JPH01500595A - 免疫調節組成物及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫調節組成物及びそれらの使用 ３五凹へ 本出願は、１９８６年６月３０日に提出された特許出願番号第８８０、１３４号 及び１９８６年１０月２９日に提出された特許出願番号第９２４、２８６号の一 部継続出願である、１９８７年２月２０日に提出された特許出願番号第０１７． ３４３号の一部継続出願であり、そしてこれらのすべては、参照によって本明細 書に組込まれている。

免疫学における方法及び組成物に関し、ここで免疫系は、特定の移植抗原及びＴ 細胞に対して活性化又は不活性化され得る。その方法及び組成物は、予防接種、 器官移植、自己免疫疾患、病原感染、及び免疫系を含む他の健康状態の情況を含 む。

発明の背景 を推動物は、広範囲の種類の障害、ウィルス及びウィルス性微生物、たとえば細 菌及び菌類による悪性、遺伝的疾患、悪性及び種々の毒素の効果に対して自身を 保護するために複雑なシステムを発育して来た。そのシステムは、非自己とは異 なるような自己を認識する能力に基すいて進化して来た。

広範囲の種類の防御機構は、食作用、溶菌（たとえば補体介在又はペルホリン介 在の）、キラーＴ細胞、たとえば細胞障害−Ｔ−１７ンバ球、天然のキラー細胞 、抗体依存性細胞障害細胞及び同様のものを含む。種々のタイプの細胞が異なっ た機構を有し、それによって侵入物又は内因性疾患細胞が除去され得る。

免疫防御機構のキイーは、Ｔ−細胞である。Ｔ−細胞は、それらがそれらの天然 の宿主に関連する１又は少数の特異的移植抗原に対する抗原に応答することに制 限されることが見出された。イン　ビトロで、１つのハブロタイブの宿主からの Ｔ−細胞は、異なったハブロタイブの宿主の移植抗原に対する抗原に応答する。

そのＴ−細胞レセプターのレパートリ−はＢ−細胞免疫グロブリンのレパートリ −よりも狭いように思われる。さらに、抗原に直接的に結合するよりもむしろ、 そのＴ−細胞レセプターは、抗原エピトープ及び移植抗原に対する同時結合を必 要とするように思われる。

移植抗原は２種のクラス、すなわちクラスＩおよびクラス■に分割され、ここで クラスＩの抗原は宿主細胞上に比較的遍在し、ところがクラス■の抗原はリンパ 球、マクロファージ及び樹枝状細胞に比較的限定される。異なったＴ−細胞が、 １つの又は他のクラスの移植抗原に対して活性化されるように思われる。主に、 Ｔ−細胞の活性の性質は、移植抗原（Ｔ−細胞はその抗原に対して相補的である ）のクラスと共に変化するであろう。

実際に、Ｔ−細胞クローンは特異的抗原及び特異的移植抗原の対立遺伝子を認識 すると思われる。さらに、抗原の配列における変化は、Ｔ−細胞、抗原及び抗原 を付与する細胞が一緒に培養される場合、その応答の性質に影響を及ぼす。変化 の性質に依存して、すべての３種の可能性、すなわち不変化、増強された刺激又 は減じられた刺激が見出される。

前記の観点から、イン　ビボ及びイン　ビトロで免疫応答を調整することができ ることが実質的な興味の対象であり、ここでその１つが特定の免疫応答の刺激又 は不活性化を提供する。この態様において、特定の出来事に対する自然の応答は 、防御応答を高めるために特定のリンパ球を刺激することによって、又は免疫応 答を減じ又は防ぐために特定のリンパ球を不活性化することによって調節され得 る。防御の源としり全体的なアプローチが達成され得る。

関連文献 Ｔ−細胞の制限及び免疫システムが理解されて来た異常な前進及び速度を示すレ ビュウ文献は、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｔｈｅ　Ｙｅａｒｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ　（１９８６）　２　：　２８〜３Ｂ　；　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ａｎｎ 、Ｒｅｖ−Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８５）　３　：　２３７〜２６１；　５ｈａ ｓｔｒｉなど、、Ｊ、　Ｅｘｐ８Ｍｅｄ。

（１９８６）１６４　：　８８２〜８９６によって示される。また、５ｈａｓｔ ｒ　ｉなど、前記（１９８５）　１６２　：　３３２〜３４５；　Ｕｎａｎｕｅ 及びＡ１１ｅｎ。

５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８７）２３６　：　５５１〜５５７；　Ｇｕｉｌｌｅｔ など、、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）　２３５：　８６５〜８７０（これは、本 出願に記載の研究の一部を開示する）も参照のこと。

ペプチド相同体に関する興味およびＩａ遺伝子生成物間の相互作用、抗原フラグ メント及びＴ−細胞レセプターの理解に関する対象の文献は、口ｅｌｉｓｉ及び Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　［ＪＳＡ（１９８５）８２　：　７０４８〜７０５２　； 　Ｗａｔｔｓなど、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ（１９８５）８２　：　５４８０〜 ５４８４　；　Ｓｃｈｗａｒｔｓなど、。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８５）　１３５　：　２５９７〜２６０７　；　Ｂ ａｂｂｉｔｔなど、。

Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１７　：　３５９〜３６１；　Ｇａｍｍｏｎｄなど 、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）３１９　：　４１３〜４１５；　Ｂａｂｂｉ ｔｔなど、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　（１９８６）８３　：　４５０９〜４５１３　：　Ｗａｔｔｓなど＋Ｉ 　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）３２０　：　１７９〜１８１；　Ｆｉｎｎｅｇａ ｎなど、、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、（１９８６＞１６４　：８９７〜９１０：　 Ｌｅｃｈｌｅｒなど、、Ｊ、　ＢＸＰｏＭｅｄ、　（１９８６Ｈ６３：６７８〜 ６９６；ＡｓｈｗｅｌＮ及びＳｃｈｗａｒｔｚ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３ ２０　：　１７６〜１７９：Ｔｏｗｎｓｅｎｄなど、、Ｃｅ１１（１９８６）４ ４：　９５９〜９６８；Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚなど、。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８４）　１３３　：　２０６７〜２０７４　；　 Ｂｅｒｋａｖｅｒなど０．Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８６）　１３６　：　２４９Ｂ〜２５０３；Ｂａ５ｔ ｉｎなど、、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

（１９８７０６５：１５０８〜１５２３：及び旧ｒａｙａｍａなど８．　Ｎａｔ ｕｒｅ（１９８７）　３２７：　４２６〜４３０に見出される。

（１９８３）１．５７　：　１６１８〜１６３４　；　Ｒａｏなど。、　Ｃｅ１ ｌ　（１９８４）３６：　８８９〜８９５：　Ｂｅｒｋｏｗｅｒなど、、　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８４）１３２　：　１３２０〜１３７８；　Ａｓｔ＋ｗ ｅ１ｍなど０．前記（１９８６）　１３６：　３ｇ９〜３９５：　Ｍｅｎｇｌｅ −Ｇａｗ及びＭｃＤｅｖｉＬｔ、　Ｐｃｏ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 ［ＪＳＡ　（１９８３）８０ニア６２〜７６５；　Ｗｅｒｄｅｌｉｎ、　Ｊ、　 ｌｌ１ｌｌＩＩＵ［１０１，（１９８２０２９：　１ｇ８３〜１８９１：Ｃｈｏ ｉなど、、　５ｃｉｅｎｃｅ＜１９８３）　２２２　：　２Ｂ：Ｊ〜２８６；　 Ｌａｋｅｙなど、。

Ｂｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ−（１９８６）　１６：　７２１〜７２７；　Ｍａ ｒｘ、５ｃｉｅｎｃｅ（１９Ｂ？）２３５　：　８４３〜８４４；　Ｋａｉｓｅ ｒ及びＫｅｚｄｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ、（１９８４）２２３　：　２４９〜２５ ４を挙げることができる。

また、アメリカ特許第４．５９９．２３０号及び第４．４６９．６７７号も参照 のこと。他の興味ある特許として、アメリカ特許第４．４７３．５５５号；第４ ．４７８．８２３号：及び第４．５６５．６９６号を挙げることができる。

発明の要約 １又はそれよりも多くの移植抗原によって制限された、強められた親和性の免疫 系のための隣接性の及び／又は非隣接性のアミノ酸配列を定義されたオリゴペプ チドを含んで成る方法及び組成物が提供される。リンパ系が１又はそれよりも多 くの抗原と接触される場合、免疫応答を調節するために使用され得るオリゴペプ チドが調製される。使用される組成物は、単一のオリゴペプチド又はオリゴペプ チドの混合物を有し、その結果、単一の組成物は、多くのバブロタイブを有する １又はそれよりも多くの細胞系と共に使用され得る。高められた親和性のアミノ 酸配列を定義するだめの方法がまた提供される。

図面の簡単な説明 第１図は、移植抗原のドメインに関連する、外部し七ブタ−及び内部リガンドか ら成る内部相補性の図による説明であ第２図は、関連するペプチドによるＴ−細 胞ハイブリド−マフＢ７．３の活性の阻害の図による説明である。活性は、培地 （ＲＰＭＩ　１６４０）のみ（・−・）における又は２０−（ローロ）もしくは ６０Ｊ＝Ｍ（０−○）でのＰ　１２−２４の存在下における、種々の濃度のＰＩ ３−２６の存在下で測定された。Ａ２０　Ｂ−細胞リンパ腫（５Ｘ１０’個の細 胞／ウェル）が抗原存在性細胞収穫し、そしてＩＬ−２依存性ＣＴＬ−１細胞系 （１０４個の細胞／ウェル）中への〔３Ｈ〕チミジンの導入の後、ＩＬ−２濃度 について検定した。それらの値は、非経験的に行なわれた実験から取られた五目 のサンプルの相加平均を表わす。

第３図は、鶏のオボアルブミン（Ｏｖａ）又はスタフィロコッカス　ヌクレアー ゼ（Ｎａｓｅ）によるＴ−細胞ハイブリド−７７Ｂ７．３の活性の阻害の図によ る説明である。活性は、培値（ＲＰＭＩ　１６４０）のみ（・−・）における又 は３０岸の０ｖａ（Ｐ　３２４−３３６）　（ローロ）もしくは６０−のＮａ５ ｅ　（Ｐ６１−８１）（０−０）における、′種々の濃度のＰＩ３−２６の存在 下で測定された。それらの値は、第１図に説明されたように五目のサンプルの相 加平均を表わす。

第４図は、培地のみ（ローロ）において、インフルエンザ赤血球凝集素Ｐ　１１ １−１２０（ムーム）又はＰＩ３−２６　（０−０）もしくはインフルエンザが 赤血球凝集素部位２　（Ｐ　１２６−１３８）（・−・）（それぞれ５０−での ）の存在において、種々の濃度のオボアルブミン（Ｐ３２４゛−３３６）及びＡ ２０を示す細胞と共に培養される場合、Ｄｏ−１１，１０Ｔ−細胞ハイブリドー マの阻害の図による説明である。与えられたそれらの値は、第１図に説明された ように五目のサンプルの相加平均を表わす。

第５図は、Ｉ−Ｅ’クラス■分子によって制限されたペプチドのアミノ酸配列を 示す。ミオグロビン（Ｐ　１３５−１４７）がＩ−Ｅ’−により制限されたＴ− 細胞クロ二ンによって認識される。スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔｅｐｈ ｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）からのヌクレアーゼ（Ｐ６６−７８）は、 Ｈ−Ｚ″′により制限されたＴ−細胞クローンによって認識される。λリプレッ サーからのｃＩタンパク質（Ｐ　１２−２４）、　Ｉ　−Ｅ　、ｄ配列（６９− ８１＞、　Ｉ　−Ｅ−配列（６９−８１）が存在する。インフルエンザウィルス からの赤血球凝集素は、Ｉ−Ｅ’により制限されたＴ−細胞ハイブリドーマによ って認識される。次にＩ−Ｅ！１’配列（２８−３６＞及びＩ−Ｅ、”配列（２ ８−３６）が存在する。

括弧内の数字は、免疫原又はＩ　ａ　９．３−のいづれかにおけるアミノ酸残基 の位置を表わす。括弧内のＬｅｕは、赤血球凝集素からのペプチド１１１〜１２ ０の最初の位置でのロイシン及びフェニルアラニンが赤血球凝集素−特異性Ｉ− Ｅ’−制限のＴ−細胞クローンの刺激のために対応することを意味する。

下線をほどこされた残基は、抗原とＩ−Ｅ、’タンパク質領域との同一性を示す 。

第６図は、オボアルブミン及びミオグロビンの一部のアミノ酸配列とクラス■抗 原のアミノ酸配列との比較を示す。オボアルブミン（Ｐ　３２６−３３９）は、 ＤＯ−１１，１０によって認識される。Ｉ−Ａ、’配列（４２−５５）。ミオグ ロビン（Ｐ　１０２−１１８）。

括弧内の数字は、天然の分子におけるアミノ酸残基の位置を表わす。

第７図は、Ｉ−Ａ’クラス■分子によって制限された５種のペプチドのアミノ酸 配列、すなわちミオグロビン（Ｐ１０６〜１１ｇ）　；オボアルブミン（Ｐ３２ ３〜３３６）　；λリプレッサーｃｌ（ＰＩ３−２６）；スタフィロコッカス　 アウレウスからのヌクレアーゼ（Ｐ６６−８０）及びブタフサ類のアレルゲン（ Ｐ５４−６５＞を示す。括弧内の数字は免疫系分子内のアミノ酸残基の位置を表 わす。ダッシュは、上記ペプチドに相当する位置での欠失を表わす。

第８図は、Ｉ−ＥＫクラス■分子によって制限された４種のペプチドのアミノ配 列、すなわち蛾シトクロームｃ（ＰＯ２−１０３）；スタフィロコッカス　アウ レウスからのヌクレアーゼ（Ｐ８９−９７）　；λリプレッサーからのｃＩタン パク質（ＰＩ３−２６）及び三ワトリ卵白リゾチーム（Ｐ８８−９６）を示す。

括弧内の数は、免疫原分子内のアミノ酸残基の位置を表わす。

特定の態様の記載 新規オリゴペプチド及びハプテン又は抗原に通常関連するエピトープに対するリ ンパ系の免疫応答を調節することにおけるそれらの使用が提供される。そのオリ ゴペプチドは、エピトープと免疫学的に交差反応する対象の免疫原と比較して、 １又はそれよりも多くの移植抗原のためにより高い親和性を有するように構築さ れている。そのオリゴペプチド配列は、フラグメント又は完全なポリペプチドの 一部として天然に存在するポリペプチド、又は組換技法又は化学合成によって調 製された合成ポリペプチドのフラグメントである。

エピトープに関しては、そのエピトープは、レセプター、特に免疫グロブリン及 びＴ−細胞し七ブタ−による認識の基本要素又は最小の単位であり、ここでその 配列は隣接することができ、又は隣接してなくてもよく、そして前記レセプター の認識に対して不可欠なアミノ酸がその配列において隣接していても良くそして ／又は隣接してなくても良い。

本発明に使用されるポリペプチド試薬は１〜２個の領域を有するであろう。最初 の領域は、目的の移植抗原に対して高められた結合性を提供するアミノ酸配列を 有するオリゴペプチドを含有するであろう。その移植抗原に結合するアミノ酸配 列は“アグレトープ（ａｇｒｅｔｏｐｅ）　”として言及されるであろう。その アグレトープは、１又は限定された数の移植抗原に特異的に結合する認識の単一 の単位である。そのアグレ）−ブは、しばしば分離された個々のアミノ酸残基を 有する、−組のアグレトーブアミノ酸残基によって定義される。そのアグレトー プ性残基間に散在されているアミノ酸は、それら自体によって又は１又はそれよ りも多くのアグレトープ残基と共にエピトープ認識を提供することができる。ア ミノ酸配列は、１又はそれよりも多くの異なった認識の単位を有し、その結果、 オリゴペプチド上に存在するアグレトープに関しては、多くの組のアグレトープ アミノ酸単位が存在し、ここで少ない出来事ではあるが、同じ組でさえ、隣接す るアミノ酸に依存して、その結合親和性において異なることが理解されるべきで ある。アグレトープアミノ酸を分離する散在アミノ酸は、どのＴ−細胞レセプタ ーがアグレトープ含有性オリゴペプチド及び移植抗原の複合体に結合するかに関 して選択される。その散在されたアミノ酸は“エピトープ、′（エピトープ、す なわちそのアミノ酸が多くの認識部位を定義することができる）として言及され るが、しかし本発明の性質の観点から、“第１エピトープとして言及されるであ ろう。エピトープを定義するこの散在された配列は、特定の免疫原に対する免疫 応答を増強するか又は減じるかいずれかに依存して、特定のサブセットのＴ−細 胞を活性化し、又は特定のサブセットのＴ−細胞の活性化を妨げるために選択さ れ得る。アグレトーブ及び第１エピトープを含むオリゴペプチドは、前記第１エ ピトープによって結合された同じＴ−細胞レセプターを結合することができるか 又は結合することができ得ない第２エピトープとして考えられ得る目的の抗体配 列に結合され得る。

しかしながら、目的の移植抗原のためのアグレトープの高められた親和性のおか げで、高められた免疫応答が目的の抗体配列に対して得られるであろう。種々の 組成物を用いることにより上記のようにして変性された、リンパ球システムの免 疫応答は、１又はそれよりも多くの特定の免疫源に不活性化又は活性化されるこ とによって、調節され得る。

調節される免疫応答は、３組の複合体、たとえば移植抗原を有する細胞、前記移 植抗原により制限されるＴ−細胞レセプター及び移植抗原及びＴ−細胞レセプタ ーの組合せに特異的に結合するポリペプチドに基づいて予測される。移植抗原は ２種のクラス、すなわちクラスＩ及びクラス■に分けられ得る。クラスｌは、哺 乳宿主のほとんどの細胞上に遍在し、そして見出され、そして冬型性α−鎮及び 保護されたβ−鎮を有する。対照的に、クラス■の移植抗原は、比較的少ない組 の細胞、主としてリンパ球マクロファージに制限され、そして各型性α−及びβ −鎮を有する。クラスＩの移植抗原の場合、それは、細胞異常又は疾患状態、た とえばウィルス感染、マイコプラズマ感染、新形成又は同様のもの、もしくは器 官移植に主に関係する。関与されるＴ−細胞は通常、異常細胞の破壊を引き起こ すであろう。

対照的に、クラス■の移植抗原は細胞免疫系の活性化に関与し、異常な生理学的 状態に対する宿主の保護に関与される細胞の拡張をもたらす。その異常な生理学 的状態は、病原菌、たとえばウィルス、細菌、菌類、原生生物、毒素又は同様の ものの侵入に関与される。さらに、そのクラス■細胞は、種々の自己免疫疾患、 たとえばリウマチ様関節炎、局部的な円板状紅斑性狼癒、糖尿病、等、並びにク ラスＩの移植抗原に関係する細胞異常又は疾患状態に関与される。

クラスＩの移植抗原はまた、器官移植の拒絶にも関与される。その免疫系は、移 植された器官上に存在する移植抗原の外来性性質を認識することができ、そして その器官を攻撃することができる。この場合、外来性細胞からの宿主の保護は所 望されないが、しかしむしろ、器官移植を攻撃するために特異的である免疫系の サブセットを減じることが所望される。

多くの場合、イン　ビトロでリンパ球応答を調節することにもまた興味が存在す るであろう。これらの情況は、マイコプラズマ又はウィルスにより感染された細 胞を特異的に破壊し、腫瘍性及び正常な細胞の混合物から特定のサブセットの細 胞を除去し、その混合物中に特定のサブセットの細胞を拡張し、種々のリンホカ イン、たとえばＩＬ−２の産生のためにならし培地を提供し、又は同様のことを 含むことができる。

イン　ビトロシステムは、完全な血液、血漿、血清、細胞画分、正常な又は不滅 化された細胞、等を含むことができる。

オリゴペプチドが定義される態様は、移植抗原の配列、各型性領域及び移植抗原 によって制限された免疫原に関係される。移植抗原の配列は、移植抗原によって 制限される抗原の免疫優性配列の間に相同関係を有することによって定義され得 、ここで移植抗原の各型性領域が含まれても良く又は含まれなくても良い。（免 疫優性配列の討論のためには、たとえばＢｅｒｚｏｆｓｋｙ、　（１，９８６） 前記及び本明細書に引用された参考文献を参照のこと）。

移植抗原は、各型性領域を有し、ここで個々の対立遺伝子が特定の宿主に関連し ている。大部分、宿主は二倍体及びペテロ接合性であり、その結果それぞれの宿 主は２種のハブロタイブを有し、ここでそれらは、宿主が特定の遺伝子座でホモ 接合性でない場合、その同じ遺伝子座から特定の移植抗原型の２種の異なったコ ピーが存在するであろうことを意味する。

免疫優性配列の相同関係は、その相同関係の比較を可能にする他のアルゴリズム も使用され得るけれども、ＦＡＳＴＰアルゴリズムを用いて比較することができ る。ＦＡＳＴＰの説明に関しては、Ｌｉｐｍａｌ及びＰｅａｒｓｏｎ、　５ｃｉ ｅｎｃｅ（１９８５）　２２７　：　１４３５〜１４４１を参照のこと。その免 疫優性配列は、所望の相同関係を提供するために、欠失又は挿入の配列における アミノ酸の数に基づいて、約３０％又はそれ以上、及び全体の２０％まで、通常 的１５％よりも多くない相同関係を有すべきである。すなわち、最良の相同関係 を提供するために、まず非保存性置換、次に欠失及び挿入を計算する。所望によ り、相同関係は、保存性置換よりもむしろ同一性を含むであろう。通常、挿入又 は欠失に関与されるアミノ酸は合計２個よりも多くなく、そして挿入又は欠失、 通常欠失において約１個よりも多くないであろう。

次の表は、保存性置換を示し、ここで同じ線上のアミノ酸は、同じ線上の他のア ミノ酸により置換され得る。

アミノ酸 脂肪族 非極性 極性 中性 Ｃ，Ｍ、　Ｓ、　Ｔ Ｎ、　Ｑ 酸性 口、　Ｅ 塩基性 に、　Ｌ、　（ｌ（） 芳香族 Ｆ、　Ｗ、　Ｙ、　（）ｌ） プロリン（Ｐ）は、等価物と思われるが、しかし同じ線上の他のアミノ酸と通常 、置換されないであろう。同様に、ヒスチジン（Ｈ）は同じ線上の他のアミノ酸 により置換され得るが、しかし通常、等価物とは思われないであろう。さらに、 いくらかの場合、酸性、塩基性及び極性のアミノ酸（Ｎ、Ｑ）は、相同関係を決 定することにおいて、１つを他のものと置換することができる。

通常、少なくとも２個の免疫優性配列がアグレトーブのためのコンセンサス配列 の決定に関与し、より普通には３個〜約８個の配列で十分であるべきであり、通 常３〜６個の配列で十分であろう。その免疫優性配列は多くの方法により同定さ れ得る。特に、移植抗原によって制限されたタンパク質は、多くの配列に分離さ れ得、そしてこれらの配列は合成され、そして次にアッセイに使用され得、ここ で特定の移植抗原を含む細胞及び該移植抗原によって制限されそして特定の抗原 に対して特異的なＴ−細胞が混合される。（アッセイのための実験部分を参照の こと。）ＩＬ−２（インターロイキン−２）の分泌のレベルを決定することによ って、免疫優性である配列を決定することができる。いくらかの抗原においては 、１以上の免疫優性配列が存在し得るけれども、普通、単一の免疫優性配列が存 在するであろう。しかしながら、１以上の配列が存在する場合、それらの両配列 は、特定の移植抗原への結合親和性を能率的にするためのコンセンサス配列を定 義することに使用され得る。

普通、７個よりも多くないアグレトーブに関与するアミノ酸、より普通には５個 よりも多くないアグレトーブを定義するアミノ酸、通常少なくとも２個、より普 通には少なくとも３個のアミノ酸が存在するであろう。それらのアミノ酸は、タ ンデムに存在し、又は１〜４個のアミノ酸、普通２〜４個のアミノ酸によって分 離され得る。相同関係、特に同一性、すなわち所望により少なくとも２個のアミ ノ酸の同一性、より所望には少なくとも３個のアミノ酸の同−性及びコンセンサ ス配列の間隔を比較することによって、そのコンセンサス配列の決定のために使 用される、１又はそれよりも多くの、普通すべての抗原よりも移植抗原に関して より高い親和性を有するであろう配列を定義することができる。従って、相同関 係を有するアミノ酸は、タンデムな相同関係が生じるけれども、任意の２種のア ミノ酸の間で、１〜４，４〜８又は６〜１２個のアミノ酸、普通２〜３又は４〜 ９個のアミノ酸だけ離れて存在する。コンセンサス配列が定義された後、アグレ トーブ及び第１エピトープを含む免疫優性領域を定義するために、特定の移植抗 原によって制限されたいづれかの抗原を走査することができる。次に、その配列 に関する情報がリンパ球システムの免疫調節のために使用され得る。

アグレトープ及びエピトープ（オリゴ−ａ−ｅ）を含むオリゴペプチドは通常、 それが結合する移植抗原の多型性領域に存在する配列と異なるであろう。移植抗 原のレセプターに対して内部リガンドとして作用する多型性領域に配列が存在す ることが見出される。従って、この領域は、多くの場合、移植抗原によって制限 された免疫優性領域に対しである相同関係を有するであろう。しかしながら、前 記内部リガンドは、コンセンサス配列といくらかの程度の相同関係を共有するけ れども、通常、コンセンサス配列と相当に異なるであろう。

移植抗原の内部リガンド配列に対して同一の配列を有するオリゴ−ａ−ｅを使用 することによって、Ｔ−細胞応答を実質的に阻害することができる。その効果は 、オリゴ−ａ−ｅが自己として認識されているかのようであり、そして三成分複 合体は形成されず、又は形成される場合、Ｔ−細胞は活性化されない。

多くの抗原が文献に記載されて来た。ここで特定の配列が、特定の病原菌又は毒 素に対する宿主の保護のために抗体の産生に有用なものであるとして記載されて 来た。これらの組成物は、大部分、約５ＫＤよりも短かく、通常的３ＫＤよりも 短かく、その結果、それらは通常ハブテンと思われる。これらの配列は、抗体目 標配列として使用され得、そしてオリゴ−ａ−ｅに連結され得る。その得られた 分子は、新規ポリペプチドを形成するために２種のドメインを有し、ここでそれ ぞれのドメインは全体の分子の約７０％よりも短く、普通オリゴ−ａ−ｅアグレ トーブ含有性ドメインは約３０〜７０％であり、そして抗体目標配列のドメイン は約１０〜６０％である。

大部分、オリゴ−ａ−ｅアグレトーブ含有性ドメインは、約８〜３０個のアミノ 酸、より普通には約８〜２０個のアミノ酸を有し、そして抗体目標配列は約５〜 ２５個のアミノ酸、より普通には約５〜２０個のアミノ酸を有するであろう。

アグレトープ含有性ドメインは、種々の方法で選択され得る。１つは一般的なオ リゴ−ａ−ｅを使用することができ、ここで第１エピトープがまた種々の方法で 選択され得る。第１エピトープが、それと共に使用されるであろう大部分の宿主 における移植多量性領域と同一でないことを確めながら、第１エピトープを任意 に選択することができる。他方、それは、無害性エピトープ、たとえばすでに示 された、破傷風トキソイド、キーホールリンペット（貝類）のヘモシアニン、ウ シγ−グロブリン、ＢＣＧ、ヒトγ−グロブリン又は細胞内在性タンパク質、等 に関連するエピトープ部位を有するように選択される。最後に、それが、抗体目 標配列を使用するるための目的といくらかの関係を共有する対象のエピトープを 有することができ、たとえばその第１エピトープは、抗体目標配列とは異なるが 、但し、抗体目標配列の抗原と同じ抗原、又はその抗原に関連する異なった抗原 上に存在するエピトープであることができる。たとえば、ウィルスの場合、第１ エピトープ及び抗体目標配列は同じか又は異なったカプシドタンパク質、エンベ ロープタンパク質、郷土に存在することができる。特定の抗体目標配列は、病原 性微生物、たとえば細菌及びウィルスの中和性抗体目標配列（エピトープ）を含 む。

免疫優性領域を定義し、そして異種配列（すなわち、それらが正常に連結される 天然の配列以外の配列）に結合されない、本発明に使用されるオリゴペプチドは 、シトクロムＣ１のアミノ酸の反復配列、インフルエンザ赤血球凝集素、天然に 存在する、約２０個よりも少ないアミノ酸のホルモン、たとえばオキシトシン、 ブラジキニン及びアンジオテンシン。

ヘルペス糖タンパク質ｄ、インシュリン、特定のウシインシュリンロー鎖、ネズ ミのミニリン塩基性タンパク質、ブタフサのアレルゲンＲａ３．ヒトＡＣｈレセ プターーＴＶＰＩ口蹄ウィルス、アンジオテンシン２．フィブリノペプチドＢ− １４゜最小刺激性ポリマー、ＨＬＡ、ＣＷ３．　ミニリン塩基性タンパク質、特 定のウサギ及びテンジクネズミ、狂犬病糖タンパク質、インフルエンザマトリッ クスタンパク質、結核菌６５Ｋｄタンパク質又は本出願の有効な提出日の前、調 製された他のジゴペプチドを含まないであろう。

すでに指摘されたように、アグレトープは通常、対象の抗原よりも移植抗原に対 してより強い結合親和性を有し、その結果そのオリゴ−ａ−ｅは、三成分複合体 を形成することにおいて対象の抗原とうまく競争することができる。そのオリゴ −ａ−ｅ配列は、完全な配列の分子又はより大きなペプチドの一部に過ぎないか も知れない。そのオリゴ−ａ−ｅは、第２エピトープに種々の方法で連結され得 る。

イン　ビボ目的に関しては、宿主が暴露される対象の目標抗原が存在するであろ う。たとえば、クローズマツチが器官移植の供与者と受領者との間に作られる場 合、強い免疫応答をもたらすことができる。器官上に存在するわずかな抗原性配 列又はエピトープが存在する。本発明によれば、１つは、宿主による拒絶応答を 減じるために、そのような抗原の免疫優性領域に応答するＴ−細胞を阻害するこ とができる。もう１つの場合、個人が、寄生病が流行している地域に入る場合、 その個人は、細胞及び体液の保護を得るために、その寄生抗原と交差反応する、 １又はそれよりも多くの抗体目標配列を有するオリゴペプチドにより予防接種を 受けるであろう。これらの及び多くの他の情況が本発明によって取り扱われるで あろう。異なった情況のためにオリゴペプチドを調製することにおいては、種々 の方法が使用されるであろう。

１つの組成物は、宿主中に存在する１又はそれよりも多くの移植抗原に対して対 象の抗原の親和性を高めるために、免疫優性部位で突然変異化された対象の抗原 を有するであろう。

特に、Ｂ−細胞及びクラス■移植抗原に関しては、対象の免疫原の種々のエピト ープがリンパ球システムに存在するＢ−１細胞の表面免疫グロブリンに結合し、 それによってその免疫優性配列は移植抗原に結合し、そして特定の免疫優性配列 を認識するＴ−細胞に付与されるであろう。高い結合親和性のために、高められ た免疫応答が達成されるであろう。突然変異化された免疫原を使用することによ って、多くのＢ−細胞が、特定の免疫優性領域を認識するＴ−細胞レセプターを 有するＴ−細胞と一緒に活性化され得る。

他方、突然変異化された領域を単独で使用することができ、それによって特定の Ｔ−細胞と共に免疫優性領域に結合する少々のＢ−細胞のみが活性化されるであ ろう。もう１つの方法は、免疫優性領域が直接的には又は普通約５０個以下のア ミノ酸、より普通には約３０個以下のアミノ酸を有する架橋を通して連結され得 る抗原上に存在する１又はそれよりも多くのエピトープ部位を選択することであ る。この態様においては、単一の融合タンパク質が得られ、ここで免疫優性領域 が１又はそれよりも多くの対象のエピトープ部位に融合される。

融合タンパク質を有するよりもむしろ、対象のペプチドに免疫優性領域を結合す ることによってその免疫優性領域を連結することができる。その結合は、種々の 形を取ることができ、その特定の態様の結合は臨界ではない。従って、オリゴペ プチドの末端又は他の部位で存在すべきシスティンを提供することができ、ここ で対象の抗原がマレイミド基により官能化され得る。システィンにより変性され た免疫優性配列とその官能化された抗原とを組合わせることによって、チオエチ ル結合が得られる。適切ならば、免疫優性配列上に存在するカルボキシル基が、 カルボジイミドを用いて、又は活性エステル、たとえばｐ−ニトロフェニルエス テルを形成して活性化され、ここでオリゴペプチド上に存在するいづれか利用で きるアミノ基がブロックされる。オリゴペプチドと対象の抗原とが反応し、ペプ チド結合を形成した後、そのブロッキング基が除去され得る。Ｆｉｅｓｅｒ及び Ｆｉｅｓｅｒ、　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒＯｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｔ＋ｅｓ ｉｓ　、第３巻、　Ｗｉ　１ｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　−ＮＹ　１１９ ７２により記載されているような他の技法もまた、使用され得る。

免疫優性領域は、オリゴ−ａ−ｅを提供するために、アグレトーブに関してのみ ならず、また第１エピトープに関しても変性され得る。従って、免疫優性領域を 認識するであろうＴ−細胞レセプターを変性することができ、その結果その免疫 優性領域は、１以上のＴ−細胞によって、又は野生型の免疫優性領域を認識する Ｔ−細胞と異なるＴ−細胞によって認識され得る。特に、免疫優性領域が抗体目 標配列に連結される場合、いづれかのＴ−細胞応答を最少にし、又は実質的に免 疫学的非反応性エピトープに対してＴ−細胞応答を提供するために、アグレトー プの変性が所望される。

この情況においては、第１エピトープは、ワクチン、たとえば破傷風トキシド又 は前に記載されたような他の比較的無毒の抗原のエピトープをまねるために変性 され得る。他方、活性化されるＴ−細胞レセプターが存在しない配列にその第１ エピトープを変性することができる。これは、特定のエピトープが結合するため に非相同性のＴ−細胞レセプターを見出す、“レパートリ−におけるホール（ｈ ｏｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）’であると思われる。自己エピ トープをまねるそれらのエピトープは、この特性及び特定のハブロタイブに発見 されるであろう他のエピトープを提供するであろうことが予期される。

所望の結果に依存して、アグレトープの種々の組合せ、すなわち第１エピトープ 及び抗体目標配列が、Ｂ−細胞及び／又はＴ−細胞の特定のサブセットを活性化 又は不活性化するために使用され得る。従って、特定の目的への調節のために、 Ｔ−又はＢ−細胞の単一のサブセット又はＴ−又はＢ−細胞のいづれか又は両者 のサブセットの群を選択的に選択することができる。

たとえば、特定のエピトープに対して特異的なり一細胞の特定のサブセットの不 活性化が所望される場合、２種の領域を有するポリペプチドが調製されるであろ う。１つの領域（すなわち抗体目標配列）は、対象のエピトープをまねるアミノ 酸配列を含むであろう。他の領域は、たとえば、対象の宿主の移植抗原の多量領 域の配列に対して同一の配列を結合するＴ−細胞レセプターを付与しないであろ うオリゴ−ａ−ｅであろう。この場合、その得られたポリペプチドは、活性化を ブロックする条件下で第２エピトープを認識し、モしてＴ−細胞レセプターに付 与されるこれらのＢ−細胞によって結合されるであろう。さらに、その抗体目標 配列は、移植抗原へのエピトープの親和性を最少にするために選択されるであろ う。この場合、Ｔ−細胞は、移植抗原へのポリペプチドの結合により活性化され ず、その結果、そのポリペプチドを認識するこれらのＢ−細胞はＴ−細胞によっ て刺激されないまま残るであろう。Ｂ−細胞のＴ−細胞刺激をブロックしたい場 合、オリゴ−ａ−ｅを非活性化するＴ−細胞が使用され得る。

Ｔ−細胞の特定のサブセットを刺激したい場合、クラス■移植抗原に対して特異 的なアグレトーブを使用することができる。この場合、第１エピトープは、対象 のＴ−細胞の特定のサブセットに向けられるように選択される。この態様におい ては、たとえば悪性条件の場合、自己免疫疾患の場合、又は同様の場合における ように、特定の抗原に向けられるＴ−細胞集団を構築することができる。

Ｂ−及びＴ−細胞の両者を刺激するためには、対象の抗原に対して特異的なエピ トープを有するオリゴ−ａ−ｅを使用することができる。さらに、その同じ又は 関連抗原の他のエピトープに連結されるオリゴ−ａ−ｅを使用することもでき、 その結果多くのＢ−細胞が刺激され、ここでは異なったサブセットのＢ−細胞が 異なったエピトープ部位に対して特異的である。この刺激は多くの異なった情況 に適用されるであろう。さらに、多くのオリゴ−ａ−ｅを有するオリゴペプチド 又はタンパク質を調製することができ、その結果、その同じ分子は多くの移植抗 原に対して効果的であろう。

たとえば、ワクチンの調製においては、特定の病原菌、たとえばウィルス又は細 菌のために異なった菌株のエピトープが提供され、その結果それらの異なった菌 株のすべてを認識するＢ−細胞が、単一の分子によって同時に刺激されるであろ う。多くの生物体、たとえば妊娠女性に対するＴ　ＯＲＣＨシリーズ（トキソプ ラスマ症、風疹、サイトメガロウィルス及び単純ヘルペスウィルス）に対して宿 主を予防接種したい場合、別の分子のエピトープがまた提供され得る。従って、 特に、一連の抗原が関与されるこれらの情況において、その主方法論は、単一の 分子が異なった生物体に関連する多くのエピトープに対する免疫化及び結合され るべき多くの移植抗原を提供することを可能にする。

普通、異なった抗体目標配列の数は、０〜２０、より普通には約０〜１０、便利 には約１〜６の範囲であろう。その抗体目標配列のそれぞれは、少なくとも約５ 個、普通８個のアミノ酸、及び約３０個よりも多くなく、より普通には約２０個 よりも多くないアミノ酸を有するであろう。個々のエピトープの性質に依存して 、エピトープは頭と尾とを連結され得又は約１〜３０個のアミノ酸、普通約１〜 ２０個のアミノ酸の架橋基によって分離され得る。その架橋基は、便利な配列で はあるが、しかし普通、エピトープ配列の正しい結合により干渉を避けるために 、そして宿主に対して有害であるエピトープに所望としない免疫応答の創造を避 けるために選択されるであろう。

本発明の組成物は、単一のポリペプチド又はポリペプチドの混合物、普通ポリペ プチドの混合物である。一般的に、ポリペプチドの数は約２０を越えず、より普 通には約１２を越えず、そして好ましくは約８を越えず、より好ましくは約６を 越えない。その混合物は普通、対象の集団中に最つども頻繁に見出される移植抗 原に向けられるであろう。すなわち、特定の移植抗原は、ある集団群、たとえば 種々の種類、たとえばヒト、他の霊長類、家畜、実験動物９等、たとえば羊。

豚、馬、鳥９等により頻繁に存在する。最っとも一般的な移植抗原、すなわちク ラスＩ又はクラス■のいづれか又は両者に結合するアグレトープを適切に選択す ることによって、関与される異なったポリペプチドの合計数を最少にする機会が 存在する。さらに、多くの場合、異なった移植抗原が、コンセンサス配列におい て特定のアミノ酸を共有することができ、その結果対象の抗原に関するより高く 又は等価の親和性が単一のオリゴ−ａ−ｅ又はコンセンサス配列を有する多くの 移植抗原により達成され得る。

大部分、はとんどの宿主はへテロ接合体であるので、１以上の移植抗原の対立遺 伝子の関与を所望する場合、２種の移植抗原が実質的に類似するコンセンサス配 列を持ないなら、少なくとも２種の異なったコンセンサス配列の分子及びヒトに おいては６種までのコンセンサス配列の分子を有することが所望されるであろう 。

宿主への投与のためには、いづれかの便利な生理学的に許容される媒体中に配合 され得る。これらの媒体は、水９食塩水。

リン酸緩衝溶液、オイルエマルジョン、等を含む。ある場合、錠剤、マイクロカ プセル、たとえば持効性のりボゾーム、ゲル、粉末、沈澱物、たとえばミョウバ ン、又は同様のものとして本発明のペプチドを配合することが所望される。ある 場合は、便利な投与システム、たとえばカテーテル、一定の拡散膜、ポンプ又は 同様のものを用いることによって、宿主中に連続した注入を提供することが所望 される。これらの配合法及び技法は当業界において良く知られている。投与はた とえば血管内、腹膜内、皮下内に注射によって又は局所的に皮内バッチ、等によ って行なわれ得る。

本発明の組成物の量は、特定の目的、投与の方法、宿主の性質、処理の持続期間 、反復処理の頻度、及び同様のものに依存して広く異なるであろう。従って、は とんどの場合、それぞれの組成物に関しては、使用される量は実験的に決定され るであろう。しかしながら、宿主へのオリゴペプチドの投与に関しては、ある一 般的な考慮が行なわれる。オリゴペプチドは一般的に宿主のｋｇ当り約０．Ｏ１ 〜ｌｋの範囲であり、ここで濃度は一般的に約１０Ｒ／−〜１■／−の範囲であ ろう。

他の添加物、たとえば安定剤、抗生物質、賦形剤、アジユバント、吸着のための 沈澱物、持効性添加物、等が配合物に含まれ得る。

本発明のポリペプチドは便利な手段によって調製され得る。

普通、化学合成又は組換え技法が使用されるであろう。大部分、本発明に使用さ れるポリペプチドは、２００個よりも少ないアミノ酸、より普通には１５０個よ りも少ないアミノ酸、好ましくは約１００個よりも少ないアミノ酸及びより好ま しくは約７５個よりも少ないアミノ酸、一般的には約８〜６０個の範囲のアミノ 酸を有するであろう。しかしながら、前に示したように、野生型又は天然に存在 するタンパク質が使用され、ここでその免疫優性領域は移植抗原の親和性を変え るために突然変異化されている。

既知の技法に基づいて、本発明の組成物をコードする遺伝子を合成することがで きる。

オリゴデオキシヌクレオチド一本領を合成するための技法は十分に確立され、そ してその鎖は２００個又はそれ以上の塩基から得られる。鎖を適切にオーバーラ ツプすることによって、大きな合成配列が調製され得る。他方、利用できる抗原 の免疫優性配列を突然変異化する場合、種々の技法、たとえばイン　ビトロ突然 変異生成、合成配列の制限及び挿入又は同様のものが突然変異を正確に導ひくた めに利用できる。突然変異が行なわれる特定の方法は、本発明に臨界ではない。

遺伝子が得られた後、それは発現のために従来の技法に従って使用され得る。相 当な数の発現ベクターが商業的に又は当業界で利用可能であり、そしてこれは本 発明に利点を与えることができる。それらのベクターにより形質転換された宿主 は、宿主ゲノム中に安定した染色体外維持又は組込みを提ｍｙｃｅｓ　）、たと えばセレビシアエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス（ｋｌｕｙｖｅ ｒｏｍｙｃｅｓ　）、たとえばラクチス（ｌａｃｔｉｓ）を挙げることができる 。微生物、特に細菌及び菌類、たとえば酵母が好ましいであろう。

所望により、それらの構成体は、分泌のために既知のシグナルリーダーと一緒に 調製され得る。シグナルリーダーは、酵母のα−因子、α−アミラーゼ、ペニシ リナーゼ２表面膜タンパク質９等を含む。そのプロセシングシグナルを有するシ グナルリーダーは、成熟に基づいてシグナルリーダー及びプロセシングシグナル を失う、融合前駆体を提供するために、遺伝子の５′末端で連結され得る。

一般的に遭遇される移植抗原である場合、本発明のヒト移植抗原はクラス■を含 む：　Ｆｉｇｎｅｒｏａ及びＫｌｅｉｎ、　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ　 （１９８６）　？　：　７８〜８１及びここに引用された文献を参照のこと；ク ラスｌに関しては、Ｋｌｅｉｎ及びＦｉｇｎｅｒｏａ前記、。

（１９８６）　７　：　４１〜４４及びここに引用された文献を参照のこと。

そのヒトクラス■抗原は、ＤＰ、ＤＱ及びＤＲに分けられ、ここでマウスＨ−Ｌ Ａ　（Ｉ−Ａ）がＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｑに対応し、そしてマウスＨ−ＬＥ　（Ｉ− Ｅ）が０重に対応する。種々の移植抗原が種々の役割を示すことができる。Ｈｉ ｒａｙａｍａなど、。

前記及びここに引用された文献によって報告されたように、サプレッサーニー細 胞（ＣＤ８”）がＤＱにより制限され、そしてヘルパーニー細胞（ＣＤ４”）が ＤＲにより制限されることが示唆される。この関係を用いて、ヘルパー細胞又は サブ１ノブザー細胞のいずれかが、抗原のエピトープへの宿主の免疫応答の免疫 調節を提供するために刺激され得る。

第１ユピトーブ及び対象の抗体目標配列は、表面膜タンパク質、エンベロープタ ンパク質、カプシドタンパク質、腫瘍遺伝子、移植抗原、毒素、アレルゲン、炭 化水素、多糖類。

等を含むであろう。ウィルス関連抗原は、ヘルペス、肝炎。

ＨＩＶ、インフルエンザ、ＦｅＬＶ、ライノウィルス及び他の病原性ウィルスの ようなウィルスを含むであろう。単細胞病原菌に関連する抗原は、プラスモジウ ム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ヘモフ及びトキソプラズマ症及び他の病原性細菌 並びに寄生体のような生物体を含むであろう。腫瘍遺伝子に関連する抗原は、ヒ ト、　ｆａｓ、　ａ＋ｙｅ、　ａｂｌ、　ｒａｓ、等のような腫瘍遺伝子を含む であろう。毒素に関連する抗原は、アフラトキシン、ジフテリア、ボツリヌス毒 素、等のような毒素を含むであろう。対象の病原菌のリストは、アメリカ特許第 ３．９９６．３４５号に見出すことができる。

多数のエピトープが、広範囲の種類の対象の生物体のために定義されて来た。中 和性抗体が向けられるエピトープに特別の興味が存在する。そのようなエピトー プの開示は、関連文献部分に引用された多くの文献に存在する。

種々のエピトープが、移植抗原の冬型性領域に結合するためにコンセンサス配列 を有する配列に連結され得る。クラス■各型性ドメインβ−２及びβ−３可変領 域に関与する領域が特に興味の対象である。これらのドメインにおいては、アミ ノ酸２０〜４０．及び６５〜８５、より特定には２〜３０及び６８〜７８が興味 の対象である。従って、本発明に従って調製される組成物は、コンセンサス配列 によって定義されたようなアグレトーブに関連するアミノ酸を含むことによって 移植抗原のための配列の親和性を増強する、少なくとも１つの突然変異を有する ことによってこれらの領域から異なるであろう。

例示のワクチンは、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）　寄生体、特にフ ァルシパラム（ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する抗体目標配列を含むワクチンで ある。テトラマー（Ｎ−Ａ−Ｎ−Ｐ）、　〔ここでｎは少なくとも３．及び普通 １２よりも多くない〕の少なくとも３個の反復単位を有する抗体目標配列が調製 される。

このオリゴマーは、特に宿主ハブロタイブのために特異的親和性を有する１又は それよりも多くのオリゴ−ａ−ｅに共有ど、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）２ ３４　：１３４９〜１３５６を参照のこと。〕その〕オリゴーａ−は、それぞれ のハブロタイブに関して無害の第１エピトープ及び少なくとも３種、好ましくは 少なくとも４種のメンバーのコンセンサス配列を有するように選択され得る。マ ロビアワクチンを調製するために使用される同じ方法が他の寄生体及び病原菌に 拡張され得る。

配列決定されているクラスＩ及びクラス■抗原の多量性領域の配列は次のもので ある。

特定の対象のドメインは、クラス■の第３可変領域、より詳しくはアミノ酸６８ 〜８０である。この領域においては、多量性アミノ酸は、Ｌ−Ｅ−Ｄ”　−Ａ” 　−Ｒ−Ａ−３”　−Ｖ−Ｄ−Ｔ−Ｙ”　−Ｃ−Ｒ［ここでその多量性部位が＊ を有する〕であり、その結果、その部位でのアミノ酸は保存的に又は非保存的に 変化することができる。

次の例は例示的であって、限定するものではない。

まず、観察が行なわれ、続いてその観察を得るために実験手段が行なわれるであ ろう。

（１９８５）２３５　：８６５〜８７０　；及びＬｅｃｈｌｅｒなど、、　Ｊ、 ＢｘｐｏＭｅｄ。

（１９８６）１６３　：６７８〜６９６（特に本明細書に引用された参考文献） に記載されているようにして得た。阻害又は活性化を決定するための方法は、Ｇ ｕｉｌｌｅｔなど０．前記に記載されている。

非刺激性ペプチド相同体による抗原−特異的Ｔ−細胞活性化の阻害 非刺激性ペプチド相同体による抗原−特異的Ｔ−細胞活性化の阻害を、Ｔ−細胞 ハイブリドーマ７８７．３及びＴ−細胞ハイブリドーマ８Ｉを用いて調べた。

７Ｂ７．３は、バクテリオファージオリプレッサー、ｃＩに由来する免疫優性ペ プチドにより免疫化されたＢａｆｂ／ｃマウスに由来した。それは、Ｉ　−Ａ’ の関係においてペプチドＰ１５−２６（ｃＩのアミノ酸残基１５〜２６を含む） により刺激される。Ｔ−細胞ハイブリドーマ８ＩはＡ／Ｊ株に由来し、そしてＩ −Ｅ”の関係下で同じペプチド（ＰＩ３−２６）を認識する。７８７．３も８Ｉ も、相同ペプチドＰ１２−１４（ｃＩの残基１２−２４を含む）によって刺激さ れ得ない。しかしながら、Ｂａｆｆ１ｂ／Ｃマウスに由来する他のＴ−細胞は、 ｉ−Ａ’の関係下でＰＩ３−２４を認識することができる。これは、ＰＩ３−２ ４が１−Ａ’分子に結合することができるが、しかしそれが特異的なＴ−細胞相 互作用残基（エピトープ）を欠くために、たぶん７Ｂ７−３を刺激することはで きないことを示唆する。ＰＩ３−２６依存性７８７．３活性は、ペプチドＰ１２ −２４がまた培養中に含まれる場合、阻害されるであろうことが見出された。第 ２図を参照のこと。

７Ｂ７゜３の場合、ＰＩ３−２４は、投与量依存性態様においてＰＩ３−２６に よる活性化を阻害し；その阻害の効力はインヒビターの濃度に依存した。ＰＩ３ −２４は、ＰＩ３−２６のために７８７．３の明確な親和性を変えた（例■を参 照のこと）。阻害効果は、培養中におけるＰＩ３−２６の濃度を高めることによ って逆にされた。

対照的に、その同じペプチド（Ｐ　１２−２４）は、ハイブリドーマのＩＬ−２ 応答により示されるように、８■活性化に対して統計学的に有意な効果を持たな かった。

７Ｂ７．３のＰＩ３−２６依存性活性化を阻害するために、他の２種の抗原系に 由来するペプチドの競争能力を決定した。この目的のために、スタフィロコッカ スヌクレアーゼ（Ｎａｓｅ）、すなわち残基６ｉ−８０（Ｐ６１−８０）及びオ ボアルブミン（Ｏｖａ）、すなわち残基３２４−３３６　（Ｐ　３２４−３３６ ）に由来するペプチドを用いて、７Ｂ７．３のｃｌ　ＰＩ３−２６依存性活性化 を阻害した。それぞれは、ｉ−Ａ″′−制限され、そしてそのそれぞれの抗原の ために免疫優性である。この研究は例■に詳しく説明されている。

結果は、７Ｂ７．３活性化が、これらのペプチドによって、投与量依存性態様下 で阻害されることを示した。その同じペプチドがＩ−Ｅ”制限のＰＩ３−２６特 異性Ｔ−細胞、８Ｉに対して有意な効果を持たないことで特異性が見られる。

Ｔ−細胞ハイブリドーマＤｏ−１１，１０は、オボアルブミン特異性であり、そ してＩ−Ａ’制限される。それは、オボアルブミンに由来するペプチドＰ　３２ ３−３３９に対して応答する。

それは、切断された相同体Ｐ　３２４−３３６に対してほとんど応答しない。Ｐ 　３２４−３３６ペプチドを刺激体として使用した。λリプレッサーｃＩペプチ ドＰ１２−２６及びインフルエンザ赤血球凝集素部位２ペプチドＣＩ−Ａ’制限 された）を、可能なインヒビターとして使用した。これらのいずれも、Ｄｏ−１ １，１０を刺激することはできない。第４図に示されるように、これらの非刺激 性ペプチドは、オボアルブミンー特異的Ｔ−細胞活性化に対してインヒビターと して作用する。Ｉ−Ｅ’により制限された、インフルエンザ赤血球凝集素由来の ペプチドＰ　１１１−１２０を、対照として使用し、そしてオボアルブミンー特 異性Ｔ−細胞活性化に対して効果を持たなかった。

この研究の結果は、同じクラス■分子（Ｉ−Ａ″′）により制限された非関連性 ペプチドによるＴ−細胞活性化の競争阻害を示した。

λリプレッサー（ｃＩ）ＰＩ３−２６ペプチドをｌ２ＳＩによりラベルし、そし て種々のクラス■分子に結合するその能力について試験した。そのペプチドは、 第１表（例■）に示されるように、ｄ及びにハブロタイブから単離されたクラス ■分子に結合することができることが観察された。Ｉ−Ａ’及びＩ−Ｅ”分子は 、ペプチドのための制限成分であり、しかしＩ−Ａ”及びＩ−Ｅ’分子はそうで はない。

Ｉ−Ｅ’分子はＢａ１ｂ／ｃマウスに由来するＰＩ３−２６特異的Ｔ−細胞のた めの制限成分として作用することが決して観察されなかった事実にもかかわらず 、ＰＩ３−２６ベブチドはそのＩ−Ｅ’分子に最っとも堅く結合する。

Ｐ　１２−２６の結合がＩ−Ｅ’分子にに対して特異的であるかを決定するため に、Ｉ−Ｅ’によって制限される（そして結合される）ことが知られているミオ グロビン誘導のペプチドと結合のために競争するその能力が試験された。その結 合は第２表（例■）に示されているように特異的である。

ＰＩ３−２６はまた、それらのそれぞれのクラス■分子に結合するために他の免 疫優性ペプチドとも競争する。しかしながら、競争は、Ｉ−Ａ′、すなわちＰＩ ３−２６によって結合されないクラス■分子によって制限されたリゾチーム由来 のペプチドに関しては観察されない（例■の第１表を参照のこと）。

事実、ＰＩ３−２６は、その相対的な結合能力及びその相対的な競争能力によっ て示されるように、Ｉ−Ｅ’分子に最っとも結合する。

この予期しない結果を考慮して、ｅＩのＮＨ，末端のドメインにより免疫化され たＢａ１ｂ／ｃマウス中におけるＩ　−Ｅ’により制限されたＴ−細胞の存在が 再試験された。

１−Ｅ’分子の関係においてＰＸ３−２６を認識することができるｃＩ免疫マウ ス中にＴ−細胞が不在であると思われる。

ＰＩ３−２６及びＩ−Ｅ’分子に関して明らかにレパートリ−におけるホールが 存在する。

Ｉ−ａ分子のレベルでの競争 スタフィロコッカスのヌクレアーゼ及びオボアルブミンの両者に由来の免疫優性 ペプチドは、ｃＩ−特異的Ｔ−細胞ハイブリドーマのＴ−細胞活性化を阻害する ことができる。観察される阻害の程度は、競争体に対する刺激体の割合に依存し 、そして従って、活性体に対する阻害は天然で競争すると思われる。同様に、Ｉ −Ａ’−制限のペプチドは、オボアルブミンー特異的Ｔ−細胞ハイブリドーマの 活性化を阻害することが示される。

ＰＩ３−２６−特異的Ｔ−細胞７Ｂ７．３の阻害を観察するためには、弱刺激性 切断相同体、ＰＩ５−２６を活性体として使用することが必要であった。同様に 、オボアルブミンー特異的Ｔ−細胞Ｄ　Ｏ−１，１，１０に関しては、不完全な 刺激性ペプチド相同体が活性体として使用された。

自己の相同体としての抗原ペプチド ｃｌペプチドはＩ−Ａ’及びＩ−Ｅ’の両者に結合し、モしてＮａ５ｅペプチド は、明らかに両りラス■分子によって制限され得、そして多分両者に結合するこ とができる事実の観点から、２種のペプチドのアミノ酸配列が、Ｉ−Ａ’又はＩ −Ｅ’のいづれかによって制限された他のペプチドのアミノ酸配列と比較された 。

第５図に示されるように、マツコラクジラのミオグロビンに由来する、Ｉ−Ｅ’ −制限の免疫優性ペプチドは、残基１゜２．５．６．９及び１３でｃＩペプチド 及びＮａ５ｅペプチドの両者に対して相同関係を有する（第５図を参照のこと） 。

ｃＩペプチドが他の！−Ｅ’制限のペプチドに相同であるとすれば、Ｉ−Ｅ’分 子の関連下でそれを認識することができるＴ−細胞が明らかに存在しないという ことは不明確であった。これを説明するために、Ｉ−、Ｅ’−制限のペプチド及 びＩ−Ｅ’分子自体の配列の比較が行なわれた。Ｅ３鎖の第３超可変領域（残基 ６９−８１）において、−列に並べられる場合、残基１，２，５及び１３は、Ｉ −Ｅ’分子によって制限されたペプチドに相同である結果が示された（第５図を 参照のこと）。ｃＩペプチドは、残基１，２．３，４．５及び１１でＩ−Ｅ、’ 分子に等しく、そして１３で相同である。さらに、この領域におけるＩ−Ｅ−分 子の配列とＩ−Ｅ、’分子の配列との比較は、残基３，４．７及び１１が単に多 量性残基であることを示す。ｅＩペプチドは、これらの多量性残基の３個でＩ− Ｅ’分子に一致し：他のＩ−Ｅ’−制限のペプチドはそうではない。この同一性 が、推定されう“レパートリ−・におけるホール”を説明すると思われる。

第５図に示されるように、インフルエンザ赤血球凝集素に由来する、ｌ−Ｅ’− 制限の免疫優性ペプチドは、上記の他のペプチドに対してほとんど相同関係を持 たない（残基１及び２でを除く）。しかしながら、このペプチドは、Ｉ−Ｅ♂分 子自体に対して著しい相同関係を有する。この場合、比較のために使用されるＩ −Ｅ、’分子の残基がＥ、鎖の第２超可変領域から取られる。Ｍｅｎｇｌｅ−Ｇ ａｗ、　Ｉ、、及び［１，ＭｃＤｅｖｉｔｔ。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　［ｌ５Ａ（１９８３）８０　：　７６２１〜７６２ ５゜−列に並べられる場合、残基１．２゜３．４．６及び１０は同一であり、モ して残基７及び９は相同である。インフルエンザペプチドは、残基５でＩ−Ｅ、 ’分子に対する挿入を受け、そしてこの残基はＴ−細胞の認識のＪｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ、　（１９８５０３５：　１３９１〜１３９４ ゜要約 従って、上記の及び続く例における研究（ま次のことを示す。

抗原特異的１゛−細胞の活性化（１゛なわち、特定のクラス■分子によって結合 された特異的ペプチドによる活性化）は、刺激性ペプチドが与えられるクラス■ 関連物と同じものに相同ペプチドが、与えられる場合、その相同ペプチドによっ て阻害され得る。これは、その相同ペプチドがＴ−細胞を活性化することができ ない場合でさえ真実である。しかしながら、その同じ相同ペプチドは、異なった クラス■分子によって結合される特異的ペプチドを認識するＴ−細胞の活性化を 阻害しない。

第１の場合、これは、クラス■抗原への結合のため競争を支持し、そしてＴ−細 胞活性化におけるその相同ペプチドによる干渉は、クラス■分子へのその結合の 結果である（従って、特異的ペプチドがそれを行なうことを妨げる）。第２の場 合、それは、第２のクラス■分子への結合のために相同ペプチドと特異的ペプチ ドとの間の競争が存在しないので、その相同ペプチドはＴ−細胞の活性化を干渉 しないことを支持する。

たった１つのペプチド結合部位がそれぞれのクラス■分子上に存在し、そして与 えられたクラス■分子によって制限された無関連のペプチドが、クラス■分子へ の結合において競争を通して特異的Ｔ−細胞を刺激するために、それぞれ他の能 力の競争インヒビターとして作用することも示された。

次のペプチド及びＩ−Ｅ″′クラス■分子自体のアミノ酸配列の比較は、Ｔ−細 胞の認識の！こめの抗原内の免疫優性ペプチドの選択が、移植抗原に結合するた めのその能力に向けられる結論を支持する： １゜　ｃＩペプチド、すなわちＩ−Ａ’及びＩ−ＤＫにより制限されるが、しか しＩ−Ｅ’分子に最っとも堅く結合する、λリプレッサーに由来する免疫優性ペ プチド：２、Ｎａ５ｅペプチド、すなわちＩ−Ａ’及びＩ−Ｅ’により制限され 、そしてたぶん両者に結合する、スタフィロコッカスのヌクレアーゼに由来する 免疫優性ペプチド：３゜　Ｉ−Ｅ’により制限される、マツコラクジラのミオグ ロビン由来の免疫優性ペプチド；及び ４、Ｉ−Ｅ’により制限される、マツコラクジラの赤血球凝集素に由来する免疫 優性ペプチド。

第５図の上部に要約されているペプチド１−３の比較は、１３残基のうち６個で （すなわち、１．２，５，６．９及び１３で）、３個の間の相同関係を示した。

そのような相同関係は、それらの通常の制限及び／又は同じクラス■分子（Ｉ− Ｅ’）に結合するための能力を説明する。

これらの３個のＩ−Ｅ’−制限のペプチドの配列とＩ−Ｅ’分子自体の配列との 比較は、ペプチド中の及び１．鎖の第３超可変領域中の４個の残基の間に相同関 係を示した。たとえば、マツコラクジラのミオグロビンペプチド、ＣＩペプチド 及びＥ、＠Ｊｎにおいて、ロイシン（非極性アミノ酸）は残基１で存在し、グル タミン酸は残基２で、アルギニン（塩基性アミノ酸）は残基５で存在し；　Ｎａ ５ｅにおいては、これらの位置のそれぞれでの残基は同じか又は相同であり：す なわちバリン（非極性）は残基１で、グルタミン酸（同じアミノ酸）は残基２で 、そしてリシン（塩基性）は残基５で存在する。すべての３個の免疫優性ペプチ ドは、残基１３でリジン（塩基性アミノ酸）を有し、そしてクラス■分子はその 位置でアルギニン（また塩基性アミノ酸）を有することが示された。

これらの３個のペプチドのアミノ酸配列とまたＩ−Ｅ”−制限されている、イン フルエンザのペプチドのアミノ酸配列との比較は、はとんど相同関係を示さなか った。インフルエンザのペプチド配列とＩ−Ｅ’分子の第２超可変領域の配列と の比較は、２個の間で著しく相同関係を示したが、しかしながら６個の残基は同 一であり、そして２個は相同であった。

その結果は、Ｔ−細胞の認識のための抗原内の免疫優性ペプチドの選択の基本が 移植抗原（たとえばクラスＩ又はクラス■分子）に結合するためのその能力に向 けられ、そしてそのような結合のための化学的必要条件が移植抗原自体のセグメ ントとの相同関係に向けられている結論を支持する。

これらの観察は、クラス■分子の特定のドメイン（それぞれの鏡上で分離されて いる）に関連する内部相補体（リガンド−レセプター）の存在を支持し、そして 結合のための内部“リガンド”が多量性領域によって一部コードされていること を支持する。同様のことが、内部“レセプター”のために真実であると思われる であろう。次に、免疫優性ペプチドは、内部“リガンド″を置換し、そして同等 の幾何学を持って、クラス■分子に結合されるであろう。次に外来性“リガンド （免疫優性ペプチド）は、内部の自己“リガンド”の相同体としてＴ−細胞によ って見出されるであろう。

上記のλリプレッザーベブチド（ｃＩ）の場合、外来性リガンドは、自己のクラ ス■分子と見分けがつかず（多量性部位で）、そして“レパートリ−におけるホ ール”が、自己耐性によって引き起こされると思われる。“レパートリ−におけ るホール”であると思われるものをもたらす、自己としての認識の考えは、新規 ではない。Ｂｕｒｎｅｔ、　Ｆ、　Ｍ、、ＣａｍｈｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９５９）　；　Ｈｅｒｎｅ、Ｎ１Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、（１９７１）　１　：　１〜５゜しか しながら、本発明に示されたデータは、その概念が物理的基礎を有することを示 す最初の分子証拠を提供する。

アロ反応性が外来性のクラス■分子の内部“リガンド”のＴ−細胞認識の結果で あることを予期することは正当である。

その内部“リガンド”が多くの多望性残基から構成され、そしてヒストトビツク 残基（クラス■分子に結合するＴ−細胞の部位）がそうでない場合、与えられた Ｔ−細胞は、自己のクラス■分子に結合される外来性“リガンド”かそれ自体の 内部゛リガンド″により結合される外来性のクラス■分子かを区別することはで きない。２種のリガンドの間に同一性が存在する場合、アロ反応性が得られるで あろう。上記結果（すなわち、すべての“リガンド°の間に相同関係が存在する ）を仮定すれば、外来性内部“リガンド”は、自己の相同として容易に考えられ 、そして従って自己＋Ｘに対して化学的に等しいであろう。外来性゛リガンド” のそれぞれの多望性残基は、自己の関与において異なった外来性抗原を理論上表 わすことができるであろう。従って、多くの％のＴ−細胞が単一のアロクラス■ 分子に応答することができるであろう。

Ａｓｈｗｅｌｌ、　Ｊ、など、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、　（１９８６）１３６　：３８９〜３９５゜ オボアルブミンのＩ−Ａ’−制限の免疫優性ペプチドのための配列（本明細書に 記載されている）が第６図に示されている。それは、Ａ８鎖の多量性領域（残基 ４２□５５）と共に一列に般べられている。Ｃｈｏｉ、　！。など、、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　（１９８３）２２１　：２８３゜それは、残基１２．１７．１９及び ２０で同一性を有する。この領域において冬型性である単一の残基は残基１２で あり、これはＩ　Ａｓ’分子（及びオボアルブミン）においてヒスチジンであり 、そしてＩ　Ａｍ’分子（制限成分）及びＩ−Ａ−分子においてチロシンである 。Ｉ−Ａ’の関連下でオボアルブミンを認識するオボアルブミン特異的Ｔ−細胞 ハイブリドーマ、Ｄ　０−１１．１０は、Ｉ−Ａ、’とのアロ反応を示す（但し 、！−Ａ、にとは示さない）。さらに、この領域は、Ｄｏ−１１，１０のアロ反 応を調整するものとしてＧｅｒｍａｉｎ及び彼の同僚によって示された。このヒ スチジン残基は、もう１つのオボアルブミン特異的Ｔ−細胞の認識のために不可 欠であるものとしてＭｃＣｏｎｎｅｌｌ及び彼の同僚によって示された。Ｌｅｃ ｈｌｅｒ、　Ｒ８ｆｅｅ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、（１９８６）胆し：６７８〜６９６：　Ｗａｔｔｓ、　Ｔ 、など０．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄ ｅ＋＋＋ｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１ＪｓＡ、　（１９８５）８２　：　５ ４８０゜これは、Ｄ　０−１１．１０細胞が自己十Ｘ（ここでＸはオボアルブミ ンベブチドである）及びアｏ（ここで７口はＩ−Ａｃである）を区別することが できないことを示唆する。

本発明に記載されたオボアルブミンペプチドは、′許容”残基の２つの領域（ク ラス■分子へのそれの結合を可能にする）を含むように思われる。１つの領域は 、位置１７〜２０　（Ｔ−細胞様Ｄ　０−１１．１０はこの領域を必要とする） を含む。これらの残基のために欠失されたペプチドは、それがＴ−細胞様Ｄ　Ｏ −５４，８を刺激することができる事実によって示されるように、Ｉ−Ａに結合 する。Ｓｈｉｍｏｎｋｅｙｉｔｚ、　Ｒ１など、、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ　（１９８４）　１３３　：　２１６７　；　Ｗａｔｔｓ、Ｔ、 、　ｆｅｅ、。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ＵＳＡ。

（１９８５）８２　：　５４８０゜最近の証拠は、位置１２の先の領域における 残基がまた、Ｉ−Ａ’結合のために“許容”フレームワークも形成することを指 摘する。Ｃｅａｓｅ、　Ｉｃ　Ｂ、など、、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ 　ｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　（１９８６）１６４　：１７７９゜Ｉ−Ａ ’の関連下でマツコラクジラのミオグロビンに由来するペプチドを認識するＴ− 細胞はまた、Ｘ−Ａ’とのアロ反応も示す。

Ｂｅｒｋｏｗｅｒ、Ｉ、など、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、　（１９８６）１６４　：１７７９゜ミオグロビンは、位置２．５．７．８及 び１２でＩ−Ａ’分子との相同関係を示す（第６図）。また、位置１２でのヒス チジン残基は、自己の関連下でのミオグロビン、Ｉ−Ａ’及びアロ、Ｉ−Ａ’の 間で類似性を担当すると思われる。

明らかな相同関係特色は、同じクラス■分子によって制限されるペプチドの間で 必ずしも見出されない。それぞれのリガンド様ドメインに関連するモチーフが見 出されるであろう（第５図及び６図）。第７図は、Ｉ−Ａ’分子のためのリガン ドに関連する３種のモチーフが存在することを示すデータの編集を表わす。第８ 図における配列は、Ｉ−Ｅ“分子のために２種のモチーフの可能性を示す。

例Ｉ　Ｔ−細胞ハイブリドーマ及び抗原付与細胞の調製ＭＭＣ制限の態様下でＴ −細胞に対する抗原を付与するＩ　−Ａ’−Ｉ−Ｅ”陽性Ａ２０．２Ｊ　Ｂａｄ 　ｂ／ｃ　Ｂリンパ腫系は、叶、　Ｊ、　Ｋａｐｐｌｅｒ及びＰ、　Ｍａｒｒａ ｃｋからの贈与であった。

Ｄｏ−１１，１０は、オボアルブミンＩ−Ａ’制限のＴ−細胞ハＸＡ／Ｊ）Ｆｌ 供与体からのリポ多糖刺激のＢ−細胞とＲ１２，４，ｌ　Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｂリン パ腫細胞系（Ｏｒ、Ｌ、　Ｇｌｉｍｃｈｅｒからの贈与物）との融合により得ら れた。ＴＡ３　Ｂ−細胞−Ｂリンパ腫ハイブリドーマ　ｌ　Ａ−／−Ｉ　Ｅｅｌ ／ｄの表現型は、この細胞系がＨ２″又はＲ２”制限のＴｈ（Ｔ−ヘルパーリン パ球）細胞ハイブリドーマのいづれかに対して抗原を付与することができるよう にする。

培養条件。Ｔ−細胞ハイブリドーマ及び抗原付与細胞は、２　Ｘ　１０−”ＭＯ ）ｆｋｇ　ミ７．５　Ｘ　１０−’Ｍノ２−メＪＬ、カフ）エタノール、１００ μ／ｄのペニシリン、１１００ａ／＊のストレプトマイシン及び１０％のウシ胎 児血清により補充されたＲＰＭＩ　１６４０（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃａｍｐａｎｙ、　８２００−６１４０＞を含む大きなウェ ル（２４ウエルプレート、　Ｃｏ５ｔａｒ　ｔ３４２４＞中で維持された。それ らの細胞系は、連続的な希釈によって２日ごとに倍増され、そしてそれらが下記 の研究に使用する前、それぞれ５−及び５０−ｆの培地を含むＴ２５及びＴ７５ フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で拡張された。

ペプチド。すべてのペプチドは、前に記載されたようなＭａｒｎ　ｉｆ　１ｅｌ ｄの固相法によって合成された。Ｍｅｒｎｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃ ｉｅｔｙ、　（１９６３）８５：２１４９〜２１５４゜合成されたペプチドのア ミノ酸組成及び配列分析は、予測した組成に対応する。配列決定及び／又はＨＰ ＬＣによって決定される場合、そのペプチドの純度は９３〜９４％である。

Ｔ−細胞ハイブリド−マフＢ７．３は、λリプレッサーにより免疫化されたＢａ １ｂ／ｃマウスに由来した。それは、Ｉ　−Ａ’の関連下でペプチドＰ１５−２ ６　（免疫原の残基１５−２６＞により刺激され得る。Ａ／Ｊ株に由来するＴ− 細胞ハイブリドーマ８Ｉは、その同じペプチドを認識するが、しかしＩ−Ｅ“の 関連を伴わない。また、Ｔ−細胞は、相同のペプチド相同体Ｐ１２−２４　（免 疫原の残基１２−２４）により刺激され得ない。しかしながら、Ｂａ１ｂ／ｃに 由来する他のＴ−細胞は、Ｉ　−Ａ’の関連下でＰＩ３−２４を認識することが できる。

これは、ＰＩ２−２４がＩ−Ａ’分子に結合することができるが、しかしたぶん ７８７．３を刺激することはできないことを示唆する。なぜならば、それは特異 的なＴ＝細胞の相互反応残基（エピトープ）を欠失するからである。Ｔｏ−細胞 ハイブリドーマ〔適切な抗原濃度を含むＲＰＭＩ完全培地２００〆を含む９６− ウェルの組織Ｃｏ５ｔ、ａｒブレー）　（＃：３５９６）のウェル中に５Ｘ１０ ’個の抗原付与細胞と共にインキュベートされたＴ−細胞ハイブリドーマ（５Ｘ １０’））の活性化はＩＬ−２を分泌するそれらの能力によって測定された。２ ４時間の培養の後、上清液（５０〆）を取り、そして次に、ＩＬ−２依存性ＣＴ 　Ｌ　−Ｌ細胞の増殖を維持するその能力によってＩＬ−２含有量についてアッ セイする。１μＣｉの３Ｈ−チミジンをウェル当りに添加した。６時間後、細胞 を、自動細胞収穫機（Ｓｋａｒｔｒｏｎ　Ｉｎｃ、、　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、　Ｖ Ａ）によって収穫し、そしてチミジン導入をシンチレーション計数管によって測 定した。

両ペプチドは１３個の残基のうち１１個を共有するので、Ｐ　１５−２６−−依 存性７Ｂ７．３活性化の阻害は、そのペプチドＰ１２−２４がまた、培養中に含 まれる場合に観察された。第２図を参照のこと。

Ｔ−細胞ハイブリド−マフＢ７．３の活性は、１０％ウシ胎児血清のみを有する ＲＰＭＩ　１６４０又は２０ｊ？ｌのＰＩ３−２４もしくは６０〆のＰＩ３−２ ４の存在下において、種々の濃度のＰＩ３−２６の存在下で測定された。Ａ２０ 　Ｂ−細胞リンパ腫（５Ｘ１０’個の細胞／ウェル）を、抗原付与性細胞として 使用した。

２４時間の培養の後、上清液（５０４）を収穫し、そして次に、Ｉ　Ｌ−２依存 性ＣＴＬ−Ｌ細胞系ｃｉ　ｏ’個の細胞／ウェル）中への’　Ｎ−（チミジンの 導入の後、ＩＬ−２１１度についてアッセイした。第２図における値は、３種の サンプルの相加平均、を表わす。

７Ｂ７．３の場合、ＰＩ３−２４は、投与量依存性態様でＰＩ３−２６による活 性化を阻害することが見出された。その阻害の有効性はそのインヒビター濃度に 依存する。第３図に示されるように、ＰＩ３−２４は７Ｂ７．３へのＰＩ３−２ ６の見掛の親和性を変え二Ｐ１５−２６抗原投与量応答曲線の５０％刺激点は、 ＰＩ３−２６が７Ｂ７．３のみと共に培養される場合、２０．７±１．２−の濃 度である。７８７．３がＰＩ３−２６及びＰＩ３−２４と共に同時培養される場 合、５％刺激点は２９．８±２．８声であけ、そしてＰＩ３−２４がそれぞれ２ ０＃Ｍ及び６０−で存在する場合、７０．３−である。その阻害効果は、培養中 におけるＰＩ３−２６の濃度を高めることによって、逆にされ得る。サンプルペ プチド、ＰＩ３−２４は、ハイブリドーマ８Ｉ、すなわちＰＩ３−２６感受性、 Ｉ−Ｅ”−制限のＴ−細胞ハイブリドーマのＩＬ−２応答に対して効果を持たな かった。Ｉ−Ａ″′及びＩ−Ｅ”との相互反応を必要とされるＰＩ３−２６の残 基は異なっていることがまた、示された。従って、Ｉ−Ｅ”制限のＴ−細胞のＰ Ｉ３−２４による阻害の不在は、Ｉ−Ｅゝ分子に結合するそのペプチドの無能性 によるものである。

例■　他のＩ−Ａ’−制限のペプチドによるリプレッサー特異的Ｔ−細胞活性化 の阻害 次の研究が、ハイブリドーマ７Ｂ７．３のＰＩ３−２６−依存性活性化を阻害す る、スタフィロコッカスのヌクレアーゼ（Ｎａｓｅ）。

残基６１−８０　（Ｐ６１−８０）及びオボアルブミン（Ｏｖａ）、残基３２４ −３３６　（Ｐ　３２４−３３６）に由来するペプチドの競争能力を試験するた めに行なわれた。これらのペプチドのそれぞれは、それぞれの場合において、Ｉ −Ａ’−制限され、そしてそれらのそれぞれの抗原に対して免疫優性であるべき であることが示された。Ｆ　ｉｎｎｅｇａｎ、　Ａ、　ｔＬ　ｅ。、Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ、ａｌ　Ｍｅｄｉ−ｃｉｎｅ　（１９８６） 　１６４　：８９７〜９１０　：　Ｓｈｉｍｏｎｋｅｖｉｔｚ、　Ｒ０輩、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（１９８４）。５Ｘ１０’個の ＴＡ３細胞がそれぞれのウェルに添加された。種々の濃度のＰＩ５１６が、培地 （１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ　１６４０）のる又は３゜−のＯｖａ　 （Ｐ　３２４−３３６）もしくは６０ｊＭのＮａ５ｅ　（Ｐ６２−８０）のいづ れかと共に添加された。Ａ２０　Ｂ−細胞リンパ腫（５Ｘ１０４個の細＠／ウェ ル）を、抗原付与細胞として使用した。

次に、７Ｂ？、３Ｔ−細胞ハイブリドーマ（５Ｘ１０’個）を添加し、そして２ ４時間培養した。Ｔ−細胞刺激のレベルを、例Ｈに示したようにしてＩＬ−２濃 度を決定することによってアッセイした。第３図に示されるように、これらのペ プチドは、投与量依存性態様で７Ｂ７．３の活性化を阻害した。その阻害の程度 は、それぞれの場合においてインヒビ−ターに対する活性化体の割合に依存しな い。

８Ｉ（Ｉ−Ｅ”−制限の）Ｔ−細胞ハイブリドーマ及びＴＡ３Ｂ付与性細胞（５ Ｘ１０’個）を、上記のようにして種々の濃度のＰＩ３−２６及び培値のみ又は ６０Ｊ２１′ＩのＯｖａ　（Ｐ　３２４−３３６）もしくは６０団のＮａ５ｅ　 （Ｐ６１−８０＞のいづれかと共に培養した。特異性は、このペプチドがＩ−Ｅ Ｋ−制限のＰＩ３−２６−特異性Ｔ−細胞、８Ｎに対して効果を付与しないこと で見られる。さらに、Ｎａ５ｅ配列の残りの代表的な他のペプチドは、７Ｂ７． ３の活性化を阻害することができなかった。

Ｔ−細胞ハイブリドーマＤｏ−１１，１０は、オボアルブミン特異性であり、そ してＩ−Ａ’により制限される。それは、オボアルブミンに由来するペプチドＰ 　３２３−３３９に応答する。

それは、刺激体として使用される、切断された相同体Ｐ　３２４−３３６にほと んど応答Ｉ、７ない。インヒビターとして、λリプレッサーペプチドＰ１２−２ ６及びインフルエンザ赤血球凝集素（Ｉ−Ａ’制限の）に由来するペプチドイン フルエンザ赤血球凝集素部位２　（Ｐ　１２６−１３８）を使用した。これらの ペプチドのいずれも、独力でＤｏ−１１゜１０を刺激することはできない。

培地のみ又はインフルエンザ赤血球凝集素Ｐ　１１１−１２０もしくはＰＩ３− ２６又はインフルエンザ赤血球凝集素部位２　（ＰＩ２６−１３８）　（それぞ れ５０Ｊｄ′Ｉで）の存在下で、Ｄｏ−１１，１０を、種々の濃度のＯｖａ　（ Ｐ　３２４−３３６）及びＡ２０付与性細胞と共に培養した。２４時間の培養の 後、解放されたＮＬ−２の量を定量化することによって、刺激を決定した。第４ 図において、それらの値は、３種のサンプルの相加平均を表わす。条件は、例■ に記載された。

第４図に示されるように、これらの非刺激性ペプチドは、オボアルブミン特異的 Ｔ−細胞活性に対してインヒビターとして作用する。Ｉ−Ｅ’制限の、インフル エンザ赤血球凝集素由来のペプチドＰ　１１１−１２０は、対照として作用し； それは、オボアルブミンー特異的Ｔ−細胞の活性化に対して効力を持りラス■分 子によって制限されたペプチドの間に観察される競争阻害の機構をさらに研究す るために、イン　ビトロにおけるクラス■分子へのペプチド結合の研究を行なっ た。結果は第１表に示される。

ペプチドＰ１２−２６を、′２５Ｉのための受容体として作用するために、Ｎ− 末端へのグロシン残基の添加により変性した。

セファ０−ス４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｏｉａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓ＠Ｓｗｅｄｅｎ）に結合された次のモノクローナル抗体：ＭＫ−Ｄ６（１−Ａ ’−特異性）、１０−３−６　（Ｉ−Ａ“−特異性）又は１４−４−４　（Ｉ− Ｅ’八−特異性）を用いて、アフィニティー・クロマトグラフィーによって、Ｉ ａ−分子を、Ａ２０（Ｈ２’）のＮｏ＋″ｔｉｉｉｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０ ）破壊物又はＡＫＴＢ−１ｂ（Ｈ２′）細胞から精製した。

免疫原性ペプチドと１ａとの間の関係の程度を決定するために、ゲル濾過アッセ イを使用した。このアッセイは、３ｕｒ＋ｓ。

本明細書に組み込む。手順に言えば、１％ＮＰ−４０／ＰＳＢ中、精製されたＩ ａ４０μモルを、＋２５ｆｉによりラベルされたペプチド（それぞれの実験のた めに約２００．０ＯＯＣＰＩ１１）　０゜２μモルと共に混合し、そして室温で ４８時間インキコベートし、Ｉａ−ペプチド複合体の形成を可能にした。Ｉａ− ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、そしてＩａに結合 されたペプチドの％を、回収された合計の１２Ｓｉ−ラベルされたペプチドに対 する空隙率での１２Ｓｉ−ラベルされたペプチドの割合として計算した。

第１表、クラス■分子への”’Ｉ　ｃｌ　ＰＩ３−２６相同体の結合クラス■抗 原　結合されたペプチドの％Ｉ−Ａ’　１６±０−８（ｎ＝５） Ｉ−Ｅ’　８．９±２．２　（ｎ＝７）　”Ｉ−Ａｋ　０．３±０゜５　（ｎ＝ ５＞Ｉ−Ｅ’　２．３±１．７　（ｎ＝５）＊　結合のレベルは、９９％以上の 信頼レベルで他のクラス■分子と有意に異なる。

第１表に示されるように、ペプチドＰ１２−２６は、予想どおりに両分子に結合 することができる。（結合のために使用される変性された形のＰＩ３−２６は、 Ｔ−細胞の活性化に関して、ＰＩ３−２６と同じように活性的である。）特異性 は、Ｉ　−Ａｋ分子に結合するためのＰＩ３−２６の無能性によって明白に示さ れ：後者は、このペプチドの制限のためにイン　ビボで活性を示さない。しかし ながら、ペプチドＰ１２−２６は、ｉ−Ｅ’分子にひじょうに良く結合する。Ｂ ａ１ｂ／ｅ免疫マウスからのＴ−細胞は、この分子によって制限されないことが 見出された。

ＰＩ３−２６の結合がＩ−Ｅ’分子に対して特異的であるかどうかを決定するた めに、Ｉ−Ｅ’によって制限されることが示された（そして結合することが）、 ミオグロビン由来のペプチドとの結合のために競争するその能力の試験が行なわ れた。結果は第２表に示される。

阻害アッセイのために、ラベルされていない投与量範囲のｃＩ　ＰＩ３−２６ベ ブチドが、Ｉａ及び１２Ｊによりラベルされたペプチドのインキュベーション混 合物（６００，１２０、２４゜約４８ｊ？１）に添加された。Ｉａとラベルされ たペプチドとの間の関連の程度を、第１表に記載されたようにゲル濾過により決 定した。インヒビターの不在下で結合されたペプチドの百分率は、オボアルブミ ン（３２３〜３３２９）　／　Ｉ−Ａ’のためには１０．６％：ミオグロビン（ １３２〜１５３）／Ｉ−Ｅ’のためには６．５％：リゾチーム（４６〜６１）　 ／　Ｉ−Ａ”のためには２１．５％：シトクロームｃ（８８〜１０４）／　Ｉ　 −Ｅ　’のためには２．５％であった。結合の５０％阻害を得るために必要とさ れる阻害性ペプチドの濃度を計算した。それぞれの実験は３度くり返えされた。

第２表６種々のクラス■分子への放射性ラベルされたペプチドの結合を阻害する λ−リプレッサーペプチドＰ１２−２６の能力 オボアルブミン　Ｉ−Ａ’　３００ （Ｐ３２３−３３９）” ＊　括弧内の数字は、親分子におけるアミノ酸残基の位置を言及する。

＋　結合の阻害は、２５００洲のＰＩ３−２６で検出された。

ＰＩ３−２６はまた、それらのそれぞれのクラス■分子に結合するために他の免 疫優勢ペプチドとも競争する。しかしながら、競争は、ｘ＝Ａ８によって制限さ れたリゾチーム由来のペプチド、すなわちＰＩ３−２６によって結合されなかっ たクラス■分子のためには、観察されない（第１表を参照のこと）。

事実、ＰＩ３−２６は、その相対的な結合能力及びその相対的な競争能力によっ て示されるように、Ｉ−Ｅ’分子に最っとも結合することは、注目すべきである 。

ＰＩ３−２６がＩ−Ｅ’分子に特異的に結合することを示す結果の点から、ｃＮ のＮＨ，末端のドメインにより免疫化されたＢａ１ｂ／ｅマウス中にＩ−Ｅ’に より制限されたＴ−細胞が存在するか否かの問題が再試験された。

１５匹のｃＩ免疫化マウスから回収されたＰＩ３−２６に対して特異的な３００ 個以上のハイブリッドのうち、ｌ７−Ｅ’分子によって制限されたものは示され なかった。すなわち、それらはＩ−Ａ’を発現するし細胞の存在下で抗原によっ て刺激され得るが、しかしＩ−Ｅ’を発現するし一細胞の存在下で抗原によって 刺激されることは示され得なかった。

対照的に、ミオグロビン（Ｐ　１３５−１４７）に対して特異的な８０個のハイ ブリッドのうち、７８個は、Ｉ−Ｅ’を発現するし一細胞上でアッセイされる場 合、Ｉ−Ｅ″′に制限されることが示された。さらに、ＰＩ３−２６免疫マウス からの分別されていないリンパ節由来のＴ−細胞は、５ｈａｓｔｒｉなどによっ て記載されているような標準のリンパ節増殖アッセイ１６４　：　８８２　］に おいてｉｏｊＭのＰＩ３−２６と共に培養する場合、有意な増殖（６８，０００ ｃｐｍのチミジンの取込み）を示した。しかしながら、そのリンパ節細胞は、Ｉ −Ａ’分子に対して特異的なモノクローナル抗体、ＭＫＤ６が１０−のＰＩ３− ２６を有する同一の培養物に添加される場合、添加された抗原を有さない培養物 以上に有意な増殖（１２５０ｃｐａ）を示すことができない。これらの同じ培養 物の増殖は、Ｉ−Ｅ’に対して特異的であり、そしてヘモシアニン特異性の、Ｉ −Ｅ’制限のＴ−細胞ハイブリドーマの刺激と阻害するモノクローナル抗体、３ ４−１−４３によって阻害されなかった（７５．０００ｃｐａ＋）。

従って、Ｉ−Ｅ’分子の関連下でＰＩ３−２６を認識することができる。ｃＩ免 疫マウス中におけるＴ−細胞が不在しているように思われ：明らかに、ＰＩ３− ２６及びＩ−Ｅ’分子に関してレパートリ−におけるホールが存在する。

次の研究は、マラリアワクチンとして使用するための合成ポリペプチドに関する 。

材料 合成ペプチドの合成及び分析は、前に記載された（に（ＢｉｌｌｅｔＰ１２−２ ６；λバクテリオファージのｃＩタンパク質由来である。

ＰＩ３−２６Ｌ　Ｆ　；残基１４及び１５がＬＦによって置換されているＰＩ３ −２６の変種である。

（ＮＡＮＰ）　１−１２−２６、（ＮＡＮＰ）　２−１２−２６及び（ＮＡＮＰ ）　３−２３−２６；それぞれ１９．２３及び２７個の残基の長さである。それ ・らは、１〜３回反復されたＮＡＮＰで始まり、次にＰ　１２−２６を有する。

ＮＡＮＰ−５０は、５０回反復されたＮＡＮＰのポリマーである。

抗体の製造のために、完全フロインドアシュパン）（ＣＦＡ）中に乳化された抗 原［（ＮＡＮＰ）３−１２−２６１　１０ｋを、マウスの腹腔内及び足の肉鉦に 日Ｏで１次注射し、次いで、不完全フロインドアジユバント（ＩＦＡ）中に乳化 された抗原５０躍を、２１日後、２次皮下注射した。日７．２１（追加免疫の前 ）、２８．及び４２日目に血液からの血清を使用した。

Ｔ−細胞の増殖 Ｔ−細胞増殖の研究のために、ＣＦＡ中に乳化された１００ｎの（ＮＡＮＰ）　 ３−１２−２６を、マウスの尾及びまた足の肉祉に日０で注射した。１０日目に 、ドレンノードを除去した。

１０％ＦＣ３，５Ｘ１０−’のＭ２ＭＥ、ペニシリン、ストレプトマイシン及び 抗原を含むＲＰＭｌ　０．１−＝ｆを含む、平底マイクロ力価プレートのウェル 当り８Ｘ１０’個の細胞を接種した。

２日目、３Ｈチミジン（ＩＣＮ）／μＣｉを、３成分又は２成分培養物に添加し た。１６時間後、細胞を収穫し、そして取込まれた３Ｈを、シンチレーション計 数器によってアッセイした。

ＮＡＮＰ、（ＮＡＮＰ）ｎ　（ここでｎ反復の数を示す）に対する抗体力価の評 価 ＥＬＩＳＡ試験を用いた。接合されたＮＡＮＰ５０又は１２−２６−ＢＳＡ（１ ０ｇ／献、２に／−１それぞれ（２５〆）〕を、室温で１時間又は４℃で一晩に わたってポリビニルウェル中に添加した。次に、ウェルをブロックし、血清を添 加し、そしてペルオキシダーゼに接合されたヤギ抗−マウスＩｇＧを添加したｃ ｉｘｉｏｏｏの希釈度）。最後に、基質（ＡＢＴＳ）を添加し、そして吸光度を ４０５ｎｍで読んだ。血清は、種々の希釈度で試験された。

結果 （ＮＡＮＰ）　３−１２−２６は、ＰＩ３−２６に対して特異的なＴ−細胞を刺 激する Ｔ−細胞ハイブリドーマ９Ｈ３５及び９　Ｃ１２７の活性化を研究した。抗原付 与性細胞は、Ｂ−細胞リンパ腫Ａ２０であり、そしてＰＩ３−２６又は（ＮＡＮ Ｐ）　３−４２−２６のいずれかの抗原を種々の投与率（０〜５０ｊｇ／ｄ）で 添加した。ＩＬ−２の解放が、Ｔ−細胞の活性化の測定として取られ、そして増 殖のためにＩＬ−２を必要とする指示が細胞系に対してアッセイした。

得られた結果は、ＰＩ３−２６（ｃＩタンパク質により免疫化された動物から単 離された）に対して特異的な、２種のＨ２’−一制限のＴ−ヘルパー細胞ハイブ リドーマ、９Ｈ３５及び９Ｃ１２７のために、ペプチド（ＮＡＮＰ）　３−１２ −２６が、適切な（Ａ２０）抗原付与性細胞の存在下で刺激体として作用するこ とができることを示した。ＮＡＮＰ含有ペプチドは、より活性的である。この結 果は、拡張されたクラス■結合性ペプチドのＴ−細胞刺激性能力が、イン　ビト ロで研究される場合、はとんど変えられないことを示す。

（ＮＡＮＰ）　−３−１２−２６ペプチドは、（ＮＡＮＰ）　５０に対して特異 的なモノクローナル抗体及びＰＩ３−２６に対して特異的なモノクローナル抗体 の両者に結合され得る モノクローナル抗体による（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６の抗体認識が研究され た。抗原、すなわちＰＩ３−２６に接合されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を マイクロウェルに吸収し、モしてＰＩ３−２６に対して特異的な、ホースラディ シコ　ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によりラベルされた抗体を添加した。

（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６の不在下で又はＰ　１２−２６Ｌ　Ｆの存在下で 、モノクローナル抗体Ｂ３．１１の結合の阻害は存在しない。阻害が、ＰＩ３− ２６．　（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６及びＰＩ３−２６３　（位置１８）（減 少する阻害の順序）により観察される。

上記研究をくり返した。但し、抗原は、マイクロウェルに結合された、放射性ラ ベルされた（ＮＡＮＰ）　５０であった。ＰＩ３−２６又は（ＮＡＮＰ）　１１ ２−２６は、結合を阻害しないが、所ろが（ＮＡＮＰ）　３及び（ＮＡＮＰ）　 ３−１２−２６は結合を阻害したことが見出された。

その結果は、モノクローナル抗体、８３．１１が、ＰＮ２−２６により結合され たウシ血清アルブミンへのその結合を、（ＮＡＮＰ）３−１２−２６の添加によ って阻害され得ることを示す。同様に、マラリア寄生体−免疫マウスから単離さ れた、（ＮＡＮＰ）　５０に対して特異的な千ツク■〕−ナル抗体は、（ＮＡＮ Ｐ）　３−１２−２６ベブチドによってその結合を阻害され得る。これらの結果 は、合成分子のＮＡＮＰ部分に対して特異的な抗体が、追加のクラス■結合ペプ チドの存在下で１ハブテン′を認識することができることを再び示す。

（ＮＡＮＰ）　５０又は（ＮＡＮＰ）　３が免疫化のために使用される場合、（ ＮＡＮＰ）　５０に対する抗体を合成することができないマウスは、マウスの対 を、（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６．　（ＮＡＮＰ）　５１）、　（ＮＡＮＰ） １−１２−２６及び（ＮＡＮＰ）　２−１２−２６により免疫化した。その血清 力価を、方法の士゛クションに示されたような直接的な結合アッセイによって、 １次免疫化の後、７日目、２次追加免疫化（対照の血清は検出可能な結合を与え なかった）の後２０日目、又はｉｏ０日目いづれかの日に試験した。（ＮＡＮＰ ）３−１２−２６により免疫化されたマウスからの血清（２次追加免疫化の後、 １０日目）は、従来の放射性ラベルされた抗−マウスグロブリンＲＩＡによって 、サー＝カムスボロゾイトファルシバラノ−（Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔ ｅ　ＦａＮｃｉｐａｒｕｍ）に直接的に結合することが見出された。

リンパ節由来のＴ−細胞の増殖は、（ＮＡＮ［７＞３−１２−２６により免疫化 された後、８日目にマウス中に観察された。チミジンの取り込みにより゛Ｔアッ セイれる場合、免疫原、ＰＩ３−２６、（ＮＡＮＰ）　１−１２−２６及び（Ｎ ＡＮＰ）　２　１２　２６によるＴ−細胞増殖が、見られた。これらの同じマウ ス中において（ＮＡＮＰ）　３又は（ＮＡＮＰ）　５０による増殖は見られない 。これらの結果は、免疫原上でのクラス■分子結合性配列の存在が、これらのマ ウス中において単独では不活性である（ＮＡＮＰ）　３に、Ｔ−細胞刺激性活性 を付与するのに十分であることを示す。すべてのＴ−細胞活性は、クラス■結合 配列に向けられる。これらの結果は、抗体活性が、免疫原の１２−２６部分上に 存在する（ＮＡＮＰ）配列に対して、（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６により免疫 化されたマウス中に誘発され、及びそのような“活性化”配列が不活性配列に付 加され、そしてその不活性配列に対する抗体を産生ずることを示唆する。

類似する実験において、（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６ＬＦにより免疫化された Ｂａ１ｂ／ｅマウスは、免疫原に対するＴ−細胞増殖応答（免疫化の後１６日目 に膵臓から取られた）を示したが、しかしくＮＡＮＰ）　３−１２−２６　（Ｐ Ｉ３−２６のみに対しても）に対してはそうでなかった。この結果は、免疫原の （ＮＡＮＰ）部分に対するＴ−細胞反応性の誘発が存在しないことを再び示す。

この場合、上記項に記載されたように、（ＮＡＮＰ）　３−１１２６は、クラス ■分子に結合し、そして活性化のためにＴ−細胞に付与することができることは 明らかである。（ＮＡＮＰ）　３−１２−２６ＬＦにより免疫化されたマウスは また、（ＮＡＮＰ）　５０ポリマーに対して特異的な抗体も誘発する。これらの 抗体は、μ及びｒ−１クラスのものである。

免疫原の（ＮＡＮＰ）部分へのＴ−細胞の反応性を検出するための無能性は、Ｂ ａ１ｂ／　ｅマウスの性質であり、そして免疫原の性質ではない。（ＮＡＮＰ） 　３−１２−２６により免疫化された５７Ｂ６／Ｈ−２６は、（ＮＡＮＰ）　３ 又は（ＮＡＮＰ）　５０に対して直接的に応答することができ、そして免疫原の （ＮＡＮＰ）部分に対するＴ−細胞反応性を伴って、（ＮＡＮＰ）　３−１２− ２６による免疫化に応答することができる。

上記結果は、Ｂ−及び／又はＴ−細胞を刺激すること又はＢ−及び／又はＴ−細 胞を不活性化することに関して、広範囲の種類の情況、すなわちくイン　ビトロ 及びイン　ビボで免疫系を調節することにおける本発明の能力及び広さを示す。

本発明は、特定の出来事に応答して及びさらに宿主の情況、すなわち宿主の移植 抗原に対して、１又はそれよりも多くのサブセットのリンパ球を選択することに おいて卓越した特異性を提供する。特定の宿主の移植抗原の多量性領域をまねる 能力によって、Ｔ−細胞免疫系が実質的に不活性化され得る。

対照的に、目的の宿主の移植抗原に結合するためのコンセンサス配列を変えるこ とによって、１又は少々のサブセットのリンパ球を特異的に活性化することがで き、予防接種の目的、病原性侵入体への増強された応答、又は免疫系による保護 に関連する他の出来事のために刺激された免疫系を提供する。

さらに、天然の組織への攻撃に関するリンパ球を不活性化することによって、自 己免疫系を調節することができる。従って、細胞の機能に関して、特定の細胞を 増強し又は減じるために本発明の広範囲な使用が存在する。

本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願は、本発明が関係する当業者 の熟練のレベルを示す。本発明におけるすべての出版物及び特許出願は、あたか もそれぞれ個々の出版物又は特許出願が、引用によって組込まれることを特別且 つ個々に指摘されているかのように、それと同じ程度に引用によって組込まれる 。

前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ測的にいくらか詳細に記載され ているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

ＦＩＧ、１ 移植抗原モデル ＦＩＧ、　２ 抗原の濃度　（ＩＬＭ） 抗原の濃度　（、ｕＭ） ○ ′−３３」　コＥ −ｉ：　＝　ｇ　ご　ご 国際調査報告 ｐＣＴ１ロ５Ｆ１７／Ｑｌへ１ｙ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．第１抗原のエピトープに対する細胞系の免疫応答を調節するための方法（こ こで、前記細胞系が前記エピトープに対して免疫学的に応答し、前記細胞系が第 １移植抗原によって制限されたＴ−細胞及び前記第１移植抗原を含有する細胞を 含んで成る）であって： 前記第１抗原の免疫優勢配列の少なくとも８個のアミノ酸配列の第１ドメイン又 は前記移植抗原によって制限された、その突然変異化された配列を含んで成る分 子と前記細胞系とを組合し、ここで前記突然変異は、前記移植抗原によって制限 されたアグレトープのコンセンサス配列又は前記移植抗原の多型性領域の配列か ら実質的に成る配列との高い適合性をもたらし； 但し、前記第１ドメイが前記免疫優性配列を含む場合、前記ドメインは、前記第 １抗原よりも他の分子の第２エピトープ部位又は前記第１抗原の天然の配列以外 によって連結された前記第１抗原のエピトープ部位に連結され；それによって、 前記エピトープに対する前記細胞系の免疫応答が調節寄れることを含んで成る方 法。
2. ２．前記細胞系が完全な血液である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記免疫優性配列が、前記移植抗原によって制限されたアグレトープのコン センサス配列に適合せしめるために、突然変異化された配列である請求の範囲第 ２項記載の方法。
4. ４．前記第１ドメインが、前記移植抗原の多型性領域の配列を含んで成る請求の 範囲第１項記載の方法。
5. ５．前記第１ドメインが第２エピトープ部位に連結される請求の範囲第１項記載 の方法。
6. ６．第１抗原のエピトープに対する細胞系の免疫応答を調節するための方法（こ こで、前記細胞系が前記エピトープに対して免疫学的に応答し、前記細胞系が第 １及び第２移植抗原の少なくとも１つによって制限されたヘテロ接合性Ｔ−細胞 及び前記第１及び第２移植抗原を含有するヘテロ接合性細胞を含んで成り、前記 移植抗原のそれぞれはコンセンサス配列に応答する）であって： 前記細胞系と少なくとも２種の分子とを組合し、前記それぞれの分子は、前記第 １抗原の免疫優性配列の少なくとも８個のアミノ酸配列の第１ドメイン又は突然 変異化されたその配列を含有し、前記突然変異は前記第１又は第２移植抗原のい づれかによって制限されたアグレトープのコンセンサス配列又は前記第１又は第 ２移植抗原の多型性領域から実質的に成る配列との高められた適合性をもたらし ；それによって、前記２種の分子のうち第１分子は前記第１移植抗原に結合し、 そして前記２種の分子のうち第２分子は前記第２移植抗原に結合し； それによって、前記エピトープに対する前記細胞系の免疫応答が調節されること を含んで成る方法。
7. ７．前記細胞系が完全な血液である請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記分子が前記第１エピトープとは異なる第２エピトープに接合され、そし て前記第１抗原とは異なる第２抗原と交叉反応する請求の範囲第６項記載の方法 。
9. ９．前記第２エピトープが病原菌のエピトープである請求の範囲第８項記載の方 法。
10. １０．前記病原菌がウィルスである請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．前記病原菌が寄生生物体である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．前記寄生生物体がプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）である請求の 範囲第１１項記載の方法。
13. １３．前記病原菌が細菌である請求の範囲第９項記載の方法。
14. １４．第１抗原のエピトープに対する哺乳類宿主の免疫応答を調節するための方 法（ここで、前記哺乳類宿主が前記エピトープに対して免疫学的に応答し、前記 哺乳類宿主が第１及び第２移植抗原の少なくとも１つによって制限されたホモ接 合性又はヘテロ接合性Ｔ−細胞及び前記第１移植抗原を含有するホモ接合性細胞 又は前記第１及び第２移植抗原を含有するヘテロ接合性細胞を含んで成り、前記 移植抗原のそれぞれはコンセンサス配列に応答する）であって：存在する前記移 植抗原のそれぞれのために前記宿主分子に付与し、それぞれの分子は、前記第１ 抗原の免疫優性配列の少なくとも８個のアミノ酸配列の第１ドメイン又は突然変 異化されたその配列を含有し、前記突然変異は存在する移植抗原によって制限さ れたアグレトープのコンセンサス配列又は前記移植抗原の多型性領域から実質的 に成る配列との高められた適合性をもたらし； それによって、前記分子はそれらのそれぞれの移植抗原に結合し； それによって、前記エピトープに対する前記哺乳類宿主の免疫応答が調節される ことを含んで成る方法。
15. １５．前記分子が前記第１エピトープとは異なる第２エピトープに接合され、そ して前記第１抗原とは異なる第２抗原と交叉反応する請求の範囲第１４項記載の 方法。
16. １６．移植抗原を有するリンパ球の第１抗原の第１エピトープに対する免疫応答 を調節するために２種の新規分子を含んで成る組成物であって、前記分子のそれ ぞれが、前記第１抗原の免疫優性配列の少なくとも８個のアミノ酸配列の第１ド メイン又は前記移植抗原によって制限された、その突然変異された配列によって 特徴づけられ、前記突然変異が前記移植抗原によって制限された異なったアグレ トープのコンセンサス配列又は前記移植抗原の多型性領域から実質的に成る配列 との高められた適合性をもたらし；ここで前記分子のそれぞれが異なった移植抗 原に特異的に結合することを含んで成る組成物。
17. １７．前記分子が、前記第１エピトープとは異なり、そして前記第１抗原とは異 なる第２抗原と交叉反応する第２エピトープを含んで成る配列に接合された前記 免疫優性配列の突然変異化された配列によって特徴づけられる請求の範囲第１６ 項記載の組成物。
18. １８．前記分子のそれぞれが１００個よりも少ないアミノ酸の分子である請求の 範囲第１７項記載の組成物。
19. １９．前記分子のそれぞれが３０個よりも少ないアミノ酸の分子である請求の範 囲第１６項記載の組成物。
20. ２０．前記分子が前記コンセンサス配列を含有することによって特徴づけられる 請求の範囲第１６項記載の組成物。
21. ２１．前記第１抗原が病原菌の抗原である請求の範囲第１６項記載の組成物。
22. ２２．前記第１抗原又は異なった第２抗原のエピトープ部位を定義する配列に結 合された第１抗原の免疫優性配列の少なくとも８個のアミノ酸の突然変異化され た配列を含んで成る組成物。
23. ２３．前記エピトープ部位が前記第２抗原のエピトープであり、そして前記第２ 抗原が病原菌、腫瘍遺伝子、移植抗原又はリポ多糖の抗原である請求の範囲第２ ２項記載の組成物。
24. ２４．異なった第２抗原のエピトープ部位を定義する配列に結合された第１抗原 の免疫優性配列の少なくとも８個のアミノ酸の配列を含んで成る組成物。