JPH01501996A

JPH01501996A - 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター

Info

Publication number: JPH01501996A
Application number: JP63501756A
Authority: JP
Inventors: カリアン，ナレンダー・ケイ; リー，ショウグァング・リン; ハング，ポール・ピイ
Original assignee: アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレイション
Priority date: 1987-01-30
Filing date: 1988-01-29
Publication date: 1989-07-13
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: JP2983997B2; AU1295088A; KR890700660A; GB2200640B; US5376547A; WO1988005822A1; EP0299053A1; GB8801948D0; IE880255L; GB2200640A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】脱−表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター技術分野本発明は有用な血栓崩壊剤である修飾したハイブリッド組織プラスミノーゲンアクチベーターに関する。

発明の背景プラスミノーゲンアクチベーター、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ− ＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）は主として２つの部分、プラスミノーゲンからプラスミン（血餅のフィブリンネットワークを分解するセリンプロテアーゼ）への変換に関与する触媒部分およびフィブリン結合のごとき生理学的特異性を担う調節領域を含有する非触媒部分よりなる。パン・シネベルトら（Ｖｌｌ　Ｚｏｎ−ｍｅｖｅｌｄ　ｅｔ　ｍｌ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナシ１ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＩＪＳ構造ドメインの機能を説明している。

ｔ−ＰＡの非触媒部分は少なくとも３つのドメイン構造：各８２アミノ酸の２つのクリングル：４５アミノ酸の表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）領域および４５アミノ酸のフィブロネクチン（フィンガー）ドメインを含有する。ウロキナーゼは８２アミノ酸の単一クリングルを含み、フィブロネクチン領域を含まない同様の非触媒ドメイン構造を有する。

ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡのＥＧＦドメインはヒト表皮細胞成長因子配列に相同のかなりの領域を占める。ベハールら（Ｖ　ｅｈａｒ　ｅｔ　ａｌ。

）は、バイオ／テクノロジー（Ｂ　ｉｏ／　Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０５１−１０５７．１９８４年１２月、ここに参照のために挙げる第７図においてこれらの相同領域を描いている。例えば、ジスルフィド結合に関与する６つのシスティン残基のうち５つの相対的位置は保存される。

同様に、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡのＥＧＦドメイン内のいくつかのアミノ酸およびアミノ配列はＥＧＦにおける同一位置に対応する：例えば、アミノ酸５２．５６−６２．６７−６９．７３−７６．７９、８１および８４−８７゜血餅フィブリンに対するその高い結合特異性のため、ｔ−ＰＡは理想的な血栓崩壊剤とされる（フレン（Ｃｏｌｌｅｎ）、サーキニレーシッン（Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、７２．１８２０（１９８５））。しかしながら、ｔ−ＰＡは肝臓によって循環から非常に迅速に除去され（ｂへ＝約１〜３分）、それにより血栓性血管偶発症の治療におけるその効果が減少される［エメイスら（Ｅｍｅｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、スロンボウシス・アンド６ヘモスタシス（Ｔ　ｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）、旦（３）、６６１−６６４（１９８５）コ。フックスら（Ｆ　ｕｃｈｓ　ｅｔ　ａｌ、　）は、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、且（３）、５３９−５４４（１９８５）、同様にウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）が肝臓によって循環から除去され、これらのブラスミ／−ゲンアクチベーターがプロテイナーゼ活性部位に依存しないプロセスによって除去されることを示した。肝細胞は迅速なｔ−ＰＡ除去を担う細胞型であることが示された。リジケンら（Ｒ１ｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　）は、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ａ、　Ｊ　。

分）がＨ鎖よりも循環から除去されるのがかなり遅いことを見い出し、Ｈ鎖が肝臓によって認識されるポリペプチド配列を含有することを立証している。ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの肝臓膜への結合は速く、アシアロ−フェトウィン（ａｓｉａｌｏ　−ｆｅｔｕｉｎ）（末端ガラクトース）、マンナンまたはフィブリノーゲンによって抑制されず、これは炭水化物が血液からのその除去を媒介しないことを示唆する。

発明の記載今回、単独でまたはこれらのポリペプチドのいくつかの未解明領域と共働して、肝臓膜への結合を担うのがｔ−ＰＡおよびウロキナーゼのＥＧＦドメインであることが判明し、これにより循環からのそれらの迅速な除去が説明される。この発見の結果、Ｎ−末端部分：すなわち、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡおよび欧州特許出願０２１３７９４−Ａ号に開示されているごときハイブリッドプラスミノーゲンアクチベーター（ｈ−ＰＡ）のＥＧＦおよびフィブロネクチンドメインの修飾によって、肝臓膜に対する親和性が顕著に減少したプラスミノーゲンアクチベーターが開発された。かくして、本発明はＥＧ！″領域が除去されている、フィブロネクチンおよびＥＧＦ領域が除去されている、および脱−ＥＧＦ　ｕ−ＰＡ、脱−ＥＧＦ　ｔ−ＰＡ、または脱−ＥＧＦ　ｂ−ＰＡに対して１またはそれ以上のフィブロネクチン領域が加えられている新規プラスミノーゲンアクチベーターを提供するものである。これらのポリペプチドはｔ−ＦＡおよびＵ−ＰＡ遺伝子のｅ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを用いる遺伝子工学によってｍ製される。

さらに、所望のプラスミノーゲンアクチベーターについてコード付けするＤＮＡから全ＥＧＦドメインを除去する必要がないことが判明した。アミノ酸５５−６２に対応するポリヌクレオチドの欠失は得られるポリペプチドを効果的に変化させ、肝臓膜による認識（結合、代謝）を回避する。プラスミノーゲンアクチベーターについてコード付けするＤＮＡのＥＧＦドメインの他の修飾は、ＥＧＦ同種アミノ酸５５−６２を産生ずるヌクレオチドの欠失、ＥＧＦドメインの第３次構造を崩壊するために、メチオニン、セリン、アラニン等を生じるコドンで置き換えることによるごとき１またはそれ以上のシスティン部位の修飾；または、ａ、ａ、６０（り゛リシン）のごとき中性アミノ酸についてのヌクレオチドのアスパラギン酸、リジン、アルギニン等の荷電アミノ酸を生じるコドンでの置き換えを包含する。

このようにして修飾したＤＮＡから産生じたプラスミノーゲンアクチベーターは肝臓を通過し、機能的に活性な形態で血流に戻される。

ブスラミノーゲンアクチベーター遺伝子のバクテリオファージＭ１３のごとき一本鎖ＤＮＡベクター中へのクローニングの後、オリゴヌクレオチドの定方向（もしくは部位特異的）突然変異により、これらのすべての修飾を容易に行うことができる（シラーら（Ｚｏｌｌｅｒ　ｅｔａｌ、　）、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏ−１ｏｇｙ）、上立旦、４６８ −５００．１９８３）。

本発明により得られる修飾プラスミノーゲンアクチベーターは脱−ＥＧＦ相同プラスミノーゲンアクチベーターと記載されるのが最も適当である。本出願人らは、ｒＥＧＦ−相同」なる表現は、産生物のＥＧＦ領域は肝臓膜による結合および血液循環からの除去に関与するので、その領域の関連する機能特性が存在しなくなるように１またはそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換によってかかる領域が修飾されていることを意味させるつもりである。

図面の記載第１および１８図は、Δ＊−５ｅｔ　Ｐ　Ａについてフード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。

第２および２８図は、ΔＥＧＦ　ｔ−ＰＡについてコード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。

第３および３８図は、ΔＥＧＦ　ｕ−ＰＡについてコード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。

第４および４８図は、（ａ）マツプ、および（ｂ）第５図で用いるｔ−ＰＡのアミノ酸１−４４についてコード付けするフィンガードメインインサートの１３２塩基対ＤＮＡ配列を示す。

第５図は、ΔＥＧＦ−ビー（ａ、　ａ、　”’）ｔ　−Ｐ　Ａについてコード付けする遺伝子の産生で用いる方法のフロー図を示す。

第６図は、Δｓｓ−ａｍ　９１−　（ｔ）　Ｋ　ａａｓｏ−鵞”　−Ｓ　ｅｒ　 −Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）　９２−ｔ−ＰＡの産生で用いる方法の７ａ−図特表千１−５０１９９６　（４）を示す。

第７図は、Δ５ｓ−ｓ＊　ｔ−Ｐ　Ａの産生で用いる方法のフロー図を示す。

第８−１０ａ図は、ｐ５°Ｈｙｂｐ−５およびそのプラスミドの産生で用いるｔ −ＰＡのに２に見い出されるアミノ酸１９２−２５８をコード付けするために合成・調製するオリゴヌクレオチドを調製するフロー図を示す。

第１１図は、Δ５ｓ−ｓ＊−９１−：Ａ１ｍ”’−に２３　９２　ｔ　ＰＡの産生で用いる方法のフロー図である。第１１図において、ＥはＥｃｏＯ１０９を表す。

方法および材料ａ）酵素反応：制限およびＤＮＡ修飾酵素は二ニーイングランド・バイオラブズ・インコーホレイティド（Ｎ　ｅｖ　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　Ｂ　１ｏｌａｂｓＩｎｃ、）、ベバリー（Ｂ　ｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州またはインターナシ１ナル・バイオチクノロシーズ・インコーホレイテッド（Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ　ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｆｅｇ　Ｉ　ｎｃ、　）、ニーＬ−／％−ベン（Ｎ　ｅｗ　Ｗ　ａｖｅｎ）、コネチカｙ）州から入手した。典型的な制限酵素反応は１００　２００ｎｇのＤＮＡおよび４００ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼ（二、−イングランド・バイオラブズ）を含有する計５０μＣ容量において行った。平滑末端の結びには、４ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼ（二ニーイングランド・バイオラブズ）を前記反応混合物に包含させる。（グブドマン・エイチ・エムおよびマクドナルド・アール・ジふイ（Ｇｏｏｄｓａｎ、Ｈ，Ｍ、　ａｎｄ　ＭａｃＤｏｎａｌｄ。

Ｒ，Ｊ、）、メソフズ・インーｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｅ　ｎｚｙｓｏｌ。

）、６８．７５．１９７９）。用いる緩衝溶液はストックＩＯＸ溶液：０．５Ｍ）リス　・ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、Ｏ，ＩＭ　ＭｇＣムおよび０゜１Ｍ　ＤＴＴ（ジチオスレイトール）として調製する。

ｂ）オリゴヌクレオチドの合成二本出願にいうすべてのオリゴヌクレオチドはジーン・マシーン（Ｇｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）モデル３８０Ａ（アプライド・バイオシステムズ・インコーホレイティド（ＡｐｐｌｉｅｄＢ　１ｏｓｙｓｔｅｓｓ　Ｉ　ｎｃ、　）、フォスター・シティ（Ｆ　ｏｓｉｅｒ　Ｃ１ｔｙ）、カリフォルニア州）を用いてリン酸トリエステル法（フレアら（Ｃｒｅａｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・イブ９ナシ１ナル・アカデミ−φオプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、　）（ＵＳＡ）、７５．５７６５．１９７８）によって合成した。結ぶ反応におけるそれらの使用前に、２００−５００ｎｇのＤＮＡ、Ｉ　Ｑユニ７　）のＴ４ＤＮＡキナーゼ、０．５ｍＭ　ＡＴＰおよびキナーゼ緩衝液（０，０５Ｍトリス−ＨＣｌ２、ｐＨ７，６，１０６Ｍ　ＭｇＣ（！ｔ、５ｍＭ　ＤＴＴ）を含有する５０μＣ容雪中で５°末端においてオリゴマーをリン酸化し、３７℃にて１／２時間インキュベートした。

ハイブリダイゼーシ箇ンブローブとして用いるために、マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブリｘ−（Ｍａｘａ＠、Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｗ）、メソフズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅ　ｎｚｙｓｏｌ、）、ｌ１．４９９（１９８０）の方法に準じｒｌｏＯμｃｉガニ／？”Ｐ− ＡＴＰ（５０００Ｃｉ／ミリモル、アメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、アーリントン・ハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　）ｉｅｉｇｈｔ＠）、イリノイ州）でオリゴマーを放射能標識した。

ｃ）ＤＮＡフラグメントの単離：ＤＮＡフラグメントをまず０．５−１．５％アガロースゲルを通す電気泳動によって分離した。電気泳動はトリス−ホウ酸塩− ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液（０，０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐＨ８，ｏ）中、約１００ボルトにて２−４時間行う。０．５μｇ／　ｍ１２臭化エチリジウム溶液でゲルを染色することによってＵｖ先光下ＤＮＡバンドを可視化した（シャープら（Ｓｈａｒｐ　ｅｔ　ａｌ、）、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

）、■、３０５５．１９７３）。ＤＮＡバンドを含有するアガロースをカミソリで切断する。該ＤＮＡをゲルから電気溶出する（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレ牛ニラ−・クローニング、ア・ラボラトリー−マニアル（Ｍｏｌｅｅｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎＬ　Ａ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、１６４頁、１９８２）。Ｅｌｕｔｉｐ−ｄ　カラム（シュライヘル・アンド・シニエル（Ｓ　ｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ）、ケーＮＡをさらに精製する。該ＤＮＡをエタノールで沈澱させる。エッペンドルブ（Ｅ　ｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロフニーゲ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）での１５分間の遠心の後、ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、真空下で乾燥し、脱イオン水５０ａｎに溶解する。

ｄ）ミニプラスミドＤＮＡの調製二適量の抗生物質を含有するＬＢ（ルリア・ベルタニ（Ｌ　ｕｒｉａ　Ｂ　ｅｒｔａｎｉ））培地約２ｍＱを単一の細菌コロニーで接種し、激しく振盪しながら３７℃にて一晩インキユベートする。マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ、　ｃｉｔ。

）、３６６頁に記載されている沸騰法によって、約１　、５　ｍＱの培地を用いてプラスミドＤＮＡを単離する。後で使用するため、培養物の残りを１５％グリセロール中、−２０℃で貯蔵する。１０℃ｇのＲＮ　Ａ　ｓｅ／川ｇ用含有するＨ２Ｏ４０℃ｇに該ＤＮＡを溶解する。１回の制限酵素分析には約８μｇで十分である。

ｅ）プラスミドＤＮＡの大規模調製：典型的には、ＬＢ培地１リットルヲ単一の細菌コロニーで接種する。クロラムフエニフールでのプラスミドＤＮＡの増幅の後、細菌細胞を収穫し、沸騰法（ホームズ・ディーｘスおよびキグレイーｃム（Ｈｏｌｍｅｓ、Ｄ、Ｓ、ａｎｄ　Ｑｕｉｇｌｅｙ。

Ｍ、）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ　ｎａｌ、Ｂ　１ｏｃｈｅｔａ、　）、ジエント遠心またはマニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、　）、９３　９６頁に記載されているごときセファロース４Ｂカラム（ファルマシア、ウプサラ（Ｕ　ｐｐｓａｌａ）、スウェーデン）上のカラムクロマトグラフィーいずれかによってプラスミドＤＮＡをさらに精製する。通常、１リツトルの培養物あたり約４００μｇのＤＮＡの回収が達成される。

ｆ）ベクター：オリゴ−ｄＧ−テールのｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイティド（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）、ガイセルスブルグ（Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を用いてｔ−ＦＡおよびＵ−ＦＡについてのｃＤＮＡをクローン化する。ｐＢ　Ｒ３２２の詳細な分子構造はマニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ。

ｃｉｔ、　）５頁および４８８頁に記載されている。組換体ｐＢＲ３２２での形質転換に用いるイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）株はＨＢＩＯＩもしくは２９４いずれかであった（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　）、ロク・シト（ｌｏｅ、　ｃｉｔ、　）、５０４頁）。２．−１．プラスミノーゲンアクチベーターのうちいくつかの産生に用いるプラスミドＰＢＳ　Ｍ２Ｓ−はストラタジーン（Ｓ　ＬｒａｔＨｅｎｅ）、サンジエゴ、カリフオノシニア州から入手した。

ｔ　−Ｐ　Ａおよびｕ　−Ｐ　Ａ遺伝子からのＤＮＡフラグメントのすべての継代クローニングはｐＵＣプラスミド−１ａｃＺおよびアンピシリナーゼ遺伝子を含有するｐＢ　Ｒ３２２由来の一連のベクターにおいて行った。これらのプラスミドは１ａｃＺ領域に多重クローニング部位も含有し、これによりＤＮＡ配列の継代クローニングにおいて大きな柔軟性を提供する（ビニリア・ジェイおよびメリック・ジエイ（Ｖ　１ｅｒｉａ、　Ｊ　、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ　、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１１．２５９．１９８２）。利用できる１１０部位のうちいずれかにおけるクローニングは、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリル　β−Ｄ−ガラクトシド）を含有するインジケータープレート上の青色ベクターコロニーのパックグランド中の白色組換体コロニーの外観によってモニターすることができる（ルザー（Ｒｕｔｈｅｒ）、モレキユラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ・ソクス（Ｍｏｌ、　Ｇ　ｅｎ、　Ｇ　ｅｎｅｔｆｃｓ）、１ヱ」−１４７５，１９８０）。組換体ｐＵｃプラスミドでの形質転換で用いるイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株は７Ｍ１０３であった。ｐＵＣプラスミドおよびイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３はファルマシア・インコーホレイティド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉ　ｎｃ、　）、ビスカフタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、二ニージャージ州から入手した。

ｇ）宿主／ベクター系１、微生物系本明細書中に記載する実験は微生物イー・コ！Ｊ　（Ｅ、　ｅｏｌｉ）　１２株ＪＭ１０３（ファルマシア（Ｐｈａｒｓ＋ａｃｉｓ＋））およびイー・フリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）Ｋ　１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、３３６２５）であった。このプロセスで用いることができる他の微生物は他の有用なイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株およびバチラス・スブチリス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）のごときバチラス属を包含する。すべてのこれらの微生物は異種遺伝子配列を複製しおよび発現できるプラスミドを利用する。

酵母における発現系では、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）および／または酵母（サツカロミセス・セレＥ゛シエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））における選択および複製が可能であるプラスミドを用いる。酵母における選択については、プラスミドは形質転換したｔｒｐ−酵母株（ＲＨ２１８）をトリプトファンに対しての原栄養素株とするＴＲＰ１遺伝子を含有する。酵母発現ベクターは酵母およびイー・フリ（Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ）間を行き来できる。該プラスミドは以下の要素：（１）複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＢＲ３２２由来のＤＮＡセグメント、（２）酵母ＴＲＰＩ遺伝子、（３）プラスミドを酵母中にて高安定で複製させるのを可能とする酵母２μＤＮＡ、（４）アルコールデヒドロゲナーゼ、α因子、グリセルアルデヒド−３− ホスフェート−デヒドロゲナーゼ等のごとき酵母遺伝子からのプロモーター領域、（５）発現系において適当な停止およびｍＲＮＡのポリアデニレーシ１ンで用いることができる翻訳開始および翻訳停止配列を有する。

２．１１乳動物細胞の培養系異種蛋白の産生のための和合ベクターの複製および発現が可能な哺乳動物細胞系を本発明で用いることができる。例えば、それらは：Ｃｏ５−７、Ｗ２Ｂ５．３Ｔ３、Ｃ）（Ｏ、ヒーラ細胞、およびＣ１２７＠胞である。用いるベクターは（１）ウィルス（ＳＶ４０、アデノ、ポリオーマ、ＢＰＶ）または細胞染色体ＤＮＡ由来の複製開始点、（２）プロモーター、（３）リポソーム結合部位のごとき翻訳開始シグナル、および（４）ＲＮＡプロセッシングシグナル（ＲＮＡスプライシング、ポリアデニレーシ曹ンおよび転写ターミネータ−配列）である。ここに示す発現ベクターの特別の例はＢＰＶウィルス複製開始点、マウスメタロチオネインプロモーターおよびＳＶ４０　ＲＮＡプロセッシングシグナルを用いる。

該ベクターはまた哺乳動物細胞培養物とイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）間を行き来できる。それはイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）アンピシリン耐性について選択可能なマーカーならびにイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡ複製開始点を提供するｐＢ　Ｒ３２２配列の誘導体を含有する。これらの配列はプラスミドｐＭＬ　２ｄに由来する。

ＢａｍＨＩ粘着末端を含有する編集されたノーイブリフドプラスミノーゲンアクチペーター遺伝子をまずマウスメタロチオネイン転写プロモーター要素およびＳＶ４０初期領初期領域転写プロセフタングシグナル間スミド３４１−３（ロー・エム・エフラ（Ｌａｗ　ＭＦ　ｅｔａｌ、　）、エム・ディ・セル・パイオル（Ｍｄ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）Ｆ、　３．２１１０．１９８３）のＢｇｌＩ［部位に挿入する。プラスミド１４２−５（ＡＴＣＣＮｏ、３７１３４）をＢａｍＨＩで消化した後得られた完全なりＰＶゲノムをユニークＢａｍＨ１部位に結ぶ。プラスミド３４１−３は細菌細胞内でのプラスミドの複製を可能とするｐＭＬ。

２、ｐＢ　Ｒ３２２誘導体も含有する。ここで組み立てた発現プラスミドは染色体外エビソームとしてマウスＣ１２７細胞においてもっばら複製することができる。トランスフェクトされた細胞は形質転換された表現型について選択できる。

さらに、より高発現レベルのために特異的なエンハンサ−要素を加えることによる、または（ネオマイシン耐性のごとき）薬剤耐性を遺伝子に挿入することによるごとき発現ベクターのさらなる修飾も可能である。

ΔＥＧＦプラスミノーゲンアクチベータ一本明細書中で特に例示する表皮細胞成長丙子ドメインを欠くプラスミノーゲンアクチベーターの調製のための比発点はプラスミドｐｔＰ　ＢＭ　１　、ｐＵ　Ｋ　ＢＭおよびｐＵＫＫＮｄ１６に基づく。

ｔ−ＰＡについてのメツセンジャーＲＮＡｔ−ＦＡを産生ずるために内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）およびヘパリンによって刺激された正常なヒト線維芽細胞（ＷＴ−３８細胞）からイソチオシアナート法（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、モレキユラー・クローニング、ア・ラボラトリ−慟マニニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌルによって全ＲＮＡを単離した。同一の刺激した細胞はウロキナーゼを産生ずる。

オリゴ−デオキシチミジン（ｄＴ）−セルロースカラム上のクロマトグラフィー（アビブら（Ａｖｉｖ　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・オブ・ナシ二ナル・アタデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ｔｌｓＡ、６９．１４０８．１９７２）によって全ＲＮＡからメッセンジ＋−ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得た。１５−３０％スクロース密度勾配における遠心によってｍＲＮＡの分画をさらに行い、個々のｍＲＮＡ画分を以下に記載するごとき■ｐ−プローブでハイブリダイズした。ｔ−ＦＡメツセージ（約２Ｏ−２４Ｓ）を含有する画分を相補性Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）の調製に使用するためにプールした。

ｔ−ＰＡ用の相補性ＤＮＡ前節に記載のプールしたｉＲＮ　Ａ　（５μｇ）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを得、末端ヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて該ｃＤＮＡをポリデオキシシチジレート（ポリｄＣ）でホモポリマーテールした。

産生物をＰｓｔｌ消化のポリデオキシシグアニレート（ポリｄＧ）テールしたｐＢＲ３２２と共にアニールした。アニールしたＤＮＡを用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）２９４細胞を形質転換し、これを培養して約１０５細菌クローンを産生した（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、　）、２２９頁）。

ｔ　−Ｐ　Ａ　クローンのスクリーニングおよび同定”Ｐ−ＡＴＰで放射能標識した後、以下の３つのオリゴヌクレオチドを用いて組換体クローンのライブラリーをスクリーニングした。

これらのオリゴマーはｔ−ＰＡ分子のアミノ酸配列、３４−３９（１７ｍｅｒ）、２５３−２５８（１８ｍｅｒ）および５２３　５２７（１５ｍｅｒ）（ペニカ・ディら（Ｐ　ｅｎｎｉｃａ　ｅｔ　ａｌ、　）、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３０１．２１４．１９６８）、１７ｍｅｒ：５°−ＣＣＡＣＴＧＴＴＧ−ＣＡＣＣＡＧＣＡ−３’；１８ｍｅｒ：５°−ＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴ−ＡＣＴＣＣＣＡ−３°：１５ｍｅｒ：５’ＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＧ−ＴＣ−３’）に対応する。約２０のコロニーはプールしたプローブに対し中程度ないし強い相同性を呈した。これらのコロニーの再画線培養および再ハイブリダイゼーションは陽性シグナルを有する１６のクローンを与えた。これらのクローンから調製したプラスミドＤＮＡをニトロセルロースペーパー上にプロットシ、個々ノフローブでハイブリダイズした。２つのクローン（４２および６２ａ）は中央（１８ｍｅｒ）および３°末端（１５＋Ｉ１ｇｒ）プローブ双方にハイブリダイズした。プラスミドＤＮＡのＰｓｔｌでの酵素消化は、クローンＮｏ。

４２が、１．１．０．６および０．４ｋｂの３つのフラグメントの形態で２キロベース（ｋｂ）より大きい最大のインサートを含有することを示した。このクローンは、５°−および３°−非翻訳領域を包含し、２６００ｂｐを含有するｔ− ＦＡ遺伝子についての全長配列を含有する。

ｐｔＰＢＭ　１３７℃にて約１０μｇのｐＷＰ４２プラスミドＤＮＡを９ユニツトのＸｈｏＩｌで２時間消化した。反応混合物を調製１．２％アガロースゲルに付し、アガロースゲル中の電気泳動によって１６１８ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。粘着末端をイー・フリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）およびｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート−ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）で満たした後、かく修飾したＤＮＡ１μｇをリン酸化した５ａ１１リンカ−３００ｎｇで一晩結んだ。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱の後、該ＤＮＡを５００のＳ　ａｌ　ｌで４時間消化し、反応混合物を調製１％アガロースゲルに適用して所望のＤＮＡフラグメントを単離した。

５ａｌｌ末端を有する該ＤＮＡをＳ　ａｌ　ｌ切断のｐＵｃ１３に結び、これを用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換し、該細胞をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌプレート上で画線培養した。

８つのアンピシリン耐性の白色コロニーを選択し、増殖させてミニプラスミド調製物を調製した。２つのクローン（ｐｔＰＳ３４ＢおよびｐｔＰＳ３９）が所要のＤＮＡフラグメントを含有することが判明した。Ｂａ５ＨＩおよびＮａｒｌで完全に消化したｐｔＰＳ３９プラスミドＤＮＡ１０μｇを調製アガロースゲルに付してｔ−ＰＡのＣ末端についてコード付けする１２８８ｂｐフラグメントを得た。

３７℃にて、ｐＷＰ４２を４ユニツトのＨｇａｌで８時間消化することによりｔ −ＰＡ遺伝子の５゛末端を得た。１％アガロースゲル中の電気泳動によって５１５ｂｐフラグメントを単離した。このＤＮＡフラグメントの粘着末端をＤＮＡポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）およびｄＮＴＰで満たし、産生物をＳ　ｉａ　ｌ切断のｐＵｃ１３に結んだ。イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換した後、約７５のアンピシリン耐性の白色コロニーを得た。

これらのコロニーのうち２４を増殖させてミニプラスミド調製物を調製した。ミニプラスミド調製物をＮａｒｌで消化し、１７のクローンがいずれかの向きの所要のインサートを有することが判明した。沸騰法を用いて、１のクローン（ｐｔＰＨｇａ４）をアンピシリンを含有するＬＢ培地１゜０リツトル中で増殖させて大量のプラスミドＤＮＡを得た。該プラスミドＤＮＡ％ｐｔＰＨｇａ４をＢａｍＨＩおよびＮａｒｌで消化し、１゜２％アガロースゲル上の電気泳動に付してｔ −ＰＡのＮ末端についてコード付けする４３４ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。

１２８８ｂｐＤＮＡ（３００ｎｇ）および４３４ｂｐ（１００ｎｇ）を−晩結んで１７２２ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。ＢａｍＨＩ切断のｐＵＣ１３で結んだ後、このＤＩＡを用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３細胞を形質転換したｃ　１０００以上のアンピシリン耐性コロニーが得られた。沸騰法によって１２のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。ＢａｍＨ１％　ＮａｒｌおよびＸｈｏｎの各々で切断することによって該プラスミドを同定した。得られたプラスミドはすべて所望の１？２２ｂｐＤＮＡフラグメントを含有することが判明した。

大規模なプラスミドＤＮＡｍ製用に、１のプラスミド（ｐｔＰＢＭｌ）を用いた。ＢａｍＨＩで切断すると、このプラスミドは完全なｔ−ＰＡ分子についてコード付けする１７２２ｂｐＤＮＡを生じた。

・ｕ　−Ｐ　Ａクローンのスクリーニングおよび同定グルンステインら（Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーディングズ・オブ・ナシ１ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７２，３９６１（１９７５）の方法によって、ｔ−ＰＡ遺伝子がそれから得られた１０″組換体細菌コロニーのライブラリーを、前掲、放射能標識した１８ｍａｒプローブでスクリーニングした。ジーン・マシーン（Ｇｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ鵬ｓ））を用いる標準的なリン酸トリエステル法によって合成したプローブは、ウロキナーゼ遺伝子の中央部分（ａ、ａ、１７３−１７９）に対応するオリゴマー配列−５”−ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＧＧＣＣＧＣＡＡＡ　ＣＣＡ−３’−を示す。約１３のクローンが中程度ないし強いノーイブリダイゼーシ１ン信号を示した。これらのクローンをテトラサイクリンを含有するＬＢ培地２社中で増殖させ、ミニプラスミド調製物を調製した。

ＲＮＡ５ｅｌ　０１１１／ｍ（ｌを含有するＨ＊０　４０ａＱに該ミニプラスミド調製物を溶解した。かく産生したＤＮＡ約８μｇをに二・ノドのＰｓｔｌで消化し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。１のクローン（ｐＵＫ５３）はサイズ長１．２．０．４および０．１ｋｂの３つのインサートの形態で１　、７　ｋｂの最大インサートを含有することが判明した。ウロキナーゼの完全な３”末端ヌクレオチド配列がＰｓｔｌ切断の１　、２　ｋｂＤ　Ｎ　Ａフラグメント中に存在していた。マキサムおよびギルバー）（Ｍａｘｉｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）法、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、によるヌクレオチド配列決定法により、該遺伝子の５゛末末端列はウロキナーゼ蛋白のシグナルペプチドコーディング領域の最初の１０のアミノ酸に対応する約３０ヌクレオチドを喪失していることが判明した。従って、喪失ヌクレオチドに対応する二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａ配列を合成し、存在する遺伝子に結んだ。

ｐＵＫＢＭ−１ウロキナーゼプラスミド（ｐＵＫ５３）ＤＮＡをＮｃｏｌおよびＭｓｔ■で切断し、産生物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。１１９８ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気溶出によって単離した。ｄＮＴＰおよびイー・フリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（クレノーフラグメント）で満たすことによって、Ｎｅｏｌ切断に対応するＤＮＡフラグメントの５°突出末端を平滑末端とした。次いで、該ＤＮＡを５Ｉｌｌａ１切断のｐｌＪｃ１３に結び、修飾したプラスミドを用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ　１０３細胞を形質Ｅ摸した。該Ｄ　Ｎ　ＡをｐＵｃ１３のＳｍａ１部位に結んで、該インサートのＮｅｏ１部位が再生された。該細胞をアンピシリンおよびＸ−ｇａＩプレート上で画線培養し、白色コロニーからミニプラスミド調製物を産生じた。

該ミニプラスミドＤＮＡＭ製物のＮｃｏｌおよびＳ　ａｌ　］での消化は約１２００ｂｐのＤＮＡフラグメントを与えた。陽性クローン（ｐｔＪＫＮＭ−３“）からの大規模なプラスミドＤＮＡ調製を行い、Ｎｅｏｌおよび５ａｌｌで消化して大量の約１２００ｂｐＤＮＡフラグメントを得、これを調製アガロースゲル電気泳動によって分離した。

ウロキナーゼ蛋白の５″シグナルペプチドコーデイングｎ域の最初の１０のアミノ酸に対応する約３０のヌクレオチドを供するために、ｐＵ　Ｋ　５３プラスミドＤＮＡをまずＰｓｔｌで消化し、４００ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。

このＤＮＡを次いで５ｃｒＦ１で処理してＤＮＡの２４２ｂｐフラグメントを単離した。該ＤＮＡの突出末端をｄＮＴＰおよびイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）で満たした。

適当な翻訳リーディングフレームを保持し、かつＳ　ａｌ　１切断のｐＵＣ１３における継代クローニングのためのＤＮＡの両末端上にＳ　ａｌ　ｌ　配列を供しつつ、３８および４２塩基対長の２つの相補オリゴヌクレオチド配列をジーン・マシーン（Ｇｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）で合成して喪失アミノ酸（−９ないし −２０）を供した。リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ）リス・ＭＣＩ２、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣＱ、、ｌＱｍＭジチオスレイトール）中、等モル量で２つのオリゴマーを混合し、５分間で８０″Ｃまで加熱し、約１時間で室温まで冷却した。４００ユニ・ノドのＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い、リガーゼ緩衝液中、４°Ｃにて、かく形成した２つの相補ヌクレオチド配列の二重鎖（約１μｇ）を１６時間で２４２ｂｐＤＮＡフラグメント約３００ｎｇに結んだ。結ん、だ混合物を１．２％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、約３２０ｂｐＤＮＡフラグメントを電気溶出によって単離した。このフラグメント（約２０　ｎｇ）を５ａｌｌ切断のｐＬ］ｃ１３　１１００ｎに結び、該ベクターを用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換した。該細胞をアンピシリンＸ−ｇａｌプレート上で画線培養した。１２の白色コロニーを選択し、増殖させてミニプラスミド調製物を調製した。該ミニプラスミド調製物をＳ　ａｌ　ｌで切断した。３２０ｂｐＤＮＡインサートを含有すると考えられるｌのクローンをプラスミドＤＮＡの大規模調製のために増殖させた。該ＤＮＡを５ａｉｌおよびＮｃｏｌで切断して、調製アガロースゲル電気泳動により、２６０ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。

遺伝子の３３３ｂｐ位置に共通のＮＣ０１制限部位を含有する２６０ｂｐＤ　Ｎ　Ａおよび１２００ｂｐＤＮＡフラグメントを結ぶために等モル量で混合した。

結んだ産生物を５ａｌｌで切断し、調製１％アガロースゲル電気泳動によって反応混合物を分離した。電気溶出によってて１４６０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮＡを５ａｌｌ切断のｐｌＪｃ１３に結び、該プラスミドを用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、ｅｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換し、これをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌプレート上で画線培養した。１２の白色コロニーを選択し、増殖させて沸騰法によりミニプラスミド調製物を調製した。

該ミニプラスミド調製物を５ａｌｌで切断し、１のクローン（ｐＵＫＢＭ−１）が所望の１４６０ｂｐＤＮＡインサートを含有することが判明した。ｐｔＪＫＢＭ−１を大容量で増殖させてプラスミドＤＮＡを得た。合成リンカ−を含有する５′末端からのオリゴヌクレオチド配列をマ牛サム・ギルバート（Ｍａｘａｍ　 −Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）法により配列決定してその真性を確認した。

それにより、ｐｔＪＫＢＭ−１プラスミド中のＤＮＡインサートが翻訳開始コドンＡ　Ｔ　Ｇ　（ｍｅｔ、リーダー配列中の−２０ａａ）ならびに停止コドンＡＧＡを含有するが証明された。この完全な遺伝子はシグナルペプチドの２０のアミノ酸（−１ないし−２０）および成熟ウロキナーゼ蛋白の４１１のアミノ酸についてコード付けする。

ｐＵＫＫＮｄ１６ウロキナーゼ配列におけるｂｐ２０４にて切断する５ｃａｌでｐＵＫ５３プラスミドＤＮＡ約１０μｇを完全に消化した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、Ｄ　Ｎ　Ａベレットを緩衝溶液（１０ｍＭＣａＣム、１２＋ａＭ　ＭｇＣｌ２＊−０，２Ｍ　ＮａＣＬ　２０ｍＭ！−リス・ＨＣ２（ｐＨ８，０）、１ｅＭ　ＥＤＴＡ）５０，１７１２中に溶解した。エンドヌクレアーゼＢａ１３１の１μＱ（２ユニツト）を反応混合物に加え、該混合物を３０℃にて１５秒間インキュベートした（レゲルスキイ・アール・ジェイ、ジェイ・エル・ホトネットおよびエイチ・ビイ・グレイ・ジｘニア−（Ｌｅｇｅｒｓｋｉ、　Ｒ，Ｊ　、、　Ｊ　、　Ｌ、　Ｈｏｄｎｅｔｔ、　ａｎｄ　Ｈ。

Ｂ、Ｇｒａｙ＋　Ｊ　ｒ、）、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　）、５．１４５．１９７８）。０．４Ｍ　ＥＤＴＡ　５μｇの添加により反応を停止した。この反応時間はＤＮＡフラグメントの各末端から約８０ｂｐ除去するのに十分であることが判明した。

フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、標準的な反応条件下でＤＮＡをオリゴヌクレオチドリンカー（１０ｂｐ）に結んだ。配列がＴＧＧＡＡＴＴＣＣＡであるオリゴマーリンカ−（ＥｃｏＲ１／Ｎｄｅ１リンカ−）を消化し、配列ＴＡＴＧ（ａ、ａ、５１に対応）を含有するＤＮＡ末端に結んでＮｄｅ１部位（ＣＡＴＡＴＧ）を得る。加えて、ｐＵｃ１３ベクター中に引き続いてクローニングを供するために制限部位、Ｅ　ｃｏＲ１ｓをリンカ−に組み入れた。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、該ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化し、１％調製アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。３４０ｂｐに対応するＤＮＡバンドを切断し、溶出し、エタノール沈澱させた。このＤＮＡ約４０ｎｇをＥｃｏＲ１切断のｐＵｃ１３ベクターＤＮＡ約０．４μｇで結び、これを用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換した（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、　）、２５０頁）。１０のプレートから約１０００の組換体コロニーを得た。該細菌コロニーをニトロセルロースペーパー上でレプリカ画線培養し、放射活性なオリゴヌクレオチドプローブを用いるインサイチニ・ハイブリダイゼーシｌンよってスクリーニングした（グルンステインら（Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーディングズ・オブ・ナシ夏ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７２．３９６１．１９７５）。用いたオリゴヌクレオチドプローブは１８ｂｐ長（Ｔ　Ｔ　ＣＣＡＴＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧ）であり、ＥｃｏＲ１／Ｎｄｅｌリンカ−からの最初の５のヌクレオチドおよびａ、ａ、５１ないし５４に対応するウロキナーゼ配列からの次の１３塩基対を含有するものである。

１２のクローンはＸ線フィルム上で、中程度ないし強い信号を示した。これらの１２のクローンから調製したミニプラスミドＤＮＡをＮｄｅｌで消化し、１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。１のクローン、ｐＵＫＫＮｄ１６、は新しく生成したＮｄｅ１部位を含有することが判明した。

ｐ５°ＨｙｂＦ−５反応混合物５０μＱ中のｐｔＰＢＭ−１プラスミドＤＮＡ約１０μｇをＮａｒＩで消化して２つのＤＮＡフラグメント−６００ｂｐおよび３８００ｂｐを得た。

より小さいＮａｒＩフラグメント（６００ｂｐ）は単離されるべき４００ｂｐの目的ＤＮＡを含有していた。反応混合物をＢＡＬ３１緩衝液で１００μｇ容量まで希釈して最終濃度１０ｍＭＣａｃ　Ｉ２．．１２ｍＭ　ＭｇＣ１２ｔ、０．２Ｍ　ＮａＣ（！、２０ｓＭ）リス−〇ｆｆ、ｐＨ８，０，１龜Ｍ　ＥＤＴＡとした。３０℃にて反応試験管をＢＡＬ３１　１μ（２（２ｕ）と共に１０秒間インキュベートした。このインキニベーシ１ン時間は６００ｂｐＤＮＡセグメントの各末端から５０ｂｐ除去するのに十分であることが判明した。この結果、１．２％アガロースゲル電気泳動に付すと、ＤＮＡサイズが６００ｂｐから５００ｂｐに減少した。反応は０．４Ｍ　ＥＤＴＡ　５μＣの添加によって停止した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ポリメラーゼ１（クレノー）およびｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ％ｄＴＴＰ）でＤ　Ｎ　Ａを平滑末端とした（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅＬ　ａｌ、）、ロク・シト（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、　）　１０９頁）。

該ＤＮＡを１．２％アガロース中で電気泳動に付し、５００ｂｐＤＮＡセグメントを単離した。１５℃にて、このＤＮＡ約１１００ｎをＦｓｐＩ／ＥｃｏＲ１オリゴヌクレオチドリンカー１μｇで一晩結んだ。

名称が示唆するように、該りンカー、ｇｅａ　ｇａａ　ｔｔｃ　ｔｇｅｓは配列ＴＧＣＣ１！、ａ、９２ンで終了するＤＮＡに結ぶとＦｓｐ１部位（ＴＧＣｇｃａ）を生じるように設計されたものであった。加えて、ＥｃｏＲＩ配列を該リンカ−に組み入れて引き続いてのＥｃｏＲＩ／ｐ’ＵＣ１３ベクター中でのクローニングに便利な部位を供した。フエ／−ル抽出およびエタノール沈澱の後、該Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲ）で十分に消化し、４００ｂｐＤＮＡフラグメントを１．２％アガロースゲルから単離した。このＤＮＡおよびＥｃｏＲＩ切断のｐＵｃ１３の等モル量を結び、産生物を用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３を形質転換した。

数千の組換体コロニーが得られた。１ｏのプレートにおける約１０００のコロニーをニトロセルロースペーパー上で複！ｌ、放射能１識したオリゴヌクレオチドプローブを用いるインサイチユ・ハイブリダイゼーシ目ンによってスクリーニングした（グルンスティンら（Ｇ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ、互、３９６１．１９７５）。用いたプローブは１８ヌクレオチド長であり、ＤＮＡ／リンカ−結合にて生じたヌクレオチド配列を表わすよう設計したものであった。これによりＤＮＡ／リンカ−結合にて異なるヌクレオチドを有するすべての望まないクローンの除去がほとんど保証された。はぼ１００のクローンはＸ線フィルムにａ露すると、中程度ないし強いハイブリダイゼーシテン信号を与えた。１２のクローンをピックアップし、増殖させてミニプラスミド調製物を得た。該プラスミド含有溶液的　８ μＣを１ユニツトのＦｓｐｌで消化した。１２のクローンのうち９つは新しく生成したＦｓｐ１部位を有していた。ベクター中のインサートの向きに依存して、Ｆｓｐｌ消化は５００　ｂｐ（クローンＮ０９２．３．５．９）または１５０　ｂｐ（クローンＮ０９１．７．８．１１．１２）いずれかを示すであろう。最終的な確認は、マキサム−ギルバー）　（ＭａｘａＩＩｌ−Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）法（メソソズ・インーｘンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ、　）、且、１４９９．１９８０）によるヌクレオチド配列決定法により行い、完全なシグナル配列およびｔ−ＰＡ遺伝子のａ、ａ、１−９２に対応するアミノ酸についてコード付けするＤＮＡを含有するｐｔＰＦｓｐ−２なる名称のクローン２におけるＦｓｐｌ認識配列ＴＧＣＧＣＡと共に、ｂｐ４６５　（ａ、ａ、　９２）位におけるＦｓｐ１部位（ＴＧＣＧＣＡ）の存在が示された。

ジーン・マシーン（Ｇ　ｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）で８つの重複するオリゴヌクレオチドを調製することによって、第８図に描いたごと（組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の第２クリングル（Ｋ２）に見い出されるアミノ酸１９１ないし２５８に対応するＤＮＡ配列を化学的に合成した。オリゴマーＩないし■の全ヌクレオチド配列を第９図に描く。オリゴマーＶないし■は相補的である。二重鎖融合のために各フラグメントに１０ヌクレオチド重複を供する。オリゴマーＨないし■はポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰでリン酸化した。

オリゴ１および■の５″末端は自己結びを回避するためにリン酸化しなかった。

すべての８つのオリゴを等量（各オリゴマー１μｇ）で混合し、相補鎖間の二重鎖形成のために１０分間で６５℃まで加熱し、次いで１５℃にてＴ４　ＤＮＡリガーゼで一晩結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱に続き、アガロースゲル上の電気泳動に付すことにより２２８ｂｐＤＮＡ産生物を位置決めしたが、それは５°および３°両末端にＥｃｏＲＩ制限部位が付着し、各々５°および３ “末端に向かってユニークＫｐｎｌおよびＡａｔＩ［制限部位を含有し、後者の制限部位はｔ−ＰＡのａ、ａ、１９１ないし２５８に対応するＤＮＱフラグメントを決定する。該２２８ｂｐＤＮＡ産生物を電気溶出し、ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Ｅ　ｃｏＲＩ切断のｐＵｃ１３に挿入した。１２のクローンからミニプラスミド調製物を調製し、ＥｃｏＲＩで切断して所望の２２８ｂｐインサートを含有するクローンを同定した。１のクローンを選択し、ｐＫ　２　＊ −５と名付ｊすた。該クローンのヌクレオチド配列決定により、目的配列を含有するＤＮＡは正しいリーディングフレーム中にあることが示された。このＤＮＡ配列は、組換えおよび転写間のルーピングアウトを回避するための所望のアミノ酸についての別のコドン配列を含有する。

ｐｔＰＦｓｐ−２約１０Ｊ１ｇをＦｓｐ−１で消化して完全なシグナルペプチド（ａ、　ａ、３５ないし−１）およびａ、ａ、９２位にユニークＦｓｐ−１制限部位を有するｔ−ＰＡの最初の９２アミノ酸についてコード付けする５５０ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡ約１μｇを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで、ジーン−ｖシーン（Ｇ　ｅｎｅ　Ｍ　ａｃｈｉｎｅ）で産生じた第１０図に描いた二重鎖オリゴマー２μｇに結んで１８６位のＡｌｍの存在以外はｔ−ＰＡの第２クリングルのａ、ａ、１８１−１９１に対応するアミノ酸配列−Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌ）＋−Ａｓｎ−Ｇｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｌａ　−Ｔ　ｙｒ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｔ　ｈｒ−の産生用に供し、および３“末端にＫｐｎ−１部位（ＧＧＴＡＣＣ）を供した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、産生物をＫｐｎ−］で切断して６１０ｂｐＤＮＡ画分を得、これをＫｐｎ−１切断のｐＫ２に−５に挿入してに２クリングルのＮ末端部分（ａ、ａ、１８１　１９１）についてのコドンがｔ−ＰＡのアミノ酸９２を提供するコドンに結合した組換体クローンを得た。この組換体クローンをｐｔＰ　Ｋ　２　＊　Ｋｐｎ　−９と名付は続いてのａ、ａ、１８０　２５８をコード付けするヌクレオチド配列を含有する。ＡａｔｌｌおよびＥｃｏＲＩで消化したこのプラスミドから所望の６３０ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。

ａ、　＊、　９５ないし２Ｑ５ｔ−ＰＡについてコード付けする情報を含有する３３０ｂｐＤＮＡフラグメント（ｂｐ４７１−８０１）をＥｃｏＲＩおよびＡｖａｌｌ切断のｐｔＰＢＭ−１から単離した。この３３０ｂｐＤＮＡフラグメントを、Ｋ２本のアミノ酸２５９ないし２６１についてコード付けするジーン鞠マシーン（Ｇｅｎｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ）で調製の二重鎖オリゴマー、ｔ−ＰＡのに１のＳ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｎ　−Ｓ　ｅｒ−Ａｓｐ−およびアミノ酸９２ないし９５についてコード付けするヘプタペプチドリンカ−に結んだ。産生物をＥｃｏＲＩおよびＡａｔｌｌで切断し、３６６ｂｐＤＮＡフラグメントを単離し、これを前節の６３０ｂｐＤＮＡ配列に結んで９９６ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。このＤＮＡ配列を増幅のためのＥｃｏＲ１切断のｐＵｃ１３に挿入し、１のＩｆ１ｍ体クローンが所望の産生物を含有するものとして同定された。このクローンをり５’ＨｙｂＦ−５と名付けた。

寒貴烈１ Δｙ−ｓｅｔ　Ｐ　ＡｐｔＰＢＭ−１約１０μｇｆｅＢｇｌｌＩで消化し、調製アガロースゲル電気泳動によって２．８ｋｂＤＮＡフラグメントを単離した。このＤＮ−ＡのフラグメントはｐＵＣベクターに対応し、ｔ−ＦＡの完全なシグナルペプチド領域（−３５ないし一１アミノ酸）を含有する。

ｔ−ＰＡクリングル１の中および前に示した喪失アミノ酸について供する化学的に合成した２０および１９塩基の２つの相補オリゴヌクレオチド配列ニー１　＋１　９０　９１　９２　９３　９４Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　ＡｖａＩＩ５”−ＧＡ　ＴＣＴ　ＧＣＣＡＣＧ　丁ＧＣ丁ＡＣＧＡＧ　↓↑　Ａ　ＣＧＧ　ＴＧＣＡＣＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＧ−５゜ＢｇｌＩＩをＢｇｌＩＩ切断の２．８ｋｂＤＮＡに結んだ。このオリゴヌクレオチドリンカー配列は、Ｂ　ｇｌ　ｍおよびＡｖａＩ［切断のｔ−ＰＡ遺伝子に連結させると、各々５“−および３°−末端にてＢｇｌＩＩおよびＡｖａｉｌ制限部位を生じるように設計されたものであった。ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼで２０塩基オリゴマーをリン酸化した。次いで、２つのオリゴマーを、リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ）リス−ＨＣｇ、ｐＨ７，６，１０＋ｎＭ　ＭｇＣ（！ｔ−１０ｍＭ　ＤＴＴ）中で等モル量で混合し、８０℃まで５分間加熱し、約１時間で室温まで冷却した。Ｂｇｌ■切断の２．ｇｋｂＤＮＡ約４μｇを二重鎖リンカ−約１ μｇに加え、１５℃にて混合物をＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に約１６時間インキ二べ一トした。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、産生物をＥｃｏＲＩで十分に消化し、リーダー配列およびリンカ−を含有する１３０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。

ｐｔＰＢＭ−１約１０μｓをＡｖａＩ！で消化して、調製１％アガロースゲル電気泳動により、７４７　ｂｐＤ　ＮＡフラグメント（４７１ないし１２１８位）を単離した。該７４７ｂｐＤＮＡフラグメントを次いでＥｅｏＲＩで消化して３３０ｂｐＤＮＡフラグメント（４７１ないし８０１位）を得た。

前節で調製した１３０ｂｐＤＮＡフラグメントおよび３３０ｂｐＤＮＡフラグメント各１μｇを混合し、１５℃にてリガーゼ緩衝液中でＴ４　ＤＮＡリガーゼと共に約１６時間インキュベートした。フエノールでの抽出に続き、エタノールを加えて産生物を沈澱させ、次いでこれをＥｃｏＲＩで消化して４６０ｂｐＤＮＡフラグメントを得た。

このＤＮＡをＥｃｏＲＩ切断のｐｔＪｃ１３に結び、該産生物を用いてコンピテントイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換し、これをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌプレート上で画線培養した。１２の組換体（白色）コロニーを選択し、ミニプラスミド調製用の培地１ｒＯＣ中で増殖させた。ＡｖａＩｌ、Ｎ　ａｒ　１またはＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩでの消化によって該組換体プラスミド中のインサートの存在をチェックした。９つのクローンは、第１図に示す向きの所要のインサートを含有することが判明した。マキサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ　−Ｇ　１ｌ−ｂｅｒｔ）法（メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ。

）、炙５，１４９９（１９８０）による１のクローンの配列決定（２５′ｔ−ｓｅ　ｔＰ　４）により、望まれないＤ　Ｎ　Ａ配列（１８７−４６３位）の正しい欠失が確認された。

５１７位で始まるｔ−ＰＡ遺伝子のその部分についてコード付けし、同時に５１７位にて共通のＮａｒｌ制限部位を生じる、前節で産生したＤＮＡ配列に付は加えるために、ｐｔＰＢＭ−１およびｐ５゛−ｘ−ｓｓ　ｔＰ　４各約５ｕｇをＮａｒｌおよびＢａｍＨＩで消化して各々１３００ｂｐおよび２００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。１５℃にてこれらの２つのＤＮＡフラグメントを一晩結び、次いでＢａｍＨＩで消化して、−１゜−ｔ−ＰＡについてコード付けする全配列を含有する１５００ｂｐＤＮＡフラグメントを単離し、次いでこれをｐ３４１ −３のＢｇ１１１部位に挿入した。得られたプラスミドのＢａｇｉＨ１部位において８　ｋｂＢ　Ｐ　ＶゲノムＤＮＡを挿入して完全なりＶＰ−依存性発現ヘクター（Ｐｔ−ｓｓｔＰ　ＡＭＴ　ＢＰＶ　４Ｑ）を得た。通常の培養、回収、単離および精製技術により、アミノ酸２ないし８９のフィブロネクチンおよび表皮細胞発育因子領域の欠けたプラスミノーゲンアクチベーターｔ−ＰＡを得る。このプラスミノーゲンアクチベーターは成熟ｔ−ＰＡにおいて現れるパン・シネベルトら（ＶａｎＺｏｎｎｅｖｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　）、ロク・シト（Ｉｏｃ、　ｃｉｔ、　）によってＤＮＡ標識ＬＫ　１−２から産生されるものと、少なくとも位置１におけるＳｅｒにより、および成熟蛋白の正しいプロセッシングにおいて役立つものの存在により異なる（Ａ　ｒｇ　−’　−Ｓ　ｅｒ＋　’）。

ｐｔＰＢＭ−１約５μｇを５ｔｙｌで消化して約３．Ｏｋｂおよび１．３５ｋｂの２つのＤＮＡフラグメントを得た。ｔ−ＰＡ遺伝子の５°末端（ｂｐ７２ないし３５０）を含有するより大きいフラグメントを電気溶出によって単離した。このＤＮＡフラグメントをＢａ１３１で５秒間消化して３°末端からｔ−ＰＡのアミノ酸番号５１に対応する約ｂｐ３４２（、、、ＴＧＣ）位までの約８つのｂｐを除去した。Ｂａ１３１での消化から得た混合物を合成により調製した（Ｆ　ｓｐｌ　−ＥｃｏＲｌ　）リンカ−１正しく　ｂｐ３４２．、、、　Ｔ　Ｇ　Ｃ配列に連結すると新しいＦｓｐ１制限部位（、、、Ｔ　ＧＣｇｃａ、、）を生じる５°−ｇｃａｇａａｔｔｅｔｇｃ　−３’に結んだ。ＥｃｏＲＩでのリンカ−付着のＢａ１３１消化産生物の完全な消化により、約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントの混合物を得、これを単離し、ＥｃｏＲＴ切断のｐｔＪｃ１３に挿入し、次いでこれを用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換した。ｔ−ＰＡのアミノ酸４８ないし５１に対応する１２のヌクレオチドおよびリンカ−に対応する９つのヌクレオチドであるＤＮＡとリンカ−との結合部で生成するヌクレオチド配列に相補させるために合成した放射能標識の２１ｍｅｒプローブでのインサイチュ・ハイブリダイゼーションによってこれらの形質転換細胞をスクリーニングした。Ｘ線フィルム上で強いハイブリダイゼーション信号を示す６つのクローンを培養してミニプラスミド調製物を得た。該ＤＮＡをＦｓｐｌで消化し、１．２％アガロースゲル電気泳動に付した。ベクター中のインサートの向きに応じ、１５０ｂｐおよび４５０ｂｐＤＮＡフラグメントの存在によって証明されるごとく、３つのクローンはＦｓｐｌ制限部位の存在を示した。マキサム・ギルバー）　（Ｍ　ａｘａｍ　Ｇ　ｉ　Ｉｂｅｒｔ）法によるヌクレオチド配列決定法により、Ｆｓｐ１部位がｔ−ＰＡのアミノ酸５１に対応する所望の位置にある１のクローン　ｐｉ−５１ｔＰＦｓｐｌが同定された。ＦｓｐｌおよびＥｃｏＲｌでこのプラスミドを消化して、最初の５１のアミノ酸に対応する３００ｂｐＤＮＡフラグメントおよびｔ−ＰＡの完全なリーダー配列を得た。

ｐｔＰＢＭ−１約１０μｓをＡｖａｉｌで消化し、７４７ｂｐＤＮＡフラグメントを調製１％アガロースゲル電気泳動によって単離した。粘着末端をイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）およびｄＮＴＰで満たし、該ＤＮＡをＥｃｏＲｌで消化して約３３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。前節で産生した３００ｂｐＤＮＡフラグメントおよび３３０ｂｐＤＮＡフラグメント各約０゜５μｇを４℃にて一晩でＴ　４　Ｄ　Ｎ　ＡリガーゼおよびＴ４ＲＮＡリガーゼで平滑末端とした。産生物混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、ＥｃｏＲｌで切断して６３０ｂｐＩ）ＮＡフラグメントを得た。該６３０ｂｐＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲ１切断のｐＵｃ１３に挿入し、該プラスミドを用いてコンピテントイー・コ！Ｊ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換した。１８０組換体クローンを選択し、ミニプラスミドＤＮＡ調製用に増殖させた。プラスミドＤＮＡのＥｃｏＲｌ、ＮａｒｌまたはＥｃｏＲｌおよびＢｇｌＩｌでの消化によって所望のクローン、ｐ５”　ＥＧＦ−ＴＰ−１１を同定した。マキサム・ギルバー）（Ｍａｘａｍ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）法による選択クローンのＤ　Ｎ　、Ａ配列決定によって、ＥＧＦドメインの欠失ならびに正しいリーディングフレームの回復が確認された。

プラスミド、ｐ５”　ＥＧＦ−ｔＰ−１１およびｐｔＰＢＭ−１、をＮａｒｌおよびＢａ＋ａＨＩで消化して、各々、３３５ｂｐおよび１３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。該２つのＤＮＡフラグメントの等モル量を結び、次いでＢａｍＨＩで消化して約１６３５ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離し、これをｐＵｃ１３中で増幅して組換体クローン、ＥＧＦｔＰ−ｐＵＣ−２２を得た。このＤＮＡはＥＧＦ−組織プラスミノーゲンアクチベーターについてのコーディング配列を含有する。このＤＮＡ配列のｐ３４１−３、ＢＰＶ−依存性発現ベクター、のＢｇ１ｍ部位への挿入、続いての通常の培養、回収、単離および精製によりアミノ酸５１−９１に対応する表皮細胞成長因子を欠＜　ｔ　−Ｐ　Ａを得る。

実施例３ ΔＥＧＦ−ウロ牛ナーゼｐＵＫＢＭ−１約２０ｕｇをＡｃｃｌおよびＮ　ｃｏ　ｌで消化して２６３ｂｐＤ　Ｎ　Ａフラグメントを得、これをＨｉｎｆ　１で切断した。位置７０ないし１２５ｂｐに対応する５５ｂｐＤＮＡフラグメントを電気泳動によって反応産生物から単離した。

ｐｔＪＫＫＮｄ１６約１０μｇをＮｄｅｌで消化し、５５０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。

２２および２３塩基長の２つの相補オリゴマーを合成し、等量混合して、各々、３°および５゛末端においてＮｄｅｌおよびＨｉｎｆ　１制限部位が両側についた二重鎖オリゴマーを得、喪失アミノ酸についてのヌクレオチド塩基および遺伝子における正しいリーディングフレームを得た。該二重鎖オリゴマーはヌクレオチド配列ニＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ５°−ＡＣＴＣＣＡＡＡ　ＧＧＣＴＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣＴＧＣ↑ＧＧ　ＴＴＴ　ＣＣＧ　ＡＧＴ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＣＧＡＴ−５°　↑Ｈｉｎｆ　Ｉ　Ｎｄｅ　ｌで表される。この二重鎖オリゴマー約１μｇを４℃にてＴ４　ＤＮＡリガーゼで５５０ｂｐＤＮＡフラグメントに１６時間にわたって結んだ。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、産生物をＥｃｏＲｌで消化し、３６０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。

５５ｂｐＤＮＡフラグメントおよび３６０ｂｐＤＮＡフラグメントのほぼ等モル量を一晩結び、産生物をＡｅｃｌおよびＥｃｏＲｌで消化して４１５ｂｐＤＮＡフラグメントを得、これをＥｃｏＲ１−Ａｃｅｌ切断のｐＵｃ１３プラスミドに挿入した。増幅により組換体クローンｐ５１　Δ＋−ａＵＫ　１を得、これを５ａｌｌおよび次いでＮｃｏｌで消化すると１２５ｂｐＤＮＡフラグメントが得られ、これをｐＵＫＢＭ−１をＳ　ａｌ　１　、続いてＮｅｏｌで消化することによって得た１２００ｂｐＤＮＡフラグメントに結んだ。該結んだＤＮＡフラグメントをＳ　ａｌ　１で消化して、ウロキナーゼの表皮細胞成長因子領域についてコード付けするヌクレオチド１３７−２７４を欠＜１３２５ｂｐＤＮＡ配列を単離した。このＤＮＡフラグメントをｐＩＪｃ１３中で増幅して組換体クローンｐ ΔＥＧＦＩＪＫ−１を得た。このＤＮＡのＢＰｖ−依存性発現ベクターのＢｇ１１１部位への挿入、続いての通常の培養、回収、単離および精製により、アミノ酸１ないし４６に対応する表皮細胞成長因子を欠くウロキナーゼを得る。

実施例４ビ（アミノ酸１−４４）、ΔＥＧＦｔ−ＰＡ実施例２　Ｔ得りｐ５’−ΔＥＧＦ　−ＬＰ　−１１約１０μｇをＢｇｌＩｌ”消化してシグナルペプチドおよび（ｔ−ＰＡのフィンガードメインのＮ末端部位に対応する）ｔＰＡの最初のアミノ酸の結合にてＤＮＡを正確に切断した。調製１．０％アガロースゲル上の電気泳動によって３．０ｋｂＤＮＡフラグメントを単離した。細菌アルカリ性ホスファターゼで産生物を脱リン酸化した。

（トリプレットフドン配列の異なる組の組み込みによるルーピング・アウトを防いで、同一のアミノ酸配列についてコード付けするが２つのフィンガーＤＮＡ配列間にかなりの異種構造を生じるように設計した）８つのオリゴマーをポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰで個々にリン酸化し、１５℃にてＴ４ＤＮＡリガーゼで一晩結び、フェノール抽出およびエタノール沈澱によって回収し、Ｂｇｌ ■で完全に消化する第４（ａ）図に示す手順の標準法によって化学的に合成した（第４（ｂ）図に示され、ｔ　−Ｐ　Ａの全フィブロネクチンドメインを表す）１３２ｂｐＤＮＡフラグメントを該３．４ｋｂＤＮＡフラグメントに結んだ。

３．４ｋｂおよび１３２ｂｐＤＮＡフラグメントを等モル雪詰んだ産生物を用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３細胞を形質転換し、これを培養した。１２の白色コロニーからミニプラスミドＤＮＡの調製を行った。該ミニプラスミドＤＮＡのＢｇｌＩ［での消化、続いての１．５％アガロースゲル上での電気泳動およびマキサム・ギルバート（Ｍａｘａ＠Ｇ　１ｌｂｅｒｔ）配列決定法により、正しいインサートサイズおよび配列を有する１のクローン、ｐ５°Ｆ ΔＥＧＦ　−ＬＰ−１を同定した。このプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＴｔ６よびＮａｒｌでの消化により、約４５０ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた。

ｐｔＰＢＭ−１約１０／ｌＺｇをＮｇｙｌおよびＢａｍＨＩで消化し、１．３ｋｂＤ　Ｎ　Ａフラグメントを単離した。

該１　、３　ｋｂ材料および４５０ｂｐＤＮＡフラグメントの約等モル量を結び、ＢａｒｎＨｌで切断して１．７５ｋｂＤＮＡフラグメントを得、これをＢａｍＨＩ消化のｐＴＪｃ１３／イー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　Ｉ　Ｑ３系中で増幅した。該産生物ＤＮＡはビ（アミノ酸１−４４）、シグナル配列を持つΔＥＧＦ−ｔ−ＰＡ完全体についてコード付けした。

かく調製したＤＮＡをＢＰＶ−依存性発現ベクターのＢｇ１１１部位に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製技術により、２つの連続する（ビーアミノ酸１−４４）フィブロネクチンドメインを有するがＥＧＦドメインを有しない表記産生物を得る。

出発物質として欧州特許出願０２１３７９４−Ａ号に開示されているポリタリングルプラスミノーゲンアク・チベーターを用いる正確に同一の手順が、ΔＥＧＦボリクリンゲルプラスミノーゲンアクチベーターの産生に適用できる。出発材料としてｐ４３８からのＨｙｂＡ　ＤＮＡ／イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｔ）ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ６７１７５）を用い、本明細書中で開示した方法によるＥＧＦドメインの欠失により、ΔＥＧＦ−（ＵＫａａ””−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−５ｅｔ−Ａｓｐ）”’−ｔ−ＰＡを得る。同様に、ｐ５０４からのＨｙｂＢ　ＤＮＡ／イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４　（ＡＴＣＣ６７１７４）を用いて、ΔＥ　Ｇ　Ｆ　−”−（Ｕ　Ｋａａ””’　−Ｓ　ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｔ−Ａｓｐ）　９２　ｔ−ＰＡを、およびｐ１１３からのＨｙｂＣＤＮＡ／イー・フリ（Ｅ、ｃｏｌｔ）ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ６７１７６）を用いてΔＥ　Ｇ　Ｆ　−”’−（Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｎ　−Ｓ　ｅｒ−Ａｓｐ−ＩＪＫａａ”−”’）−２６２−ｔ−ＰＡを得る。

同様に、以下の実施例により説明する組換え法によって、アミノ酸５５−６２がＥＧＦドメインから除去されたプラスミノーゲンアクテベーターが調製される。

実施例５ Δ５ｓ−ａｙ　９１−（ＵＫａａ”−”’−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ− ３ｅｒ−Ａｓｐ）　９２　ｔ−ＰＡこの組立てにおいて、８アミノ酸配列、ＨｙｂＢ−ＰＡのａ、　ａ、　５５−６２についてコード付けするＤＮＡ配列を部位定力同化「ループ・アウト」突然変異によって欠失した。これを達成するために、ブル−スクリプト（Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミドｐＢｓＭ１３−（ストラタジーン（Ｓ　ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ヘルパー相Ｒ４０８が存在するか否かに依存して一本鎖または二本鎖形いずれかで得られるＭ１３修飾ベクター（ラッセルら（Ｒｕｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　）１９８５）から該コーディング配列を含有する組換体プラスミドを一本鎖（ｓｓＤＮＡ）形で得た。

ＢａｍＨ１配列を両側に持つＨｙｂＢ−ＰＡ遺伝子をｐＢｓＭ１３−のＢａｍＨ１部位に挿入し、次いでこれを用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３細胞を形質転換した。インサートを含有する白色コロニーをピックアップし、増殖させてプラスミドＤＮＡを単離し、ＢａｇＨｌでの消化によって分析した。１のクローン、ｐＢＳ−４２はＴ７プロモーターと同一の向きのハイブリッドＢ遺伝子を含有し、これは５ｓＤＮＡが（＋）鎖であることを示す。このクローンを６００マノメーターで約０．３の光学密度まで増殖させ、続いて溶菌ファージ諸表千１−５０１９９６　（１６）として細胞を殺しおよび培地中に５ｓＤＮＡベクターを放出するヘルパーファージでそれを感染させることによってこのプラスミドの５ＳＤＮＡ形を得た。次いで該細胞を十分な速さにて５分間でエッペンドルフ（Ｅ　ｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロフニーゲ（ｍｉｅｒｏｆｕｇｅ）に糸状で入れ、［バルダリ、シイおよびセサレニ・シイ（Ｂａｌｄａｒｉ　Ｃ，ａｎｄＣｅｓａｒｅｎｉＧ、）（１９８５）ジーン（Ｇｅｎｅ）、１旦、２７−３２コに記載のごとくに、５ｓＤＮＡを上澄液から単離した。

ａ、　ａ、　５５−６２に対応するＤＮＡ配列をループ・アウトするために（第６図）、以下の（−）のまたは非コーディング鎖（配列３’−ＴＴＴ８１．を有する低級なもの）の３６ｂｐオリゴマーを合成した。

ａ、ａ、　４９　５０　５１　５２　５３　５４　６３　６４　６５　６６　６７　６ｇ迦険簡シ■聾カ透抛鋤山膿加加鎖（＋）５°−ＡＡＡ　ＡＧＴ　丁ＧＣＡＧＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＴＡＣＴＴＣ（−）ｌ’　−ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＴＣＧ　ＣＴＣＧＧＴ　ＧＴＣＧＴＣＣＧＧ　ＧＡＣＡＴＧ　ＡＡＧこのオリゴマー配列は所望の欠失のいずれ側にも１８ｂｐのスパンであって５ｓＤＮＡ　ｐＢＳ− ４２と一緒のアニーリングを容易とする。

該オリゴマー約１１００ｎをＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、６５℃で１０分間加熱し、次いで３０分間で徐々に室潟まで冷却することによって、結び用緩衝液（２５μｇ）中、鋳型５ｓＤＮＡ約１μｇまでアニールした。以下の二合計容量４０μｇ中、１０Ｘ結び用緩衝液４ｕＱ、２．５＋ｎＭ　ｄＮＴＰ（Ｎ＝Ａ、Ｃ，ＧおよびＴ、等量で）２ｕ（１，１０＋ｏＭ　ＡＴＰ４ μｉ２、遺伝子３２蛋白４μＱ１クレノ−Ｐｏ１１２μＱ％Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μＣを添加し、１５℃にて、合成反応（伸長）を６時間行った。合成反応混合物１０μｇを用いてＪＭＩ　０９細胞を形質転換し、これをアンピシリンを含有するＬＢ−寒天プレート上で画線培養した。

ニトロセルロース濾紙上、ハイブリダイゼーションの厳格な条件下で　ａｓｐ− 放射能標識したオリゴプローブ（ループ・アウト反応で用いたに同じ）で複製したコロニーのインサイチュ・ハイブリダイゼーシ嘗ンによって所望のクローンのスクリーニングを行った。

濾紙を低塩（０，２ＸＳＳＣ）中、５５℃にて３回洗浄し、Ｘ線フィルムに暴露した。最高のハイブリダイゼーション信号を呈するコロニーをピックアップし、増殖させてミニプラスミドＤＮＡを調製した。ＨｙｂＢのアミノ酸５５の位置における、プラスミドＤＮＡの５ｔｙｌでの消化によって最初のスクリーニングを行りた。５ｔｙｌ部位の喪失は、所望の欠失配列を有するクローンを選択するための基本的基準として採用した。２つのクローンｐΔ５ｓ−ｓｔＨＹｂＢ　１および−２をマキサム・ギルバー）（ＭａｓａｌＩＩＧｉｌｂｅｒｔ）法によるＤＮＡ配列決定法に付し、所望の欠失を有することが判明した。

実施例１の方法により、ｐΔ５ｓ−ｓ＊　ＨｙｂＢ　−１のＢａｍＨｌでの消化によって得られた２　ｋｂＤ　Ｎ　ＡをＢＰＶ依存性哺乳動物発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製技術により表記プラスミノーゲンアクチベーターを得る。

ｔ−ＰＡから欠失されるべき配列はＨｙｂＢ−ＰＡおよびｔ−ＰＡ双方のＥＧＦドメインに位置するので、正確に同一の試薬および手法を用いてΔ□−＊ｔｔ　ＰＡを組み立てた。いずれの末端においてもＢａｍＨ１配列に接したｔ−ＰＡ遺伝子をまずクローン化してｐＢＳＮ１３−ベクターに入れてｐＢ　Ｓ　ｔ−Ｐ　Ａを得、これを用いて５ｓＤＮＡを得た。ａ、　ａ、　５５−６２に対応するオリゴヌクレオチド配列をループ・アウトするために、実施例５に記載したのと同一のオリゴを用いてＤＮＡの第２（−）鎖をプライマー伸長させ、優れたクローンをスクリーニングした（第７図）。ＤＮＡ配列決定法により、１のクローン、ｐΔ５ｓ−ａｒｔ−Ｐ　Ａは所望の欠失を有することが判明した。

実施例１の方法により、ｐΔｓｇ−ａｒｔ　Ｐ、ＡのＢａｌｌ１Ｈ１での消化によって得たＤＮＡをＢＰＶ依存性哺乳動物発現系に挿入した。通常のＪ４１１．、回収、単離および精製技術により表記プラスミノーゲンアΔ５ｓ−ｓ＊　９１ −［Ａｌａ”’　ｘ２’ｌ−９２−ｔ−ｐ声。

ｐ５°ＨｙｂＦ−５はＡＴＣＣ６７５７０に見い出されるＨｙｂＦ遺伝子のｂｐ７２−８０１　ＤＮＡセグメントを含有する部分的クローンである。この遺伝子において、合成りリンゲル（Ｋ−２本）配列をｔ−ＰＡ遺伝子のｂｐ４６２／４６３（ａ、ａ、　９１／９２）位に挿入した。

８のアミノ酸（ａ、ａ、　５５６２）の欠失はｂｐ３５２−３７５に対応する。

ｐ５’ＨｙｂＦ−５ＤＮＡ約１０μｇをＢａｔａＨｌおよびＥｃｏＯ１０９で消化してに一２＊が挿入されたハイブリ９．ドＦ　ｂｐ３８０−８０１に対応する６７５ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。ｐΔ５ｓ−ｓｔｔ−ＰＡ−７約２０ｔｔｇをまずＢａ自Ｈ１で消化して１　、７　ｋｂおよび２゜６　ｋｂＤ　Ｎ　Ａフラグメントを得た。該１　、７　ｋｂＤ　Ｎ　ＡフラグメントをさらにＥｅｏＯ１０９で消化して２８０ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。２つのＤＮＡフラグメント、６７５ｂｐおよび２８０　ｂｐ、を等モル量で結んだ。フェノール抽出およびメタノール沈澱に続き、反応混合物をＮａｒｌおよびＢａｍＨｌで消化して６６０ｂｐＤＮＡ７ラグメントを単離した。ｐｔＰＢＭ−１約１０μｇｔｅＮａｒｌおよびＢａｇＨｌで切断して１３００ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。２つのフラグメント、６６０ｂｐおよび１３００ｂｐ、を結び、ＢａｍＨｌで切断して１９６０ｂｐ配列を単離した。このＤＮＡｆｃＢａｍＨ１切断のｐＵｃ１３に挿入し、次いでこれを用いてイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｊ　Ｍ１０９細胞を形質転換した。１０組換体クローン、ｐΔ５ｓ−ａｔＨｙｂＦ−１５、は表記化合物に対応する完全な遺伝子を含有することが判明した。

実施例１の方法により、ｐΔ、、、、ＨｙｂＦ　−１５をＢａｍＨｌで消化することによって得た遺伝材料をＢＰＶ依存性哺乳動物発現系に挿入した。通常の培養、回収、単離および精製により小さなプラスミノーゲンアクチベーターを得た。

ｔ　−Ｐ　Ａに比し、本発明のΔＥＧＦおよびＥＧＦ修飾修飾プラスミグンアクチベーターは肝臓膜に対する親和性の顕著な減少を示し、その結果、それらは循環に戻され、ここにそれらは３０分過剰の半減期を示し、それにより閉塞動脈の再疎通用血栓溶解性物質の一定の供給を確実とする。

本発明のΔＥＧＦおよびＥＧＦ修飾修飾プラスミノ−ゲンチクチベータ、ｔ−ＰＡ自体と同様にしておよびそれと同様のデリバリビヒクルを通じて血管の偶発症の治療に用いる。かくして、本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、ポリペプチドをｔ−ＰＡに適用される当該分野で公知の適当な医薬上許容されるビヒクルに溶解または懸濁させることによって医薬組成物に処方できる。血管内注射または注入によるそれを必要とする哺乳動物への投与はすでにｔ−ＰＡそれ自体に関して確立された技術により行うことができる。

約６ないし１２時間での約４４０１　Ｕ／ｋｇ／時間の静脈内−次投与量がｔ− ＰＡを用いる場合の慣行である。

実施例１．２および３で産生したプラスミドは１９８７年１月２１日にメリーランド州２０８５２、ロックビル（Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ）、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｓｒ＋　Ｄｒｉｖｅ）１２３０１．アメリカン・タイプ６カルチヤー０コレクシ１ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、いかに示す受託番号が与ええられた。

１、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ））（Ｂ　１０１におけるｐΔｔ　５ｓｔＰ　ＡＭＴ−ＢＰＶ−４０−ＡＴＣＣ６７２９９２、イー・クリ（Ｅ、　ｅｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　−１０３におけるｐΔＥＧＦｔＰ−ｐＵＣ−２２−ＡＴＣＣ６７３００３、イー・コリ（Ｅ、　ｅｏｌｉ）Ｊ　Ｍ　１０３におけるｐΔＥＧＦＵＫ−１ −ＡＴＣＣ６７３０１実施例５．６および７で産生したプラスミドは１９８７年１２月１８日に同コレクシ曹ン（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、以下の受託番号が与えられた。

５、イー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）ＭＭ　２９４におけるｐΔ１ｓ−ａｔ　９１−（ＵＫａａ％’−”’−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）　９２−ｔ−ＰＡ−ＢＰｖ−１４−ＡＴＣＣ６７５８８６、イー−コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｔ）ＭＭ　２９４におけるｐΔｓｓ−＋ｓｔ　ｔ−ＰＡ−ＢＰＶ１２　−ＡＴＣＣ６７５８９７、イー・コリ（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）ＭＭ　２９４におけるｐΔＳＳ−＠！−９１−［Ａ　１ｍ””−Ｋ　２コー９２−ｔ−ＰＡ−ＢＰＶ−６−ＡＴＣＣ６第１図第１　、Ａ図第３．へ図４　（ａ）Ｂｇ：　Ｉｆ　Ｖ　ＶＩ　ＶＩＥ　Ｖｌｌｌ　８ｇｌｌ１４（ｂ）ｇｌ　１１ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣ（ＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＴＡＴ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ｃａｃ　ＣＭＣＴＣＴＴＣＴＧＧ　ＧＴｖｒ　ＴＡＣＴＡＧ　ＡＴＡ　ＧＴＴ　ＧＴＣＧＴＧ　ＧＴｒＴＣＴ　ＴＧＧ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＣＣＧＴＣＣＴＧ　Ｏ？ｉＣＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＧＡＡＧＡ　ＡＣＣＱＡＧ　ＴＣＣＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＡＣＧＣＧ　ＡＧＴ　ＴｒＡ　ＴＣＴＧＴＣＧＡＧ　ＴＡＣＴＧＴ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　α℃　α℃　α℃ＣＡＧ　ＣＴＣＡＴＧ　ＡＣＡ　ＡＣＣＡＣＡ　ＴＴＡ　ＡＱ％　ＣＣＣＧＣＧ　ＣＧＧ第７図第８図国際調査報告一一一１＾−−−２Ｐ口／ＵＳ　ａａ／ＣＯ２０９国際調査報告じＳ　εε００２０９Ｓ＾　２０７９７

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｎ−末端Ｓｅｒを含有し、ｔ−ＰＡのアミノ酸４４−８９またはウロキナーゼの１−４６に対応する全表皮細胞成長因子領域あるいはｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの表皮細胞成長因子領域に存在するアミノ酸に相同の表皮細胞成長因子領域内の少なくとも１のアミノ酸の配列を欠き、それ以外はそれが由来する成熟ブラスミノーゲンアクチベーターの完全なアミノ酸配列を含有することを特徴とする修飾したブラスミノーゲンアクチベーター。２．Δ２−９９−組織ブラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベータ３．ΔＥＧＦ−組織ブラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。４．Δ５５−６２−組織ブラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。５．ポリフィブロネクチンドメイン−Δ−ＥＧＦ−組織ブラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。６．ΔＥＧＦ−ウロキナーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。７．少なくとも１のクリングルが天然ブラスミノーゲンアクチベーターに相同であるΔＥＧＦ−ポリクリングルハイブリッドブラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。８．　ΔＥＧＦ−（ＵＫａａ１−１３１−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）１−よ９１−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。９．　ΔＥＧＦ−９１−（ＵＫａａ５０−１３１−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）−９２−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。１０．Δ■■−■２−９１−（ＵＫａａ５０−１３１−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ −Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ）−９２−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。１１．ΔＥＧＦ−２６１−（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ −ＵＫａａ５０−１３１）−２６２−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。１２．　Δ■■−■２−２６１−（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇ１ｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ− Ａｓｐ−ＵＫａａ５０−１３１）−２６２−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。１３．Δ■■−■２−９１−［Ａｌａ１８■−Ｋ２〕−９２−ｔ−ＰＡであることを特徴とする請求の範囲第７項記載のブラスミノーゲンアクチベーター。１４．完全なシグナルおよび蛋白ドメインと共に請求の範囲第１−１３項いずれか１つに記載のポリペプチドについてコード付けするヌクレオチド配列を有することを特徴とするＤＮＡユニット。１５．完全なシグナルおよび蛋白ドメインと共に請求の範囲第１−１３項いずれかに１つに載のポリペプチドについてコード付けするヌクレオチド配列を有するＤＮＡユニットを含有することを特徴とする複製可能な発現ベクター。