JPH01501339A - 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された核酸ハイブリダイゼーション方法及びそれに用いるキット １−一旦 本発明は核酸ハイブリダイゼーション（交雑）方法及びその方法において用いる 診断用キットに関する。

この明細書において特定されたすべての論文及び引例はここに引例として編入さ れる。

伝統的な微生物診断においては、試料中の微生物の存在はその微生物の単離によ フて決定される。ＷＬ生物は集積培養後、その生化学的性質又はその免疫学的性 質のいずれかに基づいて決定される０両ことが必要である。このような同定は手 間がかかり時間を非常に消費するものとなる。

遺伝子研究の発展によりて、微生物はたとえ生存できないようなものであっても 、それが含有する特定の核酸によって同定し得ることが明らかになった。核酸は 通常二本鎖であるデオキシリポ核＠　（ＤＮＡ）でありてもよいし１通常二本鎖 であるリボ核酸（ＲＮＡ）であってもよい、細菌、菌類、ウィルス、酵母などの 生物体はすべてそのようにして同定される。一般に、同定操作には人工的に誘発 するリシス（溶解）、すなわちそれにより生物体の細胞壁を破壊し、同定される べき核酸を放出することが含まれる。

核酸分子（例えばＤＮＡ）の２重らせんの水素結合構造は加熱及び／又はアルカ リ処理によフて崩壊させることかできる。相対する鉛量を連結する共有結合が存 在しないから２重の核酸分子の２種のポリヌクレオチド鎖はすべての水素結合が 破壊された時完全に分離する。この鎖分離工程は変性と呼ばれる。変性核酸の非 常に有用な特性は適切な条件下でこの反応を同じ材料からの２種の相補的鎖が再 形成して２重らせんになることができるようＮ転させ得ることにある。これは再 生と呼ばれる。再生には変性により分離された２種の相補的ヌクレオチド配列の 反応が含まれる。この手法はまた何らかの相補的ヌクレオチド配列をも互いにア ニーリングして２重構造−末鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ間又は２種の異なった出所から の一本鎖ＤＮＡ間の反応のように異なった核酸部分からのヌクレオチド配列がも たらされる場合へイブリダイゼーション（交雑）として示される。

核酸へイブリダイゼーシランは特定の核酸を同定するための周知の方法である。

２種の一本鎖核酸生成物を交雑させ得ることか現在の核酸検定の基礎となつてい る。これらの検定の原理は２種の一本鎖核酸生成物を互いに接しさせ、次いで形 成された二本鎖物の量を測定することにある。

へイブリダイゼーシコン検定には通常ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション プローブの使用が含まれる。プローブは一般に一本鎖状にされた核酸の断片、又 は変性された二本鎖状の断片からなっている。プローブは標的核酸（同定すべき 核酸）上のヌクレオチド配列に対応する相補的な特定のヌクレオチド配列を有す ることて特徴づけられる。プローブと標的ヌクレオチド（−末鎖状にされた）は −緒にされると相補的な配列が対になって２重の分子を形成する。プローブは一 般に精製試薬の形として調製され、プローブの分子構造中に容易に検知できる標 識が組みこまれる。したがつて、標的ヌクレオチドの存在は標識を担持する交雑 ２重分子の形成によって確認することかできる。

ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは「標的」ヌクレオチド配列 を検定し、位置を限定し１分離するのに安価、有りダイゼーションに興味深い背 景情報をその調製方法及び使用についての討論を含めて提供している。ポリヌク レオチドハイブリダイゼーションプローブの公知の調製方法及びそれらプローブ の使用方法は文献中によく記載されている。サウザーン、ジャーナル・オブ・モ レキュラー・バイオロジー、９８：５０３−５１７（１９７５）、ファルコウら 、米国特許第４，３８５，５３５号。

シーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスニブ・ ザ・ニーニスエイ、７９：４３８１−４３８５（１９８２）、及びランガーら、 プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ オブ・ザ・ニーニス丑ゴ、、工且：　６６３３−６６３７　（１９８１）を参照 されたい、これら及びその他の文献に開示されているように、それら公知のグロ ーブ調製方法は典型的には二本鎖ＤＮＡプラスミド中にプローブ域をクローニン グすることが含まれる。プローブ域を担持するプラスミドは、典型的には酵素的 重合技術によつて標識材される。

この技術には１例えば、切れ目にツク）移動法（リグビーら、・オブ・バイオロ ジー、２０　：　２９０　（１９７６）　）、及び末端添加法などが含まれ、こ れらの方法は変性ヌクレオチドトリフオスフェートの存在下で行われる。プロー ブ核酸はまたハブテン又はビオチンを用いる化学的手段により標識材することが できる（チェノら、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８１　：　３４６６　（１９８４）、フォ ースターら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ・１．３ニア４５（１９８５） 、ビシディら、ジャーナル・オブ・りｖ＝−ｈル・ミクロバイオロジー２３：３ １１　（１９８６）。

へイブリダイゼーシヲン検定を行うには原理的には２種の方法。

すなわち溶液（又は液体）へイブリダイゼーション、及び固体キャリアへイブリ ダイゼーションがある。溶液ハイブリダイゼーションにおいては、−末鎖状にさ れた核酸製剤が相互に混合される。大量の試料の場合には反応は光学濃度の変化 によつて追跡することができる。少量の場合には、プローブに、放射性標識など の容易に検知できる標識がつけられる。未反応の一本鎖は二本鎖から分離され、 二本鎖状になりだ核酸はその中に標識が存在することを検知することにより同定 することができる。

ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）が溶液中の交雑したプローブを交雑しなか９たプ ローブから分離する標準的な方法として用いられてきた。ＨＡは正常な条件下で 交雑したＤＮＡプローブと選択的に結合するが、交雑しなかフたプローブとは結 合しない。交雑したプローブを交雑しなかったプローブから分離するのにその他 の方法も用いることができる。そのうちの１つの方法には特定の酵素、すなわち 交雑しなかったプローブを選択的に小さい断片に分解するＳ１ヌクレアーゼの使 用が含まれる。二本鎖の分子はこの酵素に影響されない０次いで、分解したプロ ーブは周知のサイズ分離方法１例えズ・イン・エンザイモロジー、　ＸＸＩＸ、 第３６３ページ、グロスマン及びモルダシ編、アカデミツク・プレス、ニューヨ ーク１９７４゜溶液ハイブリダイゼーションは速度及び反応効率の点で有利であ る。しかし１重大な欠点も有している。交雑したプローブを交雑しなかったプロ ーブから分離する段階は一般に多大の労力と時間を消費するものであり、自動化 は一部分に限定される０例えば上述のサイズ分離技術は比較的非特定的で、非効 率的であり、再現性に劣っている。ＨＡ分分力方法より特定的ではあるけれども 、この方法は一般に標的ポリヌクレオチドがプローブに対して多量に存在する場 合、または標的物がＲＮＡである場合あるいはその両方である場合にのみ有用で ある。さらに未精製サンプル、例えば植物及び動物の組織ホモジェネート、血液 、糞、Ｊｓ及び尿道粘液などの場合、有効な分離を行うことが非常に困難である 。

固体キャリアへイブリゼーションに３いては、−末鎖核酸製剤の１つは固体キャ リア上に固着させることにより固定化される。ポリヌクレオチドのいずれかの末 端を与えられた支持体と連結するのに多数の方法がある０例えば、ワイスバック 、エイ、及びブーニアン、エム、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第ＸＸＸ ＩＶ巻、パート・ビー、４６３−４７５．１９７４を参照、また、ポリヌクレオ チドの誘導体１例えば末端アミノヘキシルヌクレオチドを担持するものは容易に 種々の支持体上に付着させることがてきる。モスバック、ケイ、ら、メソッズ・ イン・エンザイモロジー、第Ｘ１．ＩＶ巻、８５９−８８６，１９７６を参照、 オリゴリボヌクレオチドは種々の支持体のホウ酸塩誘導体上に固定化することが できる。ショット−エッチ、ら、バイオ’ｒよｘ　トリー、１２，９３２．１９ ７３を参照。

一例てはあるが、ニトロセルロースは一本鎖ＤＮＡを吸着するが、ＲＮＡは吸着 しない、さらに、それ以上のニトロセルロース上のＤＮＡ吸着は周知の処理によ つて阻害することができる。その後、もし第２の変性ＤＮＡ又はＲＮＡ製剤が添 加されると、それはもし最初に吸着されたＤＮＡと対を設立することができるな らば固体キャリアに固着される。一般に最初に固体キャリアと結合しなかった核 酸製品は標識づけされる。ハイブリダイゼーション反応が完了した後に固体キャ リアは反応混合物から分離され、ハイブリダイゼーションの度合は固体キャリア に固着された標識を測定することによりて決定される。

固体キャリアハイブリダイゼーションの洗練されたものはランキの米国特許第４ ，４８６，５３９号に述べられたようなサンドイッチハイブリダイゼーションで ある。試料は標的ヌクレオチド（同定されるべき核酸）を−末鎖状にする条件で 処理される。試料は次いで２種の精製核酸試薬と混合される。第１の核酸試薬は 少なくとも１０個の塩基からなるヌクレオチド配列を有し、固体キャリアに固着 された核酸の一本鎖断片を含有している。第２の核酸試薬は少なくとも１０個の 塩基からなるヌクレオチド配列を有し、放射性同位元素で標識された核酸の一本 鎖断片を含有している。核酸試薬は標的ポリヌクレオチドと相補的塩基対合によ りて交雑分子を形成することができるものである。２種の核酸試薬は相互に交雑 することができない０次いで、固体キャリアは洗浄され、交雑分子中に取りこま れなかワた標識が実質的に除去される。その後、標的核酸の存在が洗浄された固 体キャリア上の標識を測定することにより同定される。また、サンドイッチハイ ブリダイゼーションは単一の核酸試薬を用いる方法に比して２種の特定ハイブリ ダイゼーション工程を含んでいるため改良された特徴を有している。

固体キャリアハイブリダイゼーションの利点は標的核酸とプローブから形成され た交雑分子を反応混合液から分離するのが容易なことである。しかしながら、従 来の固体キャリアハイブリダイゼーション方法は上記のランキによるサンドイッ チハイブリダイゼーション方法を含めて重大な欠点を有している。固体キャリア へイブリダ−（ゼーションの反応速度はすべてのハイブリダイゼーション成分が 拡散されないので溶液ハイブリダイゼーションより非常に遅い、溶液法で分の単 位で完了する反応は固体キャリア法では時間、あるいは日の場合もある。さらに 、ある種の核酸は塩基対合に使用できないからハイブリダイゼーション効率もま た非常に低い、その上、所要とされる調製の度合も重要である。一般に、ハイブ リダイゼーション用サンプルの調製には数時間が必要であり、１〜２時間が洗浄 に必要である。また比較的多量のプローブが必要とされる。

したがって、溶液ハイブリダイゼーション及び固体キャリアハイブリダイゼーシ ョン両方の利点を組合わせた核酸検定方法が望まれる。

遺伝学的疾病の診断は、現在の技術水準では、通常時間がかかり、労力が必要な 技術が用いられる。遺伝学的疾病の同定法として最近受は入れられている診断法 は制限酵素断片長多形化法（ＲＦＬＰ）として知られる方法である。ＲＦＬＰ法 では一般に制限酵素を用いてサンプルＤＮＡを処理することにより生じる遺伝子 断片の大きさに基づいた若干退屈な分離段階が用いられる。組状赤血球貧血症と いう特殊な例はＲＦ　Ｌ　Ｐ法の最も理解され易い変法でページには最近の胎児 期踵状赤血球貧血症試験がどのように行われるかを示す論説が記載されている。

一般にＤＮＡ試料は正常及び踵状の対立遺伝子に対し大きさの異なった２種のグ ロブリン遺伝子断片を生成させる制限酵素（ＭｓｔＩＩ）により処理される。断 片は大きざに応じて、例えばアガロース電気泳動ゲル上に分離される０次いで、 これら断片は一本鎖状にされ、ろ紙上に移され、へイブリ〜ダイゼーシジンブロ ーブによって同様サイズ片モラス中で正確な断片が同定される。この試験のゲル 電気泳動段階及び移行段階はともに高度に熟練した個人術が必要であり、かつ時 間のかかる段階である。

必要とされるのは遺伝学的疾病による遺伝子変異の存在を診断する簡単な方法で ある。

要　約 本発明はと記の要求を満足させるものである。詳しくは、本発明は液体試料中の 一本鎖標的ポリヌクレオチドを定量的、定性的のいずれかに検出する方法を含む ものである０本方法は次の段階よりなつている。

（ａ）試料を少なくとも２種の異ったプローブ、すなわち第１プローブと第２プ ローブと混合して反応混合物を形成させるが、各プローブは標的ポリヌクレオチ ドの一部分に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドからな り、それらプローブはともに標的ポリヌクレオチドと相補的な塩基対を作ること によつ丁交雑分子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固定されておらず 、プローブは互いに交雑せず、そして第２プローブは検知可使な標識がつけられ ている。

（ｂ）続いて反応混合物を第１プローブとは結合するが第２プローブ及び標的ポ リヌクレオチドとは結合しない固体キャリアに接触させる。

（Ｃ）続いて、固形キャリア上に結合した標識があるか否かを測定する。

一本鎖標的ポリヌクレオチドは二本鎖ポリヌクレオチドの変性により形成させる ことができる。好ましくは、２種のプローブは互いに競合せず、同定すべき標的 ポリヌクレオチドの異なった部分に結合させる。好ましくはその２種の異なった 部分は隣接するか又は近くにある。

本発明の方法は微生物診断に適している。また、鎌状赤血球貧血のような遺伝子 疾病の診断、がんの診断、その他の用途に適している。後者に関連して１本発明 の方法は制限酵素の使用によるなどの切断段階とサンドイッチへイブリダイゼー シジン法とを組合わせるものである６例えば、この方法は標準ポリ−ヌクレオチ ドをも含有することがある試料中の標的ポリヌクレオチドの検定に用いることが できるが、２種のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が実質的に同じで、標準 ポリヌクレオチドはＡ部分とＢ部分、標的ポリヌクレオチドはＡ′部分とＢ′部 分をそれぞれ有し、標準と標的それぞれのポリヌクレオチドの相違は標準ポリヌ クレオチド上のＡ部分とＢ部分の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが 標的ヌクレオチドのＡ′部分とＢ′部分の間に位置するヌクレオチドと相違する 。この方法は次の段階よりなっている。

（ａ）存在する標準及び標的ポリヌクレオチドの両方を標準ポリヌクレオチドの 場合はＡ部分とＢ部分をともに含むセグメントがなく、標的ポリヌクレオチドの 少なくとも１つのセグメントはＡ′部分とＢ′部分をともに含むようにそれぞれ 一本鎖状セグメントに切断し； （ｂ）段階（ａ）での処理試料を第１プローブ及び第２プローブである少なくと も２種の異なったプローブと混合して反応混合物を形成させるが、各プローブは 一本鎖ポリヌクレオチドよりなり、互いに交雑することはできず、第１プローブ はＡ部分及びＡ′部分と相補的塩基対合し、第２プローブはＢ部分及びＢ′部分 と相補的塩基対合するもので、２種のプローブはともにＡ′部分及びＢ′部分の 両方を有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖セグメントと相補的塩基対合により 交雑分子を形成し、 （ｃ）次いで両方のプローブを有する交雑分子の存在を測定する。

好ましくはどちらのプローブも固体キャリアに固定されておらず、第２プローブ は検知し得る標識を有し、両方のプロニブを含有する交雑分子の存在を測定する 段階が次の段階よりなっている。

（ａ）反応混合物を、第１プローブとは結合するが、第２プローブ、Ｂ部分のみ 含有するセグメン１へ及びＢ′部分のみ含有するセグメントとはそれぞれ結合し ない固体キャリアに接触させ、（ｂ）ｂｃいて固体キャリア上に結合した標識が 存在するか否かを測定する。

図　面 本発明の上記及びその他の特徴、形態及び長所は以下に述べる説明、添付した請 求の範囲及び図面によってよりよく理解されるであろう： 第１図は本発明の検定方法の各段階の模式的説明図である。

第２図は本発明の方法を用いる鎌状赤血球検定の模式的説明図である。

第３図及び第４図は標識検定相対信号値と標的ＤＮＡ濃度をプロットしたもので ある。

第５図はアビジン−セルロース個体キャリア及びビオチン−標識プローブの結合 特性をプロットしたものである。

ＩＬΩ」ＬＪ 本発明の特徴を具備する方法及びキットはウィルス、細菌、菌類、酵母、その他 の微生物などの生物及び伝染性試剤を含有するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲ ＮＡなと）の存在を検知するのに用いることができる０本方法及びキットは、例 えば、食品衛生上の研究、薬品診断への応用、及び何らかの微生物診断に用いる ことができる。適切な試料としては、動物及び植物の組織ホモジェネート、血液 、血清、糞、鼻及び尿道粘液、水、ちり、土などがある。固体の試料は最初に液 体媒質中でスラリー化、均質化されて試験試料とされる０本方法はまた正常な遺 伝子が変異されたような遺伝子疾病の診断にも適している０本方法はまたがんの 診断に適している。

本発明の方法におし）ては、検知すべきポリヌクレオチド（標的ポリヌクレオチ ド）を含有する疑いのある細胞を含有する試料を必要ならば前処理により生物細 胞から標的ポリヌクレオチドを溶液中へ放出させるか、又は細胞壁を標的ポリヌ クレオチドを検出するのに使用される試薬が透過し得るようにする。標的ポリヌ クレオチドは一般にＤＮＡ又はＲＮＡ、又はそれらの誘導体又は断片である。

ハイブリダイゼーションは一本鎖ポリヌクレオチド間で行われる。したが９て、 標的ポリヌクレオチドが二本鎖状てあれば、試験試料は次に存在する標的ポリヌ クレオチドが変性され得るような一条件、例えば１００℃で５分間、又はＯ，Ｓ モルＮａＯＨを用い２０〜４０℃で５分間などのような加熱又は加熱と高ｐＨの 条件で処理される。ポリヌクレオチドの変性条件は周知である。

本発明の方法は第１図に示すように溶液サンドイッチハイブリダイゼーション段 階と収穫段階よりなっている。溶液サンドイッチハイブリダイゼーションにおい ては、試験試料は少なくとも２種の異なった特定のヌクレオチドパイプリダイゼ ーシコンブローブと組合わせて反応混合物にされる。例えば、２種のプローブは 第１ブローブー結合プローブと第２プローブー・識別プローブであるものを用い ることができる。各プローブは一本鎖標的ポリヌクレオチドの一部に対し相補的 なヌクレオチド配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドよりなっている。したがって 、各プローブは標的ポリヌクレオチド上の対応するヌクレオチド配列と相補的塩 基対合することができる。

好ましくは、２種のプローブはそれらが競合しないよう標的ポリヌクレオチド上 の異なフた部分に結合し、好ましくはその部分は密接した間隔（約３００ヌクレ オチドよりも多くない間隔）内にあり、より好ましくは互いに直接隣接（約１０ ヌクレオチドよりも多くない間隔）している、プローブは互いに交雑することは できない０反応混合物中において、２種のプローブ及び−末鎖標的ポリヌクレオ チドは互いに交雑して複合２本領交雑分子を形成する。迅速かつ効果的なハイブ リダイゼーションを行うため、いずれのプローブも固体キャリアに固定されない 、第２プローブ、すなわち識別プローブは容易に検知することかできる標識を有 していることてさらに特徴づけられる。この方法はサンドイッチハイブリダイゼ ーションと呼ばれるが、それは標的ポリヌクレオチドか得られた交雑分子中て２ 種のプローブ間にサンドイッチされているからである。

プローブは別々の試薬中に含有させることがてきる。プローブは互いに交雑しな いから、すべてのプローブを単一の試薬中に保持させることもできる。プローブ と試験試料を組合わせる順序は一般に重要ではない、試験試薬へプローブを順次 （相ついで）添加することも、すべてのプローブを同時に又はその他何らかの組 合わせで添加することができる。

反応混合物はハイブリダイゼーションを助長するような条件下に保持される。こ の条件は含有されるそれぞれのポリヌクレオチドに依存するが、これは一般に知 られている。ハイブリダイゼーションは実質的に完了するまで進行させる。大部 分のポリヌクレオチドにとってその時間は約１時間よりも長くない０例えば、塩 濃度が約０．１５モル、温度６５℃でプラスミドプローブ濃度が１０マイクログ ラム／ｍｌの場合、１／２反応完了に到達する時間は２０分以内である。

収穫段階においては５反応混合物は第１プローブ（結合プローブ）と結合するこ とができるが、第２プローブ（識別プローブ）及び標的ポリヌクレオチドとは結 合することができない固体キャリアに接触させられる。ここで「結合する」及び 「結合」という用語は非特殊結合とは対象的な特殊機能基による強力な結合を意 味する。

標的ポリヌクレオチドの２種のプローブとの結合から形成される交雑分子はこの ように結合プローブによって固体キャリア上に結合される。

第２プローブはそれ自体か固体キャリア上に第２プローブ自体かほとんど非特定 結合しないように選択される。このように、試験試料中に標的ポリヌクレオチド が存在することは標識のどれかが固体キャリア上に結合しているか否かを測定す ることにより確認される。試験試薬中の標的ポリヌクレオチドの量の定量測定も また固体キャリア上に結合した標識の実際量を測定することによりて可能である 。

固体キャリア上にいずれかの標識が結合しているか否かを測定するには少なくと も２種の基本的な方法があり、そのどちらも収穫段階後の反応混合物中の固相及 び液相中の第２プローブの分布を測定する。第１の方法では、交雑分子中に組入 れられなかった過剰の識別プローブを洗浄、アスビレーション、デカンテーショ ンなどのような常法により除去する０次いで固体キャリア上に結合した標識の量 を測定する。固体キャリア上の標識の存在は試料中の標的ヌクレオチドの存在を 示すものである。第２の方法においては、固体キャリアを反応混合物の液相から 分離することもできるし、又は液相中に残しておくこともできる。液相中の溶液 中の未結合第２プローブの量を測定し、反応混合物中へ添加した第２プローブの 全量と比較する。２つの量の差がなにがしかの第２プローブが固体キャリア上に 結合していること、換言すれば試料中に標的ポリヌクレオチドが存在することを 示す。

好ましくは、第１プローブ（結合プローブ）は第１結合基を含んでなり、固体キ ャリアは第２結合基を含んでなり、結合基は互いに強力な結合を形成することに より互いに結合する。両結合基は結合対を構成する。結合対の１つの結合基は固 体キャリアの基体物質と結合し、その他の結合基はｆｆ１ｌプローブの部分であ る。結合対は、例えば、下記の対のうちの１つであフてよい、アビジン−ビオチ ン、ハプテン−抗体、抗体−抗原、炭水化物−レクチン、リボフラビン−リボフ ラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオン結合物質、酵素−基質、ボロネー ト−シスジオ−・ル、スタフＡたん白質−抗体、酵素−抑制剤、結合対はまた上 記部分の誘導体の対を含む。

それぞれの結合対の選択基準は（１）その対の結合グループが互いに結合する速 度、（２）その対の結合基間の結合力、（３）第１プローブ上の結合基の溶液サ ンドイッチ段階に対する妨害の少ないこと、（４）結合基が固体キャリアの基体 物質と容易に結合でき、第１プローブを形成するのに使い易いことなどが含まれ る。

固体キャリアの基体５ｉＩＩＪ質は、例えば、アガロース、セルロース。

ガラス、ラテックス、ポリアクリルアミド、ボリカーボネーｈ、ポリアミＩζ（ 例えばナイロンＴＭ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリカ ゲル、シリカ及びそれらの誘導体の中から選ぶことができる。上記のリストは何 ら完全なものではない、結合対の１つの結合基が固定されることのできる固体が 適している。

固体キャ゛リアは種々の形態にすることができる０例えば、それは粒子サイズが １００ミクロン以下の微細粒子（例えば微結病セルロース）、粒子サイズが０． １〜２−Ｏｍｒｎのマクロ粒子、シート、管、とベットチップ、板、ろ材、ビー ズなどであってよい。

第２結合グループを固体キャリアに固定する方法はよく知られている。第１プロ ーブのポリヌクレオチド部分を第１結合基含有体に誘導する方法もまた知られて いる。チェノら、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ。

５１７　（１９７５）；ファルコブら、米国特許第４，３８５，５３ン二２０： ２９０　（１９７６）。

゛　第２プローブ（識別プローブ）は容易に検知できる標識を含有する０種々の 特定ポリヌクレオチドプローブに対する標識付方法が知られている。容易に検知 することができ、溶液パイプリダイゼーシコン段階を不当に妨害しない標識なら ばどれでも使用することができる、適切な標識には放射性同位元素、光標識、酵 素、酵素コファクター、ハブテン、抗体、アビジン、ビオチン、炭水化物、−レ クチン、金属キレート剤なと、及びそれらの誘導体が含まれる。検出方法は放射 性同位元素の場合のように直接的なもの又は酵素標識抗体を続いて用いるハブテ ンの場合のように間接的なものがある。

３２　１２５Ｎなどの放射性同位元素をプローブの標識に用いるこＰ。

とができる、放射性標識はガンマ線計数法又はシンチレーション計数法などのよ うによく知られた方法て検出することができる。しかしながら、放射性同位元素 標識の使用は高価かつ危険である。放射性物質の取扱いには従車者の特別な訓練 及び安全措置が必要である。さらに、放射性同位元素は一定の半減期を有してお り、そのだ（一般に数週間の単位）を持っている。

上記の理由によって、光標識及び酵素作用による標識などのようなその他の標識 システムが開発された。ヘラ−らのヨーロッパ特許出願第８２３０３７０１．５ 号に述べられているように、光標識として化学発光剤、生物発光剤、蛍光剤又は リン光剤を挙げることができ、適切な条件下では放射性同位元素の場合に対比で きる感度が得られる。光標識はグローブの一本鎖ポリヌクレオチドセグメントの どの部分にも付着させることができるが、末端位置がより好ましいことが知られ ている。

光標識の例としては次のようなものがある＝（１）化学発光剤：ペルオキシダー ゼ及び機能化鉄ポルフイリン誘導体、（２）生物発光剤：細菌ルシフェラーゼ、 はたるルシフェラーゼ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、アデノシントリ フオスフェート（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元物（Ｎ ＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート還元物（ＮＡ ＤＰ）（）及び種々の長鎖アルデヒド（デシルアルドヒトなど）；　（３）蛍光 剤：アデノシンヌクレオチド、エテノ−シチジンヌクレオチドなどのような蛍光 ヌクレオチド、又は機能化ヌクレオチド（アミノ−ヘキサンアデノシンヌクレオ チド、ムルキューリヌクレオチドなど）、これらははじめ蛍光剤的に標識付され 、次いでプローブの一本鎖ポリヌクレオチドセグメントに共有的に付着されるこ とかできる：　（４）りん光剤＝２．３ブタジオン、■−しカルボキシフェニル ］−１，２−ペンタンジオン、及び１−フェニル−１，２−プロパンジオンのよ うな２−ラクトン。光標識をプローブへ付着させる方法は当業ではよく文献に記 載されている。標識はその標識を活性化すること及びその光感応を光検知装置に より測定することにより測定される。蛍光剤及びリン光剤は適切な波長の光線の 照射により活性化することができる。化学発光剤又は生物発光剤標識は昌業て周 知の方法により化学的に活性化させることができる。

識別プローブはまた酵素を用いて標識付することができる。ハイブリダイゼーシ ョン生成物はその酵素用基質上における酵素の作用により検出される０例えば１ 色原体基質上で作用することができる酵素を選択使用することができる。基質の 転化率を光学的分析装置により監視することがてきる。この転化率は次いで標的 ポリヌクレオチドの存在、不在に関係づけられる。アビジン及びビオチンが特定 の核酸プローブに酵素を結合させるのに用い得ることはよく知−られている、適 切な酵素の例としては、例えばベーターガラクトシダーゼ、アルカリフォスファ ターゼ、ホースラディッシュベルオキシターゼ及びルシフェラーゼがある。

光標識及び酵素作用による標識の大きな利点はその定性的な検知が高価な検知装 置を必要としないで目に見える形で行えることである。もちろん、これらの標識 の定量測定も光度計装置の使用により行うことができる。

第１及び第２プローブはそれぞれ標的ヌクレオチドの実質上相互に独占的な位置 に相補的であることが好ましい、換言すれば、第１及び第２プローブはサンドイ ッチへイブリダイゼーションが妨害される程度同一塩基配列で競合するものであ ってはならない。

プローブは問題とする生物から適切な制限エンドヌクレアーゼ処理したポリヌク レオチドから、又はＥｘｏｍ消化又はＲＮＡポリメラーゼ転写のような酵素的方 法によって二本鎖ポリヌクレオチドから調製することができる。これらの場合、 プローブはＲＮＡ又はＤＮＡの断片である。独特の部分の塩基配列が既知である 場合には、プローブは有機合成技術により合成することができる（スタビンスキ ー、ジェー、ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ４，３５３．１９７７、ゴ ウ、ジー、アール、ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ　６，１５５７，１ ９７９；ゴウ、ジー、アール。

ら、ヌクレイツク・アシッズーリサーチ　７，１９５５，１９７９；ナラング、 ニス、エイ、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５巻、第工部、６１０− ６２０．１９８０）、また、適当な条件下てポリヌクレオチドフォスフォリラー ゼ（Ｅ、コリ）を用いてで定の配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドを 製造すること１９８０）、また、クローニング、例えば、プラスミド又はＭ１３ バクテリオファージベクター中へ特定の配列を再結合させ、その後その再結合部 分を標準的な方法によりクローニングするこにより大量のプローブを製造するこ とも可能である。クローニング方法が好ましい。

プローブの大きさはヌクレオチド数が１０からｔｏｏ、ｏｏ。

の長さにすることができる。ヌクレオチド数１０未満では交雑が安定せず、２０ ℃以上で変性しはじめる。相補的ポリ−クレオチド配合の数１２は適切な結合悌 力を得るのに必要な最低長さである０通常実用される最低値は約１５である。ヌ クレオチド数が１００．０００を越えるとハイブリダイゼーション（再生）の速 ２１３〜２１９ページ、１９７】参照、すべてのプローブがベースごとのスケー ルで標的ポリヌクレオチドに相補的である必要はない、好ましくは、グローブは 約１５から約ｓｏ、ｏｏｏ、より好ましくは約１５から約１０，０００のヌクレ オチド数の長さである。

プローブの相補的（塩基対合）ヌクレオチドの数は好ましくは約２００から約ｓ 、ｏｏｏＯ間である。相補的ヌクレオチドは、特に相補的ヌクレオチドの数が小 さい（２００以下）場合には、互いに隣接していることが好ましい、しかし、標 的とプローブのすべての塩基対合ヌクレオチドがｌ対ｌで相補的である必要はな い。小型のグローブＨｓ−１ｏｅ）自体は自動化有機合成技術により製造される 。ヌクレオチド数１００−１０，０００の大きさのプローブは適切な酵素的方法 又は再結合ＤＮＡ法により得ることができる。

比較的小型のポリヌクレオチドセグメントの比較的かさ高な標識部分（例えば化 学発光剤標識）による標識材は場合によりてはハイブリダイゼーション工程を阻 害する。それ故、正しく標識を選択することが重要である。標識選択基準の例は 、ハイブリダイゼーション阻害なしでポリヌクレオチドへ標識を容易に組入れる ことができること、標識の検出が容易かつ感度良好なこと、標識プローブの固適 切なハイブリダイゼーション条件は、第１プローブ（結合プローブ）の第１結合 基及び第２プローブ（識別プローブ）に付着させた標識それぞれの本質、２種の プローブの大きさ、プローブの［Ｇ］＋［Ｃ］（グアニンプラスシトシン）の含 有量及び標的ポリヌクレオチド上の相補的ヌクレオチド配列、及び試験試料の前 処理方法によフて決定される。標識はへイブリダイゼーション反応が行われる温 度及び使用される塩濃度に影響を与える０例えば、化学発光剤触媒は吸収／放射 部分にとって許容される温度及び塩濃度に感応させることができる。プローブの 大きさはハイブリダイゼーションの温度及び時間に影響を与える。塩濃度及び試 薬濃度が同じであるとすれば、ヌクレオチドａｉｏ、ｏｏｏ〜ｉｏｏ、ｏｏｏの 範囲の試薬ポリヌクレオチド配列を用いるへイブリダイゼーシＩンは６７℃で４ ０分から８０分を要するが、ヌクレオチド数１４〜１００の場合のハイブリダイ ゼーションは２５℃て５〜３０分である。同様に、［Ｇ］　＋　［Ｃ］含有量の 高い配列では［Ｇ］　＋　［Ｃ］低含有配列のポリヌクレオチドの場合より高温 度で交雑される。結局、試験試料を調製するのに用いられた条件及び標的ポリヌ クレオチドを一本鎖状の形に保持する条件がへイブリダイゼーション反応に用い る温度１時間及び塩濃度に影響する。試験試料の調製条件はポリヌクレオチドの 長さ及び［Ｇ］　＋　［Ｃ］含有量によって影響される。一般に配列が長ければ 長いほど、又は［Ｇ］　＋　［Ｃ１含有量が多ければ多いほど、高い温度及び／ 又は低い塩濃度が必要とされる０反応混合物中のプローブ又は標的の濃度もパイ プ、リダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。グローブ又は標的の 濃度が高ければ高いほどパイプリダイゼーシジン温置所要時間は短い、ハイブリ ダイゼーションの基本的な速度も湿層混合物中に存在する塩のタイプ、その濃度 、及び湿層温度により影響される。塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム及びクエ ン酸ナトリウムがハイブリダイゼーションに最もしばしば用いられる塩類であり 、その塩濃度は１．５〜２Ｍという高濃度にすることができる。上記の塩を同及 びセンシウムの各種の場合が同等であるように、同等のポリヌクレオチドハイブ リダイゼーション速度が得られる。プリテンら（１９７４）（メソッズ・イン・ エンザイモロジー％第ＸＸＩＸ巻。

第Ｅ部、グロスマン及びモルディプ編、アカデミツク・プレス、区二、乳互１湊 、第３４９ページ）は一般に用いられる塩類で得られる標準的なハイブリダイゼ ーション基本速度を示すデータを提供している。ＤＮＡのＲＮＡによるハイブリ ダイゼーション速度はＤＮＡによるＲＮＡのハイブリダイゼーションのそれとは 若干具なる。その相違の程度は１０倍以上になることは積で、例えばＤＮＡ又は ＲＮＡのどちらかが過剰に用いられたかに応じて変化する。ガフ４巻、１６．第 ２３０６ページ）参照。

最適条件ではないが、ヌク１／オチド数が１００以上のほとんどすべてのプロー ブ及び標的の組合せによるハイブリダイゼーションに用いられる好ましい一般的 な条件がある。この条件とは塩化ナトリウム約０．７５モル、クエン酸ナトリウ ム０．０７５、リン酸ナトリウム０．０２５　（ｐＨ６，ｓ）、ａｓ℃及びポリ ヌクレオチド濃度ｏ−ｏｏｉ〜１．０マイクログラム／ｍｌである。また、低温 で同様な条件を得るための方法、例えば反応中にホルムアミドのような変性剤を 含有させることが知られている（ケイシーら、ヌクイレツク・アシッズ・リサー チ　４：１５３９　（１９７７））、ハイブリダイゼーション反応中に他の試薬 を添加することによって反応速度を増加することができ、その試薬の例は硫酸デ キストリン（ワールングリコール（アマジノ、アナリティカル・バイオロジー１ ５２＝３０４　（１９８６））及びフェノール（コーンら、バイオロジーにユニ １６　：　５３２９　（１９７７））がある。

本発明の検定方法によフて試験試料中の一本鎖標準標的ポリヌクレオチドの検定 に用いるキットは少なくとも２，１！の異なったプローブ、第１ブローグー結合 プローブ及び第２ブローブー識別プローブであるプローブよりなる単数又は複数 の液体ポリヌクレオチド試薬よりなる。各プローブは標的ポリヌクレオチドの一 部分に対し相補的なヌクレオチド配列を含有する一本鎖ボリヌクレオチドよりな る。どのプローブも固体キャリアに固定されていない。プローブは相互で交雑す ることはできない、第２プローブは検出することのできる標識を有している。キ ットはまた。第１グローブとは結合するが、第２プローブ及び標的ポリヌクレオ チドとは結合しない固体キャリアよりなる。プローブ及び固体キャリアのその他 の特性は上記の本発明方法の説明に全般的に記載しである。キットはまたさらに 標識の定性及び／又は定量測定用の手段よりなることもできる。

各ポリヌクレオチド試薬に１種以上のプローブを存在させることができる０例え ば、プローブは互いに交雑しないから、それらを便宜上１つの試薬中に配合する ことができる。

キットの成分として下記の成分を１種又はそれ以上含有させることが好ましい。

（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリルサルコシン酸ナトリウムのように各 種の薬品部分を溶解することができる洗剤、（ｂ）プロテイナーゼＫ及びプロナ ーゼのようなプロテアーゼ、（Ｃ）標的ポリヌクレオチドの変性を促進させる塩 類及び溶媒を含む試薬、（ｄ）第２プローブ上の標識を検出するのに使用する試 薬。

（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及びプローブ試薬は必要に応じ、単一の試薬として組合 せることもできるし、複数の試薬にすることもできる。

上述の方法及びキットは一連の標的ヌクレオチドの試験用として適用することが できる。各標的ポリヌクレオチドに別々のセットが用意され、各セットはそれぞ れの標的ポリヌクレオチド用に特殊なものである。プローブの各セットは少なく とも２種の異なったプローブ、すなわち上記で特性化したような結合識別プロー ブ（第１及び第２プローブ）よりなっている、使用される固体キャリアは多数の 標的ポリヌクレオチドのそれぞれに特定された各結合プローブの結合基とは結合 することができるが、どの識別プローブにも、どの標的ヌクレオチドにも結合す ることのできない結合基を有１ノている。それ故、１種類の汎用固体キャリアが 種々の結合プローブのすべての用いられる。キット中において、各プローブのセ ットは好ま１ノくは別々の試薬中に含有される。

上記の方法及びキットは試験試料中の数種の標的ポリヌクレオチドの同時試験用 に適用することができる。各標的ヌクレオチドには別々のプローブセットが用意 され、各セットは対応するポリヌクレオチドに対し特定のものである。すべての プローブは互いに交雑することはできない、各プローブセットは少なくとも２種 の異なったプローブ、すなわち上記で特性化した第１プロ・−ブ（結合プローブ ）及び第２プローブ（識別プローブ）よりなっている、すべての第１プローブは それらがすべて同じ固体キャリア上に収穫されるように同一の結合基を担持して いる。固体キャリアはどの識別プローブとも、またどの標的ポリヌクレオチドと も結合しない、第２プローブは種々の標識を含有するが、各標識は特定の標的ヌ クレオチドに対応するものである。収穫段階後、固体キャリア上の標識の検出に より試料中の対応する標的ポリヌクレオチドの存在及び／又はその量の情報が得 られる。キットにおいては、すべてのプローブが単一の液体試薬中に含有される ことか好ましい。

本発明の検定方法及びキットの利点は多数ある０本方法は溶液ハイブリダイゼー ション法の反応速度と反応効率を与え、かつ固体キャリアハイブリダイゼーショ ン法の試験試料からのハイブリダイゼーション生成胸の分離の容易さを与えるも のであるやさらに、本検定方法は少なくとも２種のプローブが標的ポリヌクレオ チドと相補的であることを必要とする高度に特殊なものである。溶液サンドイッ チハイブリダイゼーションは一般に１時間以内に完了することができ、収穫段階 は５分以上の時間を要しない（最適には約０．５分以下）、このように実質的な 時間節約が得られる。

さらに、本発明のキラ１−は使用が簡単である。使用者はすべての標的ポリヌク レオチドの検定に用いることができる単一の個体キャリア試薬を貯蔵する必要が あるだけである。各標的ポリヌクレオチドに対しただ１種の液体主薬が必要であ る。標識の検出に第３の試験が場合によっては必要である。

本発明の方法のもう１つの重要な利点は高価な試験試料調製を必要と１ノないこ とである。従来技術の溶液ハイブリダイゼーション法は他の細胞成分を除去し精 製した標的核酸を検定する。細胞及びウィルス中の核酸は通常他の細胞成分、一 般に蛋白質とかたく結合した複合体であり、この形状ではハイブリダイゼーショ ンに用いることができない、単に細胞又はウィルスを破壊し内容物を放出するよ う開けることはポリヌクレオチドを必然的にハイブリダイゼーションに用いるこ とができるようにするものではない、ポリヌクレオチドは細胞又はウィルスから 放出させても他の細胞又はウィルス成分と複合した形のままであり、実際には同 じように放出されたヌクレアーゼによって極度に分解されることがある。その上 、この混合物にプローブを添加するとプローブは粘着性の細胞又はウィルスの成 分と複合体となりハイブリダイゼーションに使用できなくなったり、又はヌクレ アーゼ作用によフて分解される。ポリヌクレオチドの精製のために種々の従来技 術の方法が存在する。これらの方法はすべて時間を消費するものであり一１時間 かかる方法は非常に迅速な方法であるとされているー、かつ多数の操作が必要で ある。驚くべきことに、本発明の検定方法は未精製試料を用いて行うことができ 、したがフて労力と時間を消費する精製段階を排除できるものであることが見出 された０本検定法自体は使用者の仕事をさらに単純化できる自動化が容易なもの である。検定結果は特性又は定量のいずれにもすることができる。

本発明の方法及び試験用キットのもう１つの特徴は遺伝子疾病診断用及びがん診 断用とすることにある。

遺伝子疾病はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の突然変異による結果である 。そのような突然変異はまたがん進展におけるｌ要素でもある。それ故、そのよ うな遺伝子疾病又はガンの結果として、患者から採取された正常なポリヌクレオ チド（櫟準ポリヌクーレオチド）を含有する試料はまた正常ポリヌクレオチドの 変異体である異常ポリヌクレオチド（標的ポリヌクレオチド）も含有しているこ とになる。試料はまた異常ポリヌクレオチドのみを含有することもある。正常及 び異常ポリヌクレオチドは典型的にはポリヌクレオチド上の突然変異点の配列を 除いて実質的に同じヌクレオチド配列を有している。したがって、正常及び異常 ポリヌクレオチドはある種の試薬に対して異なった反応をする。

本発明の方法は正常及び異常ポリヌクレオチド間の上記のような相違を探査する のに用いることができる０本方法は切断段階を溶液サンドイッチハイブリダイゼ ーション法と組合わせたものである。

切断段階はセグメント化段階よりなり７またもし標的ポリヌクレオチドが二本鎖 状であれば変性段階を含むこともある。これら２つの段階の順序は重要ではない 。

制限試薬、例えば制限酵素は公知である。制限酵素は正しい条件下でポリヌクレ オチドをヌク１／オチド背骨上の非常に特殊な点で分割するセグメント化段階に 用いられる。標準及び標的ポリヌクレオチドは木質的には同じである。標準ポリ ヌクレオチドはＡ部分とＢ部分を有している。標的ポリヌクレオチドはＡ′部分 とＢ′部分を有している。２種のポリヌクレオチドはポリヌクレオチドのそれぞ れのＡ部分とＢ部分間及びＡ′部分とＢ′部分間に位置する少なくとも１つのヌ クレオチドによつて相違している。制限試薬は標準ポリヌクレオチドをどのセグ メントもＡ部分とＢ部分の両方を含むことかないようセグメント化し、標的ポリ ヌクレオチドを少なくとも１つのセグメントがＡ′部分とＢ′部分の両方を含む ようセグメント化するように選択される。標的ポリヌクレオチドが標準ポリヌク レオチドの遺伝子変異体である典型的な場合には、Ａ部分とＡ′部分及びＢ部分 とＢ′部分は同じである。

存在する標的及び標準ポリヌクレオチド又はそのセグメント（セグメント段階か ら）はセグメント化段階後又はその前に、もし必要ならば変性処理、すなわち− 末鎖状化される。処理された試料はこのように標的及び／又は標準ポリヌクレオ チドのハイブリダイゼーション化用一本鎖状化物を含有している６次に、この処 理された試料は少なくとも２種のプローブと組合わされて反応混合物を形成する 。２種のプローブは第１プローブと第２プローブである。各プローブは一本鎖ポ リヌクレオチドよりなっている。プローブは互いに交雑しない、第１プローブは 標準ポリヌクレオチドのＡ部分及び標的ポリヌクレオチドのＡ′部分と相補的塩 基対合する。第２プローブは標準ポリヌクレオチドのＢ部分及び標的ヌクレオチ ドのＢ′部分と相補的塩基対合する。２種のグローブはともにＡ′部分とＢ′部 分の両方を含有する標的ポリヌクレオチドの一本鎖セグメントと塩基対合するこ とにより、交雑分子を形成する。標準ポリヌクレオチドに関してはセグメンＩ− 化処理後Ａ部分とＢ部分は別々のセグメントに存在するから、第１プローブ及び 第２プローブの両方と結合した交雑分子は形成されない０両プローブは別々のセ グメントに付着する。第１プローブ及び第２プローブの両方を有する交雑分子は 試料中に異常（標的）ポリヌクレオチドが存在する場合にのみ形成されることに なる。

両方のプローブと結合した交雑分子の反応混合物中における残存は試料中に標的 ポリヌクレオチドが存在することを示すものである。このサンドイッチへイブリ ダイゼーション法により形成される交雑分子の同定は従来公知の方法により行う ことができる０例えば、ランキの米国特許第４，４８６，５３９号に開示された 一方のプローブを固体キャリア上に固定させたのと同等の方式を用いることがで きる。すなわちすべてのプローブが溶液中に存在する必要はない、その他の方法 も知られている。これらの代りに、上述したような収穫段階をともなった溶液サ ンドイッチへイブリダイゼーシミンもまた用いることができる。後者の場合、上 述の本発明方法に対するその他の限定としてはどのプローブも固体キャリア上に 固定されないことおよび第２プローブが検出できる標識を有していることである ０反応混合物は第１プローブとは結合するが、第２プローブ及びＢ部分又はＢ′ 部分のみを含有するどのセグメントとの結合しない固体キャリアに接触させられ る。これに続く測定は、前述したように、固体キャリア上に標識が結合している かどうかをみるために行われる。

例えば５次の方法は組状赤血球検定に適している。突然変異遺伝子ＤＮＡ鎖（例 えば、踵状対立遺伝子）を含有する疑いのある試験素はＤＮＡ鎖中の構造的な遺 伝子削除を検出するため遺伝子マツピングに用いられてきた。ＤＮＡ中の突然変 異遺伝子１例えばＤＮＡ中の１点突然変異による血球業病の直接的同定はこの種 制限酵素の特殊な長所によりて可能であった。酵素開裂サイトにおける単一ヌク レオチドの変化は適切な酵素を用いるならば容易に検出することができる。制限 酵素Ｍ　ｓ　ｔ　ｎは平均してＤＮＡを開裂し、β８及びβ５遺伝子からそれぞ れ１．１及び１．３ｋｂの断片を生成させることが知られている。ＭｓｔＩＩは ディデル（Ｄｄｅｌ）サイト（ＣＴＮＡＧ）（７）サブセットである配列（ＣＣ ＴＮＡＧＧ）を開裂する。鎌状赤血球遺伝子からのＤＮＡはＭ　ｓ　ｔ　ｎサイ トでヌクレオチド変動を有している。したがって、突然変異したＤＮＡ鎖はその サイトでＭ　ｓ　ｔ　ｎ酵素によって開裂されない、制限酵素処理された試験試 料は次いでポリヌクレオチドを一本鎖状にする条件下におかれる。単一標的ポリ ヌクレオチドー単−試料へイブリダイゼイシコ変異の生じたサイトのＭ　ｓ　ｔ 　ＩＩの反対側にあるＤＮＡのサイトと結合するという制限が加わる。標的ポリ ヌクレオチドと両方のプローブよりなる複合交雑分子の形成される唯一の場合は 遺伝子が突然変異したもの、例えば鎌状赤血球である場合である。正常の遺伝子 は２種のプローブと結合するサイトの間で開裂される。この組状赤血球検定の模 式図を第２図に示す、この方法は従来技術による検定法におけるゲル電気泳動段 階及び固体支持体（ろ紙）への転移段階を排除したものである。このような単純 化は非常に意義がある。この検定法は遺伝子突然変異が含まれるその他の遺伝子 疾病の診断についても同様によく利用できる。

がん診断の場合、踵状赤ｍ球の例と同じ試験を利用するけれども、この試験はが ん遺伝子からのメツセンジャーＲＮＡのレベルの定量試験の形がとられる。

この例は収穫された信号値の標的ＤＮＡ濃度との関係を示すものこの例において 標的ポリヌクレオチドはｍｐＢ１０１７、プローブ１は第１結合基としてビオチ ンを有するＰ）ＩＢＣ６，プローブ２は３２Ｐで標識材したＭ２Ｓ　１０Ｗ、第 １プローブのビオチンと結合する固体キャリアはアビジン−セルロースである。

唯屋 ＳＳＣは０．１５モルの塩化ナトリウムとｏ−ｏｉｓモルのクエン酸ナトリウム である。ＳＳＣは種々の濃度で用いられるが、例えばｒｌｏｘｓｓｃＪとは１． ５モルの塩化ナトリウムと０．１５モルのクエン酸ナトリウムである。ＥＤＴＡ はエチレンジアミン四酢酸、ＳＤＳは硫酸ドデシルナトリウム、ＤＮＡはデオキ シリボポリヌクレオチド、ＢＳＡは牛の血清アルブミン、トリス：ＨＣＭは塩酸 で適切なｐＨに調節したトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンプラスミドＤＮ Ａは形質転換した旦。ユ又（大腸菌）、株ＬＥ３９２を培養し、得られた細菌を リゾチーム、ＳＤＳ及びＮａＯＨでリシス（溶解）処理することにより得た。Ｄ ＮＡはさらに臭化エチジウムの存在下でＣｓＣ１中での遠心分離により精製した 。モイアチス、ティー、エリッチュ、イー、エフ、及びサムテブロック。

ジェー、１９８２、モレキュラー−クローニングニア・ラボラトリ−・マニュア ル　コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−１米国、ニューヨーク、コー ルド　スプリング　バーバー）参照０Ｍ１３バクテリオフアージ、株Ｌｏｗから の複製型分子（ＲＦ）ＤＮＡは汚染旦、ヱ１２株７１．１８を培養することによ り同じ方法で得た０Ｍ１３クロ一ンｍｐＢ１０１７からの一本鎖ビリオンＤＮＡ は汚染Ｅ、コリ、７１．１８の生育培地中でピリオンを精製したウィルスのポリ エチレングリコールによる沈殿。

ＣｓＣ！；Ｌ中での遠心分離、ＳＤＳ、フェノール及びクロロホルムによる抽出 によって得た。サルモンテステスＤＮＡはシグマケミカル社（米国、ミズーリ、 セントルイス）から入手した。

二本鎖ＤＮＡはレアリーら、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブーサイエンス・オブ・ザ・ニーニスエイ８０：４０４５，１９８３ の記載の方法により切れ自移動（リグビイら、ジャーナル・オブ・モレキュラー ・バイオロジー１１３＝２３７．１９７７）により標識付した。プラスミドＰＨ ＢＣ６はプラスミドｐＢＲ３２２（ツクマキら、セλし２８二５８５，１９８２ ）中でクローンした人間のベーターグロビン遺伝子の５４００個の塩基対を含有 している。Ｍ１３クローンｍｐＢ１０１７はプラスミドＰＨＢＣ６からの１３１ ０塩基と相同の人間グロビン遺伝子の１３１０塩基を含有している０Ｍ１３、株 １０ｗはクローンｍｐＢ１０１７の７５ｏＯの塩基と相同のバクテリオファージ 遺伝子の同数の塩基を含有している。ＰＨＢＣ６及びＭ１３１株１０ｗと相同で あるｍｐＢ１０１７中の領域は重複していない。

溶液サンドイッチ生成物の収穫用固相はボールら、ジャーナル−・オブ・オルガ ニック・ケミストリー２７：２０９４，１９６２と同じ方法を用い微結晶セルロ ースなＮ、Ｎ”−力ルボニルジイミダゾールて活性化した後たん白質アビジンと 結合させることによって調製した。結合比は活性化セルロース１ｇに対しアビジ ン１　ｍ　ｇであった。調製したアビジン：セルロースが１：１の固相のスラリ ーは６ｍｌの緩衝剤巾約１ｇのセルロースを含有している。

溶液ハイブリダイゼーションは５Ｘ　５ＳＣ１各０．０２％（Ｗ／Ｖ）のポリビ ニルピロリドン−４０、フィコール−４００、及びＢＳＡ、ｐＨ６，５の２５ｍ Ｍ　ＮａＰＯ４！衝剤、及び２５０ｇ　ｇ／ｒｄｌの音波処理サルモンテステス ＤＮＡを最終的に含有する溶液中で行ワた。すべてのＤＮＡ（プローブ１．プロ ーブ２．標的及びキャリアサルモンテステス）はハイブレダイゼーション反応開 始前に１００℃で３〜５分変性した。

より詳細な試料検定法を以下に述べる。

扱務　本発明の検定法の可能性を試験し、この検定が有効に用いられる標的ＤＮ Ａの濃度範囲を決定するため下記の検定を行った。プラスミドｐ　ＨＢ　Ｃ６を ビオチン−１１−デオキシウリジントリフオスフェート（ベセスタ　リサーチ　 ラボラトリーズ、米国、メリーランド、ガイサースバーグ）を用いる切れ自移動 によつ配位子ビオチンで標識付をした。これは検定のプローブ１を構成する。バ クテリオファージＭ１３　Ｌｏｗの複製型分子ＤＮＡはアルファー３２２−デオ キシシチジントリフオスフェート（アメルシャム、米国。

イリノイ、シカゴ）を用いる切れ自移動により放射線指示３２Ｐで標識付した。

これは検定のプローブ２を構成する。プローブＸｉ約６％のビオチンヌクレオチ ドを含有し、プローブ２は０．７〜７×１１０７ｃｐ／ｐｇの放射性を有してい た。標的ＤＮＡＬｔＭ１３ｍｐＢ１０１７を用い２０ｐｇ　〜１．ＯＪＬｇの範 囲の標的ＤＮＡを含有する試料を試験した。すべての検定はプローブｌ（ビオチ ン）１００ｎｇ及びプローブ２（３２Ｐ）５０ｎｇを含有していた。プローブと 試料ＤＮＡをＰＨ７，５のトリス：ＨＣＪＬｌｏｍＭ。

ＥＤＴＡｌ、ＯｍＭの溶液中で混合し、熱変性処理し、上述した方法に示した溶 液ハイブリダイゼーション条件下におき、全容量０．２ｄで６８°Ｃにおいて一 夜湿層した。この温置時間は過剰なものであり１便宜上の理由から及び完全な反 応を行わせるためのみの理由から使用した。コントロール検定としてプローブ１ ．又はプローブ２及び２０ｎＨの標的を含む場合又は標的なしでプローブ１及び プローブ２を含む場合について行９た。交雑したプローブからの生成サンドイッ チの分離は反応物ヘアビジン：セルロースの１＝１スラリー〇、２ｍｌを添加し 、２２℃で３０分間温湿し、１３ｍｍのガラス繊維フィルターでセルロースをろ 別することにより行った。

ＰＨ７，５のトリス：ＨＣ４Ｑ、Ｏ，ｌｄ、１ｍＭのＥＤＴＡで容器を１回洗浄 し、同じフィルターでろ過し、第１次反応とした。ろ別した固体支持体はさらに ２ＸＳＳＣ及び０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳで２回、Ｏ−２ｘＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳで２回、ｏ、１ｘｓｓｃ及び０．１％ＳＤＳで２回それぞれ洗浄した。最 後の２回の洗浄は５０℃で、その他は室温で行った。すべての洗浄は０．５ｍｌ の溶液を用いた。これらの洗浄はレアリーら、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８０−＋４０４ ５　（１９８３）によるサザーン　プロット　ハイブリダイゼーション分析に用 いられたものを適用したものである。固体支持体に結合したプローブ２（３２Ｐ ）の量はミニびん中の溶液０．５ｍｌ中の樹脂及びベックマン　レディーソルブ Ｔ、Ｍ　Ｐシンチレーション液４．５ｍｌを用い液体シンチレーション計数によ り測定した。洗浄液はすべてを集め、同時に計数した。

級ヌ　１回の試験の結果を第１表に示す。ここて結合したプローブ２の量を検定 液中の標的ＤＮＡの量として直接に関連づけた。データは重複試料についての平 均値である。

第１表 ０、０　０．２ ０、０２１　０．２ ０、０６５　０．１６ ０、１８５　０．２ ０、５５６　０．３８ １、６７　０．７２ ５．０１゜６７ １５、０　２．２６ ４５．０　２．１９ 数回の試験結果はこの例で行われた検定は標的ＤＮＡ約３０ｎｇにおいて収穫信 号値が最高点になり、それ以上の量では収穫信号値は対数的に減少することを示 した。標的Ｄ　Ｎ　Ａ　３０　ｎ　ｇ以下ては、検定はプローブ２の固体支持体 への背景結合及びプローブの放射性特性により制限されるが、標的ＤＮＡ約０． ５ｎｇから１０ｎｇまで指数的に増大する。信号値の標的量に対する非直線性は 第３図にグラフで示す、第４図は最高信号値近くの第３図の拡大図である。

非直線関係はプローブの標識材に用いられた切れ自移動反応に由来すると考えら れる。この方法で標識材されたプローブは若干協同結合の要素を示すことが知ら れている（メインコス及びワール、アナリティカル・バイオケミストリー１３８ ：２６７．１９８４）からこの例はアビジン−セルロース固体キャリアとビオチ ン標識付プローグの結合特性を示すものである。

ビオチン標識付プローブをハイブリダイゼーション緩衝液からアビジン−セルロ ース上に結合させて収穫する際の速度及び特殊性をビオチン−１１−ｄＵＴＰ及 び３Ｈ−ＤＡＴＰの両方で標識材したＤＮＡ又は３Ｅ−ＤＡＴＰのみで標識材し たＤＮＡ　（コントロール）を用いて試験した。使用したＤＮＡは切れ自移動に より標識イ］したプラスミドｐＨＢＣ６（リグビーら、ジャーナル・オブ・メデ ィカル・バイオロジー１３３＝２３７　（１９７７））である。

トリス：ＨＣＭｌｏｍＭとＥＤＴＡＩ−ＯｍＭを含有する液（ｐＨ７，５）に懸 濁させたアビジン−セルロース（圧縮容積０、０５ｒｒｔｌ）をそれぞれ３０本 の微小遠心分離管中へ入れた。ビオチン標識材ＤＮＡ又はコントロールＤ　Ｎ　 Ａ　１０　ｎ　ｇ、キャリアサルモンテステスＤＮＡ５０　ＪＬｇ、酵母ＲＮＡ ２０ＩＬｇ−クエン酸ナトリウムＯ＝　０７５Ｍ、塩化ナトリウム０．７５Ｍ及 びリン酸ナトリウム０．０２５Ｍ　（ｐＨ６，５）中の牛血清アルブミン、フィ コール（ｆｉｃｏ［Ｉ）及びポリビニルとロリドンの各０．０２％（Ｗ／Ｖ−） を適切な試験管へ添加した。上記固相とハイブリダイゼーション混合物を含有す る試験管を振動台に乗せ室温で１分から３００分の範囲の時間湿層した。温首終 了後固相をテフロン膜フィルター上でのろ過により集めた。結合したＤＮＡの量 は各試料に添加した全放射能値からろ液及び洗浄液中の放射能値な差引いてめた 。データは第５図に示す、３０分以内に約９２％のビオチン−標識材ＤＮＡがア ビジン−セルロースと結合するが、他方平均２％未満のコントロールＤＮＡが固 体キャリアに結合する。結合は迅速で、効果的てあり、プローブ上のビオチン標 識に対する特異なものである。

ビオチン−標識材ＤＮＡに結合する固体相のアビジン成分に所望とされる特性を 上記と同じＤＮＡを用い種々前処理したｊｉ！；１体キャリアについて試験した 。遊離のビオチンは固体相上のアビジンサイトに対してビオチン−ＤＮＡと競合 するはずであり、固体相の２０回の１７２能力遊離ビオチンによる前処理はビオ チン−ＤＮＡ結合を５０％減少させた。さらに１０倍のより遊離なビオチン前処 理によってビオチン−ＤＮＡ結合はさらに３０％減少した。ｌｉ！；１体相のプ ロナーゼ、１％（ｗ　／　ｖ　）硫酸ドデシルナトリウム及び０．１％（ｗ　／ 　ｖ　）ベータメルカプトエタノールを用いる前処理はビオチン−ＤＮＡ結合を ５０％減少させ、さらにこの消化樹脂による遊離ビオチン処理を行うとビオチン −ＤＮＡ結合は消失した。若干異なった実験によると、ビオチン−ＤＮＡの固体 キャリアへの結合の大部分はビオチン依存的のみならずアビジン依存的でもある ことが示された。コントロール固体キャリアはセルロースをアビジンと結合させ るのと同じ方法によりまただし反応にアジピンの代りにトリスニＨ（、ｆＬを用 いて処理することにより調製した。このコントロール樹脂は上記の反応速度研究 の場合と同じ条件下で、５〜６％のコントロールＤＮＡプローブと１５〜１６％ のビオチン−標識付ＤＮＡプローブと結合した。このように、ビオチン−標識付 プローブの固体キャリアへの結合の大部分（８５％以上）は特殊な配位子アビジ ンとの相互作用によるものである。

氾 この例は煤状赤血球突然変異細胞に隣接するＭｓ　ｔ　ＩＩ断片を含有するＭ１ ３ベクターの構造を示すものである。

本発明の検定法を用いて鎌状赤血球貧血の主要な遺伝子形を検定するためには非 常に特殊な構造のＭ２Ｓが必要とされるー、基本的には、踵状赤血球個々の第６ 番コドンエラーと同じであるＭｓｔＩＩの制限サイトのどちらかの側からのＤＮ Ａｌｌｌｒ片をＭ１３ファージ中へ挿入した。この目的に使用した２種の断片は プラスミドｐＨＢＣ６（ツクマキら、叩２Ｂ＝５８５（１９８２））から誘導し 、アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。特徴的Ｍ　ｓ　ｔ　Ｕサイトの 直接下流に位置する２００塩基対のソウ１（ＭｓｔｌＩイソシゾマー）約１０ｎ ｇをＭ　ｓ　ｔ　ＩＩサイトを「埋めるＪ　ｄＸＴＰ３２５０％Ｍの存在下でフ レノウＤＮＡポリメラーゼを用いて処理した。この「鈍感型ＪＤＮＡ断片をｐｔ ｙｃ　１８のＨＣＩＩサイトへ挿入した。

２４ｐＵＣ：１８−Ｂ−２００単敲体の分析結果は２種の単離体。

ｐＵｃｌＢ−Ｂ−２００−６及びｐＵｃｌＢ−Ｂ−２００−９に挿入２００塩基 の存在を示した。ＣｓＣ１調製に続いて、ＰＵＣｌＢ−Ｂ−２００−９約２００ ｕｇをＥｃｏＲｌ及びＨｄｍで消化し。

ゲル電気泳動で精製した０次にこのＥｃｏＲｌ、ＨｄＩＩ［末端２００塩基対断 片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１８中へ挿入し一本鎖ＤＮＡを得た。この２００塩基断 片を用いて構造追加を行い、大量の特殊ＲＮＡ配列を簡単に製造できるようにし た。特に、この断片を転写ベクターｐ”ｒ’ｙ−ｉ及びＰＴ７−２　（ユナイテ ッドステーツ　バイオケミカル　コーポレーション、４４１２２オハイオ、クリ ーブランド、ｐ、ｏ、ボックス２２４０６）中へ挿入した。この構造により木発 暁の煤状赤血球検定のプローブどして用いる標識材ＲＮＡを試験管内合成するこ とができる。組状赤血球特徴の検定に必要なその他の再結合ベクターは特徴的な Ｍ　ｓ　ｔ　Ｔｌ制限サイトの直接下流に位置する８００塩基対のＭｓｔｌＩ− Ｈｐａｌ断片を用いる１、この断片はＭｓｔｎの末端に見出される５′の張出し 端を「丸める」ため、再度フレノウＤＮＡポリメラーゼを用いて同じ方法でクロ ーンした。

この８００塩基対断片を一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡを得るために４種のベクター中 へ挿入した。それらは次の通りである。

Ｍ２Ｓ　Ｂ−１９−１−８００β−グロビンメッセー・ジ状ストランドＭ１３　 Ｂ−１８−１−８００β−グロビン非メツセージ状ｐＴ７−１−８００　非メツ セージ状ＲＮＡｐＴ７−２−８００　メツセージ状ＲＮＡ本発明をある態様に関 連してかなり詳細に説明したけれども、その他の態様は可能である。したがフて 、付属の請求の範囲の精神及び範囲は上記の態様の説明に限定されるものではな い。

改良された核酸ハイブリダイゼーションを叉ジ８延４）　βＪλｆｖ＼ｆ℃ρ ｂ、溶液サンドイツチハイブリすイゼーションプ。−ブ１　＋　プローブ２　＋ 　変性標的第１結合基Ｘ保有　標ｍＬ保有 改良鎌状赤血球 喪亙」口乞炙Ｚ 第４図参照 標識検出相対信号値対標的ＤＮＡ濃度 第２図ピーク値周辺の拡大図 国際調査報告 −１−一−ｍｌ＆紳−−−１−１　Ｐ　ｃＴ／υＳ　８フ１０２５４８１吻ＩＭ １ｍｌｌＪ−ム＠＠、、、仲、、、、ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２５４８国際調査 報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体試料中の一本鎖標的ポリヌクレオチドを検出する検定方法であって （ａ）該試料を少なくとも２種の異なったプローブと一緒にして反応混合物を形 成させるが、ここで該プローブは第１プローブ及び第２プローブであり、各プロ ーブは標的ポリヌクレオチドの一剖分に相補的なヌクレオチド配列を含有する一 木鎖ポリヌクレオチドを含んでなり、それらプローブは標的ポリヌクレオチドと の相補的塩基対合により交雑分子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固 定されておらず、プローブは互いに交雑せず、第２プローブは検出可能な標識を 有しているプローブであり、 （ｂ）次いで、該反応混合物を第１プローブとは結合するが、第２プローブにも 標的ポリヌクレオチドにも結合しない固体キャリアと接触させ、 （ｃ）次いでいずれかの標識が固体キャリアに結合しているか否かを決定する 段階を含んでなる方法。 ２．第１プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片である請求項１記載の方法。 ３．第２プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片である請求項１記載の方法。 ４．固体キャリアがアガロース、セルロース、ガラス、ラテックス、ポリアクリ ルアミド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ リスチレン、シリカゲル、シリカ、及びそれらの誘導体よりなる群から選ばれる 物質で形成される請求項１記載の方法。 ５．固体キャリアがミクロ粒子、マクロ粒子、シート、ビーズ、管、ピペットチ ップ、板、及びフィルターからなる群から選ばれる形状である請求項１記載の方 法。 ６．標識が放射性同位元素、化学発光性化合物、生物発光性化合物、蛍光性化合 物、りん光性化合物、酵素、酵素コファクター、ハプテン、抗体、アビジン、ビ オチン、炭水化物、レクチン、金属キレート剤、及びそれらの誘導体からなる群 から選ばれる請求項１記載の方法。 ７．第１プローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、その ２種の結合基は互いに結合でき、２種の結合基が一つの結合対を構成する請求項 １記載の方法。 ８．結合対がアビジン−ビオチン、ハプテン−抗体、抗体一抗原、炭化水素一レ クチン、リボフラビン−リボフラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオン結 合物質、酵素一基質、ボロネートーシスディオール、スタフＡたん白質一抗体、 酵素一抑制剤、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる請求項７記載の方法 。 ９．固体キャリアがアビジン−セルロースであり、結合対がビオチン−アビジン である請求項８記載の方法。 １０．各プローブがヌクレオチド数的１５から約５０，０００の長さであり、第 １及び第２プローブはおのおの標的ポリヌクレオチドの異なった部分に相補的で あり、両部分間の最短距離がヌクレオチド数約３００よりも長くない請求項１記 載の方法。 １１．プローブと相補的な部分が直接隣接している請求項１０記載の方法。 １２．第１プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片であり、第２プローブがＲＮＡ又は ＤＮＡ断片であり；固体キャリアがアガロース、セルロース、ガラス、ラテック ス、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ プロピレン、ポリスチレン、シリカゲル、シリカ、及びそれらの誘導体からなる 群がら選ばれる物質から形成され；固体キャリアがミクロ粒子、マクロ粒子、シ ート、ビーズ、管、ピペットチッブ、板、及びフィルターからなる群から選ばれ る形状であり；標識が化学発光性化合物、生物発光性化合物、蛍光性化合物、り ん光性化合物、酵素、酵素コファクター、ヘプテン、抗体、アビジン、ビオチン 、炭水化物、レクチン、金属キレート剤、及びそれらの誘導体からなる群から選 ばれ；第１プローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、そ の２種の結合基は互に結合できるものであり；２種の結合基は結合対となってお り、その結合対がアビジン−ビオチン、ヘプテン−抗体、抗体一抗原、炭水化物 一レクチン、リボフラビン−リボフラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオ ン結合物質、酵素一基質、ボロネートーシスジオール、スタフＡたん白質一抗体 、酵素一抑制剤、及びそれらの誘導体から選ばれる請求項１０記載の方法。 １３．標的ポリヌクレオチドの検出が定性的である請求項１記載の方法。 １４．固体キャリア上に結合した標識の存在を標的ポリヌクレオチドの検出が定 量的であるように定量的に決定する請求項１記載の方法。 １５．プローブが順次試料と一緒にされる請求項１記載の方法。 １６．試料がすべてのプローブと同時に一緒にされる請求項１記載の方法。 １７．一本鎖標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの変性により形成 される請求項１記載の方法。 １８．いずれかの標識が固体キャリア上に結合しているか否かを決定する段階が さらに （ａ）交雑分子に組みこまれていない第２プローブを固体キャリアから分離し、 （ｂ）続いて試料中に標的ポリヌクレオチドの存在の有無を示す固体キャリア上 の標識の有無を検出する段階を含んでなる請求項１記載の方法。 １９．いずれかの標識が国体キャリア上に結合しているか否かを決定する段階が さらに （ａ）溶液中の未結合第２プローブの量を測定し、（ｂ）その測定値を反応混合 物へ添加した第２プローブの全量と比較して試料中の標的ポリヌクレオチドの存 否を決定する段階を含んでなる請求項１記載の方法。 ２０．複数の液体試料中の複数の−本鎖標的ヌクレオチドを検出する検定方法で あって、 （ａ）標的核酸を含有すると想定される少なくとも１液体試料の一部を少なくと も２種の異ったプローブと一緒にして反応混合物を形成させるが、ここで該プロ ーブは第１プローブ及び第２プローブであり、各プローブは標的ポリヌクレオチ ドの一部分に相補的なヌクレオチド配列を合有する一木鎖ポリヌクレオチドを含 んでなり、第１プローブ及び第２プローブは標的ポリヌクレオチドとの相補的塩 基対合により交雑分子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固定されてお らず、プローブは互いに交雑せず、第２プローブは検出可能な標識を有している プローブであり、 （ｂ）次いで、該反応混合物を第１プローブとは結合するが、第２プローブにも 標的ポリヌクレオチドにも結合しない固体キャリアと接触させ、 （ｃ）次いで標識のいずれかが固体キャリア上に結合しているか否かを測定する 段階を含んでなる（ただし、固体キャリアは複数のポリヌクレオチドに対してそ れぞれ特異的な各第１プローブと結合する）方法。 ２１．各第１プローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、 第２結合基は複数の標的ポリヌクレオチドに対して特異的な名第１プローブの第 １結合基と結合することができる請求項２０記載の方法。 ２２．各プローブがヌクレオチド数約１５〜約５０，０００の長さであり、各標 的ポリヌクレオチドに対して特異的である各プローブ対において、第１及び第２ プローブはそれぞれの標的ポリヌクレオチドの異なった部分に相補的であり、両 部分間の最短距離がヌクレオチド数約３００よりも長くない請求項２０記載の方 法。 ２３．相補的部分が直接隣接している請求項２２記載の方法。 ２４．少なくとも１種の一本鎖標的ポリヌクレオチドが二木鎖ポリヌクレオチド の変性により形成される請求項２０記載の方法。 ２５．少なくとも若干数プーブが試料と異なった時間に一緒にされる請求項２０ 記載の方法。 ２６．液体試料中の複数の一本鎖標的ポリヌクレオチドを検出する検定方法であ って （ａ）試料を複数の異なったプローブと一緒にして反応混合物を形成させるが、 ここに該プローブは少なくとも２種のプローブが名標的ポリヌクレオチドに特異 的であり、それは第１プローブ及び第２プローブであり、第１プローブ及び第２ プローブはおのおのそれぞれの標的ポリヌクレオチドの一部分に相補的なヌクレ オチド配列を含有する一木鎖ポリヌクレオチドを含んでなり、第１プローブ及び 第２プローブは標的ポリヌクレオチドとの相補的塩基対合により、交雑分子を形 成し、第２プローブは検出可能な標識を有し；複数のプローブのどれも固体キャ リア上に固定されておらず、複数のプローブは互に交雑せず、複数の標的ポリヌ クレオチドに特異的な各第２プローブは異なった標識を有しているプローブであ り、 （ｂ）次いで該反応混合物を第１プローブとは結合するが第２プローブにも標的 プローブにも結合しない固体キャリアと接触させ、 （ｃ）次いで異なった標識のいずれかが固体キャリア上に結合しているか否かを 決定する 段階を含んでなる方法。 ２７．各プローブがヌクレオチド数約１５から約５０，０００の長さであり、各 標的ポリヌクレオチドに特異的な第１プローブ及び第２プローブはそれぞれの標 的ポリヌクレオチドの異なった部分に相補的であり、両部分間の最短距離がヌク レオチド数で約３００よりも長くない請求項２６記載の方法。 ２８．相補的部分が直接隣接している請求項２７記載の方法。 ２９．少なくとも１種の一木鎖標的ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチド の変性により形成される請求項２６記載の方法。 ３０．複数プローブの少なくとも若干数が異なった時間に試料と一緒にされる請 求項２６記載の方法。 ３１．すべてのプローブが同時に試料と一緒にされる請求項２６記載の方法。 ３２．試料中の一木鎖標的ポリヌクレオチドを検出するためのキットであって （ａ）少なくとも２種の異なったプローブを含んでなるポリヌクレオチド試薬で あって、ここで該プローブは第１プローブ及び第２プローブであり、各プローブ は標的ポリヌクレオチドの一部分に相補的なヌクレオチド配列を含有する一本鎖 ポリヌクレオチドよりなり、それらプローブは標的ポリヌクレオチドとの相補的 塩基対合により交雑分子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固定されて おらず、互いに交雑せず第２プローブは検出可能な標識を有しているプローブで あり、（ｂ）第１プローブとは結合するが、第２プローブ及び標的ポリヌクレオ チドには結合しない固体キャリアを含んでなるキット。 ３３．第１プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片である請求項３２記載のキット。 ３４．第２プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片である請求項３２記載のキット。 ３５．固体キャリアがアガロース、セルロース、ガラス、ラテックス、ポリアク リルアミド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、 ポリスチレン、シリカゲル、シリカ、及びそれらの誘導体よりなる群から選ばれ る物質で形成される請求項３２記載のキット。 ３６．固体キャリアがミクロ粒子、マクロ粒子、シート、ビーズ、管、ピペット チッブ、板及びフィルターからなる群から選ばれる請求項３２記載のキット。 ３７．標識が放射性同位元素、化学発光性化合物、生物発光性化合物、蛍光性化 合物、りん光性化合物、酵素、酵素コファクター、ヘプテン、抗体、アビジン、 ビオチン、炭水化物、レクチン、金属キレート剤、及びそれらの誘導体からなる 群から選ばれる請求項３２記載のキット。 ３８．第１プローグが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、そ の２種の結合基は互に結合でき、２種の結合グルーブが結合対を形成する請求項 ３２記載のキット。 ３９．結合対がアビジン−ビオチン、ハプテン−抗体、抗体一抗原、炭化水素一 レクチン、リボフラビン−リボフラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオン 結合物質、酵素一基質、ボロネートーシスディオール、スタフＡたん白質一抗体 、酵素一抑制剤、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる請求項３８記載の キット。 ４０．固体キャリアがアビジン−セルロースであり、結合対がビオチン−アビジ ンである請求項３９記載のキット。 ４１．各プローブがヌクレオチド数が約１５から約５０，０００の長さであり、 第１及び第２プローブはおのおの標的ポリヌクレオチドの異なった部分に相補的 であり、両部分間の最短距離がヌクレオチド数約３００よりも長くない請求項３ ２記載のキツト。 ４２．プローブと相補的な部分が直接隣接している請求項４１記載のキット。 ４３．標識を定性的に検出する手段を含んでなる請求項３２記載のキット。 ４４．標識を定量的に検出する手段を含んでなる請求項３２記載のキット。 ４５．ポリヌクレオチド試薬の少なくとも１試薬が１以上のプローブを含有する 請求項３２記載のキット。 ４６．すべてのプローブが単一の試薬に含まれる請求項３２記載のキット。 ４７．複数の一木鎖標的ポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、各 標的ポリヌクレオチドに対して、少なくとも２種の異なったプローブを含んでな るポリヌクレオチド試薬であって、ここに該プローブは第１プローブ及び第２プ ローブであり、各プローブはその標的ポリヌクレオチドの一部分に相補的なヌク レオチド配列を含有する一本鎖ポリヌクレオチドよりなり、第１プローブ及び第 ２プローブはともにその標的ポリヌクレオチドとの相補的塩基対合により交雑分 子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固定されておらず、プローブは互 に交雑することはできず、第２プローブは検出可能な標識を有しているプローブ であり、名第１プローブと結合することができるが、いずれの第２プローブ及び どの標的ヌクレオチドとも結合しない固体キャリアを含んでなるキット。 ４８．各第１プローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、 その第２結合基は第１プローブ上の第１結合基と結合可能である請求項４７記載 のキット。 ４９．各標的ポリヌクレオチドに特異的な各第２プローブが異なった標識を含ん でなる請求項４７記載のキット。 ５０．第２プローブ上の標識を検出する手段を含んでなる請求項４９記載のキッ ト。 ５１．各プローブがヌクレオチド数約１５から約５０，０００の長さにあり、各 対のプローブは１標的ヌクレオチドに特異的であり、各第１プローブ及び第２プ ローブはその標的ポリヌクレオチドの異なった部分に相補的であり、その部分の 最短距離がヌクレオチド数で約３００よりも長くない請求項４８記載のキット。 ５２．プローブが標的ポリヌクレオチド上の直接隣接した場所に相補的である請 求項５１記載のキット。 ５３．ポリヌクレオチド試薬の少なくとも１試薬が１以上のプローブを含有する 請求項４７記載のキット。 ５４．各標的ポリヌクレオチドに相補的なすべてのプローブが単一の試薬中に含 有され、従ってポリヌクレオチド試薬の数が標的ポリヌクレオチドの数に等しい 請求項４７のキット。 ５５．試料中の複数の標的ポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、 （ａ）各標的ポリヌクレオチドに対して、少なくとも２種の異なったプローブを 含んでなるポリヌクレオチド試薬であって、ここに該プローブは第１プローブ及 び第２プローブであり、各プローブはその標的ポリヌクレオチドの一部分に相補 的なヌクレオチド配列を含有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでなり、第１プ ローブ及び第２プローブはともにその標的ヌクレオチドとの相補的塩基対合によ り交雑分子を形成し、どのプローブも固体キャリア上に固定されておらず、第２ プローブは検出可能な標識を有し、複数の標的ポリヌクレオチドに対するすべて のプローブは互いに交雑することはできず、複数の標的ポリヌクレオチドに対す る各第２プローブは検出可能な異なった標識を有するプローブであり、 （ｂ）第１プローブとは結合するが、どの第２プローブ及びどの標的ポリヌクレ オチドとも結合しない固体キャリアを含んでなるキット。 ５６．第２プローブ上の異なった標識を検出する手段を含んでなる請求項５５の キット。 ５７．各プローブがヌクレオチド数約１５から約５０，０００の長さの一本鎖ポ リヌクレオチドを含んでなり、各対のプローブは各標的ヌクレオチドに特異的で あり、各第１プローブ及び第２プローブはその標的ポリヌクレオチドの異なった 部分に相補的であり、その部分の最短距離がヌクレオチド数で約３００よりも長 くない請求項５６記載のキット。 ５８．プローブが標的ポリヌクレオチド上の直接隣接した場所に相補的である請 求項５７記載の方法。 ５９．ポリヌクレオ試薬の少なくとも１試薬が１以上のプローブを含有する請求 項５５記載のキット。 ６０．すべてのプローブが単一の試薬中に含有される請求項５５記載のキット。 ６１．標的ポリヌクレオチドとともに標準ポリヌクレオチドを含有する試料、す なわち両ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が実質的に同じで、標準ポリヌク レオチドはＡ部分及びＢ部分を有し、標的ポリヌクレオチドはＡ′部分及びＢ′ 部分を有し、標準及び標的ポリヌクレオチドは標準ポリヌクレオチドのＡ部分と Ｂ部分の間に位置する少なくとも１つのヌクレオチドが標的ポリヌクレオチド▽ のＡ′部分とＢ′部分の間に位置するヌクレオチドと異なることによって相遠す る両ポリヌクレオチドを含有する試料中の標的ポリヌクレオチドを検出する検定 方法であって（ａ）存在する標準及び標的ポリヌクレオチドの両方を標準ポリヌ クレオチドの場合はＡ部分とＢ部分の両方を含有するセグメントはなく、標的ポ リヌクレオチドの場合は少なくとも１つのセグメントはＡ′部分とＢ′部分の両 方を含有するように、それぞれ一本鎖状の断片に切断し、 （ｂ）（ａ）で処理した試料を少くとも２種のプローブと一緒にするが、ここに 該プローブは第１プローブ及び第２プローブであり、各プローブは一本鎖ポリヌ クレオチドを含んでなり、プローブは互に交雑することができず、第１プローブ はＡ部分及びＡ′部分と相補的塩基対合し、第２プローブはＢ部分及びＢ′部分 と相補的塩基対合し、両プローブはともにＡ′部分とＢ′部分の両方を含有する 標的ポリヌクレオチドの一本鎖セグメントとの相補的塩基対合により交雑分子を 形成するプローブであり、 （ｃ）続いて両プローブを含有する交雑分子の存在を決定する段階を含んでなる 方法。 ６２．切断段階が制限酵素処理を含んでなる請求項６１記載の方法。 ６３．標的及び標準ポリヌクレオチドが二本鎖状であり、切断段階がさらに存在 する標的及び標準ポリヌクレオチドの変性を含んでなる請求項６２記載の方法。 ６４．Ａ部分がＡ′部分と同じでありＢ部分がＢ′部分と同じである請求項６１ 記載の方法。 ６５．標準ポリヌクレオチド上のＡ部分とＢ部分の間の最短距離、及び標的ポリ ヌクレオチド上のＡ′部分とＢ′部分の間の最短距離がヌクレオチド数で約３０ ０よりも長くない請求項６１記載の方法。 ６６．標準ポリヌクレオチド上のＡ部分とＢ部分の間の最短距離、及び標的ポリ ヌクレオチド上のＡ′部分とＢ′部分の間の最短距離がヌクレオチド数で約１０ よりも長くない請求項６５記載の方法。 ６７．標的ポリヌクレオチドが標準ポリヌクレオチドの遺伝子変異体であり、標 的ポリヌクレオチドが遺伝子疾病の徴候である遺伝子突然変異の結果である請求 項６１記載の方法。 ６８．遺伝子疾病が鎌状赤血球負血である請求項６７記載の方法。 ６９．いずれのプローブも固体キャリアに固定されておらず、第２プローブは検 出可能な標識を有し、両方のプローブを含有する交雑分子の存在を測定する段階 がさらに、（ａ）反応混合物を第１プローブと結合するが、第２プローブ及びβ 部分又はＢ′部分のみを合有するセグメントには結合しない固体キャリアと接触 させ、 （ｂ）続いていずれかの標識が固体キャリア上に結合しているか否かを決定する 段階を含んでなる請求項６１記載の方法。 ７０．固体キャリアがアガロース、セルロース、ガラス、ラテックス、ポリアク リルアミド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、 ポリスチレン、シリカゲル、シリカ、及びそれらの誘導体よりなる群から選ばれ る物質で形成される請求項６９記載の方法。 ７１．固体キャリアがミクロ粒子、マクロ粒子、シート、ビーズ、管、ピペット チッブ、板、及びフィルターからなる群から選ばれる形状である請求項６９記載 の方法。 ７２．標識が放射性同位元素、化学発光性化合物、生物発光性化合物、蛍光性化 合物、りん光性化合物、酵素、酵素コファクター、ハプテン、抗体、アビジン、 ビオチン、炭水化物、レクチン、金属キレート剤、及びそれらの誘導体からなる 群から選ばれる請求項６９記載の方法。 ７３．第１プローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、そ の２種の結合基は互いに結合でき、２種の結合基が一つの結合対を構成する請求 項６９記載の方法。 ７４．結合対がアビジン−ビオチン、ハプテン−抗体、抗体一抗原、炭化水素一 レクチン、リボフラビン−リボフラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオン 結合物質、酵素一基質、ボロネートーシスディオール、スタフＡたん白質一抗体 、酵素一抑制剤、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる請求項７３記載の 方法。 ７５．固体キャリアがアビジン−セルロースであり、結合対がビオチン−アビジ ンである請求項７６記載の方法。 ７６．第１プローブがＲＮＡ又はＤＮＡ断片であり、第２プローブがＲＮＡ又は ＤＮＡ断片であり；固体キャリアがアガロース、セルロース、ガラス、ラテック ス、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリ プロピレン、ポリスチレン、シリカゲル、シリカ、及びそれらの誘導体からなる 群がら選ばれた物質から形成され；固体キャリアがミクロ粒子、マクロ粒子、シ ート、ビーズ、管、ピペットチッブ、板、及びフィルターからなる群から選ばれ る形状であり；標識が化学発光性化合物、生物発光性化合物、蛍光性化合物、り ん光性化合物、酵素、酵素コファクター、ヘプテン、抗体、アビジン、ビオチン 、炭水化物、レクチン、金属キレート剤、及びそれらの誘導体からなり；第１プ ローブが第１結合基を有し、固体キャリアが第２結合基を有し、その２種の結合 基は互に結合できるものであり；２種の結合基は結合対となっており、その結合 対がアビジン−ビオチン、ヘプテン−抗体、抗体一抗原、炭水化物一レクチン、 リボフラビン−リボフラビン結合たん白質、金属イオン−金属イオン結合物質、 酵素一基質、ボロネートーシスジオール、スタフＡたん白質一抗体、酵素一抑制 剤、及びそれらの誘導体から選ばれる請求項７６記載の方法。 ７９．いずれかの標識が固体キャリア上に結合しているか否かを決定する段階が さらに （ａ）交雑分子に組みこまれていない第２プローブを固体キャリアから分離する 段階及び （ｂ）焼いて試料中に標的ポリヌクレオチドの存在の有無を示す固体キャリア上 の標識の有無を検出する段階を含んでなる請求項６９記載の方法。 ８０．いずれかの標識が固体キャリア上に結合しているか否かを決定する段階が さらに （ａ）溶液中の未結合第２プローブの量を測定する段階及び（ｂ）その測定値を 反応混合物へ添加した第２プローブの全量と比較して試料中の標的ポリヌクレオ チドの存否を決定する段階を含んでなる請求項６９記載の方法。