JPH01501201A - 抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 成−生 この発明は新規な型の抗体および、特に新生組織形成性疾患（ｎｅｏｐｌａｓｔ ｉｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）の処置における標的細胞毒性剤（ｔａｒｇｅｔｅｄｃｙ ｔｏｔｏｘｉｃ　ａｇｅｎｔ）としての該抗体の使用に関する。

新生組織形成性疾患の処置のために多数の細胞毒性剤が開発されているにもかか わらず、この種の疾患の処置には困難な問題が残されている。最近の一つのアプ ローチとしては腫瘍細胞を破壊する二７エクター細胞再標的化現象［ｐｈｅｎｏ ｍｅｎｏｎ　ｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌｒｅＬａｒｇｅｔｉｎｇ（Ｅ　 ＣＲ）］を利用する試みがなされている。このアプローチにおいては、抗Ｔ細胞 と抗腫瘍抗原活性を有する二重特異性抗体が形成される。この技術の最初の応用 例においては［ステルツ（Ｓ　ｔａｅｒｚ）ら、ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ ）、１９８５年、第３１４巻、第６２８頁：ペレツ（Ｐ　ｅｒｅｚ）ら、ネイチ ャー、１９８５年、第３１６巻、第３５４頁：リウ（Ｌｉｕ）ら、プロシーデイ ンダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ ニーニス−１−−（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｕ　Ｓ　Ａ）、１９ ８５年、第８６４８頁］、二価抗体フンシュゲートが化学的な方法によって形成 されているが、その後の該技術の応用例においては［ステルツおよびベヴアン（ Ｂ　ｅｖａｎ）、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・ザ・サイエンシズ・オブ・ザ・ニーニスニー、１９８６年、第８３巻、第１ ４５３頁およびイムノロジー・トウデー（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ ）、１９８６年、第７巻、第２４１頁］、ハイプリドーマ技法を用いて二重特異 性抗体分子が生産されている。二重特異性抗体は、腫瘍細胞もしくは別のをの標 的細胞（例えば、ウィルス感染細胞等）およびＴ細胞に結合することによってそ の効果を発揮し、これにより、後者の作用によって前者の破壊がもたらされる。

しかしながら、前記の文献等に記載されているようなエフェクター細胞再標的化 現象の利用には種々の固有の不利益が伴う。特に、二重特異性抗体は一般に、身 体に備わっている細胞の自然致死機構（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｍｅ ｃｈａｎｉｓｍ）のうち、腫瘍細胞を死滅させる機構のみをある程度利用するに 過ぎない、この発明の目的は、エフェクター細胞再標的化現象の利用を含む身体 の細胞の自然致死機構を利用することによって腫瘍細胞を破壊させる改良法を提 供することである。

従って本発明には、致死機構を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフ ィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重 特異性抗体分子および該抗体分子の結合アフィニティーを保有するその７ラグメ ントが含まれる。

本発明による二重特異性抗体は、二重特異性であるが、２種の軽鎖と２種の重鎮 が存在する正常な形態の抗体分子を有する。従って、本発明による二重特異性抗 体分子は、１９８５年に発表されＩ；前記のステルツらの論文、ペレツらの論文 およびリウらの論文に記載されている二重特異性抗体分子とは異なる。１９８５ 年に発表されたこれらの論文に記載された二重特異性抗体は２個の正常な抗体分 子の化学的な架橋によって形成されるフンシュゲートであって、４種の軽鎖と４ 種の重鎮を有する。１９８６年に発表されｔ；ステルツとベヴアンの論文に記載 された二重特異性抗体はコンジュゲートでない抗体分子から成るが、これらの分 子の結合アフィニティーは本発明による抗体分子の結合アフィニティーとはもち ろん異なり、また著者は、該分子によるＴ細胞の死滅に係わるこれらの分子の使 用における固有の問題を認識していない。本発明はさらに、従来全く認識されて いなかったこの種の問題の解消に向けられる。１９８５年に発表されたリウらの 論文には、ヒトＴ３複合体に対する結合アフィニティーおよびヒトＢ−リンパ腫 の表面免疫グロブリンのイディオタイプに対する第二の結合アフィニティーを有 する抗体コンジュゲートが記載されている。この種のイディオタイプは、真正腫 瘍特異的移植抗原に対応し、抗体コンジュゲートを腫瘍細胞へ指向をさせるのに 使用される。従って、リウらの論文に記載された抗体コンジュゲートは本質的に は抗Ｔ細胞および抗腫瘍細胞アフィニティーを有しており、そのコンジュゲート 特性は別として、本発明による二重特異性抗体、即ち、抗腫瘍細胞もしくは他の 標的細胞アフィニティーを有する別の抗体と結合することによってＴ細胞に作用 する二重特異性抗体とは区別されるものである。

これらの抗体の主要な用途においては、上記の二重特異性抗体分子は、標的細胞 に対する結合アフィニティーを有する別の抗体と共に投与される。このような方 法により、身体の種々の細胞致死機構を作動させることができる。第一に、標的 細胞に対する結合１フイニテイーを有する抗体は標的細胞と結合し、Ｆｃ受容体 仲介致死機構、例えばに細胞、好中球および大食細胞を含む抗体依存細胞によっ て仲介される細胞素［Ａ　Ｄ　ＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ　−ｃｌｅｐｅｎｄｅｎ ｔ　ｃｅｌｌ　−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｃｙＬｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）］、大食細胞 および細網内皮系の細胞による食作用または補体活性によって、標的細胞を死滅 させる。第二に、この結果生ずる標的細胞／抗体系は、この系の免疫グロブリン アフィニティーによってさらに二重特異性抗体系と結合し、全体の系は、二重特 異性抗体系のＴ細胞アフィニティーによってＴ細胞と結合し、Ｔ細胞の毒性を利 用して標的細胞を破壊させる。

本発明による二重特異性抗体分子はＴ細胞に結合することによって作用してそれ らの毒性を伝えるが、抗体分子のＴ細胞結合アフィニティーは、致死効果をもｊ ；らすいずれのＴ細胞受容体に対して特異的であってもよい。従って、このうよ な受容体は、直接的またはＥｌｌのタイプの細胞もしくは他の仲介物の補助によ って間接的に致死効果をもたらすＴ細胞の機能を有していてもよい。また、受容 体は直接的に致死効果をもたらす細胞毒性Ｔｍ胞の機能もしくはＢｍ胞によって 致死効果を補助するヘルパーＴ細胞の機能、または自然もしくは人工のいずれか の別の間接的な様式によって致死効果をもたらす機能を有するものであってもよ い。直接的致死を活性化し得る受容体が特に重要であるが、多くの受容体は直接 的な致死様式と間接的な致死様式の両方に関連している。

特に、結合アフィニティーは、Ｔ細胞抗原特異的受容体（Ｔｉ）を含み、非常に 多数のＴ細胞上に存在するα鎖とβ鎖のうち一方もしくは両方を指向してもよく 、あるいは受容体と結合したＣＤ３ユニット全体（前述の７３）もしくは該ユニ ットに含まれる個々の鎖のうちの一つの鎖を指向してもよい。ヒトの細胞を用い Ｉ；研究によって、Ｔ細胞受容体は、ａ（Ｍｒ：約５０．０００）およびβ（Ｍ 「：約４０，０００）として同定される２種の鎖の複合体として存在することが 示され、これらの鎖は、免疫グロブリン遺伝子の場合と類似の様式によって体性 的に再配列された遺伝子によって遺伝暗号が指定される。

従って、各Ｔ細胞には、これらの２種の鎖に対して遺伝暗号を指定する遺伝子の 独特の再配列が伴う。これらの２種の鎖は、ＣＤ３複合体を含む少なくとも３種 のｆｆ１ｆの鎖、即ちγ（Ｍ　ｒ　：約２５，０００）、δ（Ｍ　ｒ　：約２０ ．０００）およびｃ（Ｍｒ：約２０，０００）として同定される鎖と関係するこ とが見出された。

既知のもしくは新規な受容体に対してＴ細胞結合アフィニティーを有する抗体は 、本発明者が開発したアッセイ法によって同定してもよい。大抵のハイブリドー マは分泌性抗体と同様に、細胞表面抗体を少量含む。例えば、ラットＩｇＧ２ｂ に対する抗体を生産するマウスハイブリドーマはその表面上に存在する、ラット ＩｇＧ２ｂに対する少量の抗体によって、ラットＩｇＧ２ｂ抗体をトラップする ことができる。ハイブリドーマ細胞を放射性標識、例えば”Ｃｒを用いて標識付 けし、次いでＴ細胞およびＴ細胞に対するモノクロナル性ラットＩｇＧ２ｂの混 合物と共に培養すると、ハイブリドーマ細胞は抗体に結合し、該抗体はＴ細胞に 結合し、これによってハイブリドーマの死滅かもＩ；らされ、その結果、放射能 が放出される。従って、このような方法は、適当なＴ細胞結合能（即ち、死滅を 誘導する能力）を有するラットＩｇＧ２ｂ抗体を検出する手段を提供する。適当 な形態のハイブリドーマを選択することｌ二よって、いずれの種（ｓｐｅｃｉｅ ｓ）およびクラスもしくはサブクラスの抗体間においてこのようなスクリーン（ ｓｃｒｅｅｎ）をおこなうことができる。このようなアッセイ法によって検出さ れる抗体を生産するハイブリドーマは、以下に記載する方法！こより、本発明に よる二重特異性抗体を調製する場合に使用してもよい。

抗−非ヒト細胞／抗−免疫グロブリン二重特異性抗体分子は特にリサーチとの関 係で重要で、例えばラットやマウスの腫瘍のような動物腫瘍を用いる細胞死滅化 に対する重要な必要条件を調べる場合のモデル系として重要である。しかしなが ら、本発明の重要な主要適用分野はヒトの医学の分野である。従って、ヒトＴ細 胞を指向する第一結合アフィニティーを有する二重特異性抗体は特に重要で、こ のような抗体は最も普通には、ヒトの体内に存在する標的細胞に対する結合アフ ィニティーを有する別の抗体と併用される。上記のようなアッセイ法を使用する ことにより、ヒトＴ細胞に対する結合能を有するモノクローナル抗体を生産する ハイブリドーマから、Ｔ細胞細胞毒性を誘発し得るものを選択することが可能で ある。このような抗体としては、実旌例２に記載されたハイブリドーマＹＴＨ１ ２，５，１４，２およびすべての関連サブクローンによって生産されるラットＩ ｇＧ２ｂ抗体が例示される。この抗体はＴ細胞抗ｌＣＤ３と結合するが、異なっ た特異性を有する他の抗体も同様にして選択してもよい。その他の抗体としては 次のものが例示される＝ハイブリドーマＹＴＨ６５５（５）６およびＹＴＨ６１ ６，７，ｌ　Ｏによって生産される抗−ヒトＣＤ２ラットＩｇＧ２ｂ抗体［タイ エ（Ｈ，Ｐ。

Ｔｉｇｈｅ）の博士論文［白血球の機能に影響を与える細胞表面抗原に対するモ ノクロナル抗体」、ケンブリッジ大学（１９８７年）］、実施例３に記載された ハイブリドーマ０ＫＴ３によって生産される抗−ヒトＣＤ３マウスＩｇＧ２ｂ抗 体、カール（Ｋ　ｕｒｒ　ｌｅ）らによって列挙されに一群の抗ＣＤ３マウスＩ ｇＧ２ｂ抗原［白血球タイピング■、第１巻、ヒトＴリンパ球、ラインヘルツ（ Ｒｅｉｎｈｅｒｚ）ら編、スプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ） 、１９８５年、第１３７頁］および［ヒト白血球分化抗原、白血球タイピング■ および白血球分化抗原に関する第３回国際研究集会と会議」の予稿集［マクマイ ケル（ＭｃＭ　１ｃｈａｅｌ）編、オックスフォード大学プレス、１９８７年］ に記載された種々の抗体、特にＣＤ３ユニツトおよびＴｉ受容体に対する抗体お よび特定の抗ＣＤ２抗体。すべてのこれらの抗体を生産するハイブリドーマはも ちろん誘導体の形態でレフロン（ｒｅｃｌｏｎｅ）もしくはサブクロン（ｓｕｂ ｃ　１ｏｎｅ）として使用してもよく、あるいは類似の特異性を有する相似ハイ ブリドーマを使用してもよい。

本発明による二重特異性抗体の第二の結合アフィニティーは、抗体免疫グロブリ ン中に存在する多様な結合サイトのいずれかを指向していてもよく、例えばアン チアロタイプ、アンチアイソタイプ（特にサブクラス）、アンチスピーシズおよ び特異性は若干劣るが、アンチイディオタイプのものであってもよい。（「アイ ソタイプ」という用語は当該分野においては、特定のクラスおよび／またはサブ クラスを指定するのに使用されるので、ラットの場合は、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ １．ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃは各々別のアイソタイプを構成す る。今の場合、アンチアイソタイプ結合アフィニティーは最も普通にはアンチサ ブクラスであり、例えば抗ＩｇＧよりも抗１ｇＧ１等であるが、ＩｇＭの場合の ように、サブクラスが存在しないときには、該アフィニティーは特にアンチクラ スとすることが可能である。）免疫グロブリンに対するこの種のタイプの結合ア フィニティーのほかに、二重特異性抗体分子の免疫グロブリンアフィニティーは 、該抗体分子の７ラグメント、例えば以下に記載するような抗標的細胞抗体の７ ラグメントＦ（ａｂ’）２等の生成によってもたらされる免疫グロブリン中のサ イトを指向してもよい。あるいは、該アフィニティーは、免疫グロブリンにハプ テンを結合させることによって免疫グロブリン上に人工的に形成されるサイトに 対するものであってもよい。抗ハプテン結合に基づく免疫グロブリンに対するこ の種のアフィニティーは、例えば、フルオレセインインチオシアネートを用いて 標識付けした免疫グロブリンまたはビオチニル化した（ｂｉｏｔ　１ｎｙｌａｔ ｅｄ）免疫グロブリンと共に利用してもよい。

免疫グロブリンの特異性は広範囲に及ぶものであるが、一定の優劣がある。本発 明による二重特異性抗体分子の主要な用途は間接的なＥＣＲであり、この場合、 該抗体分子の標的細胞への結合は、標的細胞に対する結合アフィニティーを有す る別の抗体分子を介しておこなわれる。従って二重特異性抗体分子が結合する免 疫グロブリンを、直接的なＥＣＲをもたらすようなものにすることも可能である が、好ましくは、免疫グロブリンを、別の抗標的細胞抗体を使用せずに、二重特 異性抗体分子が細胞、特に腫瘍細胞を標的化するようにするものにしないことで ある。免疫グロブリンは細胞表面抗原として作用するものでないものが好ましく 、特に腫瘍細胞表面上に存在する抗原でないものが好ましい。免疫グロブリン特 異性の劣るタイプは、内生的に合成されて発現される細胞表面免疫グロブリン、 特に腫瘍細胞表面上に発生するものに対する特異性である。アンチイディオタイ プアフィニティーは、細胞表面抗原としての多くのイディオタイプの機能および アンチイディオタイプの抗体／抗原結合のブロック機能に関しては、劣る特異性 の特別な場合である。細胞表面免疫グロブリンとイディオタイプを含む特異性の 劣る特別なものとしては、リウらの前記文献に記載されているようなヒトＢ−リ ンパ腫の表面免疫グロブリンのイディオタイプであって、腫瘍特異性細胞表面抗 原として機能するものが例示される。

しかしながら、アンチ標的細胞抗体を二重特異性抗体と併用するに際し、前者を 最大限の許容範囲内で選択する場合には、後者の免疫グロブリンアフィニティー は可能な限り非特異的にするのが好ましい。もっとも、このような好ましい選択 は、二重特異性抗体分子が生体内で使用され、また、患者の体内における望まし くない副反応が可能な限り回避されることを条件とする。実際上は、二重特異性 抗体分子と患者の体内に本来的に存在する免疫グロブリン分子との間の望ましく ない反応を回避する最も簡単な方法は、Ｔ細胞受容体結合アフィニティーと関係 する種以外の種に対して免疫グロブリン結合アフィニティーをを関係させること である。一般に、前者の種はヒトであり、後者の種は他の哺乳類の種、例えばラ ビットおよび特にマウスまたは特にラットである。従って、例えば二重特異性抗 体を、以下に説明するようにして、種々のクラスの抗体、特にＩｇＭ抗体とＩｇ Ｇ抗体（後者の種々のサブクラスのものを含む）と反応させるのが便利である。

さらに、結合アフィニティーが種全体に対しては特異的でなく、例えば少なくと もラットとマウスの両方の抗体に対する結合が可能な場合も有利である。

しかしながら実際の条件下では、これには必要な要件が多過ぎるので、ラットも しくはマウスおよびこれらの異なったサブクラスに対して特異的な小グループの 抗免疫グロブリン抗体を使用するのが適当である。

抗免疫グロブリン特異性に関して重要な点は、それが自己反応性をもたらさない ということである。例えば二重特異性抗体分子自体がラットＩｇＧ２ｂ重鎖とラ ットのカッパ軽鎖から成る場合には、抗免疫グロブリン特異性からは抗ラットＩ ｇＧ２ｂと抗ラットカッパが排除されるべきである。以下の実施例２に記載の二 重特異性抗体分子は抗体ＹＴＨＩ　２．５．１４．２（ＣＤ３抗原に対して特異 的なラムダ軽鎖を有するラットＩｇＧ２ｂ）および抗体ＲＧｌ　ｌ／１５．５（ ラットのカッパＩｂアロタイプに対して特異的なカッパ軽鎖を有するマウスＩｇ Ｇ２ａ）とのハイブリッドである。自己反応性をもＩ；らさないこのコンビネー ションは、ラットのカッパＩｂアロタイプ軽鎖を有するラット抗体のいずれとも 併用することができる。

本発明による二重特異性抗体と併用される抗標的細胞抗体に関しては、これらは 、標的細胞の表面上に存在するいずれの抗原に対して結合アフィニティーを有し ていてもよい。標的細胞は、身体から有利に採取されるいずれの細胞であっても よい。このような細胞としてはウィルス性感染細胞が例示される（ウィルス自体 は通常はＴ細胞によって攻撃されない）。感染ウィルスとしては種々のタイプの ウィルス、例えばインフルエンザや狂犬病のウィルス、寄生された細胞および寄 生虫自体、例えばマラリア、癩病、トリパノゾーマ症および住血吸虫症等の原因 となる寄生虫並びに条虫や他の寄生虫、例えば矯虫等が挙げられる。しかしなが ら、好適な標的細胞は腫瘍細胞であり、抗標的細胞抗体は腫瘍に関係するいずれ の抗原に対しても結合アフィニティーを有する。理想的な状態は、腫瘍特異性抗 原、即ち、腫瘍細胞上のみに存在して正常な細胞上に存在しない抗原に対するア フィニティーを有することである。ＢＣＬＬのようなり細胞悪性腫瘍の処置に用 いられているＢ細胞１ｇイディオタイプは、現存するこの種の抗原の非常に少な い例のうちの一つであり、実際には、腫瘍に関係する抗原は正常な細胞上にも存 在するであろう。好ましくは、抗原は腫瘍細胞上においてより高い濃度もしくは 適当な状態で異常に発現され、これによって腫瘍細胞を用いる抗体抗原反応のレ ベルが高められるが、このことは必ずしも完全に必要なわけではない。例えば、 腫ＭＭｉ胞と正常な造ＩｒｎＭｊＪ胞との間に分化がない極端な場合においても 、処置に伴う正常細胞への毒性効果は、髄移植組織の使用、または該３１！、Ｒ 前に患者自身の骨髄を採取し、これを腫瘍細胞を除去するＩ；めの生体外処理に 付した後、元に戻すことに拮抗させることができる。特に重要な抗腫瘍抗体とし ては次のものが例示される：ヒト白血球分化抗原に関する国際研究集会（パリ、 １９８０年；ボストン、１９８３年；オックスフォード、１９８６年）によって 標準化されて特性を付与されたモノクロナル抗体群によって認識された造血系の 分化のクラスターを限定する抗原に対する抗体、および全身急性リンパ芽球白血 病に関係する抗原（ＧＡＬＬ）、ヒトの結腸癌腫に発現される癌胚抗原およびヒ トの黒色腫に関係スるガングリオシドＧＤ３に対する抗体。特別なものはヒトの Ｂ細胞分化抗原ＣＤ１９であり、該抗原は正常なり細胞および多くの悪性のＢ細 胞やＢ細胞ライン上に発現される。

抗原的細胞抗体は伝統的な技法によってポリクロナル調製物として調製してもよ いが、ハイブリドーマ技法、例えば米国特許第４゜１７２．１２４号明細書およ び当該分野の広範囲の文献に記載されているハイブリドーマ技法を用いることに よってモノクロナル抗体として生産するのが簡便である。

ここに記載する二重特異性抗体分子は、伝統的な技法もしくはハイブリドーマ技 法によって調製されてもよい２種の抗体、即ち、第一の結合活性を有する抗体と 第二の結合活性を有する抗体のそれぞれ半分の化学結合によって調製してもよい 。しかしながら、本発明による特に好ましい二重特異性抗体分子は、単一特異性 抗体ではなくて二重特異性抗体の生産用に修正したハイブリドーマ技法によって 直接生産したものである。二重特異性抗体を調製するだめのこのような技術は、 一般的には、主として、ハイブリドーマ技法によって生産される二重特異性抗体 分子に関するヨーロッパ特許出願第００６８７６３号およびＰＣＴ出願第ＷＯ３ ３１０３６７９号各記載書に記載されている。二重特異性抗体および抗標的細胞 抗原の両方の調製に使用する骨髄腫出発物質としては、ヨーロッパ特許第０Ｏ１ ４５９号明細書に開示されたＹ３−Ａｇ１．２．３骨髄腫（Ｃ，Ｎ。

Ｃ，Ｍ、Ｎｏ、Ｉ　０７８）、ヨーロッパ特許第００４３７１８号明細書に開示 されたＹＢ２／３．０．Ａｇ、２０骨髄腫、骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ａ、 Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、ＣＲＬ　ｌ　５９７）、骨髄腫ＮＳ　ｌ／１−Ａｇ４　１　 （Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，Ｎｏ、Ｔ　Ｉ　Ｂ　ｌ　８）および骨髄腫Ｐ３［ステルツら 、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩ　ｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）、１９８５年、第１３４巻、第３９９４頁〜第４０００頁］、並びにヨ ーロッパ特許出願第００６２４０９号、同第０１４８６４４号、英国特許第２０ ８６９３７号および米国特許第４５２９６９４号各明細書等記載及されている種 々のヒト骨髄腫等が例示される。各々のハイブリドーマは、軽鎖を発現しない骨 髄腫または骨髄腫軽鎖損失変異型、即ちＨＬＫではなくてＨＬから誘導するのが 好ましい。本発明による二重特異性抗体の調製に使用する技術は、英国特許出願 第２１４４１４７Ａ号明細書に記載されている技術と非常に近似しており、後者 は融合パートナ−の結合アフィニティーが相違するが、本発明の場合に適用して もよい。しかしながら、本発明者はこれらの技術の特に有用な変形法を開発した 、二重特異性抗体分子の調製に関して先に述べた方法においては、２つのハイブ リドーマ融合過程が含まれるが、本発明の場合に＋ｊ、２つのハイブリドーマの うちの一方がＴ細胞を指向する抗体を生産し、他方は免疫グロブリンを指向する 抗体を生産する。２種のハイブリドーマを実施例において説明するように、常套 の方法によって融合させ、二重特異性抗体分子を分泌するハイブリドーマを調製 してもよく、該抗体分子はそれらが誘導されたハイブリドーマの各々の特異性を 有する。ハイブリドーマを生産する融合法において最も困難な段階のうちの一つ は、融合混合物から所望のタイプの二重特異性ハイブリドーマを選択することで あり、本発明者が開発した方法には、特にこの点に関する特徴が含まれる。

この方法で使用する第一のハイブリドーマは、酵素、例えばチミジンキナーゼ（ ＴＫ）または特にヒポキサンチン−グアニン　ホスホリポシルトランスフェラー ゼ（ＨＰ　ＲＴ）等が欠乏していてもよい薬剤選択標識を有していてもよい。こ のようなハイブリドーマは、５−ブロモウラシルデオキシリポースもしくは２− アミノプリン（ＴＫ用）または８−アザグアニンもしくは特に６−チオグアニン （ＨＰＲＴ用）を含有する成長培地から細胞を選択することによって得られる。

適当な薬剤を含有する培地での成長用に選択される細胞は問題の酵素を欠乏して おり、ＴＫとＨＰＲＴのいずれの場合も、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよ びチミジン（ＨＡ　Ｔ）を含有する培地では成長できない。何故ならば、アミノ プテリンはプリンとピリミジン合成への主要な経路を阻害し、また、ＨＰＲＴも しくはＴＫの欠乏によって、正常な細胞が有する機能であって、プリンを生成す るヒボキサンチンおよびピリジミンを生成するチミジンを利用する機能が失なわ れるからである。

この方法に使用する第二のハイブリドーマ不可逆的な生化学的阻害剤、例えばジ エチルピロカルボネートおよび特にヨードアセトアミドを致死量用いる処理に付 し、これによってその機能を抑止する。

この種の阻害剤は細胞の機能を抑止するが、免疫グロブリン発現とＨＰＲＴ酵素 に対して遺伝暗号を指定する細胞のＤＮＡは損傷させない。このような処理に付 した細胞は、洗浄によって過剰の阻害剤を除去した後、使用Ｉこ供される。細胞 の全体的な構造は処理後、数時間はそのままに保持され、融合は典型的には０． ５〜１時間以内におこなわれる。

２種のハイブリドーマの融合によって、両方のハイブリドーマからのＤＮＡを保 有する融合細胞系が生産され、該融合細胞系においては、阻害剤処理に付された 細胞からの活性な酵素機能の短時間の抑止は、他方のハイブリドーマから誘導さ れた酵素によって相補される。２種のハイブリドーマの融合の後、融合混合物は 阻害剤を含有しない培地中で培養される。この場合、被毒処理に付された未融合 ハイブリドーマの細胞は徐々に死滅するが、他の未融合ハイブリドーマの細胞お よび融合細胞は生存する。選択は、例えばＨＡＴ含有培地を用いて開始させる。

この場合、ＴＫまたはＨＰＲＴを欠く未融合ハイブリドーマの細胞は死滅し、融 合細胞は生存するが、これは酵素欠失が他のハイブリドーマからのＤＮＡによっ てもたらされるからである。ヨードアセトアミドは１〜２４時間以内に細胞死を もたらすが、一般により高レベルの雑種形成は、選択を２〜３日間遅らせること によって得られるが、これは、被毒細胞に由来するＨＰＲＴ発現が十分に起こる ためには若干の時間がかかるからであると考えられる。さらに最良の結果は、未 処理細胞対ヨードアセトアミド処理細胞の比を１またはそれ以上、例えば１：１ −１０：ｌにすることによって得られる。

両方のタイプの未融合ハイブリドーマ細胞を取り除いた後の細胞混合物からは、 常法により、所望の二重特異性を有するモノクロナル抗体を分泌するハイブリド ーマを単離する。このようなハイブリドーマを常套の方法によって生体外または 生体内において培養してモノクロナル抗体を生産してもよい。

本明細書に記載されｔ；タイプの二重特異性抗体の使用はそれ自体で、当該分野 で知られている二重特異性抗体の使用に比べて改良されたものであるが、本発明 の好ましい態様においては、これをさらに改良することができる。二重特異性抗 体を、前述の自然のＦｃ受容体介在致死機構によってＴ細胞に結合させ、該Ｔ細 胞の死滅を誘発させることは可能である。前記のステルツおよびベヴアンの論文 においてはこれに関しては何んら言及はなされていないが、これは従来の二７エ クター細胞再標的化法の重大な欠陥である。何故ならば、この方法においては、 Ｔ細胞毒性によってのみ腫瘍細胞を死滅させるからである。本発明の場合には、 他の腫瘍致死機構も含まれるのでこの問題はそれほど重大ではないが、腫瘍細胞 の達成し得る致死効率は低下する。従って、本発明の好ましい態様においては、 Ｔ細胞破壊の問題は、以下の２つの方法のうちのいずれかによって緩和させるか 、好ましくは実質的に回避させる。

第一の方法は、本発明による二重特異性抗体分子中の重鎮の適当なコンビネーシ ョンを利用することによってこの問題が克服されるという認識に基づく。免疫グ ロブリンの全体構造は、個々の鎖の種々の球状ドメインの相互作用によって決定 される。これらの相互作用は、鋼内と鋼量のジスルフィド架橋を含む共有結合お よび蛋白質と炭水化物の両方の残基を含む非共有結合的相互作用から成る。致死 機構を活性化するためには、補体成分とＦｃ受容体を異なった抗体中に存在する 構造部分へ結合させなければならない。しかしながら、抗体の異なった種、アイ ソタイプおよびアロタイプはそれらの蛋白質シーケンス部分において相違性を有 し、これらのシーケンスの他の部分においては多くの類似性を有している。従っ て、異なりｊ；免疫グロブリンは補体成分とＦｃ受容体と異なった相互作用をす る。さらに、ハイブリッド抗体分子が形成される場合には、これらの相互作用に おいて非常に重要な部分のシーケンスにおいて２種の重鎮は相違し、このために 異なったコンビネーションの特性が影響を受ける。

従って本発明には、致死機構を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフ ィニティーおいて免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する抗体 分子であって、該分子中の２種の重鎮が、Ｔｍ胞の破壊をもたらす身体の自然の 致死機構を利用する抗体分子の機能が低減されるように選択された抗体分子が含 まれる。

抗体を構成する免疫グロブリンはいくつかのクラスに分類してもよく、主要なも のはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥよって同定されるものである が、このうち特にＩｇＡおよび特にＩｇＧはさらにサブクラスに分類してもよい 。本発明にょる二価抗体分子は好ましくは同じクラスの重鎮を２種有し、該重鎮 は同じクラス内の異なったサブクラスのものであってもよく、また、同一もしく は異なったサブクラスのものであってもいよが、異なった種に関するものである 。ヒト、ラットおよびマウスは最も重要なものであるが、他の種、例えばラビッ トの免疫グロブリンを使用してもよい。ラットとマウスおよびラットとラットの 免疫グロブリンのコンビネーションは、マウスとマウスのコンビ不−シ目ンより も、対応するハイブリドーマの安定性の観点から好ましい。

Ｆｃ受容体介在致死機構、特にＡＤＣＣに関して、本発明者は次の知見を得た。

即ち、重鎖のＴ細胞結合アフィニティー供与能は基本的に重要なものであるが、 該重鎮の免疫グロブリン結合アフィニティー供与能も重要である。第一の種の免 疫グロブリンの特定のサブクラスのものは、第二の種の細胞介在エフェクター機 構とは相互作用せず、また、同一の種とサブクラスの２種の重鎮が免疫グロブリ ン中に存在するときに相互作用するサブクラスのものを用いる場合には、２本の 重鎮の一方を、他の種もしくはサブクラスから適当に選択したものによって置換 することによってこの相互作用を妨げることが可能である。補体活性化機構に関 しては、重鎮のＴ細胞結合活性供与能は、発生する補体活性化のレベルを決定す るに際して、ＡＤＣＣに関する場合よりも、より重要な要因であってもよいが、 重鎮の免疫グロブリン結合活性供与能は、以下に説明するように重要な効果をな おもたらす。

本発明による二重特異性抗体分子に利用する重鎮の適当なコンビネーションを選 択する場合には、２種の重鎮が関係する種および抗体が投与される種はすべて重 要な要因となるということを認識しなければならない。例えば、マウスもしくは ラットにおいてＴ細胞を死滅させない重鎮の種とサブクラスのコンビネーション は、二重特異性抗体のＴ細胞結合アフィニティーに関連して種として選択される ヒトの場合にも同様に適用してもよい。前述のように、ヒトの重鎮は、本発明に よる二重特異性抗体分子中の重鎮の少なくとも一方として使用してもよいが、よ り好ましくは、同じクラスであって異なったサブクラスのヒトの重鎮を２種使用 する。しかしながら、ヒトの骨髄腫はマウスやラットの骨髄腫に比べて入手が困 難であるので、実際上は、重鎮用の哺乳類の種としてこれらの動物種を使用して もよい。

ヒトの場合、ＩｇＧクラスはＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ３および１ｇＧ４のサ ブクラスに分類されるが（ＩｇＡクラスはｒｇＡｌと１ｇＡ２のサブクラスに分 類される）、マウスとラットの場合にはＩｇＧクラスのみがサブクラスに分類さ れ、マウスの場合にはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよび１ｇＧ３に分類 され、ラットの場合にはＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ５　ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ａ に分類される（類似の名称を付したサブクラスは必ずしもマウスとラットにおい て類似の特性を有するものではない）。実際上は各々の重鎮は大抵の場合マウス もしくはラットのＩｇＡもしくはＩｇＥ、特にＩｇＭ、就中１ｇＧであり、最も 一般的にはＩｇＧサブクラス、特にマウスのＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａもしくはＩｇ Ｇ２ｂ（１ｇＧ３は一般的ではない）またはラットのＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａもし くはＩｇＧ２ｂである。（ＩｇＧ２ａは一般的ではない）。

Ｔ細胞結合活性を有する重鎮を選択する最も簡単な方法は、Ｆｃ受容体介在機構 によって問題となる種のＴ細胞死滅へ導かない、例えばラットもしくはマウスの クラスもしくはサブクラスを使用することである。特に、ＡＤＣＣ致死を回避す る簡便な方法は、１ｇＭクラスの！ｉ鎖を使用することであるが、この種のＭ鎖 は補体活性化によって極めて効果的に致死をもたらす場合がある。活性および一 般的に入手性の観点からは、ＩｇＧサブクラスの重鎮を通常は選択する。補体活 性化による致死を回避するための優先順位はマウスの場合はＩｇＧ１＞１ｇＧ３ ＞ＩｇＧ２ａ＝ＩｇＧ２ｂであり、ラットの場合はＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ａ）Ｉｇ Ｇ２ａ＞ＩｇＧ２ｂである。他のＦｃ受容体介在致死機構、特にに細胞を含むＡ ＤＣＣによる致死の回避に関する優先順位はマウスの場合はＩｇＧ２ｂ％　１ｇ Ｇ３およびＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ａであり、ラットの場合はＩｇＧ１、特にＩｇＧ ２ａおよびｒｇＧ２Ｃ＞ＩｇＧ　２ｂである。しかしながら、コンジュゲート（ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ではなくて、二重特異性抗体分子中の２種の重鎮間には密 接な相互作用があり、Ｔ細胞結合活性を有する重鎮は、致死を促進するマウスＩ ｇＧ２ａもしくはラットＩｇＧ２ｂのようなものであるが、免疫グロブリン結合 活性を有する適当な形態の重鎮、特に異なった種または異なったアイソタイプも しくはアロタイプのものを選択することによって該致死を妨げることができると いう知見が得られた。他のラットＩｇＧサブクラスのうちで、ラットＩｇＧ２ｂ 重鎖を不活性化する好ましいものはラットＩｇ（ｙ２ａまたは特にラットＩｇＧ ２ａ重鎖である。ラットＩｇＧ２ｂもしくはマウスＩｇＧ２ａのような活性重鎮 を用いる場合、種とのコンビネーション（例えばラットＩｇＧ２ｂ／マウスＩｇ Ｇ）もしくはサブクラスによる他の形態の重鎮とコンビネーションが例示される が、これは、ラットＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ｂまたはマウスＩｇＧ２ａ／マ ウスＩｇＧ２ａコンビネーションは一般に、ＡＤＣＣ機構や補体活性化機構によ る致死を促進するのに有効であると考えられるからである。異なったアロタイプ または特に異なった種もしくはアイソタイプの重鎮の使用は、抗Ｔ細胞重鎮が致 死をもたらす場合に微弱なレベルの有効性しか示さない場合、即ち実質的には効 果がない場合にも有効であり、例えばマウスＩｇＧアイソタイプの場合のように 、２種の機構のうちの一方のみにより、低レベルで効果をもたらす。このような 場合には、アイソタイプの類似のコンビネーションを使用してもよいが、異なっ た種もしくはアイソタイプを使用すると微弱なレベルの有効性をも低下させるこ とがテキ、適当な重鎖コンビネーションが得られる。一般に、Ｔ細胞の致死の低 減度合は、標的細胞に対するアフィニティーを有する重鎮が、Ｔ細胞に対するア フィニティーを有する重鎮と同じ重鎮（種、アイソタイプおよび好適にはアロタ イプ）である二重特異性抗体分子と比較することによって評価してもよい。

前述の知見を利用するほかに、簡単な試験法を利用することによって、本発明に よる二重特異性抗体に使用する適当な重鎮コンビネーションを決定してもよい。

二重特異性抗体分子に、Ｔ細胞の致死をそれ自体で誘発し得る、Ｔ細胞に対する 特定のモノクロナル抗体の重鎖／軽鎖コンビネーションを利用する場合には、こ のモノクロナル抗体を生産するハイブリドーマを、いずれかの無関係の結合アフ ィニティーを有するモノクロナル抗体の特定のタイプの免疫グロブリンを生産す るハイブリドーマと融合させることができる。このようにして得られる二重特異 性抗体は、第一の重鎖／軽鎖コンビネーションのＴ細胞致死能が、問題となるタ イプの免疫グロブリンの重鎖／軽鎖コンビネーションとのコンビネーションによ って打ち消されるかどうかを調べる試験に付される。例えば、Ｔ細胞に対するラ ットＩｇＧ２ｂ抗体を生産するハイブリドーマを、いずれかの無関係なラット１ ｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ａ抗体を生産するハイブリドーマと融合させることに よって、ＡＤＣＣ機構と補体活性化機構の両方によって致死を誘発するＩｇＧ２ ｂ重鎖の機構が保持されるか否かを調べることができる。別の方法は、クローン 化免疫グロブリン遺伝子の／％イブリドーマへのトランスフェクションである。

この場合、クローン化遺伝子はハイブリッド細胞内で発現され、生産される混合 免疫グロブリン分子に関して、ＡＤＣＣと補体経路の両方によるＴ細胞致死能を 評価する。

このような方法は、特に有用な重鎮コンビネーションを同定するのに有利である が、一般的には、種の差異またはアイソタイプ、即ちクラスもしくはサブクラス の差異は、二重特異性分子によるＴ細胞の致死を十分に低減させ、また、アロタ イプの多くの差異もこのような結果をもたらす。重鎮コンビネーションの選択に 関する別の基準は後述する。

Ｔ細胞の致死をもたらさない適当なコンビネーションが二重特異性抗体内に存在 するが、このような抗体を調製するために利用できる方法、特にハイブリドーマ 技法を用いる方法によって、抗体のコンプレックス混合物を得ることができ、こ れらのうちの一部のものは、二重特異性抗体の示さないＴ細胞毒性を示す。骨髄 腫に由来する軽鎖を発現しない２種のハイブリドーマから二重特異性抗体分子を 調製する際に得られる混合物中に存在していてもよい種々のタイプの異なった抗 体を第１図に示す。理論的には、２種の異なった軽鎖と２種の異なった重鎮のす べての可能なコンビネーションが起こり得るが（第１図においては、Ｔ細胞結合 活性を有する鎖は黒色の記号で示し、免疫グロブリン活性を有する鎖は白色の記 号で示す）、実際は、各タイプのうちの一部が必ずしも等しくはない割合で得ら れると考えられる。いずれのタイプの抗体もＴ細胞を破壊しないケースは、Ｔ細 胞結合アフィニティーををする二重特異性抗体分子重鎮が、Ｆｃ受容体介在致死 機構、例えばＡＤＣＣまたは補体活性化によるＴ細胞の致死を仲介しない場合の みである。この重鎮がＦｃ受容体介在致死機構によってＴ細胞の死滅をもたらす 場合には、タイプ２および４は、免疫グロブリン結合重鎖の特性に関係なく、こ のルートによって毒性を示し、また、免疫グロブリン結合重鎮が他の重鎮の活性 を打ち消すようなものでない場合には、タイプ２および４のほかにタイプｌおよ び５も毒性を示す。従って、タイプ１の二重特異性モノクロナル抗体分子は、抗 Ｔｍ胞に対する重鎮および該分子の抗免疫グロブリンのハーフ（ｈａｌｆ）との 適当なコンビネーションの選択によるＴ細胞の死滅をもたらさないが、タイプ２ および４はＴ細胞を死滅させる望ましくない機能を常に有している。

異なったラットＩｇＧコンビネーションを含む二重特異性抗体をヒトの治療に使 用する場合、抗Ｔ細胞／抗免疫グロブリンコンビネーションに関する有用性の順 位はＩｇＧ２ｂ／ＴｇＧ２ｂ＜ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａ（もしくは２　ｃ）＜　 Ｉ　ｇＧ　２　ａ（もしくは２　ｃ）／　Ｉ　ｇＧ　２　ａ（もしくは２ｃ）ま たはＩｇＧ２ａＣもしくは２ｃ）／ＩｇＧ２ｂである。何故ならば、第一のコン ビネーションは二重特異性分子としてＴ細胞に対して毒性があり、第二のコンビ ネーションは二重特異性分子との混合物中において毒性分子を生成させ、第三ま たは第四のコンビネーションはＴ細胞に対して毒性のある分子を生成しないから であり、混合物中に存在する他のタイプの分子は二重特異性分子に対する希釈剤 としての役割のみを果す。ヒトの治療において特に重要な他のラット■ｇＧコン ビネーションは、二重特異性抗体としてＴ細胞に対しては毒性はないが、タイプ ２および４の毒性分子を供与するＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１および特に、タイプｌ、 ２．４および５としてＴ細胞に対して毒性のないＩｇＧ１／ＩｇＧ２ｂである。

あるいは、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ａとの４種の可能なコンビネ ーションを使用してもよく、これらは一般に、前記のＩｇＧ２ａ（もしくは２　 ｃ）／　Ｉ　ｇＧ　２　ａ（もしくは２ｃ）コンビネーションと類似の挙動を示 すことが期待される。マウスに関しては、類似のアイソタイプのコンビネーショ ンＩｇＧ１／ＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｂ は、重要なＩｇＧ１．ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの可能な非類似アイソタイプ コンビネーションに比べて、一般的には有用性は幾分劣る（特に、前記のラット ＩｇＧ２ｂ／ラットＩｇＧ２ｂの場合と同様の理由からＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ａ はそうである）。これらの非類似のアイソタイプコンビ不一シジンのうちの一部 は、ラットの場合と同様の理由から他のものよりも重要であるので、例えば、ア ンチＴ細胞結合がマウスＩｇＧ２ａから供与されるコンビネーションは、タイプ ２および４の毒性分子をもたらすことが期待されるので不利である。ラットＩｇ Ｇ／マウスＩｇＧおよびマウスＩｇＧ／ラットＩｇＧコンビネーションはいずれ も重要なものである。

本発明のさらに別の態様においては、２種の融合ハイブリドーマもしくは２種の 他の融合パートナ−に由来するハイブリドーマ系によって生産される本発明によ る二重特異性抗体を含有する抗体混合物を分別処理に付して二重特異性抗体分子 の含有率を高めてもよく、さらに好ましくは、該二重特異性抗体分子を実質的に 分離させるか、または、望ましくない他の種、即ちタイプｌの分子に対して希釈 剤として作用する分子および特にＦｃ介在受容体機構によってＴ細胞に対して毒 性を示す種の含有率を少なくとも低下させる。

このような精製処理に使用する技術は英国特許出願第２１４４１４７Ａ号明細書 に記載された技術（被精製処理物はタイプ４の１種である−価モノクロナル抗体 である）とほぼ同様である。このような方法にはアフィニティークロマトグラフ ィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点クロマトグラフィーの使用、 特に高速蛋白質液体クロマトグラフィー［ＦＰＬＣ：ファーマシア社（Ｐ　ｈａ ｒｍａｃｉａ）の商標］および高圧液体クロマトグラフィーの使用が含まれる。

アフィニティークロマトグラフィーは、特異性に対して正しい重軽鎖のコンビネ ーションを有する分子種を選択する抗原含有カラム（例えば免疫グロブリン）を 使用することによって活用してもよく、あるいは、アンチアイソタイプもしくは 蛋白質Ａカラムを使用し、アイソタイプに基づく分離をおこなってもよい。イオ ン交換クロマトグラフィーは次の知見に基づくものである。即ち、異なったｐＨ においては、蛋白質上の電荷は異なる側鎖がイオン化すると変化するので、荷電 カラムへの蛋白質の結合はイオン強度によって影響を受ける。イオン交換クロマ トグラフィーの効果的な利用法には、第一カラム（第−ｐＨ）上でのフラクショ ンの分離に続いて第二カラム（第二ｐＨ）上での処理をおこなう方法である。こ の場合、カラムは通常は反対の電荷を有するので、カチチオン交換クロマトグラ フィー処理の後にアニオン交換クロマトグラフィー処理をおこなうか、またはこ の逆の順序でこの処理をおこなう。等電点クロマトグラフィーの次の知見に基づ くものである。即ち、特定の選択されたｐＨにおいては、蛋白質は実効電荷を有 さず、荷電カラムには結合しないので、類似蛋白質混合物はそれらのｐｒに基づ いて分離される。ＦＰＬＣとＨＰＬＣは異なる利点を有するので、これらは併用 してもよい。

前記のように、Ｔ細胞毒性を示さない抗Ｔ細胞重鎮の適当な選択または異なった 種もしくはアイソタイプの抗免疫グロブリン重鎮の毒性抗Ｔ細胞重鎮のコンビネ ーションによって、Ｔ細胞の致死を実質的に回避する二重特異性抗体分子を提供 する本発明の初期の目的を達成することが一般的に可能となる。上記の精製技術 を利用することによって、Ｔ細胞に対して毒性な他の成分であって、Ｔ細胞毒性 を示す二重特異性抗体分子含有コンポジションをもたらす成分を除去することが できる。

二重特異性抗体は一般的には、全分子の結合アフィニティーを保有するフラグメ ントの形態で使用してもよい。しかしながら、本発明による二重特異性抗体によ るＴ細胞の破壊を回避する第二の方法は、結合アフィニティーを保有するが、Ｔ 細胞致死能を有さなｌ、％全抗体の７ラグメント、特にＦ　（ａｂ’　）、フラ グメントの形態で抗体を使用する方法である。この方法は、抗体分子のＦ（ａｂ ’）＝部分はその重鎖／軽鎖コンビネーションの一方を介してＴ細胞と結合する ことができるが、該抗体分子のＦｃ部分が欠如するとＦｃ介在受容体機構による Ｔ細胞の死滅は起こらないという知見に基づくものである。Ｆ（ａｂ’）ｚ部分 を使用する別の利点は、該７ラグメントはより小さしＮので腎臓からより迅速に 排泄されことである。

抗体分子のＦ　（ａｂ’　）ｚフラグメントの調製には適当な酵素系を使用する ことが必要である。このような酵素系を用いて重鎮を適当な点で切断し、重鎮の Ｆｃ領域（あるいは抗Ｔ細胞重鎖の少なくとも該領域）を除去し、一方、２種の 重鎮の残存部分は保持し、各々の残存・部分はジスルフィド架橋を介してその軽 鎖と他の重鎮に連結させる。

異なる種とアイソタイプは免疫グロブリンの切断領域において異なるアミノ酸シ ーケンスを有するので、問題となるアミノ酸シーケンスに対して特異的な適当な 酵素を使用しなければならない。さらに、２種の重鎖が種もしくはアイソタイプ の点で相違する場合には、一方の鎖中の全てではないが、その一部のシスティン 基を架橋を介して他方の鎖中のシスティン基に連結させる必要があり、また、Ｆ （ａｂ′）２フラグメントではなくてＦａｂを生成する開裂様式の可能性を考慮 しなければならない。従って、全抗体のＴ細胞致死能ではない２種の特異性を保 有するＦ　（ａｂ’　）、フラグメントまたは一つのＦｃ領域のみを欠く他の７ ラグメントを生成させるために、問題の二重特異性抗体系にとって適切な酵素（ 例えばペプシン、パパイン、ｖ８プロテアーゼ等）および該酵素を使用する条件 （ｐＨ１温度および時間）を選択する必要がある。前記の特性を有する生成物の 調製によって確認される適切な酵素とその使用条件を選択するならば、本発明に よる二重特異性抗体のＦ　（ａｂ’　）、フラグメントの調製技術は、単−特異 性抗体のＦ　（ａｂ″）２フラグメントの調製に関する当該分野の文献に記載さ れている技術とほぼ同様である。

従って本発明には、（ａ）致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合ア フィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二 重特異性抗体分子のＦ　（ａｂ’　）、フラグメント、および（ｂ）該抗体分子 を適切な酵素系を用いて処理することによって開裂させて該フラグメントを生成 させることを含む該７ラグメントの製造方法が含まれる。

前記のようなタイプ１−１０の異なる抗体分子の分別は、Ｆ（ａｂ’）。

フラグメントを使用する場合にも有用である。何故ならば、Ｔ細胞に対して毒性 を示す他のタイプのものの除去はこの場合には不要であるが、他の全てタイプ２ 〜１０は調製物中の単一の活性タイプ１の含有率を希釈し、一方、タイプ２．４ および５はＴ細胞への結合に関して競合し、タイプ３．６および７は免疫グロブ リンへの競合に関して競合するからである。他のタイプ、特にタイプ２〜７はタ イプ１に比べて減少させるか、実質上除去するのが有利である。このような分別 処理はＦ　（ａｂ″）、フラグメントを生成させる前におこなってもよいが、そ の後におこなうのが好ましい。

本発明の対象である二重特異性抗体およびそのフラグメントを医療関連分野で使 用するという提案は従来全くなされていなかった。

従って本発明には、（ａ）手術、治療または診断に使用するための二重特異性抗 体分子またはそのフラグメントであって、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対 する第一結合アフィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニテ ィーを有する二重特異性抗体分子または該全分子の結合アフィニティーを保有す るその７ラグメント、および（ｂ）新生組織形成性疾患もしくは他の疾患の処置 に使用する医薬の製造に用いるための二重特異性抗体分子またはその７ラグメン トの用途であって、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニ ティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異 性抗体分子または該全分子の結合アフィニティーを保有するそのフラグメントの 用途が含まれる。

本明細書に記載する二重特異性抗体およびそのフラグメントを使用に供する場合 には種々の方法によって配合してもよいが、通常は生理学的に許容され得る希釈 剤もしくはキャリヤーを使用する。このような希釈剤やキャリヤーは滅菌処理に 付され、まＩ；、特定の用途に対しては発熱源を含まないようにするのが好まし い。これは種々の形態、例えば燐酸塩緩衝塩水、塩水、平衡塩溶液およびブドウ 糖溶液等であってもよい。しかしながら、燐酸塩緩衝塩水が適切な場合が多い。

このような組成物は所望により単位投与量形態（即ち、単位投与量を含有する別 個の形態）または複数倍投与量形態もしくは亜単位投与量形態として提供しても よい。

本明細書に記載の抗標的細胞抗体もフラグメント、例えばＦ　（ａｂ’　）、等 の形態で使用してもよいが、前述の二重特異性抗体の場合に比べて有利ではない 。さらに、抗標的細胞抗体またはその７ラグメントは、二重特異性抗体分子また はそのフラグメントの場合とほぼ同様にして調製してもよい。２種のタイプの抗 体を同じ組成物もしくはキットに配合してもよいが、前者の場合には、以下に説 明するように、フンシュゲートの形成がもたらされる。従って本発明には、（ａ ）致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーおよび免疫 グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分子または 該全分子の結合アフィニティーを保有するそのフラグメント、並びに標的細胞に 対する結合アフィニティーを有する抗体分子または該アフィニティーを有するそ のフラグメントを含有する組成物、および（ｂ）致死を活性化し得るＴ細胞受容 体に対する第一活性化アフィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合ア フィニティーを有する二重特異性抗体または該全分子の結合アフィニティーを保 有するその７ラグメント、並びに標的細胞に対する結合アフィニティーを有する 抗体分子まｔ；は該アフィニティーを有するフラグメントを含有するキットが含 まれる。さらに本発明には、新生組織形成性疾患または他の疾患の処置に同時に 、別々にまたは逐次的に使用する生成物であって、致死を活性化し得るＴ細胞受 容体に対する第一結合アフィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合ア フィニティーを有する二重特異性抗体分子または該全分子の結合アフィニティー を保有するそのフラグメント、並びに標的細胞に対する結合アフィニティーを有 する抗体分子または該アフィニティーを有するそのフラグメントを含む生成物が 含まれる。

両方のタイプの抗体またはこれらの７ラグメントは種々の投与方法、例えば静脈 内投与法、腹膜内投与法または大脳内投与法等によって投与してもよい。投与様 式は腫瘍もしくは他の標的細胞のタイプや部位および臨床医による投与の容易性 や患者の安全性等に応じて適宜選択すればよい。しかしながら、一般的には非経 口投与法、特に静脈内注射法がしばしば用いられる。２種のタイプの抗体は同時 に、別々にまたは逐次的に使用してもよいが、通常は抗標的細胞抗体を先に投与 するか、二重特異性抗体と同時に投与するが、後者の場合、遅延時間は０．５〜 ２４時間である。２種のタイプの抗体またはこれらの７ラグメントの投与量に関 しては、正確な投与量は薬剤の効能、腫瘍もしくは他の疾患による患者の苦しみ の程度および患者の体重／体表面積比に左右されるが、その指針となる量は、各 々の抗体もしくはフラグメントを１〜２５ｍｇ、例えば各々の抗体もしくはフラ グメントを等量とするのが適当であり、１日あたり１回の投与で７〜１０日間投 与する（１０日間投与する場合、各々の抗体またはフラグメントの患者への全投 与量は１０〜２５０１１１ｇである）。

適当な場合には、投与量をこの範囲外にしてもよいが、本発明の特ン　に有利な 点は、多くの場合、低投与量にできることである。即ち、上記投与量の範囲にお ける低投与量もしくはこれ以下の投与量の場合においても二重特異性抗体分子に 対する免疫反応の発生が回避され、投与を繰り返すことができる。

本発明には、新生組織形成性疾患もしくは他の疾患の処置において、致死を活性 化し得るＴｍ胞受容体に対する第一結合アフィニティーおよび免疫グロブリンに 対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体または該全分子の結合ア フィニティーを保有するその７ラグメントを、標的細胞に対する結合アフィニテ ィーを有する抗体分子または該アフィニティーを有するその７ラグメントと併用 することが含まれる。特に本発明には、新生組織形成性疾患またはその他の疾患 の症候緩解および一時抑えを補助する方法であって、致死を活性化し得るＴ細胞 受容体に対する笥−結合アフィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合 アフィニティーを有する二重特異性抗体分子または該全分子の結合アフィニティ ーを有するその７ラグメント並びＪ、：標的細胞に対するアフィニティーを存す る抗体分子または該アフィニティーを有するその７ラグメントを、該症候緩解お よび一時抑えを達成するのに治療上有効な量投与することを含む方法が含まれる 。しかしながら、二重特異性抗体は抗腫瘍抗体と併用して、生体外において骨髄 から新生組織形成性細胞を除去し、自己組織骨髄を悪性腫瘍の処置のために移植 してもよい。

本発明による二重特異性抗体分子を間接的なＥＣＲに使用すると、ステルツやペ ヴアンによって認識されたような直接的なＥＣＲに比べて多くの利点が得られる 。前述の生体内もしくは生体外において二重特異性抗体分子を抗標的細胞抗体と 併用する方法の変形法には、患者から末梢血液単核細胞を採取し、該細胞を抗Ｔ 細胞抗体、例えば、実施例２に記載のようなモノクロナル抗体ＹＴＨＩ　２．５ ．１４もしくはｌ　２．５．１４．２を用いて短時間処理して該細胞を活性化す ることが含まれる。抗腫瘍モノクロナル抗体は、例えば分化抗原、表面免疫グロ ブリン、腫瘍関連抗原等に対して選択し、適当な抗体または抗体のコンビネーシ ョンを腫瘍細胞の標的化のために使用し、数時間後に、二重特異性抗体分子の存 在下で体内へ再導入した活性化エフェクターによって該細胞を溶解させ、過剰の 抗腫瘍細胞抗体は除去する。応用範囲が広いだけでなく、間接的なＥＣＲは直接 的なＥＣＲに比べて、予め活性化された細胞毒性１９７３球（ＣＴＬ）およびに 細胞集団を補充して、腫瘍標的を破壊することができるという利点を有する。抗 Ｔ細胞と抗標的細胞アフィニティーを有する二重特異性抗体分子のＦｃ部分が活 性化に細胞上のＣＤ１６もしくは他のエフェクター細胞集団（例えば単核白血球 村よび好中球等）に含まれるＦｃ受容体およびＣＴＬ上のＣＤ３に結合するなら ば、該抗体は治療的な用途には不適当であるが、これは、二価ＣＤ３Ｍａｂの存 在下でのＣＴＬ相互間でみられるように、ＣＴＬとＫ１ｍ胞もしくは単核白血球 等との間に相互致死をもたらすからである。従って、直接的なＥＣＲを有効に利 用するためには、Ｋ細胞上のＦｃγＲ１゜Ｗまたはエフェクター細胞上のＦｃ受 容体を、例えば、適当なＣＤ１６モノクロナル分子を用いてブロックするか、ま たは二重特異性抗体分子の重鎮を、Ｆｃ部分がＦｃ７Ｒ１ｏｗまたは他のＦｃ受 容体に結合しないように選択しなければならない。あるいは、抗Ｔ細胞／抗標的 細胞二重特異性抗体分子のＦｃ部分を、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの生成によ って不活性にしてもよい。しかしながら、これらの方法は、二重特異性抗体分で 被覆された標的細胞に対するに細胞介在ＡＤＣＣの機能を消失させる。ＥＣＲと ＡＤＣＣを併用して標的細胞に標準を定めてこれを死滅させるのが有効であり、 また、Ｋ細胞の致死は間接的なＥＣＲを利用しておこなうことができるが、これ は、抗原的細胞抗体が二重特異性抗体部分とは別々に投与できるからである。こ のような場合、ＡＤＣＣによる有効なに細胞致死を仲介することが明らかにされ ているラットＩｇＧ２ｂアイソタイプの抗腫瘍細胞もしくは他の抗原的細胞抗体 を選択するのが好ましく、また、ラット抗体の他のアイソタイプをＩｇＧ２ｂア イ・ツタイブにクラス変換する技術は知られている。処理されたエフェクター細 胞を患者の体内へ注入すると、活性化されｆ−に細胞は腫瘍サイトに達し、抗体 被覆標的細胞をＡＤＣＣによって死滅させる。従って、非機能性のＦｃ部分を有 するものとして選択される二重特異性抗体分子は、同じ標的細胞集団に対するＣ ＴＬの反応に標準をあわせることによって、間接的なＥＣＲを仲介する。

本発明による二重特異性抗体分子は、種々の時間間隔において異なる抗体を投与 する処置を可能にし、これによって過剰の第一の抗原的細胞抗体を排泄させるこ とができるので、第二に抗原的細胞抗体はその抗グロブリン特異性により、残留 する第一抗体に結合する腫瘍細胞まで効果的に到達する。これにより、細網内皮 系等の細胞によって非常に効率よく除去され得るアグリゲートの生成量は低減す る。さらに間接的なＥＣＲを利用する場合には、適当な抗原的細胞抗体を使用す ることにより、活性化に細胞は標的細胞に対するＡＤＣＣを仲介する。次いで二 重特異性抗体分子を投与するが、このとき、ＣＴＬ集団も補充し、間接的なＥＣ Ｒによって同じ標的細胞を死滅させる。

前記の使用法のほかに、本発明による二重特異性抗体分子は、致死を活性化し得 るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーおよび標的細胞に対する第二結 合アフィニティーを有する二重特異性抗体コンジュゲートを調製する場合には全 分子として使用してもよく、あるいはそのフラグメントとして使用してもよい。

この場合、本発明による二重特異性抗体分子は、Ｔ細胞に対しては同じ結合アフ ィニティーを有するが、腫瘍細胞もしくは他の標的細胞に対しては異なる結合ア フィニティーを有する二重特異性抗体コンジュゲートの調製に使用し得る中間物 を提供する。

従って本発明には、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニ ティーおよび標的に対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体コン ジュゲートであって、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィ ニティーおよび標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体に結合した免 疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分子、ま たは該全コンジュゲートの結合アフィニティーを保持するその７ラグメントを含 有することを特徴とする特許ートが含まれる。

この別の使用法においては、本発明による二重特異性抗体分子を、ここに記載の ような標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体と生体外において結合 させ、次いで該コンジュゲートを生体内へ投与する。この種のコンジュゲートは 化学的な結合によって調製することもできるが、標的細胞抗体に対する二重特異 性抗体分子の抗免疫グロブリンアフィニティーを利用して結合を形成させるのが 好ましい。従ってこの種のコンジュゲートは、致死を活性化し得るＴ細胞受容体 に対する第一結合アフィニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィ ニティーを有する二重特異性抗体分子を含有する溶液および標的細胞に対する結 合アフィニティーを有する抗体を含有する溶液を単に混合することによって調製 するのが簡便である。このようにして調製される二重特異性抗体コンジュゲート は単離せずに、患者に直接投与するのが好ましい。従って、このような調製は、 この目的にとって適切な媒体中でおこなうのが簡便であり、例えば、２成分は滅 菌した等容量の生理的食塩水中に保存してもよい。混合物は反応が完結しかつ実 質上凝集がおこらない適当な時間、例えば１時間までの時間（例えば３０分間） 放置し、次いで、特に非経口的に投与する。

二重特異性抗体分子と抗標的細胞抗体およびこれらの使用に関する前述の好まし い態様は、これらの抗体を二重特異性抗体コンジュゲートの成分として用いる場 合にも適用できる。例えば、二重特異性抗体分子のＦ　（ａｂ’　）２７ラグメ ントもしくは他の７ラグメントは抗標的細胞抗体またはそのＦ（ａｂ’）＝７ラ グメントもしくは他の７ラグメントと組合せてもよい。治療用の配合は同様にし ておこなえばよい。また、投与量に関しても同様であるが、この場合には、コン ジュゲートは２種の別々の成分のコンビネーションであるので、コンジュゲート の適切な投与量は各成分に関する投与量は各成分に関する投与量の合計となるよ うに留意すべきである。

本発明を以下の実施例によって説明する。

実施例１ ヒトＣＤ３抗原およびラット免疫グロブリンに対して特異的なモノクロナル抗体 を生産する／−イブリドーマの調製（１）抗ＣＤ３成分 Ｌｏｕラッラッ髄腫セルラインＹ３−Ａｇ１．２．３（ＣＮＣＭ、Ｉ　−０７８ ）とヒトリンパ球で免疫にしたＤＡう・ノドの肺臓細胞とを、クラーク（Ｃ１ａ ｒｋ）とワルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）の雑文ｌこ記載されｔこ方法に従って 融合させ［メソツズ・イン・ヘマトロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＨｅｍａｔｏ ｌｏｇｙ）、１９８６年、第１３巻、第１頁〜第２０頁］、融合混合物を該雑文 に記載の方法によって処理し、全ヒト末梢下細胞との反応性、ＵＣＨＴ−１［バ ーンセット（Ｂ　ｕｒｎｓｅｔ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９８ ２年、第１２９巻、第１４５１頁］や０ＫＴ−３（米国特許第４３６１５４９号 ）等のマウスモノクロナル抗体を用いる交差阻害（ｃｒｏｓｓ　１ｎｈｉｂｉｔ ｉｏｎ）および免疫沈降によって規定されるヒトＣＤ３抗原に対する特異性を有 するモノクロナル抗体を生産するハイブリドーマを選択した。この／１イブリド ーマはヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼポジティブ （ＨＰＲＴ“）であり、肺臓細胞に由来する第一の軽鎖とカッパ１ａアロタイプ の骨髄腫に由来する第二の軽鎖を発現する。

半固体状寒天上での細胞クローニングによって骨髄腫軽鎖を失った変形型に対す る選択をおこない（クラークとワルドマンの前記雑文参照）、次いで、感受性赤 血球凝集アッセイを用いてラット力・ソバ１ａアロタイプ発現の遺失を評価した （クラーク、メソツズ・イン・ヘマトロジー、１９８６年、第１２１巻、第５４ ８頁〜第５５６頁参照）。選択した変形型を半固体状寒天上でのクローニング処 理に付し、これをダルベツコ培地のイスコブス変性培地［ＩＭＤＭ（Ｉ　５ｃｏ ｖｅｓ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｅｄｉｕ ｍ）−ギブコ―ヨーロッパ（Ｇｉｂｃｏ　Ｅｕｒｏｐｅ）］、即ち、胎児性子牛 血清（ＦＣＳ）を５％ｖ／ｖ補充し、ＣＯ３を５％含む空気雰囲気下において、 重炭酸塩による緩衝剤処理に付して変性した培地中で培養した。

細胞を短時間処理した後、重炭酸塩を過剰のヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液とＮａ ＣＱで置き換えてイオン強度を維持した。

（２）抗うット免疫グロブリン成分 ＢＡＬＢ／Ｃ骨髄腫セルラインＮＳＩ／Ａｇ４．］を、完全７０インドアジュバ ント中でプールさせたラットＩｇＧを用いて免疫にしたＳＪＬマウスストレイン の肺臓細胞と融合させた［スプリンガー（Ｓ　ｐｒｉｎｇｅｒ）ら、ハイブリド ーマ、１９８２年、第１巻、第２５７頁〜第２７３頁参照］。

選択されたハイブリドーマは特定のラットアロタイプに対する特異性を有するモ ノクロナル抗体を生産するが、これはハイブリドーマ（１）によって生産される 免疫グロブリンに対応するものではないので、自己反応性は回避される。ＨＰＲ Ｔネガティブなこのハイブリドーマの変異型に対する選択は、選択性薬剤８−ア ザグアニンを含有する培地の濃度を増加させる培養によっておこなった（クラー クとワルドマンの前記雑文参照）。選択されたＨＰＲＴ−変異型をクローニング 処理に付し、ハイブリドーマ（１）に関する培養をおこなった［この処理の第一 の変形においては、ハイブリドーマ（１）は８−アザグアニンに耐性であり、ハ イブリドーマ（２）はステップ（３）においてヨードアセトアミドを用いて被毒 され、第二の変形においては、６−チオグアニンを８−アザグアニンの代りに元 の処理もしくは第一の変形において使用し、第三の変形においては、ノツブリド ーマ（２）はハイブリドーマ（１）と同様もしくはその代りに骨髄腫軽鎖遺失変 異型であり、一方もしくは両方のハイブリドーマは軽鎖を発現しない骨髄腫に由 来するものである］。

（３）バイブリド−マーバイブリドーマ細胞融合融合の前に、ハイブリドーマ（ １）をホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）中において、１０ｍＭヨードアセトアミ ドを用い、０℃で３０分間処理した。ＨＰＲＴ”ヨードアセトアミド被毒細胞を ＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１用Ｄて洗浄して過剰の阻害剤を除去し、次いでＨＰＲ Ｔ−ハイブリドーマ（２）細胞を次の３種の異なる割合で混合した：（ａ）３． ５　ｘ　ｌ　Ｏ’細胞パイプリド−？（１）＋３．５Ｘ１０’細胞／％（ブリド ーマ（２Ｘ１０：１）、（ｂ）３．５ｘｌＯ’細胞ハイブリドーマ（１）＋３． ５ｘ１０ｙハイブリドーマ（２Ｘｌ：１）、および（ｃ）３．５ｘ１０’細胞バ イブリド−？（１）＋３．５ＸｌＯ”細胞ハイブリドーマ（２）（１：　１０） 。各々の場合、細胞をＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１仁Ｄいて混合し、ペレット状に 成形した（２００Ｘｇ）。細胞融合は、５０％Ｗ／Ｖポリエチレングリコール１ ５００ＰＢＳ溶液１ｍＱを用いて細胞ペレットを攪拌下で２分間処理することに よっておこなった（クラークとワルドマンの前記雑文参照）。細胞をＨＥＰＥＳ 緩衝ＩＭ緩衝１用Ｄて一回洗浄した後、胎児性子牛血清を５％ｖ／ｖ含有する重 炭酸塩緩衝ＩＭＤＭ中に再懸濁させ、これを８ＸｌＯ’〜２ＸｌＯ６の４種類の 濃度で培養ウェルプレート（２４Ｘ　２ｍｆｆ）に移し、５％ｃｏ、含有空気雰 囲気下において３７°Ｃで培養した。翌日、ヨードアセトアミド処理した融合細 胞を含有するコントロールには全体的には生存能力は認められなかったが、融合 細胞の培養物中においては、大多数の細胞に生存能力が認められた。

培養を２４時間おこなった後、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン を用いて選択を開始させたところ（ＨＡＴ選択培地；クラークとワルドマンの前 記雑文参照）、ＨＰＲＴ−ハイブリドーマ（２）細胞はこの培地中では生存能力 を示さなかった。ＨＡＴ選択培地中での培養を２週間もしくはそれ以上の期間に わたっておこなった後、以下に示すアッセイによって、二重特異性抗体を生産す る／１イブリッドセルラインを選別した。機能性のヒトＣＤ３抗体を免疫蛍光法 を用いて検出し、これによってヒトＴ細胞白血病セルラインであるＨＰＢ−ＡＬ Ｌへの結合が示され［アドリアン（Ａｄｒｉａｎ）とヒュトン（Ｈｕｔｔｏｎ） 、ジャーナル・オブ・クリニカル・インペステイゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、１９８３年、第７１ 巻、第１６４９頁〜第１６６０頁参照］、このような結合はハイブリドーマ（１ ）の重鎮と軽鎖の両方の存在を示すものである。

機能性の抗ラット免疫グロブリン活性は、抗マウスＴｈｙ−１抗原もしくは他の 無関係な特異性を有し、マイクロタイターのウェルに固定されたラット抗体（こ れはハイブリドーマ（２）に関しては適当なアロタイプである）を用いて検出し た。このような抗体に結合し得る抗体は、マウスＩｇＧ２に対して特異的な試薬 であるビオチニル化したＹＡ９／３６．３９を用いて検出した［クラークの博士 論文（ケンブリッジ大学、１９８２年）参照］。プレート結合アッセイを利用し て、両方の親細胞に由来する免疫グロブリンの混合鋼を有する抗体を選別した（ この場合、ビオチニル化したＹＡ９／３６．６９は、ハイブリドーマ（１）のラ ットＩｇＧサブクラスに対して特異的なビオチニル化モノクロナル抗体によって 置き換えＩ；）。３種のアッセイ処理において強い正の反応を示しｔ；ウェルか ら細胞を半固体状寒天上でのクローニング処理に２回付し、適当なりローンを選 択し、これを単一特異性ハイブリドーマ（１）の場合のように培養したにの処理 の変形においては、抗うットＩｇハイブリドーマ（２）を、他の種、例えばマウ スもしくはヒトのＩｇに対して特異的なハイブリドーマによって置き換えた。第 一の変形法と併用してもよい第二の変形法においては、ハイブリドーマ（１）と （２）のうちの一方もしくは両方を、ヒトの骨髄腫から、例えばヨーロッパ特許 出願第００６２４０９号、同第０１４８６４４号、英国特許第２０８６９３７号 および米国特許第４５２９６９４号各明細書に記載のようにして誘導したハイブ リドーマで置き換えた。］。

クツｔ−ＩｇＧ２ｂ抗ヒトＣＤ３／マウスＴｇＧ２ａ抗ラット免疫グロブリン二 重特異性ハイブリドーマＬＨＣ４９，１８，２の調製この調製は実施例１の（３ ）に準拠した、但し、ハイブリドーマ（１）としてはハイブリドーマＹＴＨｌ　 ２．５．ｌ　４　［これはコツボルド（Ｃｏｂｂｏｌｄ）とワルドマンの雑文（ ネイチャー、１９８４年、第３０８巻、第４６０頁〜第４６２頁）に記載された シスタークロンＹＴＨ１２，５，２２と同一のものである。］を使用し、ハイブ リドーマ（２）としてはハイブリドーマＲＧＩ　１／１５．５（スブリンガーら の前記の雑文参照）を使用した。ＹＴＨｌ　２．５．１４はラットＩｇＧ２ｂモ ノクロナル抗体を生産し、骨髄腫に由来するアロタイプのカッパ軽鎖を発現する 。骨髄腫鎖を遺失する変異型ＹＴＨ１２，５，１４，２は、全ての試験しＩ；抗 ラットカッパ試剤に対して不活性な単一の軽鎖を分泌するので、ラムダクラスの 軽鎖を発現すると考えられる。

ＲＧＩ　Ｉ／１５．５は、ラットのカッパ１ｂアロタイプ軽鎖に対して特異的な マウスＩｇＧ２ａモノクロナル抗体を生産し、カッパ軽鎖を発現する。

融合混合物は、第三のアッセイ法におけるラットＩｇＧ２ｂに対して特異的な試 剤であるビオチニル化ＮＯＲＩ　Ｇ７．１６．２を用いて選別した［ヘーμ（Ｈ ａｌｅ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー、１９８５年、第１３４巻、第３ ０５６頁参照］。クローニング処理に付すことによって、二重特異性の抗ヒトＣ Ｄ３／抗ラツトカツパｌｂアロタイプ軽鎖ハイブリドーマＬＨＣ４９，１８，２ を選択した。

実施例３ マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ３／マウス■ｇＧ２ａ抗ラット免疫グロブリン二重 特異性ハイブリドーマＬＨＤ６．２３の調製この調製は実施例１に準拠しておこ なった。但し、ハイブリドーマ（２）としては実施例２に記載のハイブリドーマ ＲＧ　１１／１５゜５を使用し、また、ハイブリドーマ（１）としてはハイブリ ドーマ０ＫＴ３．５．２［米国特許第４３６１５４９号明細書に記載され、ＡＴ ＣＣ（ロックビル、米国）に受入れ番号ＣＲＬ８００１として寄託されたマウス ＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ３ハイブリドーマ０ＫＴ３のレフローンであるハイブリド ーマ］を使用した。０ＫＴ３−５．２は、マウス骨髄腫Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ ＩＩＣ由来する０ＫＴ３と同様ノ特性を有しており、Ｅロゼツトポジティブ精製 ヒトＴ細胞で免疫にしたＣＡＦ　ｌマウスの肺臓細胞との融合によって、マウス カッパ軽鎖を分泌する。

融合混合物は、カッパ１ｂアロタイプ軽鎖を有してマイクロタイターウェルに固 定された適当なラットＩｇＧ抗体を用いる免疫グロブリンアイソタイプア７セイ によって選別し、ビオチニル化ＹＡ９／３６．６９によってＲＧＩＩ／１５．５ 特異性を検出し、ヒトＴ細胞の補体仲介溶解によって○ＫＴ３特異性の間接蛍光 による検出をおこなった。クローニング処理によって、二重特異性抗ヒトＣＤ３ ／抗ラツトカツパｌｂアロタイプ軽鎖ハイブリドーマＬＨＤ６．２３を選択した 。

実施例４ マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ３／マウスＩｇＧ２ａ抗ラット免疫グロブリン二重 特異性ハイブリドーマＬＨＢ６３．ＩＯの調製この調製は実施例１に準拠してお こなった。但し、ハイブリドーマ（１）としては実施例３に記載のハイブリドー マ０ＫＴ３．５．２を使用し、また、ハイブリドーマ（２）としては、ラット抗 百日咳／百日咳免疫複合体によって免疫にしｔ：　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウ スの肺臓細胞および非生産性マウス骨髄腫Ｎ　Ｓ　Ｏ／　ｕとの融合によって誘 導されるＨＬ分泌性ハイブリドーマであるハイブリドーマＮＯＲＩ　Ｇ７゜１６ ．２を使用した（ＮＯＲＩＧ７．１６．２は、ヘーμらの前記雑文に記載された ＮＯＲＩ　Ｇ７．１６と同様の特性を有するサブクローンテする）。ＮＯＲＩ　 Ｇ７．１６．２は、カッパ軽鎖を発現する抗うット１ｇＧ２ｂマウスＩｇＧ２ａ モノクロナル抗体を生産する。８−アザグアニン耐性を有するＨＬ−クローンと してはＮＯＲＩＧ７．１６゜２Ａｇを使用した。融合後、間接的蛍光法によって ０ＫＴ３特異性を検出するためのヒトＴ細胞の補体仲介溶解を含む選別処理およ び無関係なラットＩｇＧ２ｂ抗体を用いて被覆したプレートを用いるＥＬ　Ｉ　 ＳＡ７　ッセイヲオコｆｔツた。ＮＯＲＩＧ７．１．６２特異性は、特異性ビオ チニル化抗マウスＩｇ試剤およびストレプタビジンーベルオキシダーゼ［アマ− ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｌｃ）から入手、イングランド］を用いて検出し た。クローニング処理によって、二重特異性抗ｅトＣＤ３／抗ラット■ｇＧ２ｂ ハイブリドーマＬＨＢ６３．ＩＯを選択した。

実施例５ 二重特異性ハイブリドーマからのモノクロナル抗体の生産実施例１，２．３また は４で調製した二重特異性ハイブリドーマを低血清培血（１％ｖ／ｖＦＣ５含有 ＩＭＤＭ）中において、５％ＣＯ２含有空気雰囲気下、３７°Ｃで４８時間保持 した。培養上澄み液は、硫酸アンモニウムを５０％ｗ／ｖの濃度で添加する沈澱 処理によって濃縮した。沈澱物を最少量の水に再溶解させた後、セファデックス Ｇ２５上において、２０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて脱塩した。

抗体をＴＳＫ−５ＰＷカラム（ＬＫＢ社製）上でのｈｐｌｃイオン交換クロマト グラフィーによる分別処理に付した。プールしたフラクションはアッセイのため にＰＢＳを用いて脱塩した。

実施例６ ラットＩｇＧ２ｂ／マウスＩｇＧ２ａ二重特異性モノクロナル抗体のエフェクタ ー細胞再標的化における活性試験（Ａ） 健康な提供者から採取した静脈血液をガラスピーズを用いる脱繊維素処理に付し た。フィコルーハイパツク（Ｆ　１ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ）上での密度勾 配遠心分離によって、界面から単核細胞を単離し、これらを、５％ｖ／ｖＦＣ５ を含有する重炭酸塩緩衝ＩＭＤＭを用いて洗浄した。これらの細胞は、抗ヒトＣ Ｄ３抗体、特に実施例２のハイブリドーマＹＴＨ１２，５，１４，２によって生 産される抗体で予め被覆した組織培養ボルト内へ、同じ培地１ＩＩＩＩｌ＋あた りｌＸｌ０’細胞で分配した。３７°Ｃで３日間培養した後、エフェクターをｒ ｌＬ２［セタス（Ｃｅｔｕｓ）］をＩＯＵ／ｍＱ含有する同じ培地中での７日間 の膨張処理に付した。

このようにして調製される芽細胞は、ＡＤＣＣを仲介し得るＦｃ受容体ポジティ ブ細胞を１０〜１５％を含有する［Ｆｃロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ） によって検出される］。これらのＡＤＣＣエフェクターは、同じ培地を用いて１ 回洗浄しＩ；エフェクター細胞を、抗Ｆｃ受容体抗体ＣＬＢ−Ｆｃｒグランエ［ チッチロー（Ｔｅｔｔｅｒｏｏ）ら、リューコサイト・タイピング（Ｌ　ｅｕｃ ｏｃｙｔｅ　Ｔ　ｙｐｉｎｇ）　ＩＩ、１９８５年、第３巻、第２７頁、スプリ ンガー、フエアランガー（ＳｐｒｉｎｇｅｒＶ　ｅｒ　ｌａｎｇｅｒ）、ニュー ヨーク］の１／６００希釈液と共に、室温で１５分間前保温することによって阻 害させた。この抗ＣＤ１６抗体はに細胞が仲介するＡＤＣＣをブロックする。

（２）ユフェクター細胞再標的化アッセイ標的セルラインとして、マウスＴｈｙ −１ポジティブセルラインＢＷ５１４７［ＣＲＬ１５８８、ＰＨＬＳヨーロピア ン・コレクション拳オブψアニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　 Ｃｏ１１ｅｃＬｉｏｎｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）、ポ ートンダウン、イングランド］を使用した。細胞は、Ｆｅ２を２％ｖ／ｖ含有す るＩＭＤＭ中において、アッセイに用いるまで、指数的生長相に保持した。約５ Ｘ１０’の細胞を２００Ｘｇにおいてスピンダウンさせ、ペレットを、６ＩＣｒ −クロム酸ナトリウム（３００μｃｉ）含有ｒＭＤＭ１５０ｐ（１に再懸濁させ 、細胞を３７°Ｃで１時間保温した後、ＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭＤＭを用いて洗浄し た。次いで標的細胞を洗浄して、２本のチューブに分配した。第一のチューブ内 の細胞は直接的ＥＣＲの分析のために、ＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭ緩衝１地Ｄ００μｇ に再懸濁させ、第二のチューブ内の細胞は間接的ＥＣＲの分析のために、ハイブ リドーマＹＢＭ２９．２．１から誘導された抗Ｔｈｙ−１モノクロナル抗体（コ ツボルドの前記雑文参照）を約１００μｇ／ｍｉ２含有する同一の培地５００μ ｇに再懸濁させＩ；。室温で１時間保温した後、第２のチューブ内の細胞を一回 洗浄して過剰のＹＢＭ２９．２．１を除去し、同じ培地中に再懸濁させた（２Ｘ ｌＯ’生存能細胞／ｍ４）。

エフェクター細胞の２倍希釈液をＵ字形底部を有するマイクロタイターウェル内 へ１５μａ入れ、等容量のハイブリドーマ、標識化Ｔｈｙ−１で被覆した標的細 胞もしくは未被覆標的細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭＤＭ培地５０μＱに添加し、 エフェクター二標的細胞比を３２：ｌ〜０．５：１とした。エフェクター細胞再 標的化試験に用いる抗体の適当な希釈液をウェル中のＨＥＰＥＳ緩衝ＩＭＤＭ１ ００μΩ中に添加し、３７°Ｃで４時間培養をおこなった後、各ウェルあたり１ ００μａの培地を採取し、放出される放射能を、フェリツブ社ガンマカウンター （ＰＷ４８００型）を用いるガンマ放射線の測定によって決定した。

（３）ＬＨＣ４９，１８抗体および５ＨＮ２０．１２抗体の活性測定法の（ａ） 〜（ｅ）の培養物の上澄みを使用した（培養物は実施例５の場合のように得た） ： （ａ）Ｙ３−Ａｇｌ　、２．３骨髄腫細胞の培養物は（コントロール）、（ｂ） 親ハイブリドーマＹＴＨ１２，５，１４，２およびＬＨＣ４９，１８ハイブリド ーマのＲＧＩＩ／１５．５の培養物の１：ｌｖ／ｖ混合物、（ｃ）ＬＨＣ４９， １８ハイブリドーマ細胞の培養物、（ｃｌ）ＳＨＮ２０．］２ハイブリドーマ細 胞の培養物（ＳＨＮ２０．１２は、クラークとワルドマンによる英国特許出願第 ８６２６４１２号を優先権主張の基礎とする、本件出願と同日付濃度特許出願の 実施例３に記載されたようにして調製したラットＩｇＧ２ｂ抗ヒトＣＤ３／ラッ トＩｇＧ２ｃ抗マウスＴｈｙ−］二重特異性ハイブリドーマである）、および（ ｅ）親ハイブリドーマＹＢＭ２９−２．１および５ＨＮ２０．１２ハイブリドー マのＹＴＨｌ　２．５．１４．２の培養物の１　：　１　ｖ／ｖ混合物。

第一の一連の実験においては、前記の（２）に記載のアッセイ法を使用した。但 し、この場合には、エフェクター：標的細胞の比は１５：１とし、上澄み（１０ ０μｇ）の希釈比は１／１００〜１／１２８００どした。コントロールＹ３−Ａ ｇ１．２−３細胞および親混合物は、非標識化標的細胞および標識化標的細胞を 用いて放出される”Ｃｒの濃度を測定したところ、有意な活性を示さなかった（ 親混合物に関する以下の記載参照）。期待されたように、５ＨＮ２０．１２抗体 は両方のタイプの標的細胞に関して顕著な”Ｃｒ放出濃度を示し、一方、５ＨＮ ２０．１２抗体とは異なって、間接的ＥＣＲのみをもたらすＬＨＣ４９，１８抗 体は標識化細胞を用いた場合には顕著な”Ｃｒ放出濃度を示したが、非標識化細 胞に関しては、コントロールと親混合物の場合と類似の５ＩＣｒ放出濃度を示し た。第二の一連の実験においては、エフェクター：標的細胞比を前記の（２）に 記載のように３２：１〜０．５：ｌとし、上澄み（１００μＱ）の希釈比はｌ／ １００とした。得られた結果を第２ａ図および第２ｂ図に示す。第２ａ図および 第２ｂ図はそれぞれ非標識化標的細胞および標識化標的細胞に関する。直接的Ｅ ＣＲをもたらす５ＨＮ２０．１２抗体は未被覆標的細胞と被覆標的細胞のいずれ の場合にも活性であるが（図を明瞭にするために、このプロットは第２ａ図のみ に示し、他のプロットは第２ｂ図に示す）、間接的ＥＣＲをもたらすＬＨＣ４９ ，１８抗体は予想されたように、被覆された標的細胞の場合にのみに有効である ことが判明した（図を明瞭にするために、このプロットは第２ｂ図のみに示し、 他のプロットは第２ａ図に示す）。しかしながら、第２ｂ図に示すように、ＬＨ Ｃ４９，１８抗体を用いる間接的ＥＣＲによってもたらされる致死は、第２ａ図 に示すように、５ＨＮ２０．１２抗体を用いる直接的ＥＣＲによってもたらされ る致死と少なくとも同程度有効である。（親混合物の場合に認められるわずかな 活性は、自然に発生する少数の微小凝集体に起因すると考えら前記（Ａ）に記載 の実験を、標的細胞としてマウスのリンパ腫ＢＷ５１４７、およびＢＷ５１４７ 細胞に関して前記（Ａ）に記載の方法と同様にして調製したマウスＴｈｙ−１ポ ジティブリンパ腫セルラインＥ　Ｌ　−４（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ、の寄託番号：ＴＩ Ｂ４０）を使用して繰り返した６ＢＷ５１４７およびＥＬ−４標的細胞は非標識 化の形態および標識化の形態で、前記（Ａ）に記載のようにして、（Ａ）の場合 のような抗Ｔｈｙ−１ラットＩｇＧ２ｃ、ＫｌｂハイブリドーマＹＢＭ２９゜２ からのモノクロナル抗体または抗Ｔｈｙ−１ラットＩｇＧ２ｂ、Ｋｌｂハイブリ ドーマＹＴＨ１５４，７，７［コツボルドら、モレキュラー・バイオロジー・ア ンド・メデイスン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉ ｃｉｎｅ）、１９８３年、第１巻、第２８５頁〜第３０４頁参照］もしくは抗Ｌ Ｃ／７２００ラット■ｇＧ２ａ、に１ｂハイブリド−？ＹＢＭ４２．２［ステニ ング（Ｓ　ｔｅｎｎｉｎｇ）ら、モレキュラー・バイオロジー・アンド・メディ スン、１９８３年、第１巻、第２８５頁〜第３０４頁参照］からのモノクロナル 抗体を標識化のために使用した。

標識化標的細胞を、エフェクターの２倍希釈液を有するマイクロタイター内に入 れ、上澄みの１／１００希釈液を次の（ａ）〜（ｃ）の培養物のいずれかに添加 した（培養物は実施例５にお載のようにして調製した）：（ａ）Ｙ　３〜Ａｇｌ 　、２．３骨髄腫細胞の培養物（コントロール）、（ｂ）親ハイブリドーマＹＴ Ｈ１２，５，１４，２およびＬＨＣ４９，１８ハイブリドーマの培養物のｌ　： 　ｌ　ｖ／ｖ混合物および（ｃ）ハイブリドーマＬＨＣ４９，１８の培養物。

第３ａ図および第３ｂ図はそれぞれＹＢＭ２９．２．１で被覆したＢＷ５１４７ 細胞およびＹＢＭ４２．２抗体を用いて得られた結果を示す。第３ｃ図および第 ３ｄ図はそれぞれＹＢＭ２９．２．１で被覆したＥＬ−４細胞およびＹＢＭ４２ ．２抗体を用いて得られた結果を示す。ＹＴＨ１５４，７抗体を用いて被覆した 両方のタイプの標的細胞を用いて得られた結果は、ＹＢＭ２９．２．１を用いて 被覆した標的細胞を用いて得られた結果と類似するので図示しない。両方のタイ プの非標識化標的細胞は予想されたように、３種類の上澄みのいずれの存在下に おいても死滅しなかった。

第３ａ図〜第３ｄ図から明らかなように、コントロールもしくは親杭体の混合物 の場合とは異なって、ＬＨＣ４９，１ａ抗体は、２種の抗原Ｔｈｙ−１および白 血球共通抗原に結合する抗標的細胞抗体を媒介としてＢＷ５１４７とＥＬ−４の 両方を良好なレベルで死滅させる。

竹Ｐ＝的揉的絽胆例１外や（％） 竹異的Ｒ的、４Ｉｌｌ売停邂牽（％） 特具的簾的却杷体制苧（％） ＃＋」的隷的細胞洛解馴％） 国際調査報告 １′１＋−ｍａ−＾帥−一・・”＋ＩＰＣ：／ＧＢ　８７１００７１１２ｌｓｌ ＃Ｍｄ慢＋１１＾１１１ｍ＋ｎ伺ｈ＋＊、ＰＣτ／Ｇｅｌεフ／Ｃ０７８２国際 調査報告 Ｇｉｌ　８７００７８２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーおよび免 疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分子、ま たは該全分子のこれらの結合アフイニティーを保有するそのフラグメント。 ２．受容体がヒトＴ細胞受容体である請求項１に記載の抗体分子またはそのフラ グメント。 ３．第二の結合アフイニティーが、Ｔ細胞受容体結合アフィニティーが関係する 種とは異なる種の免疫グロブリンに対するアフィニティーである請求項１または ２に記載の抗体分子またはフラグメント。 ４．第二結合アフィニティーがラットおよび／またはマウス免疫グロブリンに対 するアフィニティーである請求項３に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ５．第二結合アフイニティーが、抗体分子中の軽鎖または重鎖の免疫グロブリン に対応しない免疫グロブリンに対するアフイニティーである請求項１〜４いずれ かに記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ６．２種の重鎖が各々別々にヒト、ラットまたはマウスから誘導され、また免疫 グロブリンのＩｇＧクラスのものである請求項１〜５のいずれかに記載の抗体分 子またはそのフラグメント。 ７．分子中の２種の重鎖が、該分子によるヒトＴ細胞の致死を低減させるように 選択されたものである請求項１〜６いずれかに記載の抗体分子またはそのフラグ メント。 ８．Ｔ細胞致死が、Ｆｃ受容体介在致死機構によって致死を促進するのに実質上 有効でないＴ細胞結合アフィニティーを有する第一重鎖を使用することによって 低減される請求項７記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ９．重鎖がラットから誘導され、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃまたはＩｇＧ１サプク ラスのものである請求項８に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １０．２種の重鎖がそれぞれ抗Ｔ細胞／抗標的細胞特異性に関するアイソタイプ ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ａ、 ＩｇＧ２ｏ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ ｂである請求項９に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ｌｌ．重鎖がマウスから誘導されたＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のサプ クラスのものである請求項８記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １２．Ｔ細胞結合アフィニティーを有する第一の重鎮が、Ｆｃ受容体介在致死機 構による致死を促進するのに有効であるが、Ｔ細胞致死が、該第一の重鎖の有効 性をより劣化させる標的細胞結合アフィニティーを有する第二の重鎖の存在によ って低減される請求項７に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １３．第一および第二の重鎖が異なる種、アイソタイプまたはアロタイプのもの である請求項１２に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １４．第一の重鎮がラットＩｇＧ２ｂまたはマウスＩｇＧ２ａである請求項１２ に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １５．第一および第二の重鎖が同じクラスのものである請求項１３または１４記 載のに抗体分子。 １６．重鎖がラットから誘導されたアイソタイプのものであり、第一鎖／第二鎖 がそれぞれＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ｃであるか、 または、マウスから誘導されたアイソタイプのものであり、第一鎖／第二鎖がそ れぞれＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｂである請求項１５ に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 １７．致死を活性化し得るヒトＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーお よび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分 子であって、分子中の２種の重鎖が異なる種もしくはアイソタイプのものである ことを特徴とする二重特異性抗体分子または該全分子のこれらの結合アフィニテ ィーを保有するそのフラグメント。 １８．２種の重鎮がヒト、マウスおよびラットのうちの異なる種から誘導された ものである請求項１７に記載の抗体分子またはそのアラグメント。 １９．２種の重鎮が、一方がラットから誘導され、他方がマウスから誘導された ものであるか、または異なるラットもしくは異なるマウスのアイソタイプのもの である請求項１７に記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ２０．第一および第二の重鎖が同じクラスのものである請求項１７〜１９いずれ かに記載の抗体分子。 ２１．両方の重鎖がそれぞれ抗Ｔ細胞／抗標的細胞特異性に関するラフトから誘 導されるアイソタイプＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ａ、Ｉｇ Ｇ２ａ／ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ２ｃ／ＩｇＧ２ｂであるか、またはそれぞれ 抗Ｔ細胞／抗標的細胞特異性に関するマウスから誘導されるアイソタイプＩｇＧ １／ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１、ＩｇＧＩ／ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ ２ｂ／ＩｇＧ２ａである請求項２０に記載の抗体分子またはそのアラグメント。 ２２．２種の第一重鎖を有し、そのうちの少なくとも一方がその対応する軽鎖と 組み合された抗体分子および該全分子の結合アフィニティーを保有するそのフラ グメントを実質上含まない請求項１２〜１６いずれかに記載の抗体分子またはそ のフラグメント。 ２３．第一結合アフイニティーを有する２種の重鎮を有し、そのうちの少なくと も一方がその対応する軽鎖と組み合された抗体分子および該全分子の結合アフイ ニティーを保有するそのフラグメントを実質上含まない請求項１７〜２１いずれ かに記載の抗体分子またはそのフラグメント。 ２４．全分子のＦ（ａｂ′）２フラグメントまたはＴ細胞結合アフィニティーを 有する重鎖のＦｃ領域のみを欠く全分子のフラグメントである請求項１〜２３い ずれかに記載の抗体分子のフラグメント。 ２５．致死を活性化し得るヒトＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーお よび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分 子のフラグメントであって、該全分子のＦ（ａｂ′）２フラグメントまたはＴ細 胞結合アフィニティーを有する重鎮のＦｃ領域のみを欠く全分子のフラグメント 。 ２６．請求項３〜６いずれかに記載の抗体分子の請求項２５記載のフラグメント 。 ２７．致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティーおよび 標的細胞に対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体コンジュゲー トであって、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対する第一結合アフィニティー 、および標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体分子に結合した免疫 グロブリンに対する第二結合アフィニティーを有する二重特異性抗体分子を含む ことを特徴とする二重特異性コンジュゲートまたは全コンジュゲートの結合アフ ィニティーを保有するそのフラグメント。 ２８．請求項１〜２６いずれかに記載の二重特異性抗体分子またはそのフラグメ ントを、標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体分子または該アフイ ニティーを有するそのフラグメントと組み合せて有する抗体コンジュゲートまた はそのフラグメント。 ２９．標的細胞が腫瘍細胞である請求項２７または２８に記載の抗体コンジュゲ ート。 ３０．請求項１〜２９いずれかに記載の抗体分子もしくはコンジュゲートまたは これらのフラグメントおよび生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリヤーを 含有する組成物。 ３１．標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体分子または該アフィニ ティーを有するアラグメントをさらに含有する請求項３０に記載の組成物。 ３２．請求項１〜２６いずれかに記載の抗体分子またはそのアラグメントおよび 標的細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体分子または該アフィニティー を有するそのフラグメントを含むキット。 ３３．標的細胞が腫瘍細胞である請求項３１記載の組成物または請求項３２記載 のキット。 ３４．手術、治療または診断に使用するための請求項１〜２９いずれかに記載の 抗体分子もしくはコンジュゲートまたはこれらのフラグメント。 ３５．新生組織形成性疾患、ウイルス性疾患または寄生虫性疾患の処置用薬剤を 製造するための請求項１〜２９いずれかに記載の抗体分子もしくはコンジュゲー トまたはこれらのアラグメントの使用。 ３６．新生組織形成性疾患、ウイルス性疾患または寄生虫性疾患の退化もしくは 一時抑えを補助する方法であって、請求項１〜２９のいずれかに記載の抗体分子 もしくはコンジュゲートまたはこれらのフラグメント並びに腫瘍細胞、ウイルス 細胞または寄生虫細胞に対する結合アフィニティーを有する抗体分子または該結 合アフィニティーを有するそのアラグメントを、該退化もしくは一時抑えを治療 上有効にもたらすのに必要な量投与することを含む該疾患の退化もしくは一時抑 えの補助方法。 ３７．疾患が新生組織形成性疾患である請求項３６記載の方法。 ３８．請求項１〜２６いずれかに記載の二重特異性抗体分子またはそのフラグメ ントの製造方法であって、該二重特異性抗体分子を発現するハイプリドーマを培 養することによって該抗体分子を生産させ、適当な場合には、次いで該抗体分子 を処理してそのフラグメントを生成させることを含む、二重特異性抗体分子また はそのフラグメントの製造方法。 ３９．請求項２７、２８または２９記載の二重特異性抗体コンジュゲートまたは そのフラグメントの製造方法であって、致死を活性化し得るＴ細胞受容体に対す る第一結合アフイニティーおよび免疫グロブリンに対する第二結合アフィニティ ーを有する二重特異性抗体分子を、該標的細胞の一方もしくは両方に対する結合 アフィニティーを有する抗体分子またはこれらの抗体分子の一方もしくは両方の フラグメントと組み合わせ、適当な場合には、次いで得られたコンジュゲートを 処理してフラグメントを生成させることを含む、二重特異性抗体コンジュゲート またはそのアラグメントの製造方法。 ４０．請求項３８もしくは３９記載の方法によって製造される二重特異性抗体分 子もしくはコンジュゲートまたはこれらの明白な等価物。