 に含ま′れる化合物を表わしている。
また本発明は次の構造をもつ化合物も含み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。
本発明の１つの具体例ではｎは３である。
この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、ｘ　−（ｙ）ｎ−ｚ Ｘは同種ま几は異種のヌクレオチド１つ以上、同種または異種のアミノ酸１つ以 上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体上表わし、ｎは整数、２は本発明に 含まれる化合物を表わしている。
嘔らに本発明には次の構造をもつ化合物も含まれ、ｎは整数である。本発明の１ つの具体例ではｎは３である。
また本発明は次の構造をもつ化合物を含み、ｍとｎはそれぞれ同じまたは異なる 整数である。本発明の１つの具体例ではｍとｎは両方とも３である。
嘔らに本発明には次の構造をもつ化合物も含まれＲは陰イオンで、ｎは整数であ る。本発明の１つの具体例ではｎは２である。
この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、ｘ　−（ｙ）ｎ−ｚ Ｘは同種まｆｃは異種のヌクレオチド１つ以上、同種まｆｃは異種のアミノ酸１ つ以上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発 明に含まれる化合物全表わしている。
また本発明は次の構造をもつ化合物を含む。
芒らに次の構造をもつ化合物も含み、 Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２である。
この化合物は次の構造ｔもつ構成物？含み、Ｘ　−（Ｙ）ｎ−Ｚ Ｘは同種まｆｃは異種のヌクレオナト１つ以上、同種または異種のアミノ酸１つ 以上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体ヲ表わし、ｎＦＸ、整数、Ｚは本 発明に含まれる化合物を表わしている。
また本発明は次の構造上もつ化合物を含み、Ｒは陰イオンで、ｍとｎは整数であ る。本発明の１つの具体例ではｍは５、ｎは３である。
この化合物は次の構造をもつ構成物全台み、ｘ　−（ｙ）ｎ−ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオナト１つ以上、同種または異種のアミノ酸１つ以 上、抗体、目的分析物、目的分析物の類似体上表わし、ｎは整数、２は本発明に 含まれる化合物を表わしている。本発明の１つの具体例ではχはテオフィリンで ある。また本発明の別の具体例ではＸはジコキシデニンである。さらに本発明の 別の具体例ではＸはｈＣＧ由来のペプチドである。
芒うに本発明には次の構造？もつ化合物が含まれ、Ｘ−ＣＨ−ＣＨ−Ｃｏ−ＮＨ −（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨｚ）ｍ−ＺＸは同種または異種のヌクレオ ナト１つ以上、Ｚはエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種、ｎは１以上の 整数、 ｍは１以上の整数、 をそれぞれ表わしている。
本発明の１つの具体例ではＸが５番目の炭素の位置のＣＨにつけたチミジン、ｎ が７でｍが３である。
また本発明の別の具体例では２がビス（２、２’−ビピリジン）（４−（ブタン −１−ａｌ　）　−４’メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ｎ）であ る。
ちらに本発明の別の具体例ではチミジンヌクレオナトが次のヌクレオナト配列に つけｆｃ３’末端ヌクレオチドとなっている。
ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡ （）本発明はまた次の構造をもつ化合物全台み、Ｔｉテオフィリン、ＹＥＴから Ｚにつくリンカ−基、Ｚはビス−（２、２’−ビピリジン）〔４−メナルー２． ２７−ビピリジン−４’　−ｙｌ　］ルテニウム（ｎ）、Ｒは陰イオンヲ吹わし ている。
本発明の１つの具体例ではＹは８番目のＴの位１の炭素についている。＝！九本 発明の別の具体例ではＹは次の構造上もち、 （ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎｍとｎは同じまたは異なる１以上の整 数を表わしている。また別の具体例ではｍは６、ｎは４である。嘔らに別の具体 例ではｍとｎは両方とも３である。
また本発明の別の具体例ではＹは次の構造をもち、ｍ、ｎ、ｒは同じまたは異な る１以上の整数を表わしている。１つの具体例ではｍは１、ｎは１、ｒは４であ る。
芒らに本発明の別の具体例ではＹは次の構造をもち、ＣＨ３ ｍ％ｎＳ　ｒは同じ一！たは異なる１以上の整数を表わしている。１つの具体例 ではｍは１、ｎは１、ｒば４である。
ま九本発明の別の具体例ではＹは７瞥目のＴの位置の窒素についている。１つの 具体例ではＹは次の構造ｎは１以上の整数である。別の具体例ではｎは４である 。
本発明はまた次の構造をもつ化合物全台み、Ｙはリンカ−アームである。本発明 の１つの具体例ではＹは次の構造をもち （ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎｍとｎは同じまたは異なる１以上の整 数である。１つの具体例ではｍは３、”は２である。
本発明は避らに次の構造をもつ化合物を含み、ＣＨ３ ｍとｎは同じまたは異なる整数である。１つの具体例ではｍとｎは両方とも１で ある。
また次の構造ｔもつ構成物を含み、 −ｚ Ｘはシスティンま九はメチオニンの最低１つのアミノ酸から成る同糧あるいは異 種のアミノ酸１つ以上を表わし、Ｚは３番目または４番目のマレイミドの位置の 炭素によってシスティンまたはメチオニンのイオウ置換基につけたビス（２、２ ’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−ノナルー２，２′−ビピリジン− ４′−ブチラミドルテニウム（ｎ）　ｋ表わしている。
以下に挙げる例は本発明の詳細な説明であるが、これに限られるわけではなく、 発明明細書に続く承認詞実施例１−各種有機溶剤中のエレクトロ化学ルミネセン ス トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（■）クロリドへキサヒトレートの エレクトロ化学ルミネセンスを、以下のようにして調製した溶液１Ｑｍｔを含む １”１ｌ１３０丸底フラスコ中で測定した：　１．５ｉｕＸ　１０＋ａｍマグネ チックスター２−パー、直径１．０ｍｍの銀線準基準電極、配合２８デージプラ チナ線対電極、厚さ０−１ｓｎの高度に研磨したプラチナ箔１ｃｒＩＬＸ１ｃＩ ＩＬ正方形片に溶接した２２デージプラチナ線から成る作動電極（プラチナ箔作 動電葎は直径３／１６インチの半円形とし、２８デージプラチナ線対電極ｔ　３ ／Ｓ２インチの等距離をおいて囲むよようにした）。
銀線をＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆０１７８型電位計プロ ーブに接続した。プラチナ線対電極とプラチナ作動電極はｎａｓｃａ１７５’Ｈ １電位論節器の陽極及び陰極にそれぞれ接続した。装置はアースした。
ＥＧ＆Ｇ１７５型ユニバーサルプログラマ−をつけたＥＧ＆Ｇ１７５型電位調節 器全電位調節器電圧電流を測定した。プログラマ−は陽極電位＋１．７５ボルト と陰極電位−１，８０ボルトの間を１ＱＱｍＶ／秒で掃引するように設定した。
Ｈａｍａ−ｍａｔｓｕ　Ｒ９２８光電増倍ｆ　ｆ　ユーズｆ　Ｋｏｄａｋ　＃２ ３　Ａゼラチン（赤色）フィルターをつけたＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｐ　Ｒｉ　４　Ｑ　２ＲＦ型光電増倍管チューブハウジングの中に 入れ、エレクトロ化学ルミネセンスを検出した。光電増倍管チューブハウジング は０ｒｉｅｌ　７０７０型光電増倍管検出システムに接続した。循環電圧電流は Ｈｏｕｓｔｏｎ　工ｎｓｔｒｕｍθｎｔθ２００Ｘ−Ｙ型記録計に記録した。
−循環電圧電流は次の有機溶剤と１　ｍＭ　）　’Ｊス（２，２’−ピピリジル ）ルテニウム（Ｉｔ）クロリドへキサヒトレート（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）及び０．１Ｍテトラデチルア／そニウムテトラフル オロボレート（ＴＢＡＢＦ’４　）　（Ａ１＋１ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏｍｐａｎｙ　）とによって産生された。ニアセトニトリル、ｎ−ジメチルホ ルムアミド、ジメチルスルホキシド、１−メチル、２−ピロリジノン（Ａｌｄｒ ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）　。また１　ｍＭ　）リス（２ ，２’−ビピリジル）ルテニウム（Ｉｔ）クロリドへキサヒトレート及びＱ、ｉ 　Ｍ　ＴＢＡＢＦ４を含む溶液を調製する時には第三級ブチルアルコールと脱イ オン蒸留水の溶液（１：　１　、ｖ／ｖ　）　ｔ−使用した。このようにして産 生された電圧電流によると、各有機溶剤中でのトリス（２，２’−ビピリジル） ルテニウムＣｍ）クロリドへキサヒトレートの酸化還元電位に変化は見られなか った。
エレクトロ化学ルミネセンスを肉眼で検出するため、次のようにして溶液を調製 した二十分量のトリス（２゜２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドへ キサヒトレート及びＴＢＡＢＦ４を上記の有機溶剤分光器用等級（Ａｌｄｒｉｃ ｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）に溶解し、最終濃度をそれぞれ１　 ｍＭ、　０−１　Ｍとした。この溶液１Ｑｍｌを１５ｍ１口丸底フラスコに入れ た。電極をこの溶液中に没し、作動電極は＋１．７５から−１，４５ボルトの電 位間を振動させエレクトロ化学ルミネセンスが産生されるようにした。エレクト ロ化学ルミネセンスは前述の各溶液中で肉眼的に観察した。各種溶剤によるエレ クトロ化学ルミネセンスへの影響を定量的に測定するため、次のようにして溶液 を調製した：十分量のトリス（２，２’−ビぎリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロ リドへキサヒトレート及びＴＢＡＢＦ４を前述の有機溶剤中に溶解し、最終濃度 をそれぞれ２ｍＭ１０．２　ｍＭとした。この溶液一定量に、強酸化剤過硫酸ア ンモニウムを３４５　ｍＭの濃度で含有する脱イオン蒸留水を等量加えた。トリ ス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（Ｉｔ）クロリドへキサヒトレートの入 ってｂない対照溶液も調製した。このようＫして得た溶液１（：Ｊｍｌを１５ｍ Ｊ３０丸底フラスコに入れた。陰極電位を０から−２，０ボルトまで１４秒間隔 で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産生されるようにした。
Ｍｉｃｒｏｎｔａ　２２１９１型デジタルマルチメーターに接続したインチグレ ーターを用い、このようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍管チ ューブ信号の総和を計算することによってエレクトロ化学ルミネセンスを測定し た。エレクトロ化学ルミネセンス信号は振動期間の１０秒間の和をめ、ｍｖで記 録した。結果は表■に示す通りで、各種溶剤によってルテニウム（Ｉｔ）クロリ ドの効率が量的に異なることがわかる。
有機　トリスＲｕＢｉＰｙ 溶剤　（１０−’Ｍ）　対照　△ アセトニトリル　２，５４０　１０４　２，４３．１５第三級ゾチルアルコール 　１，２８０　０　１．２８ＯＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド　２，３９０　１ ４３　２，２４７ジメチルスルホキシド　２，７６０　２９　２．７３１１−メ チル−２−ピロリジノン　１．＋５３０　０　１．６３０兼測定値の単位はすベ テｍＶ　。
実施例２−ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（工ｇＧ　）抗体の エレクトロ化学ルミネセンス検出感度 ４．４’−（ジクロロメチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピ リジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識したウサギ抗マウスエｇＧ抗体（ルテニウム 標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体）のエレクトロ化学ルミネセンスを、以下のよう にして調製した溶液ｊＱｍｌを含む１５ゴ３０丸底フラスコ中で測定した：　１ ．５ｍｍＸ　１０ｍｚマグネチツクスクーラーバー、直径１．０ｍｍの銀線準基 準電極、配合２８７’−ジプラチナ線対電極、厚さ０．１龍の高度に研磨したプ ラチナ箔１　ｃｍ　Ｘ　１　ａｎ正方形片に溶接した２２ゲージプラチナ線から 成る作動電極（プラチナ箔作動電極は直径込６インチの半円形とし、２８デージ プラチナ線対電極を３／３２インチの等距離をおいて囲むようにした）。
ｆＭ線をＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆Ｇ１７８型電位計プ ローブに接続した。プラチナ線対電極とプラチナ作動電極はＥＧ＆Ｇ１７３型電 位調節器の陽極及び陰極にそれぞれ接続した。装置はアースした。
ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体溶液から放出されたエレクトロ化学ル ミネセンスは、Ｋｏｄａｌｃ＃２６Ａゼラチン（赤色）フィルターをつげたＰｒ ｏｄｕｃｔｓ　ｆｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐ　Ｒｉ　４０２　ＲＦ型光電増信 管チューブハウジングの中に入れたＨａｍａｍａｔｓｕ　Ｒ９２８光電増倍管チ ューブを用いて検出した。光電増倍管チューブハウジングは０ｒｉｅｌ　７０７ ０型光電増倍管検出システムに接続した。陰極電位を０から−２，０ボルトまで ｌ４秒間隔で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産生されるようにした。
Ｍｉｃｒｏｎｔａ　２２１９　ｉ型デジタルマルチメーターに接続したインチグ レーターを用い、このようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍管 チューブ信号の総和を計算することによってエレクトロ化学ルミネセンスを測定 した。
エレクトロ化学ルミネセンス信号は撮動期間の１０秒間の和をめ、ｍＶで記録し た。
ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体の１．２５ｘ１０−フｕの保存用溶液 は、標識抗体の濃縮液（２ｍ９／ｍ１％　７．５　Ｒｕ　／抗体）をリン酸緩衝 溶液ＣＰＢＳ）で希釈することにより調製した。この溶液一定量、（８０μりを 反応容器中の０．１Ｍテトラゾチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＴＢ ＡＢＩＩ’、　）及び１８ｒｎＭ過硫酸アンモニウムを含むジメチルスルホキシ ド（ＤＭＳＯ）　／脱イオン蒸留水（１：１）１０ゴに加えた。ルテニウム標識 抗体の最終濃度はＩ　ＸＩ　０−９Ｍとした。前述のようにしてエレクトロ化学 ルミネセンスを測定した。
ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体保存用溶液の各種希釈溶液をも調失し 、これらの溶液一定量（８０μｌ）を反応容器中のルテニウム標識抗体同溶液に 加え、標識抗体の濃度が次のようになるようにした：　５Ｘ１０−’ＭＮ　Ｉ　 Ｘｌ　０−８Ｍ％　５Ｘ１０−８Ｍ０各溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを前 述のようにして測定した。この測定値を以下の表Ｈに挙げる。これらの結果から 標識抗体（ＩＸｌｏ−’Ｍ）のエレクトロ化学ルミネセンス検出感度が示され、 エレクトロ化学ルミネセンスの強度はルテニウム標識抗マクスエｇＧ抗体の濃度 に依存することがわかる。
表　■ ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（工ｇＧ　）抗体のエレクトロ 化学ルミネセンス（ＥＯＬ　）ルテニウム標識抗マウス ５Ｘｔｏ−”Ｍ　１６１０ １ｘ１０−８Ｍ　８９２ ５　Ｘ　１０−’　Ｍ　４１８ 実施例３−固相酵素標識イムノソルベントアツセイ（ＫＬ工ＳＡ　）におけるル テニウム標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）の免疫学的反応性 ポリスチレン製マイクロタイター板の各穴を、４゜４′−（ジクロロメチル）− ２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビぎリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標 識したウシ血清アルブミン、すなわちルテニウム標識ウシ血清アルブミン（６Ｒ ｕ／　ＢＳＡ　ｓ　２０１’９　／　Ｉｌｌ　ＰＢＳ　％　５０／’Ａ’乃ｔ） あるいは未標識ＢＳＡ　（２Ｑμｇ７ｍｔ　ＰＢＳ　、　５０μｌ／穴）の十分 な濃度の溶液でコーティングし、室温で１時間インキュベートした。このインキ ュベート期間終了後、タイター板をＰＢＳで１回当たり５分間、３回洗浄した。
６　ｍｇ／　ｍｌのウサ、ギ抗ＢＳＡ抗体を含む溶液をＰＢＳで１：２０，００ ０．１：３０，０００．１：４０．０００、ｉ：ｓｏ、ｏｏｏ、１：６０，００ ０に希釈し、ルテニウム標識ＢＳＡあるいは未標識ＢＳＡでコーティングした各 穴２つずつにこの希釈液を加え、タイター板を室温で１時間インキュベートした 。前回と同様ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、各穴にヤギ抗つサギエｇａ−ペル オキシダーゼ結合体Ｃ０，５ｍｙ／ｍｌ溶液をＰＢＳで１　：１０００に希釈） を加えタイター板を室温で１時間インキュベートすることにより、結合したウサ ギ抗ＢＳＡ抗体が存在するかどうかを検出した。タイター板を前回と同様にして ０．５％Ｔｗｅ８ｎ　２０を含むＰＢＳで２回、ＰＢＳで２回洗浄した後、過酸 化水素（３０％）と２，２′−アジノージ−〔３−エチルーベンツチアジンンス ルホネー）　）　（ＫＰＬ　１Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　、　Ｍ　Ｄ　）とを 等量ずつ混合し、そのうち２００μｌをタイター板の各穴に加えた。室温で３０ 分間インキュベートした後、４１４ｎｍでタイター板の吸光度測定を行った。ル テニウム標識ＢＳＡあるいは未標識ＢＳＡでコーティングした穴に加えたウサギ 抗ＢＳＡ抗体の各希釈液の２穴の平均測定値から対照穴のバックグラウンド吸光 度の平均値を引いた。
これらの補正吸光度を表■に示す。
未標ＰＲＢＢｋとルテニウム標識ｎｓＡから得られた曲線は平行で、２つの曲線 の各点の補正吸光度の比は約０．６と一定であった。前述の活性化ルテニウム複 合体と同じものを用いてａｍし同様のＲｕ　／　ＢＳＡ標識比をもつ他のルテニ ウム標ＩＩ　ＢＳＡ　２０ツトによる実験でも同一の結果が得られた。以上の結 果から、ルテニウム標識ＢＳＡは免疫学的反応性を有し、ルテニウムで標識した 時の免疫反応性は未標識ＢＳＡと比較して約６０％に達することが示される。
表　■ ４１４　ｎｍにおける吸光度 ウサヤ抗ＢＳＡ　未標識　ルテニウム　相対免疫２０、ＯＤＤ　１．０６　０． ６６　６２％３０．０００　０．８３　０．５０　６０％４０．０００　０．６ ７　０．４０　６０％５０．０００　０．５６　０．３３　５９％６０．０００ 　０．４７　０．２８　６０％実施例４−競合固相酵素標識イムノソルベントア ツセイ（ＥＬ工Ｓａ　）におけるルテニウム標識ウサギ抗マウス４．４’−（ジ クロロメチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニ ウム（Ｉｔ）で標識したウサギ抗マウスエｇＧ抗体（ルテニウム標識ウサギ抗マ ウスエｇＧ抗体）について、マウスエｇＧへの結合を酵素標識抗マウスエｇＧ抗 体と競合する能力に関して未標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体と比較した。９６穴 ポリスチレン裂マイクロタイタ一版の各穴をマウスエｇＧ溶液（５μ、ｉｉｌ　 ／ｍｌ　ＰＢＳ　）でコーティングし、室温で６０分間インキュベートした後、 ＰＢＳで１回当たり５分間、３回洗浄した。ウサヤ抗マウスエｇＧ−アルカリ性 ホスファターゼ結合体とウサギ抗マウスエｇＧ　（１ｒｖ／ａｔ　）との混合物 を含む溶液及びウサギ抗マウスエｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合体とルテ ニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ　（１ｍｙ／ｍｌ、７．５　Ｒｕ　／抗体）と の混合物を含む溶液の２檀類を調製した。これら２ａ［類の溶液と、ウサギ抗マ ウスエｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合体を含む第３の溶液とを、０．５％ Ｔｗｅｅｎ　−２０を含むＰＢＳで１：６０００．１ニア０００．１：８０００ ．１　：９０００．１　：　１０，０００．１　：１２，０００．１　：　１４ ．ＯＤＤ、１　：　１６，０００に希釈し、マウスエｇＧを結合させたタイター 板の各列に加えた（５０μｌ／穴）。タイター板を室温で６０分間インキュベー ）　Ｌ、ＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　−２Ｑで２回、ＰＢＳで２回、１回当たり５分 間洗浄した。各穴に酵素基質ｐ−二トロフェニルホスフエー）　（１，５１１Ｉ ｇ／＋Ａ！１０％ジェタノールアミン緩衝液、ｐＨ９，６）を加え（２００μＩ ｌ、４代）、タイター板を室温で３０分間インキュベートした後、４０５　ｎｍ で吸光度測定を行った。３糎類の溶液の各希釈液の２穴の平均測定値から対照穴 のバックグラウンド吸光度の平均値を引いた。これらの吸光度の値を表■に示す 。
得られた３本の曲線は平行で、一番上が酵素結合体の結合を阻害しなかった場合 、二番目と三番目がルテニウム標識抗マウスエｇＧ及び未標識抗マウスエｇＧに よって阻害した場合である。ルテニウム標識抗マウス工ｇＧの曲線は、酵素結合 体の曲線と比較して各点共未標識抗マウスエｇＧの曲線の値の約８１％である。
以上の結果から、ルテニウム標識抗マウス１ｇＧ抗体はその抗原（マウスＩｇＧ 　）に対する免疫学的反応性を有し、マウスエｇＧへの結合を酵素標識抗マウス エｇＧ抗体と競合する能力は未標識抗マウスエｇＧ抗体の約８０％であることが 示される。
４０５　ｎｍにおける吸光度 抗マウスエｇＧ　酵素結合体十 アルカリ性ホ　ルテニウム　酵素結合体十スファターゼ　標識抗マウス未標識抗 、ウ　相対６．０００　１．４８　０．９４　０．７９　７７％７．０００　１ ．３３　０．８２　０．６９　７９％８．０００　１．２１　０．７２　０．６ ２　８２％９．０００　１．１０　０．６５　０．５６　８４％１０、ＯＤＤ　 １．０１　０．６０　０．５１　８２％１２．０００　０．８７　０．５１　０ ．４３　８０％１４．０００　０．７７　０．４５　０．３７　８１％畳（Ａ− Ｂ／Ａ−０）　Ｘ　１００％ 実施例５−ルテニウム標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）４．４’−（ジクロロ メチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ ＩＩ）で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　（ルテニウム標識ウシ血清 アルブミン）の７．８　Ｘ　１０−６　Ｍ溶液を、ルテニウム環、１ｌＢｓＡの 保存用溶液（２，６ｍ９／ｍｌ　、　６Ｒｕ　／　ＢｓＡ　）のリン酸緩衝溶液 を用いた希釈によって調製した。この溶液２６μノを反応容器中のＱ、ｉ　Ｍ　 ＴＢＡＢＦ、及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水 （１：１）１０７ｄに加えた。ルテニウム環＠Ｂｓｈの最終濃度は２　Ｘ　１０ −８Ｍとした。実施例Ｖと同様にしてエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。
同じ方法を用いて未標識ＢＳＡの７．８　Ｘ　１０−６　Ｍ溶液を調設し、未標 識ＢＳＡの最終濃度が２　Ｘ　１０−８Ｍとなるよう反応容器中に加えた。この 溶液とＢＳＡを含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。
共有結合したルテニウム標識ＢＳＡ　Ｎ未標識ＢＢＡのエレクトロ化学ルミネセ ンス測定値を表Ｖに示す。
ルテニウム環１＆　ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセンス２Ｘ１０−８Ｍルテニ ウム標識ＢＳＡ　７３０２　Ｘ　Ｉ　Ｑ−８Ｍ　ＢＳＡ　１００１００Ｄ　：　 Ｈ２Ｏ（１：　１）　０実施例６−ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブ４ ．４’−（ジクロロメチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリ ジル）ルテニウム（ｎ）で標識し□たウサギ抗マウスエｇＧ抗体（ルテニウム標 識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体）の１．２５Ｘ１０−’ＭＭ溶液、ルテニウム標識 ウサギ抗マウスエｇＧ抗体の保存用溶液（２■／ｍｌ、　７．５　Ｒｕ　／抗体 ）のリン酸緩衝溶液を用いた希釈によって調尖した。この溶液８０μｌを反応容 器中の肌ｌ　Ｍ　ＴＢＡＢＦ、及び１１３ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳ Ｏ／脱イオン蒸留水（１：１）１０７ｄに加えた。ルテニウム標識抗体の最終濃 度はｌＸ１０−８Ｍとした。実施例２と同様にしてエレクトロ化学ルミネセンス を測定した。
同じ方法を用いて未標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体の１．２５Ｘ１０−’ＭＭ溶 液調製し、未標識抗体の最終濃度がｊ　Ｘ　ｉ　Ｑ−８Ｍとなるよう反応容器中 に加えた。この溶液と抗体を含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンス も前述のようにして測定した。共有結合したルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇ Ｇ抗体、未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のエレクトロ化学ルミネセンス測定値 を表■に示す。
表　■ ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧＩ　Ｘ　１０−８ルテニウム標 識ウサギ　８９２抗マウス工ｇＧ抗体 Ｉ　Ｘ　１０−８ウサギ抗マウス工ｇＧ抗体　ＯＤＭＳＯ：　Ｈ２Ｏ（ｌ　：　 ｉ　）　Ｑ実施例７−ウシ血清アルブミンに対する抗体の均質系４．４’−（ジ クロロメチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニ ウム（…）で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）　（ルテニウム標識ウシ 血清アルシミ／）の７．８　Ｘ　１０−’　Ｍ溶液を、ルテニウム環ｆｉＢｓＡ の保存用溶液（２，５ｍ９７ｍ１．６　Ｒｕ　／　ＢＳＡ　）のリン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ　）を用すた希釈によって調製した。この溶液２６μ！！を反応容器中 のＱ、ｉ　Ｍ　ＴＢＡＢＦ４及び１８鮨過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱 イオン蒸留水（１：１）１０７ｄに加えた。ルテニウム標識ＢＳＡの最終濃度は ２Ｘ１０−８Ｍとした。実施例２と同様にしてエレクトロ化学ルミネセンスを測 定した。
同じ方法を用いて未標識ＢＳＡの７．８　Ｘ　１０−’　Ｍ溶液を調製し、未標 識ＢＳＡの最終濃度が５　Ｘ’Ｉ　Ｏ−８Ｍとなるよう反応容器中に加えた。こ の溶液とＢＳＡを含まな一同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを測定シた 。
ウサギ抗ＢＳＡ抗体の３．７５　Ｘ　１０−５　Ｍ溶液を、ウサギ抗ＢＳＡ抗体 の保存用溶液（６，０り／ｍＡ’）のＰＢＳを用いた希釈によって調製し、この 溶液一定量（２６μＩりを反応容器中のルテニウム標識ＢｓＡ溶液に加えてウサ ギ抗ＢＳＡ抗体の最終濃度がｌＸ１０−’Ｍとなるようにした。
このようにして得たルテニウム環Ｈｔ　ＢＳＡ抗原と抗体（ウサギ抗ＢＳＡ　） との混合物のエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。表■に示した結果から、 ルテニウム環＠Ｂｓｈのエレクトロ化学ルミネセンスはウサギ抗ＢＳＡ抗体を加 えると減少することが示され、ＢＳＡに対する抗体の均質系エレクトロ化学ルミ ネセンス検出が可能であることがわかる。以上の結果に基づき、本技術分野の専 門家によって他の目的分析物を検出するための均質系エレクトロ化学ルミネセン スイムノアッセイも開発され得るであろう。
表　■ ルテニウム標識ウシ血清アルデミンの抗体結合時にお未標識　ルテニウム標識　 ウサギ ＢＳＡ　ＢＳＡ　抗ＢＳＡ ０　２Ｘ１０−８Ｍ　Ｉ　Ｘｌ　０−’Ｍ　９２２Ｘ１０−８Ｍ　０　０　９４ 実施例８−マウス免疫グロブリンＧ（工ｇＧ　）の均質系４．４’−（ジクロロ メチル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ …）で標識したウサギ抗マウスエｇＧ抗体（ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇ Ｇ抗体）の６．２５　ｘ　１０−’　Ｍ溶液を、ルテニウム標識ウサギ抗マウス エｇＧ抗体の保存用溶液Ｃ２ｍｙ／ｍｌ、７．５　Ｒｕ　／抗体）のリン酸緩衝 溶液（ＰＢＳ　）を用いた希釈によって調製した。この溶液８０μｌを反応容器 中のＱ、ｉ　Ｍ　ＴＢＡＢＦ、及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ ／脱イオン蒸留水（１：１）１０１／に加えた。ルテニウム標識抗体の最終濃度 は５　Ｘ　１０−８Ｍとした。実施例２と同様処してエレクトロ化学ルミネセン スを測定した。
同じ方法を用いて未標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体の６．２５　Ｘ　１０−’　 Ｍ溶液を調製し、未標識抗体の最終濃度が５Ｘ１０−８Ｍとなるよう反応容器中 に加えた。この溶液と抗体を含まない同様の溶液のエレクトロ化学−ルミネセン スを測定した。
マウスエｇＧの２．５　Ｘ　１０−’　Ｍ溶液を、マウスエｇＧの保存用溶液（ ４，０１Ｗ　／Ｍｌ　）のＰＢＳを用いた希釈によって調製し、この溶液の２容 量（２０μｌ及び４０μりを反応容器中のルテニウム標識抗マウスエｇＧ溶液に 加えてマウスエｇＧの最終ｆＩ＃夏がそれぞれ５Ｘ１０−８Ｍ。
１×１０″″７Ｍとなるようにした。
このようにして得たルテニウム標識抗マウスエｇＧ抗体と抗原（マウスエｇＧ　 ）との混合物のエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。結果は表１１に示す。
エレクトロ化学ルミネセンス測定値がマウスＩｇＧ抗原の濃度、に依存する様子 を図１に示しである。以上の結果から、ルテニウム標識抗体のエレクトロ化学ル ミネセンスは抗原を加えると減少することがわかる。これらの結果に基づき、本 技術分野の専門家によって他の目的分析物の濃度を測定するための均質系エレク トロ化学ルミネセンスイムノアッセイも開発され得るであろう。
表　１１ ルテニウム標識抗体の抗原結合時におけるエレクトロ未標識　ルテニウム標識 抗マウスエｇＧ　抗マウスＩｇＧ　マウスエｇＧ０　５Ｘ１０−８Ｍ　Ｏ１６１ ０ ０５Ｘ１０＝Ｍ　５Ｘ１０−８Ｍ　１３６００　５Ｘ１０＝Ｍ　Ｉ　Ｘｌ　０− ’Ｍ　１２４０ｓＸｉｏ−８ｎ　０　０　０ （工ｇＧ　）抗体及びルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（工ｇＧ 　）抗体を用いたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの異質系エレクトロ化学ルミネセンスイ ムノアッセイ光学密度１．００（４２５ｎｍで）となるようにＰＢＳで希釈した 。約３Ｘ１０９細胞を円錐形ミクロ遠心チューブに入れた。細胞を遠心しく１０ 分間、１０．００　ＯＲＰＭ　）、上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（１，４ ５Ｑ／ｍｌ　）のＰＢＳ中１：５０希釈液（１ｄ）に細胞を再懸濁した。室温で １時間インキュベートした後、細胞を遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ中に細胞を再 懸濁して再び遠心した。上清を捨てた後、４．４’−（ジクロロメチル）−２， ２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識し たウサギ抗マウスエｇＧ抗体、すなわちルテニウム標識ウサギ抗マウス１ｇＧ抗 体（２ｍ９／ｄ、７．５Ｒｕ／抗体）のＰＢＳ中１：５０希釈液に細胞を再懸濁 した。室温で１時間インキュベートした後、細胞を遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ 中に細胞を再懸濁して前述のように遠心により２回洗浄した。最後の洗浄の後Ｆ Ｂ８２００μｌ中に細胞を再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌを反応容器中 のＱ、ｉ　Ｍ　ＴＢＡＢＦ、及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを宮むＤＭＳＯ／ 脱イオン蒸留水（１：１）１０ｄに加え、反応容器に移した。この細胞懸濁液の エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。細胞懸濁液の残り１００μｌを反応容 器に加え、エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。実施例２で述べた方法に従 い、細胞を含まない溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを対照として測定した。
表■に示した結果から、ルテニウム標識ウサレクトロ化学ルミネセンスイムノア ッセイが成功していることがわかる。
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｃｄａｄｅｉの異質系エレクトロ化学ルミネＤＭＳ Ｏ／Ｈ２０（１：　１　）中１．９Ｘ１０’細胞Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｃ ｄａｄｅｉ細胞懸濁液　９０ＤＭＳＯ／Ｈ２０（１：　１　）中９．３　Ｘ　１ ０日細胞ＤＭＳＯ：　Ｈ２Ｏ（１：　１　）　０実施例１０−マウス抗Ｌｏｇｉ ｏｎｅｌｌａ免疫グロブリンＧ（１ｇＧ　）抗体及びルテニウム標識ウサギ抗マ ウス免疫マウスモノクローナルエｇＧ抗体と共にインキュベートした。細胞を遠 心し、洗浄し、ＰＢＳ　Ｏ，２ｍｌ中に再懸濁した。４．４’−（ジクロロメチ ル）−２，２’−ビピリジル、ビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ ）で標識したウサギ抗マウスエｇＧ抗体、すなわちルテニウム標識ウサギ抗マウ スエｇＧ抗体（１，２５ｘ１０−’　Ｍ　）の一定量（８０μ！りを細胞懸濁液 に加え、混合物を車室温で２時間インキュベートした。対照として細胞懸濁液を 含まないルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体の同一希釈液を同様にインキ ュベートした。インキュベーション終了後、標識抗体溶液を反応容器中の０．１ 　Ｍ　ＴＢＡＢＦ４及び１８′ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオ ン蒸留水（１：１）１０１１１／に加え、ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ 抗体の最終濃度がｌＸ１０−８Ｍとなるようにした。実施例２と同様にしてエレ クトロ化学ルミネセンスを測定した。ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧ抗体 を加えた細胞懸濁液についても同様に測定を行った。表Ｘに示した結果から、エ レクトロ化学ルミネセンスの放出がルテニウム標識抗マウスエｇＧ抗体とＬｏｇ ｉｏｎｅｌｌａに結合したマウスモノクローナル抗体との間の相互作用によって 減少することがわかり、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｃｄａｄｅｉの均質系エレ クトロ化学ルミネセンスイムノアッセイが成功していることが示されている。
表　Ｘ ｌＸ１０−８Ｍルテニウム標識　９７６抗マウス１ｇＧ抗体 ｌＸ１０−８Ｍルテニウム標識　８０６抗マウス１ｇＧ抗体士 Ｌｅｇｉｏｎｒｌａ　ｍ１ｃｄａｄｅｉに結合したモノクローナル抗体 ＤＭＳＯ：　Ｈ２Ｏ（１：　１　）　０実施例１１−細菌に結合したルテニウム 標識抗体放出光学密度１．００（４２５ｎｍで）となるようにＰＢＳで希釈し、 この懸濁液２　ｍｌを円錐形ミクロ遠心チューブに入れた。細胞を遠心しく１０ 分、１０．００　ＯＲＰＭ　）、上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｃｄ ａｄｅｉに特異的なマウスモノクローナルエｇＧ抗体（１，４５Ｔｎ９／Ｉｕｔ ）のＰＢＢ中１：１０希釈液（１ｍｌ　）に細胞を再懸濁した。室温で１時間イ ンキュベートした後、前述のように細胞を遠心し、上滑を捨て、ＰＢＢ中に細胞 を再懸濁して再び遠心した。上溝を捨てた後、ルテニウム標識ウサギ抗マウスエ ｇＧ抗体（１ｍｌ、　７．５　Ｒｕ／抗体）のＰＢＳ中１＝５０希釈液に細胞を 再懸濁した。室温で１時間インキュベートシた後、前述のように細胞を遠心し、 上溝を捨て、ＰＢＢ中に細胞を再懸濁して前述のように遠心により２回洗浄した 。最後の洗浄の後ＰＢＳまたは１．０Ｍ酢酸−０，９％Ｎａ（！１　（生理食塩 水）溶液１００μｌ中に細胞を再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。
遠心後、細胞上清液１００μｌを［１，１Ｍ　ＴＢＡＢｌＰ、及び１３ｍＭ過硫 酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍＪと共に反応 容器に移した。実施例２で述べた方法に従い、酢酸／生理食塩水細胞上清液とＰ ＢＳ洗浄細胞からの上清液のエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。エレクト ロ化学ルミネセンスの測定値は表Ｍに示す通りで、モノクローナル抗体でコーテ ィングしたＬｏｇｉｏｎｅｌｌａ細菌を１．０Ｍ酢酸−生理食塩水で処理するこ とによって（Ｒｅｆ、　２３　）ルテニウム標識ウサギ抗マウスエｇＧをそこか ら溶離させると、未結合のルテニウム標識抗体により産生されるエレクトロ化学 ルミネセンスが増加することがわかる。以上の結果から、ルテニウム標識抗体は モノクローナル抗体でコーティングしたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ　Ｉｃ結合してお りＰＢＢによる洗浄ではバックグラウンドと比較してＥ（Ｌが増加しないことも 示される。
表　Ｘ ルテニウム標識抗マウス免疫グロブリンＧ（工ｇＧ　）でコーティングした細胞 の上清液のエレクトロ化学ルミバックグラウンド対照： １．０Ｍ酢酸−生理食塩水１００μ１１６４ＰＢＳ洗浄細胞上清液１００μｌ！ １２１１．０Ｍ酢酸−生理食塩水洗浄　２１４細胞上清液１００μｌ 実施例１２−尿中プレグナン−ジオール−３グルクロ尿試料を既知量のエレクト ロ化学ルミネセンス種で標識したＰＤ３Ｇ及び既知量の抗ＰＤ３Ｇ抗体と、試料 中に存在するＰＤ３ＧとＰＤ３Ｇ−エレクトロ化学糎とが抗体の結合部位に対し て競合するような条件下で接触させることによって、プレグナン−ジオール−３ −グルクロニド（ＦＤ３Ｇ）を検出し定量し得る。
適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス桓がくり返し電磁放 射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電 磁放射線をくり返し放出するようになる。放出された放射線を定量し、それによ って試料中に存在するＦＤ３Ｇの量を測定することができる。
実施例１３−トリス−ルテニウムビピリジル−ｎ−ヒドロキシサクシニミｒエス テルを用いた核酸標識１０　ｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ８，０）　−１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ中の核酸試料（５〜２５μｇ）を熱変性させ、冷却し、シトシン残基のエチ レンジアミンによる亜硫酸水素塩触媒アミノ基転移を４２℃で３時間行って修飾 する。５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，５中で１晩、外液を３回交換して 透析を行った後、試料を限外ろ過によって１００μｌまで濃縮する。このように して修飾した核酸（１〜１０μりを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，５ １００μｌで希釈する。
トリス−ルテニウムビピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル誘導体を 、当該技術分野における既知の方法によってＮ、Ｎ’ジメチルホルムアミＰ（Ｄ ＭＦ　）中の０．２Ｍ保存用溶液としてｍＪｌする。このエステル溶液５μｌを 肌１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，５中の修飾核酸溶液に加え、室温で１時 間インキュベートする。標識した核酸プローブを１５　ｐ　ｍＭ塩化ナトリウム −１３ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７６０）中で外液を最低３回交換しな がら透析して精製し、使用時まで４℃で保存する。
実施例１４−血中ヒ）？細胞白血病ｍウィルス（ＨＴＬＶ−１［１）の核酸ハイ ブリッド形成アッセイウィルス粒子からＲＮＡが遊離されるよう血液を処理する ことＫよって、全血中のＨＴＬＶ　−ｍウィルスを検出に相補的でエレクトロ化 学ルミネセンス種で標識しである一本釧オリビヌクレオチドプローゾと接触させ る。
適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス糧がくり返し電磁放 射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えること妃よって、電 磁放射線をくり返し放出するようになる。放出された放射線を定量し、それによ って試料中に存在するＨＴＩ、Ｖ−１１のＲＮＡ量を測定することができる。
実施例１５−臨床試料中Ｌｅｇｉｏｎｅｌ’ｌａ細菌の均質系核痰のような臨床 試料中のＬｅｇｉｏｎｒｌｌａ　ＩＩａｉ菌を、細菌からリボソームＲＮＡが遊 離されるよう痰を処理することによって検出し得る。このようにして得た試料を リボソームＲＮＡ中のＬｏｇｉｏｎｅｌｌａに特異的な配列と相補的でエレクト ロ化学ルミネセンス糧でｍｋｌ、た一本俸オリゴヌクレオチドゾロープと接触さ せる。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス檀がくり返し 電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによっ て、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出された放射線を定量し、そ れによって試料中に存在するＩｅｇｉＯｎｅｌｌａ細菌の量を測定することがで きる。
実施例１６−銀置換法によってｒツムＤＮＡ中に挿入したサイトメガロウィルス ＤＮＡを検出するためのハイゾ例えばリンパ球のような組織試料からＤＮＡが遊 離され、制限酵素によってＤＮＡが切断されるよう処理することで、ヒトダノム Ｄｌ’ＪＡ中のサイトメガロウィルス（ＯＭＶ　）　ＤＮＡを検出し得る。この ようにして得たＣＭｖの二本鎖断片を富む試料を、ＯＭＶのＤＮＡに相補的でエ レクトロ化学ルミネセンス糧で標識してありＤＮＡ二本鎖のうちの１方を置換し 得る一本俸オリゴヌクレオチｒゾローゾと接触させる。適当な時間後、得られた 試料にエレクトロ化学ルミネセンス橿がくり返し電磁放射線を放出し得るような 電気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放出 するようにする。放出された放射線を定量し、それによって試料中に存在するサ イトメガロウィルスＲＮＡ０量を測定することができる。
実施例１７−異質法によってヒト膀胱ガン細胞中のｒａａ腫瘍遺伝子を検出する ためのハイブリッド形成アＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔら（２４）によって以前に報 告されてｂる方法を用いて、組織試料からＤＩＪＡが遊離され、制版酵素により ＤＮＡが切断され、ＤＮＡが一本鎖となりニトロセルロース紙に結合するよう処 理することで、ヒト膀胱ガン細胞中のｒａａ腫瘍遺伝子を検出し得る。一本俸Ｄ ＮＡが結合したろ紙をｒａｓ鹿瘍遺伝子に特異的でエレクトロ化学ルミネセンス 糧で標識したオリビヌクレオチドプロープと接触させる。適当な反応時間後、得 られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス棟がくり返し電磁放射線を放出し得る ような電気化学的エネルギー源を直接与えることＫよって、電磁放射線をくり返 し放出するようにする。放出された放射線を検出し、それによって試料中に存在 するｒａ日腫瘍遺伝子を測定することができる。
実施例１８−エレクトロ化学ルミネセンスポリマーを基質とする酵素アッセイ 例えばデンプン、デキストラン、合成高分子ポリマーのような高分子酵素基質を エレクトロ化学ルミネセンス檀で標識し得る。標識した基質は多成分系中に存在 する酵素を検出し定量するのに使われる。また標識した基質は抗体、ＤＮＡプロ ーローＲＮＡプローブ、ストレプタビジン、ビオチン等と結合した酵素の量を定 量するのにも使われる。標識した基質は適当な酵素を用いて選択的により小さい 断片へと切断し得る。どのような酵素−基質の組み合わせでも使用できる。酵素 の例としてはグルコシダーゼ、リアーゼ、デキストラナーゼ等が挙げられる。適 当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス糎がくり返し電磁放射 線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁 放射線をくり返し放出するようにする。放出された放射線を定量し、それによっ て試料中に存在する酵素の量を測定することができる。
それぞれエレクトロ化学ルミネセンス程で標識されている切断断片から増幅され たエレクトロ化学ルミネセンス信号が得られることが利点である。
実施例１９−エレクトロ化学ルミネセンス酵素アッセ連鎖球菌属を含む試料を、 エレクトロ化学ルミネセンス糧で標識した合成ペプチドを含む反応液と接触させ る。合成ペプチドはこの細菌のペプチダーゼに特異的な基質を用いる。ペプチダ ーゼが合成ペプチドに作用することによってエレクトロ化学ルミネセンス榎で標 識された断片が産生される。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミ ネセンス糧がくり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を 直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出され た放射線を定量し、それによって試料中に存在する連鎖球菌属の量を測定するこ とができる。
実施例２０−エレクトロ化学ルミネセンスを利用したＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳ ａｇ　）を含む血液試料を、ＨＢｓａｇに特異的でデキストラナーゼで標識した 抗体と適当な時間接触させる。ＨＢｓａｇと結合してｂない抗体を除去し、抗原 −抗体複合物をエレクトロ化学ルミネセンス蓬で標識したデキストランと接触さ せる。デキスト２ナーゼが標識したポリマーに作用することによってエレクトロ 化学ルミネセンス櫨で標識された各断片が産生される。適当な時間後、得られた 試料にエレクトロ化学ルミネセンス棟がくり返し電磁放射線を放出し得るような 電気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放出 するようにする。放出された放射線を定量し、それによって試料中に存在するＢ 型肝炎表面抗原の量を測定することができる。
実施例２１−エレクトロ化学ルミネセンス標識プラジキニンを用いたデラジキニ ンリセプターの均質系アッセイ プラジキニンリセプターを含む適当な組織試料を調製し、エレクトロ化学ルミネ センス橿で標識したプラジキニンと接触させる。適当な時間後、得られた試料に エレクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電機放射線を放出し得るような電気化 学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放出するよ うにする。放出された放射線を定量し、それによって試料中に存在するプラジキ ニンリセプターの量を測定することができる。このアッセイはエストロジエンー エストロジエンリセプターのような他のりガンドーリセプター相互作用を測定す るのにも使用できる。さらにこのアッセイは、競合結合アッセイの形式を用いれ ば未標ｋ　＋）ガントの量を測定、定量するのにも使用できる。
実施例２２−核酸ハイブリッドの検出におけるエレクトロ化学ルミネセンス種の 利用 二本鎖ＤＮＡ　、％　ＤＮＡ　−ＲＮＡ二本鎖、二本鎖ＲＮＡのような核酸ハイ ブリッドを含む試料を、特に核酸ハイブリッドの間に挿入し得るエレクトロ化学 ルミネセンス種と接触させる。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ル ミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源 を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放出するようＫする。放出さ れた放射線を定量し、それによって試料中に存在する核酸ハイブリッドの量を測 定することができる。
実施例２３−エレクトロ化学ルミネセンスを用いた均質系イムノアッセイによる 唾液中の抗体と複合体を形成すると）Ｔ細胞白血病ウィルスｍ　（ＨＴＬＶ　− ＩＢ　）抗原の検出 抗体と複合体を形成するＨＴＬＶ　−ｍを含む唾液試料を、抗原−抗体複合物を 分離させるカオトロピック剤を含む溶液と接触させる。次にこの溶液を、ＨＴＬ Ｖ−１１１に特異的でエレクトロ化学ルミネセンス徨で標識した抗体と接触させ る。カオトロピック剤を除去し、標識抗体、未標識抗体を再び抗原と結合させる 。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁 放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによって、 電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出された放射ｌＲを定量し、それ によって試料中に存在すると）Ｔ細胞白血病ウィルスＩＩＩ　（ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉ　）抗原の量を測定することができる。
以上の方法は肝炎抗原−抗体複合物、サイトメガロウィルス−抗体複合物、非Ａ 非Ｂ肝炎−抗体複合物のような血清中の他の型の抗原−抗体複合物を含む試料に も応用できる。
実施例２４−各種５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン類の検出、同 定のためのイムノアッセイＡＸＢ、Ｃ，Ｄ、にの各５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕ ｓ　ｘンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体とこれらのエンテロトキシ ンに対して交差反応性をもつモノクローナル抗体とを精製した。各抗体は、腹水 をアガロースデル支持担体に結合させた５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのＡたん 白質カラムにかけ、モノクローナル抗体精製法（Ｂｉ。
−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、工ｎｃ、）の一部に基づき結合、溶出、 再生緩衝液を流すことによって精製した。ａｍ過程では、通常１ｍ１Ｍｊ４たり ５〜１５１ｎｇのモノクローナル抗体を含む腹水２　ｍｌを、２枚のＦ−１３分 析紙（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、工ｎｃ、　）の間にＭ ｅｔｒｉｃｅｌｌメンシラ／フィルター（Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、工 ｎｃ、　）を入れ底においた１０ゴ注射器（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ 、。
Ｉｎｃ、）の中に入れ、ピストンを挿入し、腹水を収集容器中にろ過するという 予備ろ過を行った。ろ液に等量の結合緩衝液を加え、５ｍ１ＯＡたん白質−アガ ロースカラムに重層した。次にカラムの試栗容器に結合緩衝液を入れ溶出を開始 した。流出画分の２８０　ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０　）をチェックし、１ １ｎｊずつの画分を採取した。Ａ２８０が安定した基準値に戻ったら、カラムを 結合緩衝液５ベツド容量で洗浄し、次に溶出緩衝液を流して精製された免疫グロ ブリンをカラムから溶離させた。免疫グロブリンを中和するため、溶離画分をＩ Ｍ）！ｊス塩酸ｐＨ９，ｏ　Ｏ，３ｄ中に採取した。
Ａ２８０が再び安定した基準値に戻ったら、カラムを溶出緩衝液５ベツド容量で 洗浄し、続いて再生緩衝液１０ベツド容量、結合緩衝液５ベツド容量で洗浄して カラムを次の精製過程が行えるよう調整しておいた。精製された免疫グロブリン を含む画分を集め、かくはん式限外ろ過器（Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃａｒｐ、　）を用 いて濃縮した。精製された免疫グロブリンの総たん白質をＬｏｗｒｙ法により測 定したところ、最終濃度は５　ｍｙ　／　ａｔ以上であった。
ａ段された抗体は０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液（ｐＢｓ　） 中で外液を２回交換しながら４℃で４８時間透析した。
ａ製されたモノクローナル抗体の特異的エンテロトキシンに対する免疫学的反応 性を測定するため、９６六マイクロタイター板ＫＬＩＳＡ系に分注した。抗体の 力価として得られた値を、各抗体の以前に認定されているロットの対照力価値と 比較した。十分な力価をもつ抗体を、判断試薬ホルダーすなわちディツプスティ ックに固定するため、あるいはイムノアッセイにおいてプローブとして使用する 酵素と結合させるための免疫学的に機能をもつコーティング用抗体として認定し た。
抗体をニトロセルロース膜の表面に固定して膜を付けた診断試薬ホルダー（ディ ツプスティック）を調製するため、まず膜をリン酸緩衝溶液中に室温で１時間浸 して膜の湿潤性を上げた。スティックを溶液から取り出し膜を空気乾燥させた。
５ｔａｐｈｙｘｏｃｏｃｃｕθの各エンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｏ，Ｄ、にの１つ に特異的な精製モノクローナル抗体または非特異的な対照マウス免疫グロブリン （，７ａｃｋｇｏｎ工ｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、工ｎｃ、）の溶液を２　ｐｉずつ膜表面上の異なる位置に直接スポットした。
使用した各抗体の濃度はニトロセルロースの結合部位を飽和し得ることが知られ ている濃度であった＝３Ａ抗体（Ａ）キシンに特異的）２５０μｌ／ｖｔｌ、２ ｓ抗体（Ｂ）キシンに特異的）　５０　ｔｔｌ／ｍｌ、　１　ｃ　３抗体（ｃｌ 、ｃ２、Ｃ！３）＊シンに特異的）３００μ、９／ゴ、６Ｄ抗体（Ｄ）キシンに 特異的）２００μｙ７ｍｌ、４　Ｋ抗体（Ｅトキシンに特異的）２５０μＩ／Ｉ ｌｌ、非特異的対照マウス免疫グロブ、リン２００μ７９／Ｉｄである。ディツ ノスティックを室温で空気乾燥させ、膜上に残っているたん白質結合部位をブロ ックするためディツプスティックを０．５％Ｔｗｅｅｎ　２Ｑ及び３％ウシ血清 アルブミンを含むリン酸緩衝溶液中に浸した。このブロック溶液中で一晩室温に てインキュベートした後、スティックを空気乾燥させた。
精製されたモノクローナル抗体２Ａ（Ａ及びＥトキシンに特異的）、６Ｂ（Ｂ％ ＣＩ、ｃ２．０３）キ”′ンに特異的）、１Ｄ（Ｄトキシンに特異的）を酵素ア ルカリ性ホス２アターゼに共有結合させ、診断試薬ホルダーのディツプスティッ クの膜表面に固定した抗体に結合しているＡ、ＢＸ　Ｃ！ｉ、ｃ２、ｏ３、Ｄ、 ｍｌ：）キシンの存在を検出するための結合プローブとして使用した。各結合体 はグルタルアルデヒドを２種類の機能をもつｉＪ橋試薬として用いる２段階の化 学量論的に制御された段階によって調製した。この段階では、Ｅ工人等級アルカ リ性ホスファターゼＣ２５００Ｕ／ｍ９、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　Ｃｏｒｐ、　）　３．４７１１１１を、１３．４μｌの水性グルタルアル デヒド溶液（２５％、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ　）を含む５　Ｑ　ｍ Ｍリン酸カルシウム緩衝溶液ｐ）１７．２の１．２ｄ中に加えた。混合物を室温 で９゜分間かくはんし、酵素分子の未結合アミノ基にグルタルアルデヒｒを結合 させた。インキュベーション終了後、精製されたモノクローナル抗体１１ｖ／ｒ ｎｌの濃度のものを２　ｒｎｌ加え、混合物をさらに９０分間かくはんし、氷冷 することにより結合反応を終結させた。結合体を０．１％アジ化ナトリウムを含 むリン酸緩衝溶液中で外液を２回交換しながら４℃で４８時間透析した。透析後 の溶液にウシ血清アルブミンを最終濃度３％となるように加え、４℃での保存中 に安定であるようにした。
抗体−酵素結合体の特異的エンテロトキシンに対する免疫学的反応性を測定する ため、９６穴マイクロタイター板ＥＬＩＳＡ系に分注した。結合体の力価として 得られた値を、各結合体の以前に認定されてｂるロットの対照力価値と比較した 。十分な力価をもつ結合体を、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕθエンテロトキシン 類のディツプスティックアッセイに使用するものとして認定した。
ハム、ソーセージ、ヌードル、チーズ等のような５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ による食品汚染が最も発生しやすい形の食品を、５ｔａｐｈ７１０ＣｏｃＣｕ８ エンテロトキシン類のアッセイを実施するため均質系液体悲濁液とした。典型的 な抽出方法としては、食品２０！；！に水２Ｑｍｌを加え、ｓｔｏｍａｃｈｅｒ 　１ａｂｂｌｅｎｄｅｒ　（Ｔｅｋｍａｒ　Ｃｏ　）を用いて混合物を３０秒間 ホモジナイズした。より粘性の高い食品の場合には水の容量を２倍にした。ホモ ジナイズの前または後に５ｔａｐｈｙｌＯｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンを食品 に加えた。食品ホモジネートについて上述の診断試薬ホルダーディツプスティッ クを直接使用して試験を行った。エンドトキシンを少量加えた食品試料において も陽性の結果が得られた。５ｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕｌｉエンテロトキシンの 検出感度を上げるため、さらに抽出の段階を加えた。ホモジネートの声を６Ｎ　 ＨＣ！ｌを用いて通常４．５に調整し、２０，０００ｇで２０分間遠心し、上清 の−を５　Ｎ　ＮａＯＨを用いて７．５に調整し、再び２０．０００　ｇで２０ 分遠心し、上溝をディツプスティックアッセイに直接使用した。このようにして 調製した食品抽出物のエンテロトキシン検出感度は、試験した各食品中の各トキ シシにつき１　ｎ９／ｒｎｌ抽出物であった。
牛乳のような液体食品については診断試薬ボルダ−ディツプスティックを液体食 品中に浸し固体食品ホモジネートの場合と同じ方法で直接試験を実施した。これ らの食品を試験する際にも、上述のような追加抽出段階を加えることにより感度 がｉ　ｎｌ／ｍｌにまで上がるようにした。
５ｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕｌｌ＋の個々のエンテロトキシンに特異的ナモノク ローナル抗体を固定したニトロセルｏ　−ス膜のついた診断試薬ホルダー（ディ ツプスティック）を、液体食品、食品ホモジネート、または上述のようにして調 製した食品抽出物１ｍｌ、あるｂはＰＢＳ　１ｍｌの入った試験管中に浸した。
以上の溶液には５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｘンテロトキシ７　ｉ　ｒＪ／ ｍｌまたはそれぞれ１ｎ９／ｍｌの濃度のエンテロトキシン類の混合物を加えて お騒た。ディツプスティックをこれらの試料溶液中に室温で１時間、ロータリー シェーカーで振とうしながら浸した。その後ディツプスティックを試料から取り 出し、０．５％Ｔｗｅｅｎ　−２０を含むＰＢＳ　中テ５分間、ＰＢＳ単独中で ５分間ずつさらに２回振と５した。
前述のモノクローナル抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体の混合物を次のよ うにして調製した：２人結合体（Ａ及びＥトキシンに特異的）、６Ｂ結合体（Ｂ 、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３トキシンに特異的）、１Ｄ結合体（Ｄトキシンに特異的）の １：１０００希釈液を同一溶液中（０，５％ＴＷｅｅｎ　−２０及び６％ＢＳＡ を含むＰＢＳ３ＱｍＡ！中各結合体３０μｌ）に調製した。この結合体混合物中 にディツプスティックを浸しくスティック１本当たり２ｍｌ　）　、室温で振と うしながら３０分間インキュベートした。ディツプスティックをＰＢＳ　−Ｔｗ ｅｅｎ中で２回、ＰＢＳ中で３回、１回当たり５分間ずつ振とうしながら洗浄し 、膜表面から未結合のモノクローナル抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体を 除去した。
未結合のモノクローナル抗体−酵素結合体を診断試薬ホルダーディツプスティッ クから除去した後、ディツプスティックを５−ブロモ−４−クロロインドリルホ スフェート（ＢＣＩＰ、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）及びニト ロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ、　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣＯｏ）を 含む溶液中に浸し、結合した結合体の存在を検出した。ＢＣ！工Ｆ及びＮＢＴ溶 液はそれぞれ次のようにして調製した＝３．２ｍｙのＢＣＩＰを０．１　Ｍ　ト リス塩酸、Ｑ、１Ｍ　Ｎａ１ｌ、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液１０１ｎｌに、８． ８〜のＮＥＴを同溶液１０ｍ１に溶解した。これらの溶液は使用直前に混合した 。ディツプスティックを基質混合物中に室温で３０分間振とうしながら浸し、そ の抜水で洗浄して空気乾燥させ、アッセイの結果が永久に記録されるようにした 。本アッセイの全過程を通じてピペット操作はほとんどあるｂは全く必要なく、 処理時間も最小限ですみ、約２時間で終了することができる。酵素結合体の基質 であるＢＣＩＰは膜上のトキシンに結合した結合体によって加水分解され、ＮＥ Ｔを還元してディツプスティック上の膜に結合する不溶性の青色物質とし得る反 応産物を産生ずる。試料中に５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンが 存在し膜上に固定された第１モノクローナル抗体に結合して第２モノクローナル 抗体−酵素結合体と結合することによって検出されていれば、ニトロセルロース 膜上に青色スポットが出現し指示される０試料中に５ｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕ ８エンテロトキシンが存在しない場合は、ニトロセルロース膜は白色のままであ る。対照のマウス免疫グロブリンを固定した位置の膜も各場合共白色のままであ った。ＡＸＢｌ　ｃｌＤｌＥの各５ｔａｐｈ７１０ＣＯＣＣｕ８エンテロトキシ ンに特異的なモノクローナル抗体を固定した膜上の明確に区別し得る位置に青色 スポットが出現することによって、特定のエンテロトキシンが同定される。診断 試薬ボルダ−ディツプスティックを使用する本方法により、液体食品、食品ホモ ジネート、食品抽出物中の１種類ある込は複数の５ｔａｐｈｙ１ｏｃｏｃｃｕｓ エンテロトキシン類をｉ　ｎ１ｌｒｎｌの量まで検出することが可能である。
本発明の方法（ＣＡＰ−ＥＩ　ＭＰＮ　）と４４．５℃においてＥＣプロスを使 用するＥＰＡによって承認されているＭＰＮ確認試験の方法との便中大腸菌型の 検出効率を比較するための実験を行った。
実験は標準５−バイアルＭＰＮアッセイに以下の変更を加えて実施した。硫酸ラ ウリルトリプトースプロス’（ＬＳＴ、　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ　、　Ｄｅｔｒ ｏｉｔ　Ｉ　Ｍ工）の代わりに、４−１チルウンベリ７エロングルクロニ）”　 （ＭＵＧ。
Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ！ｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　 ８３　μｇ／ｍｌを含ムフェノールレッド乳糖フロス（ＰＲＬＢ、　Ｄｉｆｃ。
Ｌａｂｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ工）を推定用培地として使用した。
フェノールレッド染色剤によって乳糖の発酵により産生される酸を検出し得るた め、ＰＲＬＢを選択した。乳糖発酵により得られた気体は、各バイアル中に挿入 した倒立Ｄｕｒｈａｍバイアルに集気した。Ｅ、ｃｏｌｉの存在を予備的に確認 するための選択薬剤としてＭＵＧを用いた。便中の主要大腸菌型であるＥ、　Ｃ ０１ｉは、ＭＵＧを切断しＵＶ光線下で見える螢光性ラジカルを遊離させること のできる水中に存在する唯一の細菌である（４．１０）。ＣＡＰ−’Ｅ工Ａ　Ｍ ＰＮアッセイ方法によって次の３種類のデータが得られる：１）乳糖の発酵によ る酸及び気体の産生（推定大腸画盤アッセイ）　、２）　ＭＵｏの切断による螢 光（Ｅ、　ｃｏｌｉまたは便中大腸菌型の推定確認Ｌ３）ｃＡｐ−酵素イムノア ッセイ確認（モノクローナル抗体を利用した確認試験）。次にＭＵＧ及びｃＡｐ −１工Ａ反応の結果を、ＩＣプロス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ。
Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ工）を用いた４４．５℃の高温下での乳糖発酵に基づく標 準方法（１）による結果と比較した。
実験は次のようにして行った：　ＭＰＮアッセイに必要な３種類の１０倍希釈系 列を作るため、付近の河川から採取した水試料を以下に示す容量で、ＰＲＬＢ− ＭＵＧ１０ゴを含みバイアルキャップの内側にポリスチレン製穴のついたバイア ルに接種した。
系列Ａ−５バイアル、１−００　”接種系列Ｂ−５バイアル、０．１０Ｗｊ接種 系列ｃ−５バイアル、０．０１　ｒｎｔ接種その後バイアルをすべて３５℃で約 １８〜２０時間インキュベートした。
次の日すべてのバイアルについて酸及び気体の産生、ＵＶ光線下での螢光を試験 した。酸または気体の反応の有無にかかわらず、濁度（増殖）の見られたバイア ルはすべて倒立させ、細胞−培地懸濁液がキャップ内側のポリスチレン製穴を満 たすようにした。倒立させたバイアルを３５℃で１時間インキユベートシ、細菌 （抗原）をポリスチレン裏キャップ穴に付着させた。
次にキャップ穴に結合した抗原をバイアルから除去し、抗体を用いる確認試験を 続げた。
アッセイのＥ工Ａ（酵素イムノアッセイ）の部分を行うため、穴をリン酸緩衝溶 液（ＰＢＳ　、　Ｎａｃ１８．５　ｉ　。
Ｎａ２ＨＰＯ４１−０２Ｊｉ’、ＮａＨ２ＰＯ，・Ｈ２Ｏ０−３８６Ｊｉ’　ｓ 蒸留水でｉｏｏｏｍとする、ｐＨ７，２）中のウシ血清アルプミ：ｙ　（ＢＳＡ 　、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉａ、　ＭＯ） ３％溶液で３５℃、３０分間処理し、ポリスチレン上の未結合部位をすべてブロ ックした。ＢＳＡ溶液を捨てた後すぐにＰＢＳで穴を２回洗浄し、Ｅ、（！Ｏ１ ｉ細胞に対するモノクローナル抗体を含む）・イブリドーマ純胞上清を各穴に５ ０μｌずつ加え、３５℃で１時間インキュベートして抗体をポリスチレンに結合 した特異的抗てた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０溶液（ＰＢＳ　＋　０．０５％ Ｔｗｅｅｎ　２０　、Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｐ ｈｉｌｌｉｐａｂｕｒｇ。
ＮＪ　）を用いて穴を３回洗浄し、未結合抗体を完全に除去した。親和性カラム で柑製したアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウスｘｇａ抗体（結合体、Ｋ ＰＬ。
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　）をＰＢＳで１：１０００に希釈し、各穴 に５０μノずつ加えた。３５℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅ ｅｎ　２０溶液を用いて穴を４回洗浄し未結合の結合体をすべて除去した。検出 に使用するアルカリ性ホスファターゼの基質は、バラニトロフェニルリン酸ナト リウムまたはＳｉｇｍａ　１０４基質（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を１０％ジェタノール−アミン緩衝溶液（ジ ェタノールアミン９７ｍｌ、ＮａＮ３　Ｑ、２Ｊｉ’ｓ　ＭｇＯ１２６Ｈ２”　 １０　ｏ■、蒸留水８００１Ｗｊ、　ｐＨ９，８）中に最終濃度１　ｍｌ　／　 ｒｎｔとなるよう溶解したものを用いた。基質を各穴に１００μｌずつ加え、６ ５℃で３０分間インキュベートした後各穴中の反応を肉眼で観察した。本実施例 における定量の目的のためには、反応した基質溶液をマイクロタイター版に移し 、４０５　ｎｍフィルターをつけたＴｉｔｅｒｔθｋＭｕｌｔｉｓｃａｎ　（Ｆ ＩＯＷ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｃｌｓａｎｓ、ＶＡ　）　を用いて機器 測定を行った。
ＩＣプロス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍ工）を使用した便 中大腸菌型の従来型確認試験を行うため、ＰＲＬＢ中での各−晩培養液からの増 殖菌を一白金耳ずつ、１０ゴのＩＣプロスを含み倒立Ｄｕｒｈａｍバイアルを入 れた試験管中に無菌的に移した。試験管を標準方法（１）に従い４４．５℃で２ ４〜４８時間インキュベートした後、乳糖発酵の有無を検出した（　Ｄｕｒｈａ ｍバイアル中に採取された気体によって）。バイアル内に少しでも気泡の見られ たものは陽性反応と認めた。
実験１の結果から、乳糖からの気体産生に基づく陽性の組み合わせは５５１であ り、ＭＰＮ統計表によると３５大腸菌型／ゴである（推定試験）。気体産生陽性 （＋）バイアルのうちＭＵＧアッセイで陽性だったのはわず認）。確認試験デー タのうち従来型ＥＣ試験では５本の試験管（Ａ１〜Ａ５）が便中大腸菌型陽性で あったのに対し、ＣＡＰ　−Ｅｌ法では陽性反応を示したのは４バイアル（Ａ２ 〜Ａ５）のみであった。Ｅｌの陽性測定値は０．５５から１．０６までの範囲で あり、陰性測定値は０．２０付近であった。ＥＩＡ試験とＭＵＧ試験のデータで は共に同じバイアルＡ２〜Ａ５で便中大腸菌型の存在が示されているため、ＥＩ Ａ（７）Ｍ性データはＭＵＧの陽性データによって強く裏付けられている。従来 型ＭＰＮ法（１５，１６，２０）では（＋）の誤判断及び（−）の誤判断の発生 土が高−ため、バイアルＡ１がＭＵＧ及びＥＩＡでは陰性でＥＣでは陽性であっ たという事実も驚くべきことではない。ＥＣ培地では高温度でのインキュベーシ ョンによって選択性が変わり便中大腸菌型の回収率に影響することが知られて因 る。また便中大腸菌型（Ｅ、　ｃａｌｌ）のうち約７％はＥＣにおいて気体を産 生ぜず（陰性の誤判断）、非便中大腸菌型のうち８％はＥＣブロス中でも増殖し 気体を産生じ得る（陽性の誤判断）ことが知られている。すなわち試験管Ａ１中 で見られたＥＣ反応は誤判断の陽性反応である可能性があり、ＭＵＧ及びＥＩＡ のＡ１に関する結果との不一致の原因となっていると思われる。同実験中の他の バイアル（Ｂ１−Ｂ５．０１〜Ｃ５）については、すべての試験においてよい相 関関係が見られた。言い換えれば、ＭＵＧで（−）であったバイアルはＥＣでも ＥＩＡでも（→であり、これらのバイアル中には便中大ｂｙ型が存在しないこと が確認できた。
実験２においてはバイアルに接種した水試料は、推定試験における全試験管で気 体産生が陽性であったため、さらに強く汚染されていたといえる。ＭＰＮ統計表 によると陽性の組み合わせは５５５であり２４０大腸菌型／　ｍ１以上が存在す ることが示された。確認試験を比奴すると、ＭＵＧ、ＥＣ，抗体利用Ｅ工Ａの間 にはよい゛相関関係が見られた。螢光を示した（　ＭＵＧ＋　）バイアルはすべ てＥＣ及びＥＸＡでも陽性であった。Ｅ工Ａ反応の測定値はやや弱す陽性０．４ ６　（Ｂ　２　）から０４で見られた非常に強い反応２．１５までの範囲であっ た。
以上の２つの実験結果から、本発明における抗体利用ＣＡＰ　−Ｅｌ試験は便中 大腸函型の存在を確認するＫＰＡの承認したＥＣ試験と同様に有効であることが 示されている。さらにバイアルＡ１の例で見られるように、ＣＡＰ　−ＥＩＡ試 験は抗体−抗原反応の特異的性質を利用しているため陽性または陰性の誤判断が より少ない。またＣＡＰ　−Ｅ工Ａ試験は従来型ＭＰＮ試験に比べていくつかの 顕著な利点をもっている。すなわち＝１）簡便さ一推定試験及び確認試験共同− のバイアルを用いて行うことができ、液を移したり他の培地を使用する必要がな い。２）迅速さ−ＣＨＡＰ　−ＥＩＡ試験は従来型試験に要する時間のｌろから １４の時間で光子できる。
３）特異性−抗体はその抗原標的に対して高度に特異的である。
以上の利点に加えてＣＡＰ　−ＥＩＡのキャップ穴は同一バイアルから４裡類の 独立したデータ（酸、気体、螢光、ＥＩＡ）が得られるような独自のデデインと なっており、水及び／または食品試料中の大腸菌型及び便中大腸菌型を分析する ための従来型ＭＰＮ試験よりもはるかに優れた代替法である。
バイアルまたはポリスチレン挿入物を含む試験管キャップを用いてＥＩＡを実施 するという構想は大腸菌型または便中大腸菌のアッセイに限定されるものではな く、他の細菌の検出にも同様に応用し得るものである。
実施例２６ ２−（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−プロピル）− Ｌ　３−ジオキシランの合成不活性なアルゴンで気体を置換した６　００　ｍｌ ！の三顕フラスコに、乾燥テトラヒドロ７ラン（ＴＨＦ　）　３　［］　ｍｍと 乾燥ジインゾロビルアミン７．６５　ｍｌ　（５４，６ｍｍｏｌ）を、注射器を 用いて攪拌しながら添加した。低位型ビーカー中、ドライアイス−インプロパツ ールの混合物にフラスコを浸して、溶液を一７８°Ｃに冷却した。フラスコＫ　 ２．５　Ｍ　ｎ−ブチルリチウム２１．６７ｎｌ（５４ｍ　ｍｏｌ）をゆりくと 添加した。この溶液を１５分間攪拌し、ＴＨＦ　３　Ｑ　Ｑ　ｍｌに溶解した４ 、４′−ジメチル−２，２′−ビピリジン９．５８　！ｊ（５２ｍｍｏｌ　）の 溶液を、カニユーレを用いて攪拌しながら、１時かげて滴下して加えた。
生じた褐色の混合物をさらに一７８℃で２時間攪拌し、２−（２−ブロモメチル ）−１，３−ジオキシ２生じた混合物を、−７８℃で５時間攪拌した。その後反 応容器を水浴中（１０°Ｃ）に置き、３０分経過すると色が変化し始めた（１時 間後には、濃紫色となり：２時間後には、青色となり；２．５時間後には、緑色 となり；　３．２５時間後には、レモンイエローとなった）。
反応混合物に、飽和ＮａＣｌ３　Ｑ　ｍｌを添加し、その後、水１Ｑｍｌとエー テル５Ｑｍ７を添加して反応を止めた。
水相をエーテル３００　ｍｌで２度抽出し、エーテル層を合併して水１００ｍＪ で逆抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応生成物を精製するために、活 性度■で、中性のアルミナ（メルク）９０を用いてす／ゾルを分離した。溶出溶 媒としては、石油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）を用い、その後石油エ ーテル／ジエチルエーテル（１：１）を用いた（原料は、石油エーテル／ジエチ ルエーテル（２：１）で完全に溶出され、生成物は、その後溶出された）。
プロトンＮＭＲ解析により、単離した反応生成物の構造は、以下に示すものであ ることを確認した。
実施例２７ ４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２’−ビピリジンの合成及び精 製 ２−（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−プロピル）− １，３−ジオキソラン２Ｉを、ＩＮａｃ１５（ＩＪに溶解し、５０℃で２時間加 熱した。
この溶液を冷却し、炭酸水素ナトリウムでｐＨ７〜８に調節し、クロロホルムｉ ｏｏｍｚで２度抽出した。
クロロホルム層を合併して少量の水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し 、ロータリーエバポレーターで蒸発すると黄色のオイル状物質を与えた。
この黄色のオイル状物質を、酢酸エチル／トルエン（１：１）を溶出溶媒として 用いるシリカゲルカラムで精製し、不純物はメタノールで溶出した。
プロトｙ　ＮＭＲ解析〔δ１．９６−２．１１　（ｍ、　２　Ｈ）；２．４３　 （ｓ、３１１）；　２．４６−２．５０　（ｔ、２Ｈ）；２．５３−２．８０　 （ｍ、２Ｈ）　；　７．１２−７．１４　（ｍ。
２Ｈ）　；　８．１７−８．１２　（−ｂｒ、　ａｔ　２Ｈ）　；　８．５２− ８．５８（ｍｔ　２Ｈ）；９−８９（ａｓ　ＩＨ））により、反応生成物の構造 は、以下の通りであることを確認した。
実施例２８ ４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）酪酸の合成 ４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２’−ビビリシフ０−５１　（ ２，Ｑｍｍｏｌ）を無水アセトン１０Ｉｌ！ｌに溶解した。この溶液に、微粉に した過マンガン酸カリウム２２５　”？　（ＫＭｎＯ４＃　１−４２　ｍ　ｍｏ ｌ）を少量ずつ攪拌しながら添加した。この反応を薄層クロマトゲランイー（シ リカ；酢酸エチル／トルエン５０：５０）により追跡すると、アルデヒｒが徐々 に消失していき、Ｒｆ値の低ｂビピリジンが生成することが指摘された。
反応が完了した後に水を添加し、ＭｎＯ２を濾過し、Ｎａ２ＣＯ３（水溶液）少 量ずつを用いて洗浄した。アセトンを回転式エバポレーターで蒸発し、残留物を ０Ｈ２Ｃ１２で抽出して非酸性ビピリジンを除去した。
０．１ＨのＨＯＩを注意深く添加することにより水溶液を酸性としてｐＨ４，８ とした。この−に達すると溶液は部分的に懸濁し、これよりも低い−では懸濁液 は再び溶解した。この混合物を等量のｃＨ２ｃ１２で５回抽出し、Ｎａ　２　Ｓ Ｏ４で乾燥し、回転式エバポレーターで蒸発するとオイル状物質を与えるが、こ の物質は、減圧下では急速に固化した。この粗製の固体をクロロホルム二石油エ ーテルから再結晶して、白色の結晶を得た。
融点：　１０３．５°Ｃ−１０５，５℃；工Ｒ：　１７０４ｃｍ−１゜プロトン ＮＭＲ解析は、以下の構造と一致した。
ＯＨ３Ｃ！Ｈ２−ＯＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨ実施例２９ ビス（２，２’−ビピリジン）（４−（ブタン−１−アル）　−４’−メチル− ２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（■）２過塩素酸塩：化合物■の合成エチレ ングリコール５Ｑ ルジクロリド２水塩２５０ダ（　０−４　８　ｍ　ｍｏｌ）（　Ｓｔｒｅｍ　） を急速に加熱して沸騰させ、その後シリコン油浴（１３０°Ｃ）に浸した。生じ た赤紫色〜オレンジ色の溶液に、２−［３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ ン−４′−イル）プロピル）−１．３−ジオキシ２ン１　５　０１’９（　０− ５　３　ｍ　ｍｏｌ）のエチＬ／ングリコール１０ゴ溶液を添加した。得られた オレンジ色溶液を１３０℃で３０分間攪拌し、冷却して室温とし、蒸留水で１＝ １に希釈した。
この溶液に、過塩素酸ナトリウムの濃水溶液を添加すると、非常に微細なオレン ジ色の沈殿を生じた。この混合物を一夜冷蔵し、濾過し、沈殿を水で洗浄した。
を行うと、鮮明なオレンジ色をした結晶を生成した。
その後、結晶を濾過し、冷水で洗浄し、乾燥した。この再結晶操作をくり返すと 、総量１５０〜の鮮明なオレンジ色の結晶を与えた。
ＮＭＲ解析は、以下の構造を示した。
本実施例においては、上で同定した化合物は、化合物Ｉであると見なされる。
実施例３０ ビス（２．２’−ビピリジン）（４−（４−メチル−２、２′−ビピリジン−４ ′−イル）酪酸〕ルテニウム（ｆｆ）ジヘキサフルオロ７オスフェート：化合物 Ｈの合成４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）酪酸１　３４ １Ｗ（　０．５２ｍｍ０１　）を、水１５０ＩＩＩｊに溶解した。この溶液をア ルゴンで脱気し、ルテニウムビピリジルジクロリド２水塩（　Ｓｔｒｅｍ　）　 ２　５　０”９（　０−４　８　ｍ　ｍｏｌ）を添加した。この混合物をアルゴ ン気流下で４時間還流した。水を回転式エバポレーターで蒸発し、残留物を最娶 量の水に再溶解し、ＳＰ−２５−セファデツクスイオン交換カラムにかげた。水 で不純物を溶出した後に、０．２　Ｍ　ＮａＣ１溶液を用いて化合物を赤色帯と して溶出し、ＮＨ，ＰＦ６の飽和水溶液を添加することにより、ヘキサフルオロ ホスフェイトとして単離した。粗生成物を、熱アセトン−ジエチルエーテルから ２度再沈殿させた。元素分析：計算値：Ｃ２４３，８０％ｐ　Ｈｔ　３．３６％ ；Ｎ、８．７６％。測定値：ｃ、４３．８２％；Ｈ，３，５４％；ＩＪ、８．５ ５％。
プロトンＮＭＲの解析は、以下の構造と一致した。
実施例３１ Ｎ−（４−（４−メチル−２，２′−ビビ　リジン−４′−イル）−ゾチル〕− ７タルイミドの合成不活性なアルゴンの気流下に、乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ ＨＦ　）　３０　ｍｌ及び乾燥ジイソプロピルアミン７．６５ｍ／　（５４，６ ｍｌ　）を、６００７＋１Ｊの三顆フラスコに、注射器を用いて攪拌じながら添 加した。低位型ビーカーに入れたドライアイス−イソプロパツール混合物にフラ スコを浸すことＫより、この溶液を、−７８℃に冷却した。２．５　Ｍ　ｎ−ブ チルリチウム２１．６１１１７（５４ｍ　ｍｏｌ）をゆっくりとフラスコに添加 した。得られた溶液を１５分間攪拌し、４．４’−ジエチル−２゜２′−ビピリ ジン９．５８９　（５２ｍ　ｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ３００ｍｌ溶液を、カニユー レを介して、攪拌しながら１時間かけて滴下した。
生じた褐色の混合物をさらに一７８℃で２時間攪拌し、１，３−ジブ０モプロパ ７１００　！ｉ（０，４９５ｍ０１）を急速に添加し、得られた混合物を一７８ ℃で１時間攪拌した。その後、この混合物を室温で２時間攪拌した。混合物の色 調は、褐色から青、さらに黄色へと変化した。殆んどの溶媒を回転式エバポレー ターで蒸発し、水２００ｍ１を添加すると二層となった。濃塩酸を添加して−を ０に下げた。有機溶滓層を廃棄した。水層を１００Ｈのエーテルで２度洗浄した 。−を１〜２に上げた。赤色のオイル状物質を分離し、（１！Ｈ２Ｏ１２に抽出 した。この溶液を無水Ｎａ２ＣＯ３で乾燥した後に、殆んどの０Ｈ２０１２を回 転式エバポレーターで蒸発し、サンプルをシリカゾルカラムにかけた。クロロホ ルムでサンプルを溶出すると、淡黄色のオイル状物質を与えた。この物質は、− 夜冷却すると結晶化した（　１２．３７　ｇ）。
この様にして合成した４−（４−ブロモブチル）−４′−メチル−２，２′−ビ ピリジンの粗結晶４Ｉ（１３，３ｍｍｏｌ　）を、その後フタルイミドカリ２． ４６ｇ（１３−３ｍｍｏｌ　）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　）６０　ｒｎ ｌ懸濁液に添加した。その後、この混合物を約５０℃で２時間攪拌した。この混 合物に０ＨＣ１３９［］　ｍｍを添加し、さらに水１２５ｍ１を添加した。ＣＨ Ｃｌ３層を分離し、水層をクロロホルム５Ｑｍｌで２度抽出した。
ＣＨＣｌ３層を合併して水５［］ｍＡ’で洗浄し、無水Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾 燥し、回転式エバポレーターで蒸発すると、淡橙色のオイル状物質を与え、この 物質は一夜の間に固化した。この粗生成物をアセトン／エタノールから再結晶す ると、白色結晶（融点、１１４．５−１１７．８°Ｃ）２．２１．９　（４４， ５％）を与えた。元素分析：計算値：０．７４．３８％；Ｈ，５，７０％；Ｎ１ １１．３１％。
測定値；Ｃ１７３，９８％；Ｈｔ６．１４％；Ｎ。
１１．２８％。工Ｒニアタルイミドカルボニル伸縮１７７１及び１７０４儂−１ ゜プロトンＮＭＲの解析では、アｏマチイック共鳴（δ７．５７−７．８５．ｍ 、４Ｈ）と通常のビピリジル誘導体のシグナルを示した。これらのデータは、以 下の構造と一致する。
実施例６２ テオフィリン−８−ブチリック−Ｃ４−Ｃ４−メチル−２，２′−ビピリジン− ４−イル）−ゾチル〕アミＶ：化合物■の合成 Ｎ−（４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−ブチルツーフ タルイミド３７０　ｍｙ（１ｍｍｏｌ）をエタノール１Ｑｍｌ中で泥状にし、色 水ヒドラジン（７２０ｍ９．１．４　ｍ　ｍｏｌ）で処理し、攪拌し、４時間還 流すると、この間に固体はすべて溶解した。この反応の終末に向って、白色の沈 殿が生成し始めた。
冷却した後に、この反応混合物を５０％ＮａＯＨで塩基性とし、水１ｏｏｍｔに 注加した。溶液を得た後にＮａ２ＣＯ３を添加し、生成物をオイル状物質として 塩析した。（１！Ｈ２Ｏ１２４Ｑ　ｍｌずつを４回用いてアミンを抽出した。抽 出物をＯａ　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、濾過し、蒸発するとアミノビピリジン誘導体を 無色のオイル状物質として与えた（収量−０，１３５ｇｍ；５６％）。
４−（４−（１−アミノブチル））−４’−メチル−２，２′−ビビリシフ１． ３４ＩＣ５，（５ｍｍｏｌ）及びテオフィリン−８−酪酸（１，１８９ｚ　４． ４　ｍ　ｍｏｌ　）を室温で乾燥ピリジン１Ｑｒｎｌ中に溶解した。この溶液に 、ジシクロへキシルカルボジイミド１．１６　ＩＩ（５，＜５ｍｍｏｌ）を添加 した。室温で一夜攪拌をし続けた。アルミナの薄層クロマトグラフィー（移動相 −１５％メタノール／クロロホルム）を行ったところ、Ｒｆｏ、６８の単一生成 スポットを示した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過して除去し、ピリジン を留去すると固体を与えるが、これをエーテル中でトリチュレートし、濾過した （収量＝２．１３，９；９９％）。
実施例Ｗ ビス−（２，２’−ビピリジン）〔テオフィリン−８−ブチリック−４−（４− メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−ブチルアミｐ）ルテニウム（Ｉ Ｉ）ジクロ＋）　ｙ　：　’Ｒｕ　（ＩＩ）−化合物■結合体の合成上述の化合 物１［［１７５１ｎ９（０−３５７ｍｍｏｌｅｓ）及びビス−（２，２’−ビピ リジン）ルテニウム（■）ジクロリド２水塩１５４ｍ９　（０，２９６ｍ　ｍｏ ｌｅｓ　）“の混合物に、エタノ−／’／　Ｈ２Ｏ（１：　１　、ｖ／ｖ　）　 ４　Ｑｍｌを添加した。
この混合物を暗所で１５分間アルゴンで脱気し、アルゴン気流下暗所で６時間還 流すると、澄明なチェリーレッドの溶液を与えた。生じた澄明なチェリーレッド の溶液を室温に冷却し、回転式エバポレーターを用いて、３７℃以下の暗所で溶 液を維持しつつ溶媒を除去した。
得られた残留物を約５　ｍｌのメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０ クロマトグラフィーカラム（７５ｃＩｒＬＸ　３ｃｍ　）にかけ、約０−４　０ ．７ｍｌ／ａｔの流速で溶出した。鮮明な赤色のバンド（生成物）には、褐色の 非螢光バンド（不純物）と、２個の螢光バンドが接近して続いていた。赤色の生 成物バンドには、褐色の非螢光バンドからも少量の不純物が混入していることが 判明した。この混入物は、同様の条件下の２度目のセファデックスＬＨ−２０カ ラムにサンプルをかけることにより、生成物から分離した。
°　回転式エバポレーターで溶媒を蒸発することにより赤色の生成物を得た。得 られた固体物質を約１ｄのメタノールに溶解し、約７５ｍ／のジエチルエーテル 中で再沈殿させるとオレンジ色の粉末を与え、これを濾取した。
元素分析：計算値：０，５４．５１％；　Ｈ，５，７２％：Ｎ、１３．９９％； ０９１０．４７％；　Ｃ１，６，４４％。
測定値：０９５５．０４％；Ｈｔ６．３５％：Ｎ。
１３．１８％；ｏ、１０．６２％；０１，６．６８％。
実施例３４−テオフィリンに対して特異的な抗体を用いたＲｕ　（…）−化合物 ■結合体により生ずるエレクトロルミネセントシグナルの変調 実施例３３で述べたこのＲｕ（Ｉｔ）−化合物■結合体を０−３５　Ｍ　フッ化 ナトリウムを含むｐＨ６，０の０．１Ｍリン酸Ｍ！を衝液（ＰＢＦ緩衝液）で最 終製置が１５０　ｎＭになるまで希釈した。テオフィリンに対し特異的なモノク ローナル抗体（クローン番号９−４９、腹水ロット番号ＷＯ３９９、ｃａｔ　ｎ ｏ、　Ｑ　４６）　ｔ−ＫａｌｌｅｓｔａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎ ｃ、　（０ｈａｓｋａ、　ＭＮ　）より入手した。
このモノクローナル抗体をＰＢＦ　ｋ衝液を用いて様々な濃度に希釈した（１１ ＩＩｌ中のタンパク質が２１．９μｓから７００μＩの範囲）。
テオフィリンに反応しないもうひとつのモノクローナル抗体（対照ＭＡＲ）をＳ ｉｇｍａ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）より入手し、ＰＢＦｍ衝液を用いて ｌ　ｍｌ中のタンパク質が２１．９μＩから７００μｌまでの様々な濃度に希釈 した。
テオフィリンの標準溶液をＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、より入手 したテオフィリン（Ｍｉ１ｗａｕｋθθ、Ｗ工、ネコ番号２６−１４０−８、Ｍ 、Ｗ、　１８０　、１７　）を用いて調製した。テオフィリンはＦＢ？緩衝液中 に最終濃度が７５μＭとなる様に溶かし、アッセイに使用する為にＰＢＦ緩衝液 で６μＭにまで希釈した。エレクトロ化学ルミネセンスの測定を実施するに先立 ち２５　Ｑ　ｍＭのシュウ酸と５％（ｖ／ｖ　）のＴｒｉｔｏｎ　−Ｘ　１００ を含む溶液（ＥＯＩ溶液）を反応混合物に添加した。測定は反応溶液を含む試験 管に２つの白金ガーゼ電極を取り付けられる様に改良されたＢｅｒｔｈＯ１ｄル ミノメータ−を用いて行なった。この電極をポテンショスタットに接続し、エレ クトロ化学ルミネセンスの測定は走査速度５　Ｑ　ｍＶ／ｓｅａで１．５から２ ．０ボルトまでこの電極間の印加電圧を変化させる事により実施した。この測定 に使われたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメータ−には高利得の赤感性光電子倍増管が 付すていた。このルミノメータ−の記録計への出力は１０５ｃｏｕｎｔｓ／ｖｏ ｘｔに合わせた。この測定値はＸ　−Ｙ　−Ｙ’記録計に記録され、このピーク 高をエレクトロ化学ルミネセンスの測定値として用いた。この電極は測定と測定 の間に０．１　Ｍ　’）ン酸、８０．１Ｍクエン酸、０．０２５　Ｍシュウ酸、 及び１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ　−１００を含むｐＨ４，２の緩衝液ですすぎ、この 溶液中でこの電極に＋２．２から−２，２ボルトの間の電流を６０秒間パルスと して流し、続いて＋２．２ボルトを１０秒間流す事によりきれいにする。次にこ の電極をこの溶液から取り出し、蒸留水中ですすぎ、水気を拭きとって乾かす。
この実験は表■に概略を示したとおりに実施した。
対照のモノクローナル抗体の溶液、テオフィリンに対する抗体の溶液、又はＰＢ Ｆ緩衝液を一組の試験管に注いだ（ステップ１）。この試験管にテオフィリン溶 液又はＰＢＦ緩衝液を加えた（ステップ２）。この溶液を試験管を簡単に振る事 で混合し、室温で２５分間反応させた。その後Ｒｕ（ＩＩ）−化合物■結合体の 溶液をこの試験管に加えた（ステップ３）。この試験管を撮り、室温で１５分間 放置した。最後にこのＥＯＬ溶液１００μｌを各々の試験に添加し、上述の様に エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。この結果は表Ｗに示した。
表　■ エレクトロ化学ルミネセンスに関して抗体−ｎｕ（Ｉｆ）−化合物■共役物の相 互作用が及ぼす効果を研究する為表　Ｗ Ｒｕ（ＩＩ）−化合物■共役物のエレクトロ化学ルミネッセンスに対する抗体と テオフィリンの影響抗体タンパク質　対照脚　抗テオフィリン　抗テオフィリン ルミネッセンスの測定値 ２．１９　５５，０００　４０，０００　４３，０００５５．０００　４１，０ ００　５７，０００４．３８　５７．０００　２２，５００　３７．０００５７ ．０００　２５．０００　３６，０００８．７５　５３，０００　２０．０００ 　３３，５００５０．０００　２２，０００　３０，５００３５．０　４３，０ ００　１３，５００　１７，５００４１．０００　１４．０００　１６，０００ ７０．０　４２，０００　１１，０００　１１，０００３７．５００　１２，０ ００　１２，５００重複試料のエレクトロ化学ルミネセンスを上述した様に測定 した。上の実験で用いたＲｕ（ＩＩ）−化合物■結合体のエレクトロ化学ルミネ センスは抗体を添加しない緩衝液中で測定した際５７．２００であった。緩衝混 合液に対するバック゛グラウンドは５７５０であった。
このデータはルテニウム化合物が付着したテオフィリン類似体、即ちＲｕ（ＩＩ ）−化合物■と接触した際、特異的にテオフィリンを認識するモノクローナル抗 体はそのエレクトロ化学ルミネセンスを減じるであろう事を示して因る。エレク トロ化学ルミネセンスの減少量はＲｕ（■）−化合物■結合体の濃度を一定に保 った場合、抗体の濃度に比例する。テオフィリンと反応しない抗体を使用する場 合は抗体が高い濃度でもエレクトロ化学ルミネセンスはわずかに減少するだけで ある。
このデータはまた、テオフィリンを抗テオフ１イリン抗体に接触させた後、Ｒｕ （ｎ）−化合物■共役物を混合物に加えた場合、エレクトロ化学ルミネセンスの 量はより大きくなる事も示している。この事はテオフィリンは抗体の結合に関し てＲｕ（ＩＩ）−化合物■共役物と競合しその結果としてエレクトロ化学ルミネ センスを生じるＲｕ（ＩＩ）−化合物■結合体が大量に得られる。
実７）ｌＪ３５−ホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンス　イムノアッセイ に基づいた血清中のテオフィリンの実施例６４で述べた結果に基づいてテオフィ リンに対するホモジニアスイムノアツセイ法を競合結合の型についての実施例６ ３で述べたテオフィリンとこのＲｕ（ＩＩ）−化合物■結合体に対する抗体を用 いて開発した。材料は０．１Ｍフッ化ナトリウムを含むＰＨ６，０の０．１　Ｍ 　！Ｊン酸緩衝液を除き実施例６４で述べた物と同じであった。このアッセイに 対してはテオフィリンに対するモノクローナル抗体の濃度を特別に選択した。
この抗体濃度は５５μｌ７ｍ１であった。このＲｕ（１）−化合物■結合体の濃 度は１７５　ｎＭに調整した。テオフィリンをヒト血清に最終濃度が１ｍｌの血 清当り２．５．５．１０．２０、及び４０マイクログラムとなる様に加えた。
アッセイは１０μｌの血清を２９０μｌの抗テオフィリンモノクローナル抗体に 加え、室温で２５分間放置する事により行なった。次に１００μｌのＲｕ（ＩＩ ）−化合物■共役物を各々の試験管に最終濃度が３５　ｎＭになる様に加え、こ の溶液を室温で１５分間放置した。実施例３４で述べたＥＯＬ溶液を１００μｌ ずつ各々の試験管に注ぎ、この溶液のエレクトロ化学ルミネッセンス特性を１． ５〜２．５ボルトの範囲を５ＱｍＶ／ｓｅａで走査して先に述べた方法で測定し た。このデータを第２図に示す。このデータは血清試料中のテオフィリン濃度と この反応混合物より生ずるエレクトロ化学ルミネセンスの量との間に相関がある 事を示している。この結果はテオフィリンのアッセイ開発の可能性を示している 。
これらの結果に基づけば、この技術に習熟した人は生物基質中の興味ある目的の 分析物質を検知したり定量する為にホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンス イムノアッセイを開発する事ができるであろう。
実施例３６−ホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセイに基 づく溶血した血清、脂血症の血清、買置の血清、及び正常血清試料中のテオフイ 様々なタイプの血清試料中のテオフィリン濃度をホモジニアス　エレクトロ化学 ルミネセント　イムノアッセイを用いて測定した。このアッセイの型は実施例３ ３で述べたテオフィリンに特異的なモノクローナル抗体とＲｕ（ＩＩ）−化合物 ■結合体を用いた競合結合アッセイである。エレクトロ化学ルミネッセンスの為 の試薬と方法は先の実施例で述べられている。
様々な血清試料中のテオフィリン濃度の測定に使われている螢光偏光法をＡｂｂ ｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ　（ＮｏｒｔｈＣｈｉｃａｇｏ、工Ｌ）より 購入した自動ＴＤＸ器機を用いて英雄した。このアッセイには溶血した血清、脂 血症の血清、黄痘の血清及び正常の血清を用い、この異常血清に対するデータは 以下の表■に示す。
表　ＸＶＩ ホモジニアス　テオフィリン　アッセイ潜在的に問題のある血清の特徴 血清　ファクターの濃度　正常値の範囲溶血　１２　、４１ｎ９／６１　ヘモグ ロビ７　０−３．２　ｍ？／ａｌ脂肪血症　４０５ダ／ｄｌ！トリグリセリド　 ｉ　０−１９０ダ／ｄＡ’１９６１ｎ９／６７３　コｖステロール　１２０−２ ００　ｍｙ／ｄｘ黄痘　装置　Ｉ　０ｍ９／ｅＬｌビリルビン　０−１．５■／ ｄＪ様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μｇテオフィリン／　ｍｌから ４０μｌテオフイリン／　ｍｌの間になる様にこの血清試料に加えた。このホモ ジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセイの結果を第６図に示す 。
各々の血清試料はテオフィリン濃度に関して螢光偏光法でも分析した。このホモ ジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセイと螢光偏光法とで測定 したテオフィリンの濃度を比較した。このデータは散布図としてプロットし、第 ４　Ａ　−Ｄ図に示す。このデータの点を線型回帰により分析し、相関係数を計 算した。この分析によりこの２つのアッセイの間には特に強い相関がある事が示 されている。この相関係数（ｒ）は０．９８から１．００であった。正常血清、 溶血した血清、脂血症の血清試料に対する曲線の勾配は０．８から１．２の間で あり、この事はこれらの血清試料からのテオフィリンの回収率が非常に高い事を 示している。
テオフィリンを含め買置の血清試料から生じるエレクトロ化学ルミネセンスは他 の血清試料に対するものより高いが、これは各々のテオフィリン濃度に於込て比 例して高くなった。この事は第４Ｄ中に見る事が出来る。この相関係数はエレク トロ化学ルミネセンスと螢光偏光を比較したデータ点に対して１．００である： しかし勾配は２．１４である。この事は買置の血清試料中のテオフィリンの高い 回収率を示している。
これらの結果に基づいて、黄痘の試料中のテオフィリン濃度を既知の量のＲｕ（ ＩＩ）−化合物結合体を黄痘の血清の一部に加える事により試料に対する標準曲 線を描き、これを用いて測定することができるであろう。
これらのデータはホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセイ は、異常な量のヘモグロビン、脂肪、及びビリルビンを含む血清試料中のテオフ ィリン濃度を測定する為に使用できる事を示している。
ホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセイはＥＣＬ検出に於 ける多能性、即ち生物分子のより高い濃度でより敏感な検出が出来るという理由 から螢光偏光法よりも優れている。
さらにホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセントイムノアツセイは入射光源が 不必要で、電気的励起のみが効率的な光の発生に必要であるという理由からも螢 光偏光法よりも有利である。従ってエレクトロ化学ルミネセント　イムノアッセ イには精巧な光学は必要でない。この測定原理は電気化学的刺激によって誘発さ れる純粋に特異的な光子の放出であるので、このシステムの感度は本質的に螢光 偏光法より十分に高く、より幅広いダイナミックレンジが達成できるであろう。
また、非常に多様な目的の分析物質の測定が螢光偏光法よりもホモジニアス　エ レクトロ化学ルミネセントイムノアツセイで可能である。これは生物分子の認識 作用、即ち抗体−抗原相互作用により電気的に刺激された化学ルミネセンスが敏 感な変調を起こす事に因る。
これらの結果に基づけば、この技術に習熟した者には異常な血清試料中の興味あ るその他の目的の分析物質を検知する為のホモジニアス　エレクトロ化学ルミネ セント　イムノアッセイを開発できる事がわかるであろう。
実施例３７−ホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンス　イムノアッセイに基 づく血清中のテオフィリンのアッセイ及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ （！　）様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μμテオフイリン／　ｍｌ から４０μｓテオフイリン／Ｈになる様にヒトの血清試料に加えた。各々の試料 を次に２つの部分に分け、この試料中のテオフィリン濃度をホモジニアス　エレ クトロ化学ルミネセンス　イムノアッセイで測定し、同じ血清試料に対してＨＰ ＬＣ法で得られた結果と比較した。ホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンス 　イムノアッセイに於けるアッセイの型はテオフィリンに特異的なモノクローナ ル抗体とＲｕ（ＩＩ）−化合物■結合体を用いた競合結合アッセイである。
このアッセイの為の試薬と方法は先の実施例で述べられている。様々な血清試料 中のテオフィリン濃度の測定に使われたＨＰＬＯ法は以下に述べる。
テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチン）をアセトニトリルで血清タンパク 質を沈殿させる事により抑清タンパク質から分離する。テオフィリンを含む上澄 み液をＷａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｍｉｃｒｏ　Ｂｏｎｄａｐａｋ　 Ｃｉ　８カラム（３，９ｍｍＸ３０α）を装備したＨＰＬＣシステムに流した。
このクロマトグラムは１０分以内に完全に分かれた。
以下の試薬を使用した：酢酸ナトリウム（試薬用）、脱イオン水（Ｍｉｌｌｉｐ ｏｖｅ　Ｍｉｌｌｉ　ＱシステムによりＮＭ）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ用） 、テオフィリン標準試薬、（Ｓｉｇｍａ　）。血清タンパク質を沈殿させる為に 用いた溶媒は１４％（Ｖ／Ｖ　）のアセトニトリルを含むｐＨ４，０の２０　ｍ Ｍ酢酸ナトリウム級衝液とした。このＨＰＬＣの移動相の緩衝液は７％（ｖ／ｖ 　）のアセトニトリルを含むｐＨ４，０の１３ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液とした 。流速は１．５　ｍｌ　／　ｍｉｎとし、流出液は２７０　ｎｍにセントされて いるＵＶ分光光度計でモニターした。このＵＶ吸収検出器の感度は０．０２吸光 度単位フルスケール（ＡＵＦＳ　）にセットした。気温は２２℃から２４℃の間 であった。
血清中のテオフィリン濃度測定に関するホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセ ント　イムノアッセイとＨＰＬＯアッセイの結果を図５に示す。データは散布図 としてプロットされデータの点は線型回帰により分析された。その相関係数を計 算した。相関係数（ｒ）は０．９８であり、これは２つのアッセイの間に強め相 関がある事を示している。
曲線の勾配は１．１９７であり、ＨＰＬＯに基づいた標準的方法に比べてホモジ ニアス　エレク）　ｏ　化学ルミネセント　イムノアッセイの方がこの血清試料 からのテオフィリンの回収率が優れている事を表わしている。
このホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　アッセイはＨＰＬＣ法よりも スピード、感度、及び多数の試試料を簡単に扱えるという点でより有利である。
これらの結果に基づけば、この技術に習熟した者にはＨＰＬＣやその他同類の方 法で検出できる分析対象物をホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセント　イム ノアッセイで検出する方法を開発できる事がわかるであろう。
実施例３８−テオフィリン−ウシ血清アルブミン結合体の製法 テオフィリン−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）共役物をテオフィリン−６−メ チル−酪酸、テオフィリン−８−酪酸、及びテオフィリン−７−酢酸から以下の 方法により調製した。５０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌの０．１５ＭＮａＨＣＯ３、ｐ Ｈ９，０に溶解した。１６ｍｇのエチル３’、３−ジメチルアミノゾロピルカル ポジイミド塩酸塩（ＥＤＣ工）、！＝１１７ＶのＮ−ヒドロキシコハク酸塩（Ｎ Ｈ８）　、及びジメチルスルホキシドに溶かした１７．８１ｎ９のテオフィリン −７−酢酸、又は２０〜のテオフィリン−８−酪酸、又は２０．９ダのテオフィ リン−３−メチル−酪酸を別々に加えこの溶液を４５℃で１〜２時間加熱した。
この溶液をＢＳＡ溶液に一滴ずつ加え１時間反応させた。ＢＳＡのテオフィリン 結合体は５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５のカラムを用いたケ９ル濾過りロマトグ ラフィーでＰＨ７，４の０．１５　Ｍ　ＰＢＳ　／　０．１％アジ化物を移動相 とし、流速３０　ｍｌ／ｈｒで分離精製した。
実施例３９−テオフィリン−ＢＳＡ　Ｂｉｏｍａｇ粒子の製法４　ｍｌのＢｉＯ ｍａｇ−アミン粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ。
工ｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ　）を０．００８％Ｎｏｎ１ｄａｔ　 Ｐ−４０（ＮＰ−４０）を含むｐＨ７，４のリン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ　） 　（ＰＢＳ　）　２Ｑ　ｍｌで２〜３回ＢｅｐａｒａｔｅＴ−ｆｌａｓｋ中で洗 った。このＢｉｏｍａｇ　ｗｅｔ　ｃａｋｅに５％のグルタルアルデヒドを含む ＰＢＳを１Ｑｒｕｌ加えロータリーミキサーで６時間活性化させた。活性化され たＢｉｏｍａｇ粒子を上述の様に合計４回洗い、Ｔ−ｆｌａｓｋに移し換えた。
１Ｑ　ｍｌ（Ｄ　ＰＢＳ／ＮＰ−４０中の実施例３８に述べた方法で調製された テオフィリン−ＢＳＡを６．８■この活性化されたＢｉｏｍａｇ　ｗｅｔ　ｃａ ｋｅに加えた。４°Ｃで一晩反応させた。
この活性化されたＢｉｏｍａｇ　ｗｅｔ　ｃａｋｅを２Ｑｍｌの１％ＢＳＡ　／ 　０．１５　Ｍ　ＰＢＳ　／　０．１％アジ化物（ｐＨ７，４）で３回洗った。
この際最初の洗浄はロータリーミキサーを用いて約３０分間続げた。
実施例４〇−化合物Ｉ−抗テオフイリン結合体の製法１、ｉｍ／のマウス抗−テ オフイリン　モノクローナル抗体（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ　、　ｏット番号ＷＯ３ ９９；　４．６１１９／ｍｌ）　を１０．０００．９で８分間遠心した。緩衝液 は０．２　Ｍ　ＮａＨＣＯ３，０，１５Ｍ　Ｍａｉｌ、でアジ化物を含んだｐ） １９．０のものＫＡｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３　［１ｃｏｎｃｅｎｔ ｒａｔｏｒを用いて取り換えられた（３０００．９で遠心された）。この抗体溶 液は２ｍｌに希釈され、６．２〜の化合物Ｉが加えられた。室温で２時間攪拌し ながら反応させ、１１１ｙ／ｌｌｌ１の濃度のＮａＢＨ水溶液を７９μ！加え、 この溶液を３Ｑ分間攪拌した。
こうして得られた溶液を前もってトリス緩衝液で平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘ 　Ｇ　−２５０カラム（１，０ｃｍ　Ｘ　１８．０ｃＩＬ）にかけ、流速１５１ ｉＺ／ｈｒで流出させた。化合物Ｉ−抗−テオフィリン結合体を含む７ラクシヨ ンを集め、透析チューブに移し、０．１５　Ｍリン酸塩／　０．１５　Ｍ　Ｎａ Ｆ（ＰＢＳ　）、ｐＨ６，９（４＃）に対し透析した。
実施例４１−不均質エレクトロ化学ルミネセント　ア免疫学的測定法のひとつの 型を用いて、テオフィリンに対する不均質アッセイを化合物■で標識された抗テ オフィリン抗体とＢｉｏｍａｇ　磁気粒子上に固定されたテオフィリンＢＳＡを 用いて開発した。この抗体濃度は２０μｊｉ／ａｔであった。磁気粒子の濃度は １％固体（ｗｔ／ｖｏｗ　）であった。テオフィリンは１ｍｌの血清に対し最終 濃度が１０及び４０μＩとなる様に加えた。
このテオフィリン血清標準物は１％のＢｓＡを含むＰＰＰ緩衝液（リン酸ナトリ ウム緩衝液、ｐ）（７，０、Ｑ、ｉＭ７ッ化す）　＋Ｊウム）で１０００倍に希 釈した。
アッセイは、７５μｌの希釈された血清標準物を７５μｌの抗体が結合した化合 物■に加え、この溶液を室温で２０分間反応させる事により実施した。次に５０ μｌのテオフィリン−ＢＳＡ　−ＢｉＯｍａｇ粒子を加え、この懸濁液を５分間 放置した。この粒子を磁気的に分離し、上澄み液の１００μｌについて実施例４ ８で述べる方法に従ってエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。
テオフィリン濃度　ＥＣＬ”　ＳＤ　％ｃｖ０　８．７５８　８１　０．９％ １０　１１．０７８　３６８　３．０％４０　１４．１０６　６７４　４．８％ “ｌｏＬＩＯ秒間に対するカウント 廿希釈について補正されている これらの結果に基づけば、この技術に習熟した者は生物基質中のその他の興味、 ある分析対象についても不均質エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイを開 発する事が出来るであろう。
実施例４２−化合物…−ジブキシｒニン結合体の製法攪拌バーが付いた５Ｑｍｌ の丸底フラスコに１００．２ｍｇ（０，１０４ｍｍｏ１）の化合物■、４１　Ｉ ｎｇ（０−１０５ｍ　ｍｏｌ）のジビキシグニン（５１ｇｍ＆　）及び２８１ｎ ９（０−１３６ｍｍｏ１）の１，３−ジシクロへキシル力ルボジイミＹ　（Ｄｅ ｃ　）を加えた。この混合物に８−１０１１！／の無水ピリジン（Ａｌｄｒｉｃ ｈ　５ｕｒｅ−８ｅａｌ　）を１８デージの針を付けたシリンジで加えた。この フラスコに栓をし、テフロンのテープで封をして溶液が赤くなるまで穏やかに攪 拌した。このフラスコはフードの中で攪拌しながら暗い状態で２４時間放置し、 この時６■（０，０１５ｍｍｏ１）のジゴキシゲニンと２０ｍｇ（０−０９７ｍ ｍｏ１）のＤＣＣを加えた。この溶液には栓をし、暗い状態で室温に於いて攪拌 した。翌日、ジシクロヘキシル尿素の沈殿は観察されなかった。さらに１８ｍｐ （ｏ、ｏ　５　ｍ　ｍｏｌ　）のジゴキシデニンと１０３ｍｇ（０−５０ｍｍｏ ｌ）のＤＯＯを加えた。フラスコに再び封をし暗す状態でさらに攪拌を続けた。
７２時間後さらに１０３１ｎ９のＤＣＣを加え暗い状態で３時間攪拌した。
この溶液に５〜１０滴のＨ２Ｏを加え、次にこれをロータリーエバポレーターに 移して赤い固体を生じるまで暗い状態で乾燥させた。
得られた赤い固体はアルミニウムホイルで扱い、デシケータ−中でＣａＳＯ４を 用いて一晩乾燥させた。この乾燥させた固体を次に３〜５Ｍのメタノールに溶か し、この混合物に約０．２５．９の無水で固体状態のＬｉ０１０４を加えた。Ｌ ｉ０ＩＯ，が溶けたら、この溶液をＳ＠ｐｈａａｅｘＬＨ−２０のカラム（７５ ｃＩＩＬＸ　１９ｉ＋ｉ＋）にかけ、流速７〜１Ｑ　ｓｅａ／ｄｒｏｐの範囲で メタノールにより流出させた。
クロマトグラフィーが展開した際３つのバンドが確認された；第１の淡橙色（赤 色ルミネセンス）のバンド（７ラクシヨン１）：第２番目の暗赤色のバンドでこ れはこの反応の主生成物を示している（クラクション２）：及び第３番目の最初 の２つのバンドの後ろに続いたバンドで（おそらく未反応の原材料から成り）こ れは捨てた。
バンド１と２はこのカラムでかろうじて分離されたものなのでパンｒ２の中の橙 色生成物をフラクション２Ｃ１５ｍｌ＞のメタノール溶液を約３ｏｏｍｔの無水 ジエチルエーテルに滴下し攪拌した。得られた沈殿は１５１メデウムフリツト上 で吸引濾過により集め、１５ｍＡ！のジエチルエーテルで５回洗った。残こった エーテルを真空デシクーター中でＣａＳＯ４を用いて一晩この化合物を乾燥させ る事により取り除いた。この固体物質は以下の様に同定された： 実施例４３−化合物■−ジゴキシデニン結合体のエレクトロ化学ルミネセンス（ ＩｃＬ　）　：抗ジゴキシン抗体ジビキシンに対するモノクロナル抗体をイムノ アッセイ緩衝液で以下の濃度に希釈した： １．１０，５０，２００，４００　μ、９７ｍｌ化合物■−ジゴキシグニン結合 体（５０マイクロモル）をイムノアッセイ緩衝液（０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ ６，０，０，１Ｍフッ化ナトリウムを含む）で１５０ｎＭに希釈した。
ポリプロプレン族の試験管（１２ｍｍＸ７５龍）に入った２００μｌのイムノア ッセイ緩衝液に様々な濃度ｃＤ　シミキシン抗体を１００μｌと化合物■−ジゴ キシケ９二ン結合体を１００μＡ（１５０ゴＭ）加えた。試験管をポルテックス 上で攪拌し、室温で１５分間反応させた。反応の後、１００μｌのＥＣＬ溶液（ 先述）を加えエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。
０．１　１０８０００ ３０　ｎＭ化化合物−ジゴキシデニン結合体に対するＫＣＬカウントの総計−１ １３６６６（ピーク高）試験管１本当り４０μｙの濃度でシグナルの非特異的抗 体による変調は６７，０００カウントでありジゴキシンに対する特異的抗体が存 在する時は３６，０００であった。
第６図かられかる様に、化合物■−ジゴキシグニン結合体の固定された濃度に反 応する際、抗ジゴキシン抗体の濃度が上昇するとエレクトロ化学ルミネセントシ グナルの変調が上昇する事が示された。この特徴は血清や血漿中のジゴキシｒニ ンの測定に対してホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンスを基礎としたアッ セイを開発に当り有益となるであろう。
実施例４４−ホモジニアス　ジゴキシン　アッセイ実施例４３で述べた結果に基 づいてジゴキシンに対するホモジニアス　エレクトロ化学ルミネセンス　イムノ アッセイをジゴキシンに対する抗体と本化合物■−ジゴキシデニン結合体を用い 競合結合型のアッセイ法を使って開発する事ができるであろう。使用されるであ ろう試薬は実施例４３に記載されている。このアッセイに対してはジゴキシンに 対するモノクローナル抗体の特異的な濃度が選択されるであろう。この抗体濃度 はｉ　ｍｌ当り７５〜１００μｇである。本化合物Ｉ−ジゴキシデニ／結合体の 濃度は５〜１５ｎＭ（最終濃度）となるであろう。
ジゴキシン標準物がヒト血清に最終濃度が血清ｌ　ａｔ当りジゴキシン０．１． ０．５．１．２．４．８、及び１６ゴｇとなる様に加えられるであろう。このア ッセイは１０〜６０μｌの血清を３００μｌの抗−ジゴキシンモノクローナル抗 体に加え、室温で６０分間この溶液を放置する事により実施されるであろう。次 に１００μｌの本化合物■−ジゴキシグニン結合体を最終濃度が５〜ｊ５ｎＭの 範囲になる様に各々の試験管に加え、この溶液を室温で２０分間放置する。先に 述べたＥＣＬ溶液を１００μｌ各々の試験に入れ先に述べた様にしてＥＣＬが測 定されるであろう。
実施例４５−ウアバイン−ウシ血清アルジミン結合体の製法 ５０１ゴｇのウアバイン８水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ　）を５　ｍｌの脱イオン水 に溶かした。８１ｍ９のＮａ工ｏ、をこの溶かしたウアバインに加え、この混合 物を室温で２時間反応させた。この反応はＰＨが５と６の間になるまで脱イオン 水で平衡化したＤｃｎｖｅＸ　ｐ（−８イオン交換樹脂のカラム（５ｍ／）にこ の混合物を通す事により止めた。廃液入れに入ってくる流出液が混合のサインを 示したら酸化されて得られたクラクションを集めた。
１００■の凍結乾燥されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）の結晶（Ｓｉｇｍａ 　）を０．０５％のアジ化物を含むｐＨ７，４の０．１　Ｍ　！ｊ　７酸カリウ ム緩衝液５　ａｔに溶かした。この酸化されて得られた溶液にこのＢＳＡ溶液を 一滴ずつ攪拌しながら加えた。こうして得られた溶液は室温で１時間反応させた 後Ｎａｐ！ＮＢＨ４（Ａｌｄｒｉｃｈ　）を６０ｒｎ９加えた。次にこの溶液を 室温で一晩攪拌した。
この溶液をポリエチレングリコール−８０００で濃縮しく　１１　ｍｌから４　 ｍｌまで）、遊離状態のウアバインと過剰の水素化ホウ素をこの溶液から５ｓｐ ｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（カラム−０，６ｃｍＸ　３７ｃｍ　；溶離剤−０，１Ｍ 　Ｋ２ＰＯ４／Ｑ、１５　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５，０，０５％ＮａＮ３　） を用いて取り除いた。フラクション１１−１７を集め、そのタンパク質濃度を２ ８０　ｎｍに於げる吸収を（希釈後に）測定する事により決定した。
実施例４６−ウアパインーＢＳＡ−セファロースの製法セファロース４Ｂで活性 化された臭化ジシアンを２　／！５ｉｎｔｅｒｅｄ　ｄｉｓｋ　ｆｕｎｎｅｌ上 で４００ゴのｉ　ｍＭ　ＨＣ！ｌを１回に５ＱＩＩＪずつ使って洗った。この樹 脂を次に２０扉ｔのＱ、１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、Ｑ、５　Ｍ　ＮａＣ１緩衝液、− ９，０（カップリングバッファー）で洗った。この樹脂をポリゾロブレン製の容 器に移し換えた後、１５ゴのカップリングバッファーに溶かした３０１１！ｇの ウアバイン−ＢＳＡを加えた。この活性化された樹脂をロータリー混合しながら ２時間このウアバイン−ＢＳＡと共に反応させた。残こった活性化部位は室温で ２時間７１の０．５Ｍエタノールアミン（ｐＨ８，０）と反応させた。
５ｉｎｔｅｒｅｄ　ｄｉｓｋ　ｆｕｎｎｅｌを用いてこの樹脂を以下の溶液それ ぞれ１００Ｍ１ずつで洗った：カツプリングバツファー；　Ｑ、１５　Ｍ　ＰＢ Ｓ　；　１ｍＭ　ＨＯＩ　；カップリングバッファー；０．２％ＮＦ−４０を含 むＰＢＳ　；及びＰＢＳ　。
この樹脂を再び１１ｍ１に懸濁し、十分な量のこの懸濁液を内径１−Ｏｃｉのカ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）に入れ総ｂｅｄｖｏｌｕｍｅが５．５ｍｌになる 様にした。
実施例４７−抗−ジ♂キシンー化合物１ｉ合物の製法とアフィニティー精製法 マウス抗ジゴキシンモノクローナル抗体（（：ａｍｂｒｉｄｇｅＭｅｄｉｃａｌ 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　、　ｃａｔ　ｎｏ、　２Ｑ　Ｑ　Ｍ　−Ｑ　１４、 ロット番号ＭＡ　２５０７　Ｆ　）の１　ｍｇ／ｄ貯蔵用溶液を４５０　μｌｌ 　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　！ｌ　Ｑ濃縮ユニットを用イて１００μ ｌにまで濃縮した。この濃縮物に０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐ）１９ ．（５を９００μｌと化合物Ｉを０．６■加えた。反応（アミノ化）を室温で２ 時間行ない、その後５０μｌのＯ−Ｉ　Ｍ　ＮａＢＨ４（ａｑ）（Ｓｉｇｍａ　 ）を加えた。得られた溶液を１時間放置した過剰の化合物Ｉ及びその他の生成物 をこの抗体結合体からセファデクスＧ−２５クロマトグラフィー（カラム＝　１ ．０　ＣｍＩｐ　Ｘ　１８　ｃｍ　；溶出剤＝０．１Ｍリン酸塩緩衝食塩水）に よシ分離した。試料は２０　ｍｌ　／　ｈｒの流速で１ｍ／ずつのフラクション にして採Ｊ、’２１３ｏｎｍに於ける吸収を２．０　ＡＵＦＳ及びＱ、５　ＡＵ ＦＳでモニターした。
フラクション５．６．７、及び８を集め、予め洗っであるウアバイン−ＢＳＡ− セファロースアフィニティーカラム（３，５−のカラムで内径１ｃＩＩＬ）にか けた。そしてｉ　５　ｍｌ　／　ｈｒの流速で溶離させた。保持されていない物 質が溶出した後、流速を２Ｑｍｌの溶出液が集まるまで３　Ｑ　ｍｌ　／　ｈｒ に上げた。移動相のこの食塩水濃度は０．５　Ｍに上昇し、さらに２０−をカラ ムから溶出させた。
ウアバインに特異的な抗ジビキシンー化合物！結合体は４Ｍと６ＭのＫＳ　ＣＮ を加える事によシ取シ除かれた。抗ジゴキ７ンー化合物Ｉ結合体に当るフラクシ ョンを集め１０ｍＭリン酸塩緩衝食塩水（４Ｊ　；ｐＨ７，４）、成いて０．１ ＭＩＪン酸塩緩衝液に対して透析した。
実施例４８−ジビキシンに対する不均質エレクトロ化学ルミネセントイムノアツ セイ １０■の固体シー！’　＊　Ｖ　７を１Ｑ　ｒｒｒｌ　（Ｄ　ＤＭＳＯ：　Ｈ２ Ｏ（８：２）に溶かし、ジ♂キシン濃度を１ｑ／ｍｊとした（今後これを貯蔵用 標憩液と呼ぶ）。
この貯蔵用標懲液から０．１　％　ＢＳＡ及びＱ、ｉ　５　Ｍ　ＮａＦを含むｐ ）１７．０の０−１５Ｍリン酸緩衝液（今後ＥＣＬ緩衝液と呼ぶ）を用いて以下 の濃度の作業用標準液を調製した；１３ＱｎＪ／ｍｊ、４０　ｎｇ／ｌ＋Ｉｌ、 ２０ｎｇ／１ｍ’、１Ｑｎｇ／ｍＡ、５　ｎｇ／−及びＯｎｇ／７０７５μｌの 抗ゾビキシンー化合物Ｉ結合体（１：９０に希釈されている）及び７５ｍのそれ ぞれの標準液をガラス試験管にピペットで注ぎ、ｖｏｒｔｅｘ上で混合し室温で ２００分間反応せた。
５０μｌの予め洗浄されたウアバイン−ＢＳＡ　−ＢｉＯｍａｇ粒子を各々の試 験管に加え、ｖｏｒｔｅｘで混合した後室温で５分間反応させた。ＢｉＯｍａｇ 粒子を分離し、上澄み液をそれぞれ別の試験管に移した。
１００μｌの上澄み液を４００μノの０．１２５　Ｍリン酸カリウム０．１２５ Ｍ／−ｃｙｒＲ；　３２　ｍＭシュウ酸；１−２５　％　Ｔｒｉｔｏｎ、Ｘ−１ ００ト試Ｍｆ中テ混合Ｌり。
この試料をＢｅｒｔｈｏｌｄ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに入れ、先に述べた様にエ レクトロ化学ルミネセンスを測定した。但しその方法は開回路からの加電圧を２ ．２ｖに切シ換え、光子の計数を１０秒間で積算する様に改変された。
電極はリン酸−クエン酸緩衝液を用いて以下の方法で測定の間に洗浄した： （ａ）　電極に３秒おきに交互に−２，２ｖと＋２．２ｖのパルスを１分間送る 。
（ｂ）　電極を＋２．２ｖに１０秒間保つ。
（Ｃ）電極を脱イオン水ですすぎ、水気をとって乾かす。
この結果を第７図に示す。
実施例４９−エレクトロ化学ルミネセンスを有する化学種によるＤＮＡの標識づ け エレクトロ化学ルミネセンスを有する化学種によるＤＮＡの標識づけを以下の２ つの方法を用いて行なった合成人 １．０Ａ２６０の標単的に合成された３８量体（ＭＢＩ　５８）ＴＣＡＣＣＡＡ ＴＡＡＡＩ：’ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ”　テ Ｔ”が５位の炭素が −ＣＨ＝ＣＨ−Ｃｏ−ＮＨ−（ＣＨ２）、−ＮＨ２で修飾されたチミジンである ものを０．０１　Ｍリン酸緩衝’ｉ、ｐＨ８、７に溶かした。１００μ１０ヒス （２、２’−ビピリジン）（４−（ブタン−１−ａｌ）　−４’−メチル−２， ２′−ビピリジン〕ルテニウム（Ｉ［）二過塩素酸塩（化合物Ｉ）（０，０１Ｍ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８，７６００μ！中に２．５ｍ９）の溶液。内容物 を攪拌し室温で一晩放置した。１００μｌの水素化ホウ素ナトリウム飽和水溶液 をこの混合物に加え、この可逆的なイミンのシッフ塩基結合を非可逆的なアミン 結合に変換させ友。この反応は室温で２時間行なった。次にこの溶液を注意深く 希酢酸で処理し、過剰の水素化ホウ素す）　ＩＪウムを失活させた。この反応溶 液をＰ−２？ル濾過のカラム（１８インチ％’７２インチ）で予め０．１Ｍ酢酸 トリエチルアンモニウム、ＰＨ６，７７で平衡化されているものにかけた。この カラムはこの同じ緩衝液で溶出させ、２−の７２クシヨンを流速２　Ｑ　ｍ／！ 　／　ｈｒで集めた。７ラクシヨン９及び１０に溶出したＤＮＡは未反応のルテ ニウムビピリジル化合物と十分に分離された。この集められたＤＮＡ試料は典型 的なＵＶ吸収を示し、さらに４５０ｎｍで励起すると６２０　ｎｍで螢光の発光 スペクトルを示した。この螢光の発光はこのＤＮＡ試料中にルテニウムビピリジ ルの化学種が存在する事を示している。この生成物は単一の橙色の螢光を発する バンドとしてポリアクリルアミドゲル電気泳動で移動する。この標識されたＤＮ Ａ　（ＭＢＩ　３８−化合物ｌ結合体）の電気泳動による移動度はおよそ未標識 のＤＮＡと同じである。
合成り 本ルテニウム化合物をまず５ｍ９．６０μｌの無水ジテチルホルムアミＶに溶か し、これを９４■のジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で２０ ０４の無水ＤＭＦ中の５２１ｎ９のＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理する事 によυＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体に変換した。この反応は０℃で４時 間行なった。
沈殿したジシクロヘキシル尿素を遠心によシ取シ除き、この上澄み液（２００μ ｌ）を０．０１　Ｍ　１．１ン酸緩衝液ｐＨ８，７７中にアミノ結合したＤＮＡ 　（合成Ａで述べた）を含む溶液（１００μｌの緩衝液中２Ａ２６０）に加えた 。
この反応は一晩室温で行なった。かなシの量の固体が反応液中に現われたがガラ スウールで濾過して取シ除いた。この濾液を濃縮し、３．５ｍＡの１Ｍ酢酸トリ エチルアンモニウム（ｐＨ６，８）に溶かした。この反応混合液を次に合成Ａで 述べた様にクロマトにかけた。この標識されたＤＮＡは合成Ａで調製された材料 について述べた様な全てのスペクトル上及び電気泳動上の特徴を示した。
実施例５〇−標識されたＤｈＡの電気的に発生させた化学ルミネセンスの特性 実施例４９、合成人で得られた標識されたＤＮＡ試料（ＭＢＩ−化合物■）を用 いてそのエレクトロ化学ルミネセンスの特性を研究した。様々な濃度の標識され たＤＮＡを０．１Ｍクエン酸、２５ｍＭシュウ酸及び１．０チＴｒｉｔｏｎ　Ｘ 　−１００を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ４，２、Ｑ、５ｍＪに溶かし、 改良されたＢｅｒｔｈｏｌｄ　Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ肋表昭６４−５ＯＯ１４ Ｇ　（４５） で測定した。第８図に様々なりＮＡ濃度に対するエレクトロ化学ルミネセントシ グナルの反応を示す。
実施例５１−化合物ｌで標識されたオＩＪ　サヌクレオチドのハイブリダイゼー ション実験 実施例５０で述べた３８量体に対する相補ストランドをＡＢＩ　ｍｏｄｅｌ　３ ８　Ｑ　Ｂ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて合成し、これをＭＧＥＮ 　−３８と命名した。
このオリヒヌクレオチドへの化合物■の共有結合的付着がＭＢＩ　５８オリビヌ クレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を与えているかどうかを調べる 為に、以下の実験を考案した。様々な濃度の標的フラグメント（ＭＧＥＮ　−３ ８）をＧｅｒｍａｎ　ＲＰナイ０７メンプランのシート上にスポットし、■工６ ８又は■ｌ３８−化合物■を固定し、エーテルでプローブした。両方の７ラグメ ントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びガンマ３２ｐ　（ＡＴＰ　）で処理し 、５′末端を３２ｐで標識した。ＤＮＡと化合物Ｉで標識されたＤＮＡのハイブ リダイゼーション感度を比較した。
ｓ　ｏ　ｎｇから０．０５　Ｈｇまでの範囲の濃度のＭＧＥＮ　−５８ＤＮＡを ナイロンメンプランにスポットし、空気乾燥した。メンプランは１スポツトに対 し２枚ずつ用意した。このプロットをそれぞれ以下の溶液で２分間ずつ処理した ：　ＤＮＡを十分変性させる為に１　、５　Ｍ　ＮａｃＪ−０，５Ｍ　ＮａＯＨ ；プロットを中和する為に１．５　Ｍ　ＮａＣＪ−０，５Ｍ　ＴＲｌ５　；最後 に２　Ｘ　ＳＳＣ０このゾｏットを８０°Ｃの真空オープン中で２時間焼いた。
ハイプリダイゼーションゾロープは以下の要領で調製した：３μ、ｌＤＭＢＩ３ ８及び迎ｌ３８−化合物■を１０単位のＴ４キナーゼと１２５μｃ１のガンマ３ ２Ｐ−ＡＴＰでキナーゼ処理した。ＤＮＡへの同位体の取シ込み率を測定し以下 に示した。
ＭＢＩ　３８総カウント数　４−Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｐｍ／　Ｉｌｌ取シ込まれ たカウント数　３．１　ｘ　１１０５ｃｐ　／μｌ取シ込み率＝７５．６チ ＭＢＩ３８−化合物Ｉの総カウント数　３．２　ｘ　１０’　ｃｐｍ　／　ｔ＃ 取シ込まれたカウント数　２．６　ｘ　１１０５ｃｐ　／　ｔｔｌ取シ込み率＝ ８１．２チ プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの溶液をＭａｎｉａｔ ｉｓ　（２４）に従って調製した。プロットは５０４　／　ｍｌの仔ウシ胸腺Ｄ ＮＡと供に５５°Ｃで４時間ハイブリダイゼーションした。次にこのプロットを １０．０００，０００　ｃｐｍの各々のプローブを含むハイゾリダイゼーショ／ 溶液に入れた。そして５３°Ｃで一晩（１２時間）ハイブリダイゼーションさせ た。
翌日このプロットを以下の様に洗浄したニー５６℃の２　Ｘ　ＳＳＣ＋　０．１ チＳＤＳで１５分間ずつ２回−０，２Ｘ　ＳＳＣ＋０．１　％　ＳＤＳで２回（ 上と同様に）−０，１６ｘ　ｓｓｃ　＋　０．１チＳＤＳで２回（上と同様に） このプロットを次に空気乾燥し一７０℃でＫｏｄａｋＸ　−Ｏｍａｔフィルムに さらした。
このＸ線分析（第９図参照）からＭＢＩ　３８とＭＢＩ３８−化合物■のプロー ブの間には非常に似たハイブリダイゼーションのパターンが見られる事がわかっ た両方の場合に於いて５　ｎｇの標的に対するプローブのハイブリダイゼーショ ンが観察され、最低０．０５　ｎｇの標的ＤＮＡに至るまでわずかなハイブリダ イゼーションの痕跡が認められた。陰性対照のＤＮＡ　（５０ｎｇスポットした ファージラムダＤＮＡ　）に対してはこのプローブによるハイブリダイゼーショ ン活性は検出されなかった。
実施例５２−化合物Ｉで標識されたＤＮＡゾローゾのハイブリダイゼーションの 特異性に関する実験幾つかのＥ、　ｃａｄｉ及び非１μ）ｌｘ株からｒツムのＤ ＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ　（２４）の方法に従って分離した。使用した生物は： １匹旦　ＥＣ１３株−天然分離株 １匹且　にＩＡ株−腸管病原性株 １ユ主り、１０ＨＯ７株−毒素原性株 １旦３．ｔＥＣ５０株−天然分離株 互、竺臣Ｂ株−実験用株 一二工二　Ｋ１２株−実験用法 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｙ二」！！：Ｌ　ンテロバクター・エインデイイ ＳａｌｍＯｒｅｌｌａ　ｐａｒａｔｙｐｈｉ　Ｂ　サルモネラ−パラチフィＢ Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａλす！傷四−サルモネラ−ボッダム上述の株から得られた ＤＮＡを６μｇずつ重複してＧｅｌｍａｎ　ＲＰナイロンメンプラン及びＳ＆Ｓ ニトロセルロースメンプラン上にスポットした。陰性対照として５０　ｎｇのフ ァージラムダＤＮＡをスポットした。陽性対照はｓ　ｏ　ｎｇからＯ−５ｎｇの 範囲の様々な濃度の相補ストランド、ＭＧＥＮ−３８とした。このプロットは実 施例５１で述べた方法によシ調製し処理した。
このゾローゾ用ＤＮＡは放射性を取り込ませる為に１２５μＣ１のガンマ”Ｐ　 −ＡＴＰと共にＴ４キナーゼ処理された３、８μ９のＭＢＩ　３８−化合物Ｉフ ラグメントから構成された。
ＭＢＩ！＋８−化合物総カウント数　−３，３５Ｘ　１０’　ｃｐｗｔｓ取シ込 まれたカウント数　−１，５０Ｘ　１０’　０２ｍ　／ｌｔｌ取シ込み率　−４ ４，７％ このアッセイの為に２，６００．０００　ｃｐｍの活性を６各のフィルターをプ ローブする為に用いた。このノ１イゾリダイゼーション溶液、条件、洗浄溶液及 びプロトコルは実施例５１で述べたものと同様のものを用いた。
このプロットのＸ線フィルム（第１０図）はそれぞれ適宜反応させた陽性及び陰 性対照を示している。ラムダＤＮＡ　（５０ｎｇ　）ではノ１イゾリダイゼーシ ョン活性は検出されず、最低０．５　ｎｇの濃度までＭＧＥＮ　−５８の相補配 列に対し強いハイブリダイゼーションが観察された。これらの結果は感度に関す る実験の結果と総合的に一致するものである。
実施例５３−２．２’−ビピリジニウムへキサクロロオスミウム酸塩（ＩＶ）の 製法 １．０１　ｇのへキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）アンモニウム、（ＮＥ（４） 　２０Ｅｃ１６、（Ａｌｆａ　）　（１，００等量）を５ＱｍＪの３　Ｎ　Ｈｃ ｊ（ａｑ）に７０℃で溶かした。この熱せられ、攪拌された溶液に５　Ｎ　ＨＣ ＪＩ　（ａｑ）に溶かした２゜７−ビピリジンを一滴ずつ加えた。赤い塩、（今 後（ｂｐｙＨ２”）ＯｓＣＪ　６”−と呼ぶ）で分子量５６２．２ｆｉ／ｍｏｘ ｅがこの溶液から沈殿した。
沈殿はこの溶液を０℃の水浴で２時間冷却する事によシ完了した。生成物をｇｌ ａｓｓ　ｆｒｉｔｔｅｃＬ　ｆｉｌｔｅｒ上で吸引濾過によシ集めた。この沈殿 物を連続的に５〜１０ＷＬｌの氷冷した３　Ｎ　ＨＣｊ　（ａｑ）と水で洗った 。最後に２０１１１／の無水ジエチルエーテルで洗った後、この生成物を真空下 ７０℃で４８時間乾燥させた。収量＝１．０１ｇ橙色粉末（（ＮＨ４）２０ｓ　 Ｃｊ６に基づいた収率７８％）。この生成物はさらに精製する事なく使用した。
実施例５４−２　、２’−ピぎリジンテトラクロロオスミウム酸塩（ｍＶ）の製 法 実施例５３で調製した（　ｂｐｙＨ２”）　（ｏｓｃＪｔ、２−）塩０−９ｇ（ １，６０ｍｍｏ１）をパイレックスの試験管に量シ取る。この試験管をアルビン の出入口と温度計（最大目盛４００℃）の付いたパイレックスの煙管に入れた。
この装置全体を煙管に入れアルビンを流し込んだ。
この炉を加熱し、温度を２７０−３００℃に上げた。
反応の間を通してアルビンを穏やかに管に流した。このアルビンの出口を反応の 間に生成したＨＣＪを実験室外へ排気する為にｆｕｍθフード下に向けた。温度 が２７０℃に近づくにつれ、反応物の熱分解が開始しもこの固体からＨＣｊガス が発生するのが観察された。
３０分間にわたシ激しく　ＨＣｊが発生するのが観察され、その後しだいに鎮静 化し始めた。６時間後、オープンを止め、試料を室温まで冷却した。この生成物 、（ｂｐｙ）　ｏｓｃＪ４、細かく分かれた茶褐色の固体を１２時間、攪拌され た３　Ｎ　ＨＣＪ　（ａｑ）溶液中に懸濁し、続いて６時間攪拌された無水ジエ チルエーテル中に懸濁する事によシ精製した。ｇｌａｓｓ　ｆｒｉｔｔｅｃｌ　 ｆｉｌｔｅｒ上で吸収濾過する事によシこの生成物を分離した結果、２．２’− ビピリジンテトラクロロオスミウム酸塩（■）が０．７５９　（９５％　）収穫 された。これを今後（ｂｐｙ）ｏｓｃｔ４と呼ぶａ　（Ｍｗ＝　４８９−３９　 ／　ｍａｌｓ）。
この生成物はさらに精製する事なく使用した。
実施例５５ シス−（２，２’−ビピリジン）〔シス−ビス（１゜２−ジフェニルホスフィノ ）エチレンツージクロロオスミウムの合成 攪拌子と還流冷却器を付けた５Ｑ＋ｎｊの丸底フラスコに、実施例５４に於いて 合成した（ｂｐｙ）ｏｓｃＪ、　２３０１ｎｇ（０−４７ｍ　ｍｏｘ　）とシス −ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレｙ（ＤＰＰ−ｅｎｅ）４６５１ １１＆（１，１７ｍｍｏ１）を添加した。ジグライム２５Ｉ＋ｌｊを添加し、内 容物をアルビン気流下で５時間還流した。濃緑−黒色の溶液をアルビン気流下で 室温に冷却し、２００ｍｊ！のビーカーに移し入れた。無水ジエチルエーテル８ ０ｒｎｔを加えると濃緑色の沈殿を与えた。この沈殿をガラスフィルター（中程 度の孔）上に吸引濾過によシ収集し、２０ｍ１ずつの無水ジエチルエーテルで５ 回洗浄した。この沈殿をその後ＣＨ２ＣＪ□１５＃Ｉｌに溶解すると濃緑色の溶 液を与えた。この溶液をガラスフィルター（中程度の孔）を通して自然濾過して 約３０　［］ｍＪた。灰色−緑色のシス−（２，７−ビピリジン）〔シス−ビス （１，２−ジフェニルフォスフイノ）エチレン〕−ジクロロオスミウム■錯体、 これ以後は、シス−（ｂｐｙ）　（ＤＰＰ　−ｅｎｅ　）○５ＣＪ２と記述する 、の沈殿が生じた。この錯体をガラスフィルター（中程度の孔）上に吸引濾過し て収集した。生成物を速かに２Ｑｍｌの冷１　：　２　Ｖ／ｖエタノール／水で 洗浄し、その後３３ｍＡ１ずつのジエチルエーテルで７回洗浄した。スレート灰 色の粉末を、真空デシケータ−中ＣａＳＯ４を用いて一夜乾燥した。
収ｉ　：　２４０　”９　（（ｂｐｙ）ＯｓＣｊ４　Ｆ分子量＝８１４．Ｕ！／ ｍｏ１θに基づいて６３チ）。この生成物は、これ以上精製しないで使用した。
実施例５６ （２、２’−ビぎリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチ レン（２−（３−（４−メチル−２，７−ビぎ、リジン−４′−イル）プロピル 〕−１，６−ジオキソラン）オスミウム（Ｖジクロリドの合成 攪拌子と還流冷却器を装備した１ＱＱｍＪの丸底フラスコに、実施例５５で合成 したシス−（ｂｐｙ）　（Ｉ）ｐｐθｎθ）Ｏ８Ｃ−１ｘ　１２９１ｎｇ（０， １５８ｍ　ｍｏｌ）と２−Ｃ５−Ｃ４−メチル−２，２−ビぎリジン−４−イル ）ゾロぎル〕−１，３−ジオキソラン、即ちｂｐｙｏｘａｌ、０．６ｇ（１，３ ｍ　ｍｏｌ　）を添加した。これにエチレングリコール１５ｍＡ！を添加した。
この懸濁液をアルゴン気流下に３時間還流した。室温に冷却した後に、水ｉＱｍ ７！をフラスコの内容物に添加した。
水に入れたＳＰ−セファデックスＣ−２５イオン交換街脂のカラム（３０ｃＩＩ Ｌの高さＸ１９＋ｍ内径）を調製した。反応フラスコの内容物をカラムにかけた 。カラムをＨ２Ｏ（約５００７ｍ）で溶出してエチレングリコールと過剰のｂ： １ＩｙＯｘａ１配位子を除去した。Ｏ−２５ＭＮａ（Ｊ　（７３Ｃ）溶液で溶出 して淡黄色の小バンド（長波長のＵＶ先光下はオレンジ色の螢光）を分離し、そ の後非螢光のオリーブグリーンのバンドを分離した。これらのパンＰは、反応の 副生成物であることを示した。それらの同定は行わず、廃棄した。これらのバン ドをカラムから除去すると同時に、０．５　Ｍ　ＮａＣＪ　（水溶液）による溶 出を始めた。最初のオレンジ色螢光を有するオレンジ色のバンドは、必要とする 生成物の塩化物塩である（２．７−ビぎリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフェ ニルホスフィノ）エチレン）（２−（：！１−（４−メチル−２，７−ピビリジ ンー４′−イル）プロピル）−１，５−ジオキシラン）オスミウム（■）、これ 以後は（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂｐｙｏｘａｌ）Ｏｓ　（Ｉｆ）２＋と記 述、であると同定した。この物質は、ティリングした黄色バンド（緑色螢光）と 褐色パンｒ（非螢光）から純粋に分離した。
（ｂｐ７）（ＤＤＰｅｎｅ）　（ｂｐｙｏｘａｌ）Ｏｓ　（Ｉｔ）２＋を含む分 画中の溶液量を、回転式エバポレーターで蒸発して５３ｍＡ！とじた。その後濃 Ｎａ１Ｊ水溶液を５ＱｍｌずつのＣＨ２（４２で３回抽出した。ＣＨ２（Ｊ□抽 出液を合併し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ヒダ折シの濾紙で自然濾過した。赤 色のＣＨ２（４２溶液を回転式エバポレーターで蒸発して濃縮し１０ｍＡ！の容 量とした。ＣＨ２ＣＪ２溶液を、良く攪拌した２００ｍ１の石油エーテルにゆつ くシと滴下することにより、オレンジ色の固体として錯体を単離した。沈殿した 錯体をガラスフィルター（中程度の孔）上に吸引濾過して収集した。生成物を、 １５ｍ１ずつのジエチルエーテルで３回洗浄した。生成物を真空デシケータ−中 ＣａＳＯ４によシー夜乾燥した。
収量：　（ｂｐｙ）（ＤＰＰａｎｅ）（ｂｐｙｏｘａｌ）Ｏ８（ＩＩ）”（ＣＪ −）２　＋２　Ｈ２Ｏをｉｉｏｍｇ（シス−（ｂｐｙＸＤｐｐｅｎｅ）ｏｓｃ１ ２に基づき６６チ）。
生成物は２水塩であシ、分析的に純粋である：ｃ５７Ｈ５４Ｎ４ｏ４ｐ２ｃｊ’ ２ｏＳ　＋　２　Ｈ２Ｏ（分子量＝　１１０９．５９　Ｅ／ｍｏｌｅ　）。
理論値：　ｃ、　５５．２０　％　；　Ｈ，４，８７％　；　Ｎ、　５．０５　 ％　；０、５．７７チ：σ、　６．３９チ。測定値：　Ｃ，５６，０りチ；Ｈ， ５，１８％　；　Ｎ、　４．８８％；　ｏ、　６．８７　％　；ＣＪ、　７．０ ７　％実施例５７ シス−ジクロロ−ビス−（４、４’−カルボエトキシ）−２，２’−ビピリジン 〕ルテニウム（ＩＩ）の合成攪拌子と還流冷却器を装備した２５０ｍ１の丸底フ ラスコに、シス−テトラ−（ジメチルスルホキシド）ジク０ＣＩＡ／テニウム（ Ｉｔ）　（Ｒｕ（ＤＭＳＯ）、Ｃｌ２）　７５０　ｒｎｙ（１，５５ｍｍｏ１） とエチレングリコール１００−を添加した。フラスコの内容物をアルゴン気流下 に軽く沸騰させ、（４、４’−カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジン７５６ 〜（り−０９ｍ　ｍｏｌ）を添加した。アルビン気流下の加熱を５分間継続した 。オレンジ色の溶液は、褐色／黒色となシ、リチウムクロリド０．７５９とエチ レングリコール５０ゴを添加した。この溶液をさらに１０分間加熱した。室温に 冷却した後に、混合物に約１００ゴのＨ２Ｏを添加した。この混合物を、２００ ＋ｎＩｔずつのＣＨ２（Ｊ２で５回抽出した。
ＣＨ２（４２抽出液を２００１＋！７！ずつの水で６回洗浄した洗浄する毎に水 層を（赤色の）螢光についてテストし、水層に螢光が検出されなくなる迄は、必 要があれば洗浄を続けた。ＣＨ２Ｃｊ２抽出液を無水Ｎａ４ＳＯ４で乾燥した生 成物のＣＨ２Ｃｌ２溶液を蒸発し、攪拌している１０倍量の無水ジエチルエーテ ルに滴下することによシ単離した。沈殿した生成物を吸引によシ濾取し、５０１ １１のジエチルエーテルで１度洗浄し、真空デシケータ−中でＣａＳＯ４によシ ー夜乾燥した。収率＝２５チ濃いメタリックグリーン結晶。
この生成物は、分析的に純粋である。
理論値：　Ｃ，４１１，５７；　Ｈ，４，０１；　Ｎ、　７．４５　；ＣＪ！、 ９．４０；ｏ、　２１．２１　ｏ測定直：　ｃ、　４４．１６　；　Ｈ，３，７ ２；　Ｎ、　７．１１；Ｃ１９，５３；　０．２０．１５ｏ分子量＝　７５４− ５　Ｊｉｉ’　／　ｍａｘθ。
実施例５８ ビス（（４、４’−カルボメトキシ）−２６フーービリジン）２−（３−（４− メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）プロピル）−１，３−ジオキソラン ルテニウム（１１１２過塩素酸塩の合成 ビス（４、４’−ジカルポメトキシー２．２′−ビぎリジン）ルテニウム（Ｄ） ジクロリド２５０■（０−５３ｍｍ０１）のメタノール／水（１：１）５０ｍＡ ！溶液に、２−（３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−ゾ ロビル）−１，５−ジオキソラン（ｂｐｏｘａｌ）１０５■（０，３７ｍ　ｍｏ ｌ）を添加し、この混合物をアルゴン気流下に１２時間還流した。この溶液を冷 却し７０　＊　Ｈｃｉｏ、　０．５　ｍｊを添加した。メタノールをゆつくシと 蒸発した。沈殿した赤色結晶を濾取し、少量の冷却した水で洗浄し、ついでエタ ノール及びエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。ビス（４、４’−ジヵルポメト キシー２，２′−ビピリジン）ルテニウム（Ｉｒ）ジクロリｒと４−（４−メチ ル−２，２′−ジピリジン−４′−イル）−酪酸又は４．４′−メチル−２，２ ７−ビぎリジンから錯体を合成するために、同様の方法を使用した。
２１＋ＩｔのヒトＩｇＧ　（２，５ｍｔ２　／ｍｔ　）を２１の０．２Ｍ炭酸水 素ナトリウム緩衝液、ＰＩ′１９．６に対し４℃で一晩、穏やかに攪拌しながら 透析した。化合物■を存在するタンパク質（２，７＃／１００μｌジメチルホル ムアミド）に対して１００ｍｏＩＩＬｒ過剰に調製し、溶かした。この透析され たタンパク質を一滴ずつｔａｇ　−ａｌｅｈｙｄｌに加えた。この間２時間、溶 液を室温で穏やかに攪拌した。タンパク質に対し１００　ｍｏｌａｒ過剰の水素 化ホウ素ナトリウム（脱イオン水に溶かしたＬ２４ｍｙ／ａｔ溶液１００μｌ） をこの溶液に加え、室温でさらに３０分分間中かに攪拌を続ける。この結合体を 室温で０．２　Ｍ　ＴｒｉＢ、　Ｐ）ＩＱ、Ｑで平衡化し７’ｊセフ７デクスＧ −２５カラム（１，０ｃｍ　ｘ　１８．０　ｃｍ　）にかけ、溶出液を２８０　 ｎｍでモニターした。ボイドボリュームのピークを集め、合わせて２ノのＴｒｉ 　ｓ緩衝液に対し透析した。この結合体に対し標準的なＥＬＩＳＡ法で免疫学的 活性をテストし、使用時まで４℃で貯蔵した。
実施例６０−　Ｂｉｏｍａｇ　／ヤイー抗ヒトＩｇ（）粒子の製法５９１ｉ　Ｂ ｉｏｍａｇ　−ａｍｉｎｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌｅｄ粒子（ＡｄｖａｎｃｅｄＭａ ｇｒｅｔｉｃｓ　、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　、　ＭＡ　）を２＋５ｍｌ清浄なＴ −フラスコに入れ、リンヌ塩緩衝食塩水ＣＰＢＳ　）で５回洗った。とのｗｅｔ 　ｃａｋｅを１２．５１ｄの５％新しいゲルタールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ　） に再懸濁し、外界温度で６時間中分に回転させた。このｖａｔ　Ｃａｋｌｉｌを 別の’１’−７ラスコに移しＰＢＳで３回洗浄した。この活性化された粒子″ｔ １２．５ｍｌのＰＢＳに再び懸濁し、１５ゴの遠沈管に移した。この懸濁液に２ ゴのＰＢＳに溶かした１　２．５１ｎ９のヤヤ抗ヒトＩｇＧ　（Ｈ十Ｌ　）　（ Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａ’ｂｓ　）を加えた。この管を室温で３時間中分に回転し 、次に４℃で一晩回転させる。翌日この粒子を１４！＝　（”／ｖ　）ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ　）を含むＰＢＳで２回洗浄し、次にＱ、１％　ＢＳＡを含 む１２−５ｍ７！のＰＢＳ中で４℃で使用時まで貯蔵する。
実施例６１−　Ｂｉｏｍａｇの磁気に基づく粒子アッセイを用いた偽ホモジニア スヒ）　ＩｇＣ）エレク）Ｏ化学ルミネセンスアッセイ 化合物Ｉ−ヒｌ−ＩｇＧ結合体をＯ−１％　ＢＳＡを含む０．１５Ｍ＋Ｊン酸緩 衝液で１＝５０に希釈し、１本の試験につき２５０μｌずつ入れた。希釈剤（上 述と同様ＰＢ　ｗ／ＢＳＡ　）を１５０μｌずつ試験管に注ぎ、次に様々な希釈 率の目的の分析物質（ヒトＴｇＧ）又は希釈剤（陰性対照）を加えた。さらに非 特異的目的の分析物質（ヤゼー抗ウサギＩｇＧ）を特異性のアッセイをチェック する為に試験管数本に入れた。ヤギ抗ヒ）ｆｆｇＧ（Ｈ＆Ｌ）と結合した１％Ｂ ｉＯｍａｇを５０　ｔｚｌ各々の試験管に加えた。この試験管はｖｏｒｔｅｃ上 で混合され、室温で穏やかに振盪しながら１５分間反応させた。この粒子を溶液 から磁気的に除去し、得られた上澄み液１００　Ａｌｌ　ｔ−Ｂｅｒｔｈｏｌｄ 管に移し、ここに４００μｌのクエン酸塩−シュウ酸塩−Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ　− １００溶液を加えた。この管をｖｏｒｔｅｚ上で混合し、Ｒ−２６８光電子増倍 管及び直径０．２９インチの輪状の５２ｆ−ジ二重白金メツシュ電極が付いた改 良型ＢｅｒｔｈＯ’ｌｄルミノメータ−で測定した。この電極は、ポリカーボネ ートの支持体で覆われ、直径０．０１インチの白金線／銀ペイント・コンタクト を介して電圧源に接続されている伝導性ペイントによって支持されている。加電 圧は＋１．４から＋２．１５Ｖまでステップして、この間１０秒間の積算をした 。測定と測定の間にはこの電極を脱イオン水ですすぐ事によりｔ気化学的に清浄 にし、次にシュウ酸とＴｒｔｏｎ　Ｘ　−１００’ｃ含む０．１Ｍリン酸塩−ク エン酸塩緩衝液に浸漬し、加電を−２，２ｖから　−＋　２．２　ｖまで（各々 の電圧で３秒間）２分間及び２０秒間ステップし、＋　２．２　ｖのｐｏｔｅｎ ｔｉａｌで１０秒間保持した。この電極を洗浄液から取シ出し、脱イオン水です すぎ、水気を吸い取って乾かした。この方式に於いてはエレクトロ化学ルミネセ ントシグナルは目的の分析物質の濃度に直接比例した。
実施例６２−ビス（２，２’−ビビリシン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル −２，ｚ−ビピリジン−４′−ジチルアミドルテニウム（Ｉ［）二過塩素酸塩： 化合物■の製法実施例６２に記載されている方法で５００１ｎｇ（Ｌ５５　ｘ　 Ｉ　Ｑ−３ｍｏ１）のフタルイミドから調製シタ４−（４−（１−アミノジチル ）　）　−４’−メチル−２゜２−ビピリジンを無水ピリジンに０．３１１９（ １，４８×１０’−”　ｍｏｌ）のマレイミドヘキサン酸と０．３０６９（１− ４８ｘ　１０−３ｍｏ１）のＤＤＣと共に溶解した。−晩攪拌した後、ジシクロ ヘキシル尿素を濾過によシ除去し、ピリジンを真空下で蒸発させた。この残留物 をカラムクロマトグラフィー（活性■アルミナ、５チた。収量：０．５６ｇ（９ ５チ）。
１０　ｏｃｙ（２，５Ｘ　１０−４　ｍｏｂ　）のマレイミド−ヘキサン酸、４ −メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミド及び１００ｍｇ（２−０ ６ｘｌ　Ｏ−’ｍｏ１）のビス−（２、２’−ビピリジン）ルテニウムニ塩化物 二水和物を５ＱｍＪのエタノール／水（１：１）に溶かし、アルゴンで脱気して ４時間還流した。得られた透明の橙色溶液を２５ｍ１の固体−１Ｍ塩素酸ナトリ ウム、２５ゴのエタノール、及び２５ｒｎｌのアセトンで希釈し、真空状態でゆ つくシと蒸発乾固させた。乾固したら、さらに２５ｍ１の水と２５ｍ！！のア℃ トンを加え、この溶液を約１５〜２０１ｎｌになるまでロータリーエバポレータ ーで濃縮した。沈殿した固体を集め水で洗い乾燥させた。
この試料は１：９メタノール／クロロホルムの溶媒系でアルミナの調製用ＴＬＣ で精製した。ここで速く展開してきたバンドをプレートをかき取り、本化合物を メタノール／クロロホルム（１：１）中で攪拌スる事によシ溶離させて分離した 。アルミナを取シ除く為に濾過した後、橙色の溶液を蒸発乾固させ８６．７＃の 精製された化合物を得た（７２％）。この構造は懇によシ確認された。
（＋１０９−１４５、ＪＰｌ　４１、Ｖｅｒｎｏｎ　５ｉｖｅｎｓ。
○ｈ１ｏ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）を１ｍ７！の０．１５Ｍクエ ン酸緩衝液、ｐＨ６，０に懸濁し、１．１　！ｌ’（７）化合物■は６００μｌ のジメチルホルムアミドに溶かした。このペゾチド溶液を一滴ずつ１分間以上か けて化合物■溶液に加えた。この溶液を室温で１時間穏やかに攪拌した。次にこ の試料を、室温でＱ、２Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８，５で流速１５　ｍｌ　／　 ｈｒで平衡化されたＢｉｏ　−Ｇｅ’ｌ　Ｐ　−２カラム（Ｂｉｏ　−Ｒａａ　 ；　１ｃｍｘ　４５ｃｍ）にかけ、溶出液を２８０　ｎｍでモニターした。この ボイドボリュームを集め、合わせて、室温で５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＪ！ 、ｐＨ７−０で平衡化されたＱＡＥ−５ｅｐｈａａｅｘ　Ａ　−２５カラム（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　；　１　ｃｒｒＬＸ　１０　ｃｍ　）にかけた。これは未標 識の全てのベゾチドを取シ除く為に行なった。（この未標識のベゾチドは陽性に チャージした樹脂に吸着され、プラス電荷の標識されたベゾチドはそのま＼カラ ムを通過する。この溶出液は２８０　ｎ＋ｎでモニターされ、最初の主な−一り を集め凍結乾燥によシ濃縮した。
乾燥させた固体を再び最少量のＰＢＦに懸濁した。このｈＣＧペゾチドー化合物 ■結合体は使用時まで４℃で貯蔵された。
実施例６４−　ＤＥＡＥ　ＡＦＦＩ　−Ｇｒｌ　ＢｌｕｅりＯｆトゲラフ４ｍｌ のＤＥ−ＡＦ；　ＡＦＦＩ　−Ｇｅｘ　Ｂｘｕｅ　（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）をク ロマトグラフィー用のカラム（１ｃｍｘ１０カラムサイズ）に注ぎ、室温でＯ− ０２８Ｍ　ＮａＣｊを含む０．２ＭＴｒｉｓ　−ＨＣｊを用い流速４　Ｑ　ｍｌ 　／　ｈｒで１時間かけて平衡化した。この流速を２　Ｑ　ｍｌ　／　ｈｒに下 げ、予めこのカラム緩衝液に対し透析されたウサイ抗−ｈＣＧペゾチド（ａｎｔ ｉ　１０９−１４５、Ｖｅｒｎｏｎ　５ｔｅｖｅｎｓ、　Ｏｈｉ。
５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）を１ｍ７！このカラムにかけた。
ｉ　ｍｊｔずつのフラクションを集め、溶出液は２８０　ｍｍでモニターした。
ボイドボリュームのピークを集め、数回の実験分を合わせ、ポリエチレングリコ ール６．０００　（Ｓｉｇｍａ　）で囲まれた１　２　Ｋ　ＭＷＣＯ透析サック にこの溶出液を入れる事により：；ｌ！した。この抗体ス）、ＨＰＬＣによシ純 度をテストした。ＨＰＬＣの結果、ひとつの大きなピークを得、これは純粋で活 性のある製剤である事を示している。
実施例６５−精製されたウサイ抗ｈｃＧペゾテドに対するｈＣＧペプチド−化合 物■結合体の滴定：エレクトロ化学ルミネセンスシグナルの変調 ｈＣＧペゾチドー化合物■結合体を０．１Ｍクエン酸−６，２を含む０．１　Ｍ 　ＩＪン酸緩衝液で希釈した。この混合物の一部をｍｉｃｒｏｆｕｇａ管に入れ た。予め精製された抗ペゾチド抗体を様々な濃度に希釈し、この管に加え、Ｖｏ ｒｔｅｘで混合した後室温で１時間反応させた。エレクトロ化学ルミネセンスを 測る直前に、この一部をシュウ酸とＴｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００（Ｓｉｇｍａ　 ）の入ったＢｅｒｔｈＯｌａ管に移した。この管をＶＯｒｔｅＸで混合し、Ｒ− ２６８光電子増倍管を用い、二重白金メツシュの電極を持つＢｅｒｔｈＯｌａ　 ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで３ｗｅｅｐ　モード（＋１．５から＋２．５ｖまで５ 　Ｑ　ｍＶ　／　ｓｅｃで６回走査し、２回目の走査のピーク高を測定値とする ）を使って測定した。測定の間にこの電極を電気化学的に清浄にした。最初にこ れを脱イオン水で洗い、次にこれを２５鮨のシュウ酸塩と１チのＴｒｉｔｏｎ　 Ｘ　−１００を含むｐＨ６，１の０．１　Ｍ　ＩＪン酸塩−クエン酸塩緩衝液に 浸漬した。加電圧は各電圧に於いて６秒間、＋２．２ｖと−２，２Ｖの間を１分 間及び５０秒間スイッチを入れ、＋　２．２　ｖで１０秒間保持した。次に電気 を切シ、洗浄液から電極を取シ出し脱イオン水ですすぎ、水気を吸い取って乾か した。
この結果はエレクトロ化学ルミネセントシグナルはこのペゾチドに対する抗体の 濃度に直接比例するという一般的傾向を示した。この事はエレクトロ化学ルミネ センスで標識された分析対象物が抗体と接触するとエレクトロ化学ルミネセンス シグナルが落ちるその他の実験とは対照的である。
実’Ｊ５例６ローエレクトロ化学ルミネセンスシグナルの出カニ　Ｒｕ　（ｆｌ ）−化合物■結合体の安定性に関するデニノーーーーーーーーーーーーー−一一 −−−−−−−Ｒｕ（ＩＩ）−化合物Ｉ共役物を１チの正常なヒト血清（ＮａＳ 　）を含むか或いは含まない０．１　Ｍ　リン酸塩−クエン酸塩緩衝液、ｐ）１ ６．１で３００ｎＭｔで希釈した。
各々の緩衝液の種類のうちひとつを４．２０．３０、及び５０℃でインキュベー トし、６．４、及び５日目に試料を採取した。この試料は室温と平衡状態にし、 そのエレクトロ化学ルミネセンスシグナル出力を測定した。４００μｌの試料を 試験管内で１００μｌの１２５ｍＭシュウ酸−５ｔｌｂ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　− １００と混合し、浜松Ｒ−２６８光電子増倍管と二重メツシュ白金ガーゼ電極の 付いた改良型ＢｅｒｔｈＣ）１４ルミノメータ−に入れた。測定は加電圧を＋１ ．５ｖから＋２．５ｖまで５　Ｑ　ｍＶ　／　ｓｅａで３回スイーゾし、２回目 のぎ−ク高を記録し、エレクトロ化学ルミネセンスのカウントに変換する事によ シ測定した。測定の間、電極を電気化学的に清浄にした。脱イオン水ですすぎ、 電極を２５−シュウ酸塩と１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含む０．１Ｍリン 酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し、−２，２Ｖから＋　２．２　ｖまで３秒間の 休止をして、各電圧１分間及び５０秒間、電圧を振込した。電圧を＋２．２ｖで １０秒間止め、次に取シ除いた。電極を洗浄液から取シ除き、脱イオン水で洗い 、水気を吸い取って乾かした。この結果は実験の全過程を通じて各々の緩衝液の 種類で一貫したシグナルが存在する事を示している。この事は本試薬の安定性と これがエレクトロ化学ルミネセンスシグナルを発生する能力がある事を示してい る。
実施例６７−Ｒｕ（Ｉ［）−化合物Ｉ結合体の免疫学的反応性試験二安定性に関 する実験 本Ｒｕ（Ｉ）−化合物■結合体を実施例６６で述べた条件で希釈し、インキュベ ートした。試料’ｔ５．４、及び５日目に採取し、室温にまで冷却し、Ｐａｎｄ ｅｘ。
Ｉｎｃ、　、　Ｍｕｎａｓｌｅｉｎ　、　ＩＬよシ入手したｐａｎａｅｘ　Ｓｃ ｒｅｅｎＭａｃｈｉｎｅを用いてＰａｒｔｉｃｌｅ　Ｃｏ！１＋：ｅｎｔｒａｔ ｉｏｎＦｌｕｏｒｓｓｃａｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（ＰＣＦＩＡ　）に よシ免疫学的反応性をテストした。このＰＣＦＩＡは競合的アッセイ方式で行な った。このラテックス粒子（ＰａＭｅｘ　）をテオフィリン−ＢＳＡと結合させ た。これらの粒子の一定量をＲｕ（１）−化合物■結合体テスト溶液と抗テオフ ィリンモノクローナル抗体（腹水、Ｈｙｃｌｏｎｅ　ｃａｔすＥ−５１２０Ｍ、 ｌｏｔすＲＤ　２０　Ｑ　）　Ｏ最終濃度ｉで、及び一定量のヤイ抗マウスＩｇ 　−ＦＩＴＣ結合体（Ｐａｎ４θｘ１ｃａｔ　＋　５５−０２−１、’ｌｏｔす ＣＯｌ　）と混合した。
インキュベーションの後、この試料を加工し、ＰａｎｄｅｃＳｃｒｅｅｎ　Ｍａ ｃｈｉｎｅで測定した。この結果は５５℃で５日間のインキュベーションの後に 於いてさえ目に見えるほど活性は失われなかった事を示している。
実施例６８一様々なルテニウム及びオスミウム化合物のエレクトロ化学ルミネセ ンス 様々なオスミウム及びルテニウム化合物を１ＱｍＪの窒素でパージしたアセトニ トリルにｉＱｍＭの濃度で溶かした溶液として、電解質には１Ｍテトラゾチルア ンそニウムテトラフルオロホウ酸塩を用いて電気化学的に測定した。電解用電極 はＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｆ”ｙＳｔ＠ｍａｗＩｎｃ、　ｓ　Ｗｅｓｔ　 Ｌａｆａｙｅｔｔｅ　、　ＩＮよシ入手した白金デイスク電極である。白金線対 向電極と１．０ｍｍの銀線を参照電極として使用した。測定は走査速度１００ｍ Ｖ／Ｂｅｃで−２，２ｖから＋２．２ｖまで（ｖｓ　ＳＣＥ　）走査する事によ シ実施した。各々の電気化学的測定の後、飽和カロメル参照電極（ＳＣＥ　）と 銀線との間の電圧差全測定した。従って報告される値はＳＣＥに対する電圧に補 正されている。
エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ　）の測定を０．１Ｍリン酸塩−クエン酸 塩緩衝液（ｐＦ（４，２）　、２５　ｍＭシュウ酸、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ −１００を含む３．５ｍｌの水溶液中で行なツタ。
使用した電極システムは０．１ｉｘの白金線でＲａｄｉｏ　５ｈａｃｋトランジ スタソケツト（≠２７６−５４８）に接続された２つの白金ガーゼ（５２ゲージ ）電極から構成されていた。
この電極は６Ｑｍｌのセルロースアセテートプラスチックの薄片の外側に取シ付 けられた。このプラスチックには直径７４インチの穴があけられておシ、電解用 と対向−参照電極の間を容易に溶液が流れる事の出来るようになっている。ひと つの電極が電解用（これは光電子増倍管に近い）として機能し、もうひとつの電 極が対向及び参照電極として機能するためにこれらの電極をポテンショスタット に接続した。測定は走査速度５　Ｑ　ｍ’Ｖ　／ａｅｃで１．５ｖから２．５ｖ まテ（バイアス電圧）走査して行なった。Ｅｅｌの測定は化合物の与えられた濃 度に於けるシグナル対ノイズの割合、即ち、又はシグナル対バックグランドの割 合として報告する。
バックグランドはＥｃｌ化合物の添加されていない緩衝液に対し観測されるシミ ネｔン六カウント数と定義される。ルミネセンスの測定値は第１回目又は第２回 目の線型走査の間に観測されるピーク光出力とした。
エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ　）及びサイクリックボルタンメ）　ＩＪ −の測定の双方を各々の溶液について、Ｕｒｓａｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　０ｘｆｏｒｄ。
Ｅｎｇｌａｎａよシ入手したＥＧ　＆　Ｇ　ＭＯ（ＬＱＩ　２７３ポテンシヨス タツト又はビポテンショスタットを用いて実施した。各々のＥＣＬの測定に於け る光子流はＷｉｌｅｂａｄ　。
Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａｎｙよシ入手したＢｅｒｔｈｏｌａ　ＢｉＯＢｌｏｌｕ　 ＬＢ９５００１ｕｍｉｎｏｒｉｅｔａｒでモニターした。この装置はＱ、５ｍｊ の測定溶液中に２〜６個の電極システムが設置できる様に改変されている。電気 化学的及びエレクトロ化学ルミネセンスの測定はともにＤｅｌｆｔ　、　ＨＯｌ ｌａｎａよシ入手したＫｉｐｐ　＆　Ｚｏｎｅｎ　Ｍｏｄｅｌ　ＢＤ　９１　Ｘ 、　Ｙ、　Ｙ’レコーダーによシ記録した。目的の化合物ｆ　５．ＯｍｌのＥＣ Ｌ溶液に溶かすか、或いはＥＣＬ溶液に溶けない場合はアセトニトリルに溶かし て、これを５０ゴ用い、螢光の測定を行なった。測定はＰｅｒｋｉｎ　−Ｅｏｍ ｅｒ　ＬＳ　−５星螢光分光光度計で行なった。最大励起波長を照射中に発光ス ペクトルが測定でき、逆に、最大発光波長をモニターする間に励起スペクトルを 記録できるようにする為に、励起及び発光スペクトルを記録する前にこの溶液の 励起及び発光スペクトルの予備走査を実施した。
ＥＯＸ　Ｅｒｅａ　螢光発光　ＥＣＬ（Ｓ／Ｎ）１化合物　ＶＳ、ＳＣＥ　最大 重の波長　及び濃度ａ）　Ｒｕ（’ｂｉｐｙ）：＋　１−０７Ｖ　−１，５２Ｖ 　６２５ｎｔｏ　ＩＸｌｏ−９Ｍ（２，５） ｂ）　Ｒ，ｕ（４，４’　−１，１９Ｖ　Ｎ、Ｄ、　６２８　ｎｍ　２Ｘ１０− ’　ＭＣ０２−ｂｉＩ）７）３　（４−０５）ｃ）　Ｒｕ（４，４’ＣＯ２１， ５４Ｖ　−０，８９Ｖ　６５６　ｎｍ　１ｘｉｏ−１ｏ　Ｍ−Ｅｔ−ｂｉ　ｐｙ ）　３　（２，０１）８）　０Ｂ（ｂｉｐｙ）２１−８２　Ｖ　−０，９９Ｖ　 ５８５　ｎｍ　ＩＸｌｏ−８Ｍ（Ｃ○ＸＰｙ） ｆ）○５（ＤＰＰｅｎｅ）　ｉ、６Ｑ　Ｖ　Ｎ、Ｄ、　６５０　ｎｍ　６＞＜１ Ｑ−８Ｍ（ｂｐｙＸｂｐｙｏｘａｌ）　（１０−８）１（Ｎ／Ｓ）はシグナルを 与えられた濃度に於ける化合物のＥＣＬ出力（ルミネセンスのカウント数）とし て定義し、ノイズを化合物が溶解している緩衝液自体のレミネセンスのカウント と定義した際のシグナル対ノイズの割合である。
ｐＨ４，２で測定したその池の化合物の三〇Ｌと異なハ化合物Ｃ）は生理学的な Ｐ［′（７に於いてもがなシのＥＣＬを示す。
！Ｌ）トリス（２，ｚ−ビぎリジン）ルテニウム２＋ｂ）ト、リス（４、４’− カルボン酸−２，２′−ビピリジン）ルテニウム計 ｃ）　）リス（４、４’−カルボエトキシ−２，２′−ビピリジン）ルテニウム ２＋ ａ）　二塩化ビス（２、２’−ビピリジン）〔テオフィリン−８−酪酸−４−（ ４−メチル−２，２′−ビピリジン）　−４’　−ｙｌ　）−ブチル）アミド〕 ルテニウム（ＩＩ） ｅ）ジヘキサフルオロリン酸〔♂スー（２，２’−ビピリジン）（モノカルボニ ジ）ピリジル〕オスミクム（Ｉｆ） ｆ）二塩化（２，ｚ−ビピリジン〔シス−ビス（１゜２−ジフェニルホスフィン ）エチレン：！（２−Ｃ５−Ｃ４−メチル−２，７−ピピリジンー４′−イル） プロピル）−１，５−ジオキソラン）オスミウム（Ｉ［） 実施例６９−ビス（２、２’−ビピリジン）　（４−（４’−メチル−２，７− ビピリジン）ブチルアミン〕ルテニウム（ＩＩ）二過塩素酸 Ｃ２９ｊ！　（２，４８ｍ　ｍｏｌ）の二塩化ビス−（２，ｚ−ぎりシン）ルテ ニウム（ＩＩ）二水和物（Ｓｔｒｅｍ　）及び０．７１９１！　（２，９８ｍ　 ｍｏｌ　）の４−（４−（１−アミノブチル）〕〕４−メチルー２，２′−ビビ リシン実施例３２で記載されている）を５（Ｊｄの５０１５０工タノール／Ｈ２ ０に懸濁し、アルザン存在下で６時間還留水で、続いて０．２５　Ｍ　ＮＥＬＣ Ｊで溶出した。最後に０−４　Ｍ　Ｎａ　Ｃ２で溶出させた。本生成物を含むフ ラクションを約１００ｍ７！まで濃縮し、この溶液か濁るまで過塩素酸を加えた 。−晩冷蔵し、本生成物の赤橙色結晶（１，２１５ｇ）ｔ−得た。元素分析の結 果構造は以下の様に確認され九二 実施例７０−テオフィリン−８−（！ｔ、３−ジメチル）酪酸の製法 ５．６−ジアミノ、　Ｎ１．　Ｎ３−ジメチルウラフル水和物（１０１，０，０ ５９ｍｏ１）及び３．３−ジメチルグルタミン酸無水物（１２，６ｇ、８．８５ 　ｘ　１Ｑ−”ｍｏｘ　）ｆ：１００ｍｊ！Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンに溶かし 、Ｄｅａｎ　−５ｔａｒｋ　）ラップを使って還流した。°こ”の反応の内容物 は加熱後可溶化し、橙赤色に変化した。４時間の還流後、１１＋ｌｔの水がこの トラップ中に集まった。
これはこの反応の完了を示している。この反応物を室温まで冷却した。この時、 全体が固まっていた。この固体をｆｒｉｔｔａｄ　ｆｕｎｎｅｌ上で濾過し、色 が淡黄色になるまで洗った。ＤＭＦから２回再結晶させ゛た後、中間生成物であ るラクタムの純粋な白色結晶（融点２８３．１−２８４．９°Ｃ）を得た。この ラクタムを水の中で８時間煮沸し九。冷却するとこの溶液から純粋な白色の結晶 （融点２１Ｂ−２２０°Ｇ）が生じた。プロトンＮＭＲと元素分析から以下の構 造が確認された：実施例７１−ビスー（２，７−ビぎリジン）〔テオフィリン− ８−（３，３−ジメチル酪酸−（４−（４−メチル−２，２′−ビビリシノー４ ′−１１）−ブチル）ア１００■（０−５４ｍ　ｍｏｂ　）のテオフィリン−８ −（６，６−ジメチル）酪酸及びｏ、ｓ　２５　ｇ（Ｉ’Ｊ−５４ｍ　ｍｏｌ） の二過塩素酸ビス（２、２’−ピリジン）　（４−（４’−メチル−２，２′− ビピリジン）ブチルアミンルテニウム（ＩＩ）ｔ　Ｏ−５５１１１（１−７ｍ　 ｍｏｎ　）のシンクロヘキシルカルボジイミドと共に１ｏｒｒｔｖｆｉ４水ぎり ジンに溶かし九。２日間攪拌して反応させた。多量のゾククロヘキシル尿素の沈 殿を濾過によシ除去昧真空状態でこのピリジン溶液を濃縮した。この残留物をメ タノールに溶かし、５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２０の夕ｏマドグラフにかけた。
目的とするフラクションを濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させ、橙色の沈殿物 を得た。
元素分析とプロ）　７　ＮＭＨの結果、構造は以下のとおシである： 実施例７２−テオフィリン−８−プロピル（４−メチ＃−２，２’−ビぎリジン −４′−ブチル）カルボン酸アミｒの製法 ６１．８ｍ９　（１，５５Ｘ　１Ｑ−’　ｍｏｂ　）の８−（ガンマ−アミノゾ ロビル）テオフィリンフタル酸ヒドラジド塩をｉ　ｍｌの水に溶かし、ＨＣＪで 酸性にした。沈殿させたフタル酸のヒドラシトを濾過によシ除去し、水溶性の濾 液を蒸発乾固し、真空中、で乾燥させて３４．５１Ｆ−９（１，３１Ｘ１０−’ ｍｏｌ）のテオフィリン−８−プロピルアミン塩酸塩を得た。この物質ｆ　５　 ｒｕｇの無水ピリジンに溶かし、６６−９ｍ９　（１−４４ｘ　１Ｑ−’　ｍｏ ｌ）の４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４’　−ｙｌ）酪酸と２６． ４ｍ９　（２，６２Ｘ　１０−４　ｍｏｌ　）のトリエチルアミンをこれに加え た。最後に２９．７ダ（１，４４ｘ１０−’　ｍｏｌ）のジシクロへキシルカル ボシイミドをこの溶液に加えた。得られた濁った溶液を一晩攪拌した沈殿した塩 とジシクロヘキシル尿素を濾過によシ除去し、この溶液を蒸発乾固させて白色固 体全得、これを溶出剤として５チのメタノールを含むジクロロメタンを用いたア ルミナのクロマトグラフにかけた。生成物は白色粉末（融点２１５°−２１６， ５°Ｃ）として４４、？９（７１チ）得られた。ノコトン前及び元素分析によシ 以下の構造が確かめられた：○ｊ１０．２９　；　ＣＪ、　、　６．５２　：実 測；　ｃ、　５３．３０　；　Ｈ，５，２２；Ｎ　１Ａ−ＦＡ　：　ｎ　１ｎ− ＡＭ　ＴｂｒｉＬ’９　−　Ａ−ＱＦ−実施例７３−二塩化ビス−（２，ｚ−ビ ピリジン）〔テオフィリン−８−プロピル（４−メチル−２，２′−ビピリジン −４′−ブチル）カルボンアミド〕ルテニウム（Ｉ［）の製法 １００ｑ＜　２−０６　Ｘ　１Ｑ−’　ｍｏｌ　）の二塩化ビス（２゜２−ピぎ リジン）ルテニウム（Ｓｔｒｅｍ　）及び１０８■（２，２７ｘ　ｉ　（ｊ’　 ｍｏｂ　）のテオフィリン−８−プロピル（４−メチル−２，２′−ビピリジ／ −４′−ブチル）カルボンイミドをアルゴンで脱気した５０％エタノ−Ｉノに加 えた。この溶液ヲ加熱還流した。得られたチェリーレッドの溶：ｆｉｆ室温で’ ＦＴｒｎ空で濃縮した。この残留物を溶出剤にメタノールを用いて５ｅｐｈａｃ ｔｅｘ　ＬＨ−２０（７５ｃｍＸ　１９１１１　Ｉ−Ｄ−）でクロマトグラフし た。
生成物のパンＰを分離し、溶媒をとばして、無水エーテル中に入れ沈殿させた。
本生置物９収旦、ま１５６■（７５％）であった。元素分析の結果、本生成物中 には４モルのメタノールが存在している事が示された。
分析締果：計算上；　ｃ、　５４．０９　；　Ｈ，５，６５；　Ｎ、１４．１６ 　；八ｍ　＋４・ｏｏ　ｊ　”Ｊａ　ＩＬＩ−０：１）ｊＸ　Ｌ戸しＬｓＯ・γ ＤＱ実施例７４−二過塩素酸ビス（２，７−ビぎリジン）〔１−プロモー４−　 （４’−メチル−２，ご−ビぎリジン−４−ｙｌ　）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ ）の製法実施例６１で調製された配位子１−プロモー４−（４′−メチル−２， ２′−一ビリジン−４−ｙｌ　）ブタンｅ　Ｏ，２９、ｆｉ’及び二塩化ビス（ ２，７−ビぎリジン）ルテニウＡ（ｉｎを０．Ｉ１２　ｇ、６０ｍの１：１ンｖ エタノール／水の入ったフラスコに入れた。この溶液を窒素で１５分間脱気した 。反応は窒素中で６．５時間加熱還流して行なった。ＮａＣｌＯ２の飽和水溶液 を冷却したこの赤色溶液に加えた。真空下で溶媒を除き、深赤色の残留物を溶離 剤としてアセトニトリル／トルエン１：１　ｖ７ｖを用いたアルミナのカラムク ロマト（２０αＸ２、５　ｃｍ　、　Ｍｅｒｃｋ　、天然活性３）Ｋかけた。本 生成物バカラムよシ暗赤色のバンド（バンド≠２）として溶出した。目的とする フラクションを集め、約１Ｑｍｌのジクロロメタンに再び溶かし、無水エチルエ ーテル：シ沈殿させ、最後に真空下で乾燥させて３２０■（５６％）の収量の本 生成物を得た。本生成物の構造は元素分析とスペクトル特性によシ確認され、以 下に示す。
実施例７５−二過塩素酸ビス（２，７−ビぎリジン）〔テオフィリン−９−（４ −（４−メチル−２，２′♂ピリジン−４′−１１）ブタン〕ルテニウム（Ｉの 製法テオフィリンＯ銀塩はテオフィリンのアンモニア溶液（２５ｔｎｌ　ｃｏｎ ｅ、　ＮＨ４ＯＨ及び７５ゴの水中ＩＱ２．１６８Ｎ）と硝酸銀のアンモニア溶 液（ｉ　Ｑ　ｒｎｌ　ｃｏｎｅ、　郊４０Ｈ及び５　Ｑ　ｄ　）Ｉ２０中に２． ００６ｇ）’を共に混合し、暗い状態で反応させる事によシ調製した。この２つ の溶液を混合させた直後、白色の生式物が出現した。生成物の沈殿が完了したら 、この沈殿物Ｉ６０ゴｍ６ａｉｕｍ　ｇ１ａａｓｆｒｉｔ上で濾過する事によシ 集めた。この沈殿物を希アンモニア水で洗浄し、真空下で乾燥させた。テオフィ リンの銀塩の構造は元素分析によシ確認した。
４１■のテオフィリンの銀塩及び１２２ダの二過塩素酸ビス（２、２’−ビｔリ ジン）〔１−プロモー４−（４′−メチル−２，７−ビピリジン−４−７１）ブ タン〕ルテニクム（ＩＩ）ｔ　１５　ｍｌの無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ 　）に溶かし、反応は暗条件で行なった。得られた赤色溶液はアルプンで脱気し 、２４時間加熱還流し、次に室温までアル♂ン存在下で冷却した。この溶液の冷 却は氷点まで続け、次にこの黒色の鉄金属懸濁液を濾過し、５ゴのア七トンで洗 浄した。赤色の濾液を０．２＃の過塩素酸ルテニウムで熟達し、Ｌｉ　Ｃｊ’　 ０４を溶解した後この溶液を真空下で蒸発乾固させ、赤色の残留物を暗条件で一 晩真空中に置き乾燥させた。この試料を５−５ｍ１のメタノールに溶かし、０． ２５ｇの無水ＬｉＣＪＯ４’ｉ加え、溶かした。得られた溶液は溶出剤にメタノ −＃ｔ−使用した５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ−２Ｑのカラム（７５ｃｍＸ　１９ｃ ｍ、ｔ、ａ、　）にかけた。主生成物は７ラクシヨン＋２（暗赤色バンド）とし て溶出した。フラクション÷２を濃縮し、メタノールに再び溶かし、エチルエー テルに注いで沈殿させ九。この生成物を真空下で乾燥させ、８０１ｎｇ（５０％ 収率）の物質を得た。
この構造は元素分析と赤外線及び発光スペクトルで確認した。
〒−へ （イ）寸 ト、　・　０ 第１０ （７ｒ′７ス１９Ｇ）　（ＸＩＯ−７）矛３０ テ　キ　７　イ　リ　／　ン１ノ貿二　（ｕｇ／ｍｌ）第４Ａ口 う゛　ヲト　；イｊ　リ　／ン）；−レウし、工。、７ゆ、。
蛍光侮も試状 第４Ｂ口 蛍も俤九試状 第４Ｃ■ デ才　７４シン４じＬ（ｕ９／ｍｌ） ゛　＋　λ５　イ２〉　応　舊ｎ’ｔ＊第４Ｄ口 う゛　牙　フイ　リ　ン　シ老−１内Ｌ　（ｕｑ／ｍ１）栄も４先林伏 ｖ５（！ｌ） ＰＬＣ 第７０ ジコ′キ／ン（ｎｑ／ｍ１） ＤＮＡ　液友　（ｎＭ） 手続補正書（自発） 昭和６３年　２月２ｔ！−日

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．（ｉ）試薬にくり返へし放射線を放射誘起させるのに効果のある適切な 放射線源からの電気化学エネルギーを暴露して試薬にくり返へし電磁放射を誘起 することが可能な、および （ｉｉ）分析物質と試薬が結合するような適切な条件下で接触が効果的に行われ 、目的の分析物質を結合することが可能な、 試薬と試料を接触させること； ｂ．試薬にくり返へし効果的に放射を誘起させる適切な放射線源からの電気化学 エネルギーを生成する試料に暴露し、暴露が試薬にくり返へし電磁放射を誘起す るような条件下で効果的に行われ、および ｃ．放射する電磁波を検出し、その際、試料中の目的の分析物質の存在を検出す る； こと（ａ、ｂおよびｃ）を包含する約１０−３モル濃度以下の試料中に存在する 目的の分析物質を予め測定した多成分系の液体試料において、検出する方法。 ２．段階（ｂ）に先だち、目的の分析物質と結合していない試薬が段階（ａ）に 由来する試料から分離している、請求の範囲第１項記載の方法。 ３．段階（ａ）において試料を試薬と接触させるに先だち、目的の分析物質を固 定化するように試料が処理されている請求の範囲第１項記載の方法。 ４．目的の分析物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、 リピド、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、リポ多糖、糖タン パク質、ペプチド、細胞性代謝物、ホルモン、薬理学的試薬、トランキライザー 、バルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非 生物性高分子、合成有機分子、有機金属分子または無機分子である請求の範囲第 １項記載の方法。 ５．薬理学的試薬がテオフイリンである、請求の範囲第４項記載の方法。 ６．薬理学的試薬がジゴキシンである、請求の範囲第４項記載の方法。 ７．ホルモンがヒト絨毛膜ゴナドトロピンである、請求の範囲第４項記載の方法 。 ８．目的の分析物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、 核酸タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ペプチド、ホルモン 、薬理学的試薬、非生物性高分子、合成有機分子、有機金属分子または無機分子 であり、約１０−１２モル以下の濃度で試料中に存在している、請求の範囲第４ 項記載の方法。 ９．目的の分析物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイドま たは核酸であり、約１０−１５モル以下の濃度で試料中に存在している、請求の 範囲第８項記載の方法。 １０．試薬が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビィロィド、脂質、脂 肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、リポ多糖、糖タンパク質、ペ プチド、細胞性代謝物、トランキライザー、バルビツール酸塩、アルカロイド、 ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物性高分子、合成有機分子、有機金 属分子、無機分子、ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンに結合してい るエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種からなる、請求の範囲第１項記載 の方法。 １１．試薬が抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンドまたは酵素、またはビオチ ン、アビジンまたはストレプトアビジンに結合しているエレクトロ化学ルミネセ ンスを発する化学種からなる、請求の範囲第１項記載の方法。 １２．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が金属がルテニウム、オスミ ウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデンおよび テクネチウムの群から選択されている金属含有有機化合物からなる、請求の範囲 第１０または第１１項記載の方法。 １３．金属がルテニウムまたはオスミウムである、請求の範囲第１２項記載の方 法。 １４．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がルブレンまたは９，１０− ジフェニルアントラセンである、請求の範囲第１２項記載の方法。 １５．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス〔（４，４′−カルボ メトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピ リジン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキンランルテニウム（ＩＩ）であ る、請求の範囲第１２項記載の方法。 １６．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテ ニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第１２項記載の方法。 １７．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸〕ルテニウ ム（ＩＩ）である、請求の範囲第１２項記載の方法。 １８．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が（２，２′−ビピリジン） 〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフイノ）エチレン〕｛２−〔３−（４− メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソラ ン｝オスミウム（ＩＩ）である、請求の範囲第１２項記載の方法。 １９．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブチルアミン〕ルテニウム ＩＩである、請求の範囲第１２項記載の方法。 ２０．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）ブタ ン〕ルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第１２項記載の方法。 ２１．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル アミドルテニウム（ＩＩ）ジ過塩素酸塩である、請求の範囲第１２項記載の方法 。 ２２．試料が固体、エマルジョン、サスペンジョン、液体または気体から由来す るものである、請求の範囲第１項記載の方法。 ２３．試料が水、食品、血液、血清、尿、糞、組織、唾液、油、有機溶剤または 空気から由来するものである、請求の範囲第１項記載の方法。 ２４．試料がアセトニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド 、ｎ−メチルビロリジノンまたは第３級ブチルアルコールからなる、請求の範囲 第１項記載の方法。 ２５．試料が付加的に還元剤からなる、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６．試料が付加的に酸化剤からなる、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２７．ａ（ｉ）試薬にくり返へし放射線を放射誘起させるのに効果のある適切な 放射線源から電気化学的エネルギーを暴露して試薬にくり返へし電磁放射を誘起 することが可能な、および （ｉｉ）目的の分析物質と試料中には通常存在しない相補的な物質上の結合部位 を競い、相補的な物質に関しては、目的の分析物質と試薬が相補的な物質に競合 的に結合するような適切な条件下で効果的に接触することが可能な、 試料を試薬と接触すること； ｂ．試薬にくり返へし効果的に放射を誘起させる適切な放射線源からの電気化学 エネルギーを生成する試料に暴落し、暴露が試薬にくり返へし電磁放射を誘起す るような条件下で効果的に行われる；および ｃ．放射する電磁波を検出し、その際、試料中の目的の分析物質の存在を検出す る； こと（ａ、ｂおよびｃ）を包含する約１０−３モル濃度以下の、試料中に存在す る液体試料中の目的の分析物質を、多成分の予め測定した量において、検出する 方法。 ２８．目的の分析物質がテオフイリン、ジゴキシン、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン である、請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．試薬がエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的の分析 物質である、請求の範囲第２７項記載の方法。 ３０．試薬がエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的の分析 物質の類似体である、請求の範囲第２７項記載の方法。 ３１．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス〔（４，４′−カルボ メトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピ リジン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）であ る、請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３２．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス〔（２，２′−ビピリ ジン）〔４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ル テニウム（ＩＩ）である請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３３．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸〕ルテニ ウム（ＩＩ）である、請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３４．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が（２，２′−ビピリジン） 〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフイノ）エチレン｛２−〔３−（４−メ チル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン ｝オスミウム（ＩＩ）である、請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３５．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブチルアミン〕ルテニウム （ＩＩ）である、請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３６．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）ブタ ン〕ルテニウム（ＩＩ）である請求の範囲第２９または第３０項記載の方法。 ３７．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル アミドルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第２９または第３０項記載の方法 。 ３８．相補的な物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、 脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、糖脂質、糖タンパク 質、ペプチド、細胞性代謝物、ホルモン、薬理学的試薬、トランキライザー、バ ルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物 性高分子、合成有機分子、有機金属分子または無機分子である、請求の範囲第２ ７項記載の方法。 ３９．ａ（ｉ）試薬にくり返へし効果的に放射誘起させるのに効果のある適切な 放射線源からの電気化学エネルギーを暴露して試薬にくり返へし電磁放射を誘起 することが可能な、および （ｉｉ）分析物質と試薬が結合するような適切な条件下で接触が効果的に行われ 、目的の分析物質と結合することが可能な、 試料を既知量の試薬と接触させること；ｂ試薬にくり返へし効果的に放射誘起さ せる適切な放射線源からの電気化学エネルギーを生成する試料に暴露し、暴露が 試薬にくり返へし電磁放射を誘起するような条件で行われ；および ｃ放射線量を定量的に測定し、その際、試料中に存在する目的の分析物質の量を 定量的に測定する； こと（ａ、ｂおよびｃ）を包含する試料中に存在する目的の分析物質の量を多成 分系の液体試料の予め測定した量において定量的に測定する方法。 ４０．段階（ｂ）に先だち、目的の分析物質と結合していない試薬が段階（ａ） に由来する試料から分離している、請求の範囲第３９項記載の方法。 ４１．段階む（ａ）において試薬と試料を接触させる以前に、目的の分析物質を 固定化するように試料が処理されている、請求の範囲第３９項記載の方法。 ４２．目的の分析物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド 、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、リポポリサツカロ イド、糖タンパク質、ペプチド、細胞性代謝物、ホルモン、薬理学的試薬、トラ ンキライザー、バルビタール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミ ノ酸、糖、非生物性高分子、合成有機分子、有機金属分子または無機分子である 、請求の範囲第３９項記載の方法。 ４３．薬理学的試薬がテオフイリンである、請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４．薬理学的試薬がジゴキシンである、請求の範囲第４２項記載の方法。 ４５．ホルモンがヒト絨毛膜ゴナドトロピンである、請求の範囲第４２項記載の 方法。 ４６．試薬が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、リピド、 脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ペ プチド、細胞性代謝物、ホルモン、薬理学的試薬、トランキライザー、バルビツ ール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物性高分 子、合成有機分子、有機金属分子あるいは無機分子に結合したエレクトロ化学ル ミネセンスを発する化学種からなる請求の範囲第３９項記載の方法。 ４７．試薬が抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンドまたは酵素、またはビオチ ン・アビジンまたはストレプタビイジンに結合したエレクトロ化学ルミネセンス を発する化学種からなる、請求の範囲第４６項記載の方法。 ４８．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が金属がルテニウム、オスミ ウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、パラジウム、モリブデンおよび テクネチウムの群から選択されている金属含有有機化合物からなる、請求の範囲 第４６項記載の方法。 ４９．金属がルテニウムまたはオスミウムである、請求の範囲第４８項記載の方 法。 ５０．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がルブレンまたは９，１０− ジフェニルアントラセンである、請求の範囲第４６項記載の方法。 ５１．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス〔（４，４′−カルボ メトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビー ピリジン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）で ある、請求の範囲第４６項記載の方法。 ５２．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテ ニウム（ＩＩ）である請求の範囲第４６項記載の方法。 ５３．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸〕ルテニウ ム（ＩＩ）である、請求の範囲第４６項記載の方法。 ５４．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が（２，２′−ビピリジン） 〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフイノ）エチレン〕｛２−〔３−（４− メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキンラ ン｝オスミウム（ＩＩ）である、請求の範囲第４６項記載の方法。 ５５．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブチルアミン〕ルテニウム （ＩＩ）である、請求の範囲第４４項記載の方法。 ５６．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４−イル）ブタ ン〕ルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第４４項記載の方法。 ５７．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル アミドルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第４４項記載の方法。 ５８．試料が固体、エマルジョン、サスペンジョン、液体または気体から由来す るものである、請求の範囲第３９項記載の方法。 ５９．試料が水、食品、血液、血清、尿、糞、組織、唾液、油、有機溶剤または 空気から由来するものである、請求の範囲第３９項記載の方法。 ６０．試料がアセトニトリル、ジメチルスルホキサイド、ジメチルホルムアミド 、ｎ−メチルピロリジノンまたは第三級ブチルアルコールからなる、請求の範囲 第３９項記載の方法。 ６１．試料が附加的に還元剤からなる、請求の範囲第６０項記載の方法。 ６２．試料が附加的に酸化剤からなる、請求の範囲第６０項記載の方法。 ６３．ａ（ｉ）試薬にくり返へし放射線を放射誘起させるのに効果のある適切な 放射線源から電気化学エネルギーを暴露して試薬にくり返へし電磁放射を誘起す ることが可能な、および （ｉｉ）目的の分析物質と試料中には通常存在しない相補的な物質上の結合部位 を競い、相補的な物質に関しては、目的の分析物質と試薬が一定量の相補的な物 質に競合的に結合するような適切な条件下で効果的に接触することが可能な、 一定量の試薬と試料を接触すること； ｂ試薬にくり返えし放射誘起させる効果のある適切な放射線源からの電気化学エ ネルギーを生成する試料に暴露し、暴露が試薬にくり返えし電磁放射を誘起する ような適切な条件で行われ；および ｃ放射線量を定量的に測定し、その際、試料中に存在する目的の分析物質の量を 測定する；こと（ａ、ｂおよびｃ）を包含する目的の分析物質の量を多成分系の 液体試料の予め測定された量において、定量的に測定する方法。 ６４．目的の分析物質がテオフイリン、ジゴキシンまたはヒト絨毛膜ゴナドトロ ピンである、請求の範囲第６３項記載の方法。 ６５．試薬がエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的の分析 物質である、請求の範囲第６３項記載の方法。 ６６．試薬がエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的の分析 物質の類似体である、請求の範囲第６３項記載の方法。 ６７．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス〔４，４′−カルボメ トキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリ ジン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）である 、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法。 ６８．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテ ニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法。 ６９．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−酪酸〕ルテニ ウム（ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法。 ７０．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種が（２，２′−ビピリジン） 〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフイノ）エチレン〕｛２−〔３−（４− メチルー２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソラ ン｝オスミウム（ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法。 ７１．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種かビス（２，２′−ビピリジ ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブチルアミン〕ルテニウム （ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法。 ７２．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）｛マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチ ルアミドルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方 法。 ７３．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がビス（２，２′−ビピリジ ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル アミドルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第６５または第６６項記載の方法 。 ７４．相補的な物質が全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイド、 脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タンパク質、リボタンパク質、リポ多糖、糖タンパ ク質、ペプチド、細胞性代謝物、ホルモン、薬理学的試薬、トランキライザー・ バルビツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生 物性高分子、合成有機分子、有機金属分子または無機分子である、請求の範囲第 ５７項記載の方法。 ７５．ａ．単独支持体に固定された多数の抗体と試料を接触し、各抗体は固定化 された抗体と目的の分析物質との間でコンプレクスを形成するような異った目的 の分析物質とコンブレタスを形成することが可能である； ｂ．試料から固定化された抗体を除去する；ｃ．結合していない分析物質を除去 するよう固定化された抗体を処理する； ｄ．固定化された抗体コンブレタス、目的の分析物質および標識抗体との間で一 種の結合物を形成するように、固定化抗体と目的の分析物質と間でコンプレクス 形成可能な標識抗体とコンブレタスを接触させること； ｅ．標識抗体の存在およびその際目的の分析物質も検出すること； を包含する単一液体食品中または均一食品試料中の異なった目的の分析物質の存 在を検出する方法。 ７６．目的の分析物質が微生物である、請求の範囲第７５項記載の方法。 ７７．微生物がバクテリアである請求の範囲第７６項記載の方法。 ７８．目的の分析物質が抗体である、請求の範囲第７５項記載の方法。 ７９．抗原がエンテロトキシンである、請求の範囲第７８項記載の方法。 ８０．抗原がアフラトキシンである、請求の範囲第７８項記載の方法。 ８１．標識抗体がそれぞれ同一の検出マーカーで標識されている請求の範囲第７ ５項記載の方法。 ８２．検出マーカーが酵素結合体、螢光体または化学ルミネスセンス体である、 請求の範囲第８１項記載の方法。 ８３．検出マーカーがエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種に効果的に放 射誘起させる適切な線源からの電気化学的エネルギーに暴露してくり返へし電磁 放射を誘起することが可能なエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種である 、請求の範囲第８１項記載の方法。 ８４．エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種がルテニウムまたはオスミウ ムからなる、請求の範囲第８４項記載の方法。 ８５．固定化された抗体が単一のニトロセルロース膜上に固定化されている、請 求の範囲第８３項記載の方法。 ８６．試料に浸す表面をもつ下部をもつ診断薬ホルダー、表面に少くとも１枚の 膜がついていて、膜の別の領域に固定化されたエソトロトキシン上に異種抗原決 定基に特異的な多数のモノクローナル抗体がついている； 界面活性剤入り水性緩衝溶液からなる第一洗浄液；酵素に結合し、膜上に固定化 されたモノクローナル抗体が特異的である各エンテトロキシン上の異種抗原決定 基に特異的であるモノクローナル抗体からなる検出溶液； 水性緩衝溶液からなる第二洗浄液； 酵素によって生成物に変換される酵素基質からなる溶液； 酵素によって基質の変換によって形成された生成物と反応して肉眼上着色してい る沈殿物を生成する染料からなる溶液； 以上からなる単一試料中の異種エンテロトキシンを検出するキット。 ８７．膜がニトロセルロースで、抗原決定基がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエ ントロトキシン上である、請求の範囲第８６項記載のキット。 ８８．ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＡ、Ｂ、ＤおよびＥに特 異的な４種のモノクローナル抗体がニトロセルロース膜に付着している、請求の 範囲第８７項記載のキット。 ８９．モノクローナル抗体が１種以上のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロ トキシン上の抗原決定基に特異的で、ニトロセルロース膜に付着している、請求 の範囲第８８項記載のキット。 ９０．モノクローナル抗体がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＣ １、Ｃ２およびＣ３上の抗原決定基に特異的である、請求の範囲第８９項記載の キット。 ９１．酵素がアルカリホスフアターゼで、基質が５−ブロモ、４−クロロインド リルホスヘイトで、染料がニトロブルー・テトラゾリウムである、請求の範囲第 ９０項記載のキット。 ９２．ａ．試料を単一リアクターの成育ゾーンに入れ、リアクターには固定化ゾ ーンと成育ゾーンを供へている； ｂ多数の試料中に微生物が存在するように成育ゾーンで試料を処理する； ｃ試料中に存在する微生物が固定化されるように、試料を固定化ゾーンに移す； ｄ固定化した微生物を別々に回収する；ｅ抗体と微生物の間でコンプレクスが形 成するように、微生物に特異的な標識抗体で固定化微生物を処理する； ｆ標識抗体を含むコンプレクスの存在およびその際微生物も検出する； こと（ａ〜ｆ）を包含する試料中の微生物の存在を検出する方法。 ９３．標識抗体が検出可能マーカーで標識されている、請求の範囲第９２項記載 の方法。 ９４．検出可能マーカが抗体に結合した検出可能な酵素、螢光体または化学ルミ ネセンス体である、請求の範囲第９３項記載の方法。 ９５．検出可能マーカが抗体に結合したエレクトロ化学ルミネセンス体である、 請求の範囲第９３項記載の方法。 ９６．エレクトロ化学ルミネセンス体がルテニウムまたはオスミウムを含有して いる、請求の範囲第９３項記載の方法。 ９７．試料が水または食品である、請求の範囲第９２項記載の方法。 ９８．微生物が大腸菌群である、請求の範囲第９２項記載の方法。 ９９．微生物が成育するように微生物を含有する試料を処理する成育帯と微生物 を固定化する固定化帯からなる単一リアクター。 １００．固定化帯と同様に、成育帯と膜被覆バイアルキヤップ、成育培地を含有 するプラスチックバイアルからなる請求の範囲第９９項記載のリアクター。 １０１．膜が微生物に特異的な抗体で被覆されている、請求の範囲第９９項記載 のリアクター。 １０２．膜がポリスチレン、ニトロセルロースまたはナイロンである、請求の範 囲第９９項記載のリアクター。 １０３．ａ非選択的ラクトース培地をふくむ少くとも１ケのバイアル； ｂ少くとも１ケのダーラムバイアル； ｃポリスチレン挿入口を備へた少くとも１ケのバイアルキヤップ； ｄウシ血清アルブミン溶液； ｅ抗大腸菌モノクローナル抗体−酵素結合体；ｆ水緩衝溶液；および ｇ酵素基質溶液； からなる試料水溶液中において大腸菌群を検出するキット。 １０４．抗大腸菌群モノクローナル抗体に結合した酵素がウシ小腸アルカリホス フアターゼで、酵素基質がｐ−ニトロフェニルホスヘイトジナトリウムである、 請求の範囲第１０３項記載のキット。 １０５．ｎが整数である下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １０６．ｎが２である、請求の範囲第１０５項記載の化合物。 １０７．ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １０８．ｎが２である、請求の範囲第１０７項記載の化合物。 １０９．ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１０．ｎが２である、請求の範囲第１０９項の化合物。 １１１．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１２．ｎが２である請求の範囲第１１１項記載の方法。 １１３．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１４．ｎが２である、請求の範囲第１１３項記載の方法。 １１５．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１６．ｎが１である、請求の範囲第１１５項記載の方法。 １１７．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １１８．ｎが３である、請求の範囲第１１７項記載の方法。 １１９．ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２０．ｎが整数である請求の範囲第１１９項記載の化合物。 １２１．ｍおよびｎがそれぞれ同一または異る整数である下の式の構造の化合物 。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２２．ｍとｎの両者が３である、請求の範囲第１２１項記載の方法。 １２３．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２４．ｎが２である、請求の範囲第１２３項記載の方法。 １２５．下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２６．Ｒが陰イオンで、ｎが整数である、下の式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２７．ｎが整数である、請求の範囲第１２２項記載の方法。 １２８．Ｒが陰イオンで、ｍとｎがそれぞれが同一または異る整数である、下の 式の構造の化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １２９．ｍが５で、ｎが３である請求の範囲第１２８項記載の方法。 １３０．Ｘが同一または異なった１ケまたはそれ以上のヌクレオタイド、同一ま たは異った１ケまたはそれ以上のアミノ酸、抗体、問題の分析物質または問題の 分析物質の類似体を示し Ｙが少くとも１ケの炭素原子を有するリンカーグループを示し、ＸおよびＹに結 合している、およびＺは請求の範囲第１１１、第１１３、第１１５、第１１７、 第１２３、第１２６または第１２８項記載の方法の化合物を示している下の構造 Ｘ−Ｙ−Ｚの構造の合成物。 Ｘ−Ｙ−Ｚ １３１．Ｘがテオフイリンである請求の範囲第１３０項記載の合成物。 １３２．ｘがジゴキシグニンである、請求の範囲第１３０項記載の合成物。 １３３Ｘがヒト絨毛膜ゴナドトロピン由来のペプチドである、請求の範囲第１３ ０項記載の合成物。 １３４Ｘが同一または異った１ケまたはそれ以上のヌクレオタイドを示し Ｚがエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種を示し ｎが１または１より大きい整数を示し、およびｍが１または１より大きい整数を 示している下の式の構造の合成物。 Ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｚ１ ３５．Ｘが第５位の炭素原子のＣＨに結合しているチミジンで、ｎが７でｍが３ である、請求の範囲第１３４項記載の合成物。 １３６．Ｚがビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−アル）−４′ メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）である、請求の範囲第１３ ５項記載の合成物。 １３７．チミジンヌクレオタイドが下の式のヌクレオタイドシーケンスに結合し た３′末端ヌクレオタイドである、請求の範囲第１３６項記載の合成物。 【配列があります】 １３８．Ｔがテオフイリンを示し、 ＹがＴとＺに結合したリンカーグループを示し、ｎが１または１より大きい整数 を示し、および、 ｍが１または１より大きい整数を示している、下の式の構造の合成物。 〔Ｔ−Ｙ−Ｚ〕２＋（Ｒ）２ １３９．ＹがＴの第８位の炭素に結合している、請求の範囲第１３８項記載の合 成物。 １４０．Ｙが下の式の構造で、ｍおよびｎが同一または異なる、１または１より 大きい整数でを示す請求の範囲第１３９項記載の合成物。 （ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ１４１．ｍが３で、ｎが４である請求 の範囲第１４０項記載の合成物。 １４２．ｍおよびｎが両者３である、請求の範囲第１４０項記載の合成物。 １４３．Ｙが下の式の構造をもち、ｍ、ｎおよびｒが同一または異なる、１また は１より大きい整数を示す、請求の範囲第１３９項記載の合成物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １４４．ｍが１、ｎが１であり、ｒが４である請求の範囲第１４３項記載の合成 物。 １４５．Ｙが下の式の構造をもち、ｍ、ｎおよびｒが同一または異なる、１また は１より大きい整数である、請求の範囲第１３９項記載の合成物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １４６．ｍが１、ｎが１であり、ｒが４である、請求の範囲第１４５項記載の合 成物。 １４７．ＹがＴの７位のちっ素に結合している、請求の範囲第１３８項記載の合 成物。 １４８．Ｙが下の式の構造をもち、ｎが１または１より大きい整数である請求の 範囲第１４７項記載の化合物。 （ＣＨ２）ｎ １４９．ｎが４である請求の範囲第１４８項記載の合成物。 １５０．Ｙがリンカーアームである下の式の構造である化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １５１．Ｙが下の式の構造をもち、ｍおよびｎが同一または異なり、１または１ より大きい整数である、請求の範囲第１５０項記載の化合物。 （ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ１５２．ｍが３で、ｎが２である、請 求の範囲第１５１項記載の化合物。 １５３．下の式の構造をもち、ｍおよびｎが同一または異なる整数である化合物 。 ▲数式、化学式、表等があります▼ １５４．ｍおよびｎが共に１である、請求の範囲第１５３項記載の化合物。 １５５．下の式の構造をもち、Ｘが同一またはＺ−Ｘ 異なる１ケまたはそれ以上のアミノ酸を示し少くとも１ケのシステインまたはメ チオニンを含有し、ＺがシステインまたはメチオニンのＳ置換基にマレイミドの 第３または第４位の炭素原子で結合しているビス（２，２′−ビピリジン）マレ イミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミドル テニウム（ＩＩ）である合成物。
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