JPH01501206A

JPH01501206A - Ｆｃレセプタ―タンパクを発現するＤＮＡ

Info

Publication number: JPH01501206A
Application number: JP62507044A
Authority: JP
Inventors: ラベツチ，ジエフリー・ブイ．; アンケレス，ジエイ・シー．
Original assignee: メモリアル・スローン―ケッテリング・キヤンサー・センター; ザ・ロツクフエラー・ユニバーシテイ
Priority date: 1986-10-28
Filing date: 1987-10-28
Publication date: 1989-04-27
Also published as: WO1988003172A1; AU8270187A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｆｃレセプタータンパクを発現するＤＮＡ及朋！弓口」本発明はイムノグロブリンレセプターに係わる０本発明は特に、前記レセプター分子を発現するヌクレオチド配列、レセプター分子自体及びこれら分子を産生ずる形質転換細胞系（セルライン）に係わる０本発明はまた、前記タンパクの産生方法にも係わる９本発明は更に、イムノグロブリンレセプターに関係する臓器の類似体にも係わる。

一生体を外来抗原から保護するという機能を得るための免疫システムでは、Ｆｃレセプターとして知られている特異的抗体レセプターの仲介による抗体−抗原複合体とエフェクター細胞との間の相互作用を介して液性及びＩＩＩ胞性経路間°の協働作用が発生する。これらのレセプター分子はエフェクター細胞に対する抗体の結合を仲介する上で決定的な役割を果たすと共に抗体機能の調節にも関与する。

最も一般的なりラスのイムノグロブリンであるイムノグロブリンＧのＦｃドメインのレセプターはＢ細胞、成る種のＴＩＢ胞、天然キラー細胞即ちｒＮＫＪ細胞、マクロファージ及び多形核白血球の上に存在することが知られている。これについては、例えばＵｎｋｅｌｅｓｓ他、＾ｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏ１．３１：２４７ −２７０（１９８１）；　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ他、　Ｃｏｎｔｅａ　、Ｔｏ　、Ｉｍｍｕｎｏ上ｉｏ１．１３：１−３１（１９８４）；　Ｄｉｋｃｌｅｒ、　Ｍｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１９：１３０１−１３０８（１９８２）を参照されたい。

免疫複合体が好中球及びマクロファージ上のＦｅレセプターに結合すると、食作用、活性化酸素代謝物及び炎症メゾイエイタ−例えばロイコトリエン及びプロスタグロンジンの放出、並びに中性ヒドロラーゼの誘発を含む細胞反応が生じる。

これについては、例えばＮａｔｈａｎ他、　Ｎ、Ｅｎ　、Ｊ、Ｍｅｄ。

３０３：８２２（１９８０）を参照されたい。Ｆｅレセプターは、例えばＵｈｅｎ他、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｌｍ５ｕｎｏ１．９５：３６８−３７９（１９８５）でリンパ球上のものについても記述されており、この場合はＢ細胞による抗体産生の調節という役割を果たすとされている。

Ｆｃレセプターはあらゆるクラスのイムノグロブリン（Ｉｇ＾、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、　ＩｇＮ）に関して記述されているが、分子自体については殆ど何も解明されていない、特性が最も良く知られているレセプターは恐らく、「高親和性好塩基／肥満細胞、１．Ｅレセプター（ＦｃＥ）として知られているもの、及びＩｇＧ２ｂ／ｆｇＧＩ免疫複合体に結合するマウスマクロファージＦｃレセプター（ＦｅＣ２ｂ／ＩＲ）であろう、ネズミ種に関しては、種々のｒｇｃサブクラスの競合的結合（Ｄｉａｍｏｎｄ他、　Ｕ■」旦。

１５０ニア２ｌ−７２６（１９７９）　；　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２５：６３１−６３３（１９８０）　；Ｊ、Ｅｘ上、Ｍｅｄ、区：５１４−５１９（１９８１））及びプロテアーゼに対する感受性の差違（ｔｌｎｋｅｌｅｓｓ、　ムｈＬカ説、１４２：１５２０（１９７５））の研究によって１ｇＧ３（ＦｃＧ３Ｒ）、ＩｇＧ２ａ　（ＦｃＧ２ａＲ）及びＩｇＧ２ｂ／Ｃ１複合体（ＦｅＣ２ｂ／ＩＲ）に関する結合部位の存在が明らかになった。

この分子は、Ｎ結合グリコジル化部位を４つもつ５０〜６０にダルトンの膜内在性糖タンパク質であるとされてきた。

これについては、Ｇｒｅｅｎ他、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０：９８６７ −９８７４（１９８５）を参照されたい。

最近の研究では、レセプターの詳細な生化学的特性を知る必要が出てきた。公知のモノクローナル抗体の１つである２、４Ｇ２はマクロファージ及びリンパ球双方のネズミＦｅＧレセプター上に存在するエピトープに対して作用する。

Ｕｎｋｅｌｅｓｓ、　Ｌ玉」シルｌ−，１５０：５８０−５９６（１９７９）参照、この認識されたエピトープはマクロファージ及びリンパ球上に存在することが知られているが、例えばＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　、１３４：２８３５−２８３８　（１９８５）に記載のＰｈ１ｌｉｐｓ他の研究；Ｌ工」しルー−０■主＝２８２−２９６（１９８５）に記載のＢａｕｍ他の研究及びＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４：１７７４−１７７９（１９８５）に記載のＴｅ１ｌｌａｎｄ他の研究は、２．４Ｇ２に対して活性なリンパ球レセプターのイソタイプ特異性カ月ｇＧ２ａに結合しないＦｅＣ２ｂ／ＩＲより広いことを立証している。また、ＦｅＣ２ｂ／ＩＲは、Ｍａｒｋ他、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：２６３５−２４１（１９８５）及びＨｉｂｓ他、　ム、μす１目−，２２：３３５−３４８（１９８５）に記載の公知のＨ１システムに関連したアロ抗原として同定された。染色体１上の遺伝子座は、抗原提示細胞上の産生物を特定し且つ混合リンパ球反応を強く刺激することになる非Ｈ−２７細胞増殖反応を制御する。この遺伝子座の対立遺伝子はこれまでに４つ同定された（ＦｅｓｔｅｎｓＬｅｉｎ、Ｔｒａｎｓ　１ａｎＬａｉｔｏｎ　Ｐｒｏｅｅｅｄｉｎ　ｓ８：３３９−３４２（１９７６））、　ＦｅＣ２ｂ／ＩＲと同じであることが知られているＬｙ−１７抗原（Ｈｏｌｅｓ他、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｅｉ、８２ニア７０６−７７１０　（１９８５））はこの遺伝子座に密に結合するか又はこの遺伝子座によって決定される。

マクロファージとリンパ球レセプターとの間のイソタイプ特異性の相違及び機能的異質性とを考慮して、マクロファージ及びＴ細胞クローンのｅＤＮ＾の単離及び特性分析を行った。これらの実験の結果、２つの遺伝子が単離された。そのうち１つは２つの異なる対立遺伝子形態で存在し、ｉｇｃに結合する細胞外ドメインは相同性が極めて高いがトランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインは様々であるようなタンパク質を発現する。これらの遺伝子は以後ＦｃαＲ１Ｆｃ７９Ｒ及びＦｃβ２Ｒと称する。

′　の、を一旦第１図はマクロファージＦｅＧα発現遺伝子の制限地図及び配列決定法（ａ）とヌクレオチド配列（ｂ）とを示す、　ＵＴは未翻訳配列、Ｓは信号配列、Ｅ−Ｃは細胞外ドメイン、ＴＭはトランスメンブランドメイン、Ｃは細胞質ドメインを表す。

第２図はＭＨＣクラスＩＩタンパクＥに対するＦｃＣの相同性を示す、単一の点は保存的突然変異を表し、２つの点は同一性を表す。

第３図は種々の細胞系におけるＦｃＧαｍＲＮ＾の分布を示す。

第４図は第１図と同様の説明図であって、ＦｅＧβ、　ｃＤＮ＾の制限地図及び配列決定法（ａ）とヌクレオチド配列（ｂ）とを示す、　第５図はＦｃＣα及びＦｃＧβ１タンパクのアミノ酸配列を示す、細胞外部分の相同性は全体で９５％である。

第６図は近交系マウスの［ｌＮ式のサザン法分析を示し、ＦＣＣ遺伝子に関連した多型現象を明らかにしている。

第７図は種々の細胞系におけるβ、転写物の分布を示し且つマクロファージβ２転写を立証している。

第８図はＦｃＣβ２　ｅＤＮ＾の制限地図及び配列決定法（ａ）とヌクレオチド配列（ｂ）とを示している。

第９図はイムノグロブリン結合活性の復元によって示される、トランスフェクションしたマウス黒色腫細胞のＦｃＣβ２の発現を示す。

第１０図はマクロファージ及びＴＭ細胞系から得たＩｇＧ２ｂ／ＧＩＦｃＲｃＤＮ＾遺伝子の構造を要約して示す。

ま　い　の＝　ｆ　；　日Ｆｃ　Ｒの　びアミノＬ上」シμｍ、　１５２　＋　１０４８　（１９８０）に記載のＭｅｌｌｓｉｎ他の公知の方法を少し変えて、ＦｃγレセプターをＳ４９．１細胞系から精製した。懸濁培地中で増殖した細胞（１ｘｌＯ”）を、０．２７ＩＵ／醜ｌのアプロチニンと５Ｊジイソプロピルフルオロホスフェートした．溶解物の上澄み４０，０００ｘにを、樹脂１−１当たり２ｍｇの２、４Ｇ２　ｉｇｃと結合したＳｅｐｂａｒｏｓｅ　４Ｂの５−１カラムに通した。

このカラムを先ず１０カラム容量の１％ＮＰー４０７０．２％ドデシル硫酸ナトリウム含有ＰＢＳで洗浄し、次いで１０カラム容量の１０ｓＭオクチルーβーＤーチオグルコシド含有ＰＢＳで洗浄した。

５０ｍＭ　）リエチルアミンと１０−Ｍオクチル−β−Ｄ−チオグルコシドとを含むｐ）１１１．０のＰＢＳでタンパク質を溶離し、すぐにトリスＨＣＩで中性に調整した。このタンパク質をトリフロオロ酢酸で酸性化し、Ｊ、Ｃｈｒｏｍｉｔｏ　、２９７：０３−１９（１９８４）４．：記載のＰｉｎ他の方法に従い５ｕｐｅｌｅｏ　Ｃ８２ｃｍカラムに通してアセトニトリル０．１％トリフロオロ酢酸によりグラジェント溶離した。

Ｓ４９．１１ｇｆ；２ｂ／γルセブターの２２個のアミン末端アミノ酸を、Ｗａｔｅｒｓ　ＲＰＬＣシステム及びミクロシーケンス装置（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅｌ　４７０＾）を用いて前記物質Ｚｏ。

ｐｒｏ　Ｉに間して調べた結果、ＴＩＩＤＬＰＫＡＶＶＫＬＥＰＰＷＩＱＶＬＫＥＤであることが判明した。対応オリゴデオキシヌクレオチドを合成すべく、縮重度合が比較的低いという理由から７つのアミノ酸ＥＰＰＷＩＱＶを選択した。

　ＤＮＡ　４：３６５−３７４（１９８２）にＣｈｅｎ他によって記載されている好ましいコドンの使用及び形成するＧ−Ｔ塩基対の能力とを考慮して、２０ヌクレオチド配列を合成した。この配列は先に符号で示した配列の相補的ストランドに相当する。この配列はである。

て！ロファージＦ−」且９゜メクレ本±上ｌ廼雅ＸＪ！２　”　９配列前述した縮重度の低い混合プローブを３２ｐ−γ＾ＴＰで末端標識して特異活性を高くし、プラスミドベクターｐＵｃｅ中でサイズを細分されたＪ７７４　ｍＲＮＡに構成されたマウスマクロファージｃＤＮ＾ライブラリーのスクリーニングに使用した（Ｐｏｒｔｎｏｙ他、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８６））、　５０，０００クローンのライブラリーをスクリーニングした結果、２つの陽性クローンが同定された。

前記スクリーニングは６Ｘ　ＮＥＴＳ、　ＩＸ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ、１０’ｅｐ＋＊／−１の３２ｐ−末端標識オリゴヌクレオチド（１０”ｃｐｍ／ｐｇ）を含むハンブリダイゼーション反応を４５℃で１６時間行うことによって実施した１次いでフィルタを６Ｘ　ＳＳＣにより２５℃で５分間洗浄し、その後前記バッファにより４０℃で１分間洗浄し、更に同じバッファにより４５℃で１分間洗浄した。フイルタを乾燥させ、増感板により一７０℃で６時間オートラジオグラフィーにかけて現像した。陽性クローンを同定し、フィルりを６Ｘ　ＳＳＣ中５０ ℃で１分間再洗浄し、更にで６５℃で１分間洗浄した。陽性クローンをより高い温度で示差的に溶融し、コロニー精製、プラスミド調製及び制限酵素分析に力）けな。

最大挿入物（１３００塩基対Ｐｓｔｌフラグメント）をもつクローンを選択して更に分析した。このクローンの配列決定法を第１ａ図に示し、ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を第１ｂ図に示す、６４位の＾ＴＧで始まり８４６位で終了するヌクレオチド７８２個の読取り枠が発見された。推定されるシグナルペプチダーゼの切断部位は矢印で示し、この種の配列のコンセンサスルールに基づいて指定した（Ｖａｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｅ＋、１３３：１７−２１（１９８３））、ヌクレオチド１６０− ２１０からコードされた１９個のアミノ酸は前述のＳ４９．１配列のアミノ酸３ −２２と同じであるが、相違点として位置１２がＳ４９．１ではグルタミン酸残基であるのに対しＪ７７４ではアスパラギン酸である。最初の３つのアミノ酸及び位置１２のこのような相違は。

以下に述べるマクロファージとＴ細胞との間の異質性に起因する。アミノミ３０個のシグナル配列を推定して番号−３０から−１で示し、疎水性核の上に線を引いた。この予想シグナルペプチダーゼの切断部位は前述のＶａｎ　）Ｉｅｉｊｎｅに従い−１と１との間で矢印で示す、Ｎ結合グリコジル化部位は箱で囲み、システィン残基は円で囲んだ、推定されるタンパク質配列は２つの疎水性アミノ酸残基領域を含み、第１ｂ図ではこれら領域の上に線を引いて示した。これらの領域ζよ推定上のシグナル配列（ヌクレオチド６４−１５３）とトランスメンブランアンカー配列（ヌクレオチド７０９−７６９）とをコードする。４つの潜在的Ｎ結合グリコジル化部位（第１ｂ図の箱で囲んだ部分）と２つの鎖間ジスルフィド結合を構成し得る４つのシスティン残基とを含む成熟タンパク質には、アミノ酸１８５個の細胞外ドメインが存在すると予想される。セリン及びスレオニンに富んだ領域はトランスメンブランドメインの直前にあり、３０％の残基がこれら２つのアミノ酸で表されるアミノＭ　１５５−１８５からなる。この配列力）らアミノ酸２６個の細胞質ドメインが予測される。第１配列↓よ３０．０４０ダルトンの分子量を有すると推定される。この配列は前述の４つのＮ結合部位でグリコジル化され、場合によっては０結合部位でもグリコジル化される。

上記細胞外ドメインは２つの内部反復配列力）ら成る。予想成熟タンパクのアミノ酸２５〜７５はアミノ酸１００〜１５５に相同を示す、システィン残基周囲のこれらの相同クラスターは構造的反復ドメインを示唆する。これらのデータ番よ、細胞外ドメインがシスティン残基によって規定される反復ドメインから成ることを示唆する。この配列をタンノ（り配列データバンクに比較すると、イムノグロブリン分子、ＭＢＣクラスＩ及びクラスＨタンパク、β２マイクログロブリン及びこの超遺伝子族＜ｓｕｐｅｒｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）のその他の遺伝子に対する有意な相同が判明した。、細胞外ドメインとウサギＶ領域との相同は、双方のタンパクでシスティン残基の周囲に集中する相同クラスターによって判明した。この相同は、このＦｅレセプターが２つのイムノグロブリン様ドメインを含み、各ドメインが、７０〜８０個のアミノ酸ドメインの内部の４２個のアミノ酸の潜在ジスルフィドループから成ることを示唆する。

このＦｃＲに対する最も有意な相同はＭＨＣクラス■タンパクＥβで観察され、第２ａ図に示すごとく９１個のアミノ酸領域にわたる３２％の一致が観察される。プログラムｒｄｆ　（Ｌｉｐｍａｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５〜１４４０１９８５））を使用してこれらの２つの配列のランダムシャラフリングを行なうと、第２ａ図の最適位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が極めて有効で平均＋５の標準偏差であることが判明した。Ｅβに対するこの相同はβ２ドメイン（第２ｂ図）で発生し、β２ドメイン自体がイムノグロブリン様ドメインである。この分析によればまた、これらの２つのタンパクのトランスメンブランドメインの相同も明らかである。

種々の細胞系から抽出したーＲＮ＾において、α遺伝子と指称されるＪ７７４細胞系からクローニングされたｅＤＮ＾に対応するメツセージの存在を分析した。

　Ｃｈｉｔｇｗｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：５２９４（１９７９）及びＬｅｈｒａｅｈ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６：４７４３〜４７５１（１９７７）の一般手順を使用した。要約すれば、１１１ｆｔのポリ八ＲＮ＾をアガロース−ホルムアルデヒドゲルで分画し、ニトロセルロースに移し、完全αプローブ（ａ）又は５′α配列に構築されたプローブ（ｂ）とストリンジェント条件下にハイブリダイズした。第３図から明らかなごとく、マクロファージ系Ｐ３８８　Ｄｉ、圓Ｅｌｌ　３＾、ＲＡＩＩＩ　２Ｂ４．７及びＪ７７４で広いハイブリダイゼーションバンドが検出される。　ＦｃγＲモノクローナル抗体２．４Ｇ２と反応するＴ細胞系Ｓ４９．１はより高い分子ｌのｍＲＮＡ種を含む、　Ｐ２Ｓ５は均等な存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の２つのＲＮ八へを示し、ＷＥＨＩ　３＾は、１８Ｓより速く泳動する主バンドと、１８Ｓより遅く泳動するはるかに少ない存在量のバンドとをもつ、　２．４に２陰性の系ＣＬ、７（線維芽細胞）、し−細胞（線維芽細胞）及びＬ５１７８９（Ｔ細胞）はα転写物を含まない、プローブをｅＤＮ＾の５°配列に構築し同じマクロファージ及びＴ細胞ＲＮＡ（第３ｂ図）の研究に使用すると、α遺伝子の発現の細胞型特異性が明らかであった。　Ｓ４９．１細胞系においてはこのプローブによる転写物は全く検出されず、Ｐ２Ｓ５においては１つの種だけが検出される。同様に、ＷＥＨＩ　３＾において、１８Ｓより遅く泳動する少ない存在量の種はこのプローブによって検出されない、α ｃＤＮ＾から３゛プローブを構築したときも同様の結果が得られた（Ｓｅｔ−Ｐｓｔ、データ図示せず）。

これらの結果は、Ｔ細胞系Ｓ４９．１とマクロファージ様系Ｐ３８８及びＷＥＨＩ　３＾は、完全プローブでプローブした際にクロスハイブリダイズする、５° 及び３°末端はマクロファージα転写物と相同でないＲＮＡ種を含むことを示す、別の２つのＴ細胞系ＥＬ−４及びに−３６を分析すると、Ｓ４９．１で検出された転写物と同様のサイズの転写物が検出された（データ図示せず）。

これらの転写物とその発現の遺伝的基盤（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｂａｓｉｓ）とを同定するために、ｅＤＮ＾ＤＮＡラリーを、サイズ分画したＳ４９．１　ｍＲＮＡに構築し、完全ｃＤＮ＾αＤＮＡブでプローブした。陽性クローンを頻度０．１％で同定し、制限地図作成及びＤＮＡ配列解析によって特性決定した。

第４ａ図は、β１と指称されるＴ細胞転写物の物理的地図と配列決定方法とを示す、第４ｂ図はこのタンパクのヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列とを示す、使用した手順は、マクロファージＤＮＡの物理的地図と配列とを得るために使用した１罷え１の手順と同じであった。ヌクレオチド３４０の八ＴＧで開始しヌクレオチド１３２６で終結する１つの読取枠が検出された。変性以前のこのタンパクの予想分子量は３６．７５０ダルトンである。ヌクレオチド４２フ（位置＋１）から開始する２２個のアミノ酸がコードされ、これらはこのタンパクの決定アミノ末端配列と一致する。このＮ末端に先行する配列は、特徴的疎水性コア（上線を付した部分）をもつシグナル配列をコードし、このシグナル配列は、α転写物のシグナル配列と相同でない（第１ｂ図参照）、細胞外ドメインは、第５図に示すごとく、β１配列のアミノ酸４で開始しアミノ酸１７４まで続くα配列と９５％一致する。β１配列のトランスメンブラン及び細胞質ドメインは　配列の類似ドメインに相同でないと予想される。これらの２つの転写物の５゜及び３°非翻訳ドメインで配列相同は全く観察されない。

Ｓ４９．Ｉ　ＦｅγＲについて更に４つのトリプシンペプチドの配列を決定した。１０個のアミノ酸の配列５ＱＶＱＡＳＹＴＦＫがβ１配列の位？１Ｆ５０〜５９に確認された。８個のアミノ酸の配列ｌ５ＦＦＨＮＥＫが位置１２０〜１２７に確認された。１３個のアミノ酸配列ＥＭにＥＴＬＰＥＥＶＧＥＹが位ｒ１１２２２　ヘ２３５ニ存在ｔ、りｌｔ＆４：ｌ：、１３個のアミノ酸配列ＴＥＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＫが位置２７１〜２８３に確認された。

α配列及びβ１配列の双方がＢ＆ｌｂ八マウへに由来の細胞系から得られなので、高度に保存されたｍ取外ドメインの５％の配列変異は対立遺伝子変異がら生じながった。β１転写物が第二遺伝子に由来したことを確認するために、マウスの種々の同系株から得られたＤＮＡのサザンプロット分析を使用して、α及びβゲノム配列の地図を作成した。第６図に示すごと（、丁ａｑｌで切断し完全αプローブでプローブしたＤＮＡは、この遺伝子に関連した多型性を検出し、異なる長さの３つの制限フラグメントを生じる。これらのプロ・）トを５°及び３゛プローブで再度プローブして決定すると、この多型性はα遺伝子の３′に存在する（データ図示せず）、シかしながら、これらの同じＤＮＡ標本を完全β１　ｃＤＮ＾ＤＮＡブ（第６ｂ図）でプローブすると、α遺伝子に関連した３°多型性フラグメントは、２．４ｋｂの非多型性フラグメントで置換されている。これらのデータは、α及びβ転写物が、細胞外ドメインをコードする高度に保存された配列を含む異なる遺伝子に由来することを示唆する。低度にストリンジェントな条件下（２５％ホルムアミド、１０％ＫＭデキストラン、５ＸＳＳＣ４０℃；最終洗浄液＝、２ｘＳＳＣ１，１％ＳＤＳ　４０℃）にα及びβの双方のプローブとのハイブリダイゼーションを行なうと、クロスハイブリダイズする追加の制限フラグメントが検出され、これは、この遺伝子族＜ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ）の第三の遺伝子の存在を示唆する（図示せず）。

！ＪｆｆｌｌｌＪ　びマクロファージ７におＣの第７ａ図は、β１　ｃＤＮ＾ＤＮＡブでプローブされたマクロファージ及びＴｉ胞系のＲＮ＾プロット分析の結果を示す、このプローブは、Ｓ４９．１転写物を検出し且つマクロファージ系の α転写物にクロスハイブリダイズすると予想される。しかしながら、このプロットの結果と第４ａ図の結果とを比較すると、異なるパターンの転写物が異なる存在量で検出されることが明らかである。特に−ＥＨＩ　３＾及びＰ２Ｓ５は、同等の存在量の２つの転写物を示し、この転写物の一方がＳ４９．１転写物と同じ見掛は易動度をもつ。これは、第７ｂ図に示すごとく、α遺伝子に対する相同が観察されないこの転写物の５′非翻訳領域に構築された５′βｌプローブを使用することによって確認される。マクロファージ系においてはこのプローブによって転写物が検出される。これにより、マクロファージにおいてはβ遺伝子が発現すること及びＪ７７４、ＲＡＭ及びＰ３８８Ｄ１において検出される転写物がＳ４９．ｌ　Ｔ細胞系で検出される転写物とは異なるサイズをもっことが判明する。これらのマクロファージβ転写物を研究するために、Ｊ７７４　ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを、β遺伝子に由来の共通非反復配列によってスクリーニングした。得られたクローンの制限酵素地図は、これらのクローンとＳ４９．１細胞系のβ１転写物との違いがＸｍｎ部位の欠失にあることを証明した。β２と指称されるマクロファージβ転写物の物理的地図と配列決定戦略とを第８ａ図に示し、ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列とを第８ｂ図に示す、これらを得るために使用された手順は煎ｍ−の手順と同じである。

１　２　の　：　ドメイン　のＴ、。

スブー　ス β１配列及びβ２配列は全長にわたって一致するコード配列及び非コード配列を有しているが、β１配列においては、β２配列のヌクレオチド７８３の直後に１３８個のヌクレオチドが挿入されている（ヌクレオチド１０６６〜！２０４、第４ｂｌＪの上向き矢印で示す）、この配列により、β１転写物の細胞質ドメインに４６個のアミノ酸が挿入されることになる。この挿入の結果として、Ｓ４９．１及びＴ細胞系ＥＬ−４及びに−３６において検出される転写物が大きい（データ図示せず）、　７７　ＲＮ＾ポリメラーゼから発生したβ１遺伝子特異性ラジオラベルＲＮＡプローブを使用したＲＮａｓｅ保護（Ｘ＋＊ｎ−Ｐｓｔ、第４ａ図参照）を行なうと、Ｓ４９．１及びに−３６７細胞系においては５００個のヌクレオチドから成るβ１遺伝子特異性の被保護フラグメントが検出されたがマクロファージ系Ｐ３８８Ｄ１においては検出されなかった。　Ｓ４９．１及びに− ３６においては、５００ｂ、の被保護フラグメントに加えて、Ｐ２Ｓ５　Ｄｉマクロファージ被保護フラグメントと同時泳動（ｅｏｍｉｇｒａｔｅ）する３８２ｂｐのフラグメントが検出された。このフラグメントは、β２転写物による保護が予想されたフラグメントのサイズと一致する。これらの結果は、β遺伝子がＴ細胞及びマクロファージに転写されることを示唆する。また、Ｔ細胞においては、１３８ｂｐの挿入をもつ転写物が検出される。これはＴ細胞ＦｅγＲβ中に追加エキソンを発生せしめる別のスプライス経路によって極めて簡単に説明できる。何らかの翻訳後嘘コを行なう前のβ２タンパクの予想分子量は３１，８８６である。

ＦｃγＲの機能的ドメイン：トランスフェクションされたセルラインにおける発現ＦＣレセプターに関して記載されている構造的異質性の機能的役割を評価し、リガンド結合に１以上のポリペプチド鎖が必要か否かをｉ認するために、ＦＣレセプター陰性細胞をこれらＣＤＮＡクローンでトランスフェクションした。転写にＳＶ４０初期プロモーターを利用する発現ベクター（ｐｃＥＸＶ−３）（Ｍｉｌｌｅｒ　、他、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４：４２１２−４２１７（１９８５年）参照）内にβ１又はβ２　ｃＤＮＡをコードする配列をクローニングして発現を行った。０４１８に対する耐性を付与するｐＧＣｃ。

ｓ　３ｎｅｏ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　、他、　Ｊ、　Ｍｏ　ｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ、　１　□３２７−３４１　（１９８２）参照）及び上記プラスミド禍築物を使用して８７８Ｈ１マウスメラノーマｌ胞をコトランスフェクションした。

Ｇ４１８含有培地中で１０日間培養した後、モノクローナル抗体２．４Ｇ２結合ヒト赤血球と共にロゼツト形成させることによって各クローンをスクリーニングにかけた＜Ａｌｂｉｎｏ、他１Ｍ０１＆Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　、　５　：　６９２−６９７　（１９８５）　＠照）。陽性細胞をりＯ−ニングした後、そのＦｃ γレセプター活性につき試験した。

第９図は、発現ベクター内にりＯ−ニングされたβ２　ＣＤＮＡによって得られたメ結果を示ず。２．４３２エピトープを発現する安定ラインはラビット抗５ＲＢＣでオプソニン化した羊赤血球（ＳＲＢＣ）に強力に結合した。この事実はＦｃγレセプター機能をｖ１ｔ！的に示すものである。更に、この結合はモノクローナル抗体２．４Ｇ２によって濃度依存的に阻害され、この事実からもこの結合が該レセプターに特異的であることが示される。発現ベクター内でクローニングされたβ１挿入物によってントランスフェクションされた細胞も同様の結合様式を示した。

ントランスフェクションされていない８７８Ｈ１細胞、ＦｃγＲβ配列がＳＶ４０初期プロモーターに関して逆の方向で挿入されているものでトランスフェクションされた細胞及び抗体で被覆されていない５ＲＢＣを用いた場合は全て陰性の結果が得られた（データは示さず）。以上の実験から、該ｃＤＮＡクローンが発現するタンパクが１１１胞の表面に提示されて特異的な様式で抗原−抗体複合体の結合を媒介し得ることが示された。マウスＬ細胞又はモンキーＣＯ８細胞などの他のセルラインを用いた実験によって、これら配列がＦＣＣレアターを特定する能力は細胞種特異的ではないことが示唆された。

Ｆｃγレセプターをコードする遺伝子が２つ同定された。その一つはαと命名され、マクロファージセルライン及び腹膜マクロファージ内で発現される。もう一方はβと称され、マクロファージ及びＴセルライン内で発現される。これら遺伝子は、夫々２つのグリコシレージョン部位を有する二つの繰り返しＮ末端ドメイン及び４２−４５個のアミノ酸から成る分子内ジスルフィドループ形成可能部分を有するＩｌ！透過タンパクをコードしている。この構造予測は、Ｎ結合グリコシレージョン部位が４つ存在することを示したイン・ビボ標識方法によって得られた結果と一致している。γ及びβ遺伝子の細胞外領域については９５％の相同性がある一方で、そのｊｉ！透過及び細胞質領域を」−ドする部分は全体的に異なっており、これは、リンパ球及びマクロファージのＦＣγレセプター間に見られる機能の相違は異なるシグナル′ＩＲａにその一部が由来していることを示唆するものである。

しかしながら、細胞特異的なスプライシング機構が異なるタンパク産生をなし得ることを考えるならば、該遺伝子システムにおける複雑さには更にもう一つのレベルがあると考えられる。

β遺伝子はＴ細胞及びマク［１）７−ジの両者において転写されるが、ＴＩＢ胞特異的な転写産物（β１）を分析してみると１３８個のヌクレオチドが付加されていることが判り、従って、Ｔｉ胞系Ｆｃγレセプターの細胞質領域内に４６個のアミノ酸が挿入されることとなる。ＲＮアーゼ保護実験によると、β１転写物はＴセルラインには見出されるが、Ｊ７７４　、　Ｐ　３８８Ｄ１又はＲＡＷマクロファージセルラインには見出されない。これは恐らく、β遺伝子のもう一つの異なるスプライシング経路から生じたものであろう。初期のマクロファージセルラインＰ３８８及びＷＥＨＩ３ＡがＴセルラインのものと同じ見掛は上の移動度を有するβ転写物を有していることから、β１スプライシングはマクロファージ成熟の間に発達段階的に調節されるものであることが示唆される。上記アミノ酸挿入による効果は未だ理解されていないが、βＩＦｃγＲ中の細胞質内領域がより長くなることから、シグナル導入に関与する細胞質又は膜タンパクとの相互作用が異なってくることが考えられる。α及びβ遺伝子から誘導された３つの転写物の構造を第１０図に概説する。

これらレセプターについて得られた配列から、ＦＣγレセブターは、上皮細胞からＩＯＡを輸送する機能を担うポリｌＱＡレセプター（Ｍｏｓｔｏｖ　、外、　Ｎ　ａｔｕｒｅ　３０８：３７−４３　（１９８４）参照）がそうであるように、イムノグロブリン配列ファミリーに属することが判明した。全体的なイムノグロブリンとの相同性の他に、ＦｃγＲについて幾つか他の重要な相同点が同定された。

α及びβ遺伝のＩＢ胞外領域は、ＭＨＣクラス■タンパクＥβのβ２領域に非常に相同的である。対照的に、ポリＩＱレセプターはＦＣγレセプターと上記のような顕著な相同性はなく、これがクラス■抗原決定基よりもＦｃγレセプターに対する距離的関係が遠いことを示唆している。

α鎖の膜誘過領域に検出されるがβ鎖には検出されない他の顕著な相同性は、アセチルコリンレセプター鎖の膜透過領域の１つとの間で見られるものである。Ｙ　ｏｕｎｇ他（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｔｌ、△ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、ａｏ　：　１６３６−１６４０　（１９８３）　）及びネルソン他（ｌ４Ｃｌ　ｉｎ、　Ｔ　ｎｙｃｓｔ、　７６　：　５００−５０７　（１９８５））はＦＣ７レセブターに対するリガンドの結合に対応するイオンチェンネル活性について報告している。Ｆｃレセプタータンパクの様々な構造的領域が果たす役割については目下研究中である。

本発明のこれまでに記載された種々の態様は、当業者によって利用及び応用され得るであろう。例えば、免疫障害を有する患者については、必要なＦｃレセプタータンパクを発現せずに、従って感染に対して十分な又は完全な応答を具備することがない細胞及び器官までその原因を追跡することが可能である。適当に形質転換された細胞の培養によってイン・ビトロで産生されたＦｃレセプタータンパクをその中に有する人工器官、又は該タンパクを産生ずる形質転換細胞（生理学的に許容可能なもの）と共に接種される器官等が考えられる。

第二の利用・応用例としては、本明細書で開示のＤＮＡに対応するヒトＤＮＡを獲得する目的での本発明ＤＮＡの使用である。マウスのプローブを用いて、確立されたＤＮＡハイブリダイゼーシフン技術に従い、ヒトｌ”ｃレセプタータンパクを発現するＤＮＡの位置を明らかにしそれとハイブリダイズさせることができる。これらの技術は当業者には良く知られているものである。

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｆｃレセプタータンパクを発現する実質的に純粋なヌクレオチド配列。
２．前記レセプタータンパクがＦｃｒレセプタータンパクである請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド配列。
３．前記レセプタータンパクがＦｃｒａレセプタータンパクである請求の範囲第２項に記載のヌクレオチド配列。
４．前記レセプタータンパクがＦｃｒｂレセプタータンパクである請求の範囲第２項に記載のヌクレオチド配列。
５．前記ＦｃｒｂレセプタータンパクがＦｃｒｂレセプタータンパクである請求の範囲第４項に記載のヌクレオチド配列。
６．的記ＦｃレセプタータンパクがＦｃｒｂ２レセプタータンパクである請求の範囲第４項に記載のヌクレオチド配列。
７．以下の配列を有する請求の範囲第３項記載のヌクレオチド配列：【配列があります】
８．以下の配列を有する請求の範囲第５項記載のヌクレオチド配列：【配列があります】
９．以下の配列を有する請求の範囲第６項記載のヌクレオチド配列：【配列があります】
１０．実質的に純粋なＦｃｒレセプタータンパク。
１１．前記タンパクがＦｃｒａタンパクである請求の範囲第１０項記載の案質的に純粋なＦｃｒレセプタータンパク。
１２．前記タンパクがＦｃｒｂタンパクである請求の範囲第１０項記載の実質的に純粋なＦｃｒレセプタータンパク。
１３．前記タンパクがＦｃｒｂｌタンパクである請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋なＦｃすこレセプタータンパク。
１４．前記タンパクがＦｃｒｂ２である請求の範囲第１２項記載の実質的に純粋なＦｃｒｂレセプタータンパク。
１５．以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１１記載の実質的に純粋なタンパク：【配列があります】
１６．以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１３項記載の実質的に純粋なタンパク：【配列があります】
１７．以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１４項記載の実質的に純粋なタンパク：【配列があります】
１８．真核細胞を、Ｆｃａ．Ｆｃｂｌ及びＦｃｂ２レセプタータンバクから成る群より選択されたＦｃレセプタータンパクを発現する実質的に純粋なヌクレオチド配列で形質転換し、該形質転換細胞を発現に好適な条件下で培養し、該タンパク及び該発現タンパクを精製することから成る、実質的に純粋なＦｃレセプタータンパクを得る方法。
１９．キャリアＤＮＡの部分内に連結された、Ｆｃ．Ｆｃｂ及びＦｃｂ２から成る群より選択されたＦＣレセプタータンパクを発現する実質的に純粋なヌクレオチド配列を含む、Ｆｃレセプタータンパク発現ベクター。
２０．ｐｃＥＸＶ−３である請求の範囲第１９項記載のベクター。
２１．Ｆｃａ、Ｆｃｂ及びＦｃｂ２から成る群より選択されたＦＣレセプタータンパクを発現する外来性ヌクレオチド配列で形質転換された真核細胞ライン。
２２．請求の範囲第２１項記載の生理学的に許容可能なセルラインを含有するイムノグロアリンレセプター器官アナログ。
２３．実質的に純粋なヒトＤＮＡを含有するサンプルをマウスＦｃレセプタータンパクを発現するマウスＤＮＡサンプルと、該マウスＤＮＡ及び相補的ヒトＯＮＡ間のハイブリダイゼーションに好適な条件下で接触させ、ハイブリッドＤＮＡを非ハイブリッドＤＮＡから分離させる為に該サンプルを処理し、該ハイブリッドから該マウスＤＮＡを除去することから成る、ヒトＦｃレセ７タータンパクを発現する実質的に純粋なヒトＤＮＡを得る方法。
２４．前記ＤＮＡがＦｃｒ．Ｆｃｒａ．Ｆｃｒｂ１及びＦＣｒｂ２から成る群より選択されたレセプタータンパクを発現する請求の範囲第２３項記載の方法。
２５．請求の範囲第２３項記載の方法で得られた実質的に純粋なヒトＤＮＡ。