JPH0578397A - 血栓溶解タンパク質 - Google Patents
血栓溶解タンパク質Info
- Publication number
- JPH0578397A JPH0578397A JP3029624A JP2962491A JPH0578397A JP H0578397 A JPH0578397 A JP H0578397A JP 3029624 A JP3029624 A JP 3029624A JP 2962491 A JP2962491 A JP 2962491A JP H0578397 A JPH0578397 A JP H0578397A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- pcdm8
- encoding
- fragment
- thrombolytic protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】高い血栓特異性を有し、かつ、抗凝固作用を発
揮する新規な血栓溶解タンパク質を提供する。 【構成】本発明の血栓溶解タンパク質は、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子またはその改変体と、トロンボモジ
ュリンの上皮細胞増殖因子様ドメインの一部または全部
とが直接にまたはリンカーを介して結合してなるハイブ
リッド体であり、遺伝子組換え手法により調製される。
揮する新規な血栓溶解タンパク質を提供する。 【構成】本発明の血栓溶解タンパク質は、組織プラスミ
ノーゲン活性化因子またはその改変体と、トロンボモジ
ュリンの上皮細胞増殖因子様ドメインの一部または全部
とが直接にまたはリンカーを介して結合してなるハイブ
リッド体であり、遺伝子組換え手法により調製される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組織プラスミノーゲン
活性化因子（以下、ｔ−ＰＡ）またはその改変体と、ト
ロンボモジュリン（以下、ＴＭ）の上皮細胞増殖因子
（以下、ＥＧＦ）様ドメインの一部または全部とが結合
してなる血栓溶解タンパク質に関する。更に詳しくは、
ＴＭの持つ抗凝固作用を発揮し、かつ、ＴＭを介した高
血栓特異性を有するｔ−ＰＡとしての作用を併せ持つ血
栓溶解タンパク質に関するものである。さらに、臨床に
おいては再閉塞を生じ難く、かつ、副作用を減じる効果
をもたらす、新しい血栓溶解タンパク質に関するもので
ある。
活性化因子（以下、ｔ−ＰＡ）またはその改変体と、ト
ロンボモジュリン（以下、ＴＭ）の上皮細胞増殖因子
（以下、ＥＧＦ）様ドメインの一部または全部とが結合
してなる血栓溶解タンパク質に関する。更に詳しくは、
ＴＭの持つ抗凝固作用を発揮し、かつ、ＴＭを介した高
血栓特異性を有するｔ−ＰＡとしての作用を併せ持つ血
栓溶解タンパク質に関するものである。さらに、臨床に
おいては再閉塞を生じ難く、かつ、副作用を減じる効果
をもたらす、新しい血栓溶解タンパク質に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】ｔ−ＰＡは、血漿中に存在する不活性型
酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解すること
によって活性型酵素であるプラスミンに変換する。プラ
スミンは血管内に種々の原因によって生じたフィブリン
塊（血栓）を分解する（下記文献１）参照）。 １) 欧州特許出願公開 No．0041766 A2
酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解すること
によって活性型酵素であるプラスミンに変換する。プラ
スミンは血管内に種々の原因によって生じたフィブリン
塊（血栓）を分解する（下記文献１）参照）。 １) 欧州特許出願公開 No．0041766 A2
【０００３】ｔ−ＰＡは他の血栓溶解剤に比べてフィブ
リン親和性が高く、特異的にフィブリン、ひいては血栓
を溶解するものとして注目されていた。しかしながら、
実際臨床に用いられた場合、閉塞冠動脈の再開通には予
想されていたよりもはるかに多量の投与量（患者あたり
１００〜１５０ｍｇ）が必要であることが明らかになっ
た（下記文献２））。このため、ｔ−ＰＡの血栓特異性
の効果が薄れ、結局全身性の出血傾向が生じてしまうと
いった問題が指摘されている。そこで、より高い血栓特
異性の付与を目的とした改変ｔ−ＰＡや他のタンパクと
のハイブリッド体の作製も行われている（下記文献３）
〜５））。 ２）ザ ティ アイ エム アイ スタディ グルー
プ，エヌ．イングル．ジェー．メド．３２０ ６１８−
６２７（１９８９） （Ｔｈｅ ＴＩＭＩ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ，Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０ ６１８−６２７（１９８
９）） ３）欧州特許出願公開Ｎｏ．２９２３２６ ４）特開平１−８５０７８号公報 ５）欧州特許出願公開Ｎｏ．３５０６９２
リン親和性が高く、特異的にフィブリン、ひいては血栓
を溶解するものとして注目されていた。しかしながら、
実際臨床に用いられた場合、閉塞冠動脈の再開通には予
想されていたよりもはるかに多量の投与量（患者あたり
１００〜１５０ｍｇ）が必要であることが明らかになっ
た（下記文献２））。このため、ｔ−ＰＡの血栓特異性
の効果が薄れ、結局全身性の出血傾向が生じてしまうと
いった問題が指摘されている。そこで、より高い血栓特
異性の付与を目的とした改変ｔ−ＰＡや他のタンパクと
のハイブリッド体の作製も行われている（下記文献３）
〜５））。 ２）ザ ティ アイ エム アイ スタディ グルー
プ，エヌ．イングル．ジェー．メド．３２０ ６１８−
６２７（１９８９） （Ｔｈｅ ＴＩＭＩ ｓｔｕｄｙ ｇｒｏｕｐ，Ｎ．Ｅ
ｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０ ６１８−６２７（１９８
９）） ３）欧州特許出願公開Ｎｏ．２９２３２６ ４）特開平１−８５０７８号公報 ５）欧州特許出願公開Ｎｏ．３５０６９２
【０００４】また、ｔ−ＰＡの問題点として、再閉塞が
挙げられる。血栓溶解療法で再開通に成功しても高度狭
窄が残っている場合、急性再閉塞をきたすことが多い
（下記文献６））。特にｔ−ＰＡの場合、Ｇｏｌｄらの
報告によると急性期に４５％と高率に再閉塞をきたし
（下記文献７））、その他の報告でも１８〜３０％の再
閉塞をきたすと報告されている（下記文献８）、
９））。 ６）ディ．ジー．ハリソン エトアル．，サーキュレー
ション ６９ ９９１（１９８４） （Ｄ．Ｇ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ ６９ ９９１ （１９８４）） ７）エイチ．ケイ．ゴールド エトアル．，サーキュレ
ーション ７３ ３４７（１９８６） （Ｈ．Ｋ．Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ ７３ ３４７ （１９８６）） ８）ジェー．エイチ．チェセブロ エトアル．，サーキ
ュレーション ７６１４２ （１９８７） （Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ ７６ １４２ （１９８７）） ９）木全心一 脈管学 ２９ ４９７ （１９８９）
挙げられる。血栓溶解療法で再開通に成功しても高度狭
窄が残っている場合、急性再閉塞をきたすことが多い
（下記文献６））。特にｔ−ＰＡの場合、Ｇｏｌｄらの
報告によると急性期に４５％と高率に再閉塞をきたし
（下記文献７））、その他の報告でも１８〜３０％の再
閉塞をきたすと報告されている（下記文献８）、
９））。 ６）ディ．ジー．ハリソン エトアル．，サーキュレー
ション ６９ ９９１（１９８４） （Ｄ．Ｇ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ ６９ ９９１ （１９８４）） ７）エイチ．ケイ．ゴールド エトアル．，サーキュレ
ーション ７３ ３４７（１９８６） （Ｈ．Ｋ．Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔ
ｉｏｎ ７３ ３４７ （１９８６）） ８）ジェー．エイチ．チェセブロ エトアル．，サーキ
ュレーション ７６１４２ （１９８７） （Ｊ．Ｈ．Ｃｈｅｓｅｂｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ
ｕｌａｔｉｏｎ ７６ １４２ （１９８７）） ９）木全心一 脈管学 ２９ ４９７ （１９８９）
【０００５】一方、ＴＭは血管内皮細胞上に存在する糖
蛋白で、血中に生じたトロンビンと非常に高い親和性で
結合し、複合体を形成する。ＴＭはトロンビンと結合す
ると、トロンビンの持つ血液凝固作用（フィブリン形成
触媒、血液凝固第Ｖ因子の活性化および血小板の活性
化）を抑制する。さらに、この複合体はビタミンＫ依存
性のタンパク質であるプロテインＣを抗凝固酵素（活性
化プロテインＣ）に変換する速度を少なくとも１０００
倍に増大する。すなわち、ＴＭはトロンビンを血液凝固
酵素から抗凝固酵素へ変換させる作用を有する。
蛋白で、血中に生じたトロンビンと非常に高い親和性で
結合し、複合体を形成する。ＴＭはトロンビンと結合す
ると、トロンビンの持つ血液凝固作用（フィブリン形成
触媒、血液凝固第Ｖ因子の活性化および血小板の活性
化）を抑制する。さらに、この複合体はビタミンＫ依存
性のタンパク質であるプロテインＣを抗凝固酵素（活性
化プロテインＣ）に変換する速度を少なくとも１０００
倍に増大する。すなわち、ＴＭはトロンビンを血液凝固
酵素から抗凝固酵素へ変換させる作用を有する。
【０００６】ＴＭは最初にＣ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎらにより
同定された（下記文献１０））。ＴＭはウサギの肺（下
記文献１１））、ウシの肺（下記文献１２））やヒトの
胎盤（下記文献１３））から単離および精製されてい
る。ヒトのＴＭのｃＤＮＡが報告されており、ＴＭの化
学構造図が提供されている（下記文献１４）の第１８９
３頁）。ＴＭ分子は５つのドメインからなり、アミノ末
端より疎水性領域、システインに富む領域、潜在的Ｏ−
グリコシレーション部位を有する配列に富む領域、疎水
性膜通過領域、および細胞質ゾルの尾部から構成されて
いる。
同定された（下記文献１０））。ＴＭはウサギの肺（下
記文献１１））、ウシの肺（下記文献１２））やヒトの
胎盤（下記文献１３））から単離および精製されてい
る。ヒトのＴＭのｃＤＮＡが報告されており、ＴＭの化
学構造図が提供されている（下記文献１４）の第１８９
３頁）。ＴＭ分子は５つのドメインからなり、アミノ末
端より疎水性領域、システインに富む領域、潜在的Ｏ−
グリコシレーション部位を有する配列に富む領域、疎水
性膜通過領域、および細胞質ゾルの尾部から構成されて
いる。
【０００７】このうち、システインに富む領域は、ＥＧ
Ｆの前駆体と類似の６つの繰り返し構造（以下、アミノ
末端側からＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６と呼ぶ
ことにする）を有することが示されおり、ＥＧＦ様ドメ
インと呼ばれている。天然のヒトＴＭのＥ１〜Ｅ６に相
当するアミノ酸配列としては、例えば文献１４）の第１
８９４頁のFig ５に開示されているように、天然のＴＭ
の２２７位から４６２位に相当するアミノ酸配列（Ｅ１
＝２２７〜２６２位、Ｅ２＝２６３〜３０４位、Ｅ３＝
３０５〜３４４位、Ｅ４＝３４５〜３８６位、Ｅ５＝３
８７〜４２１位、Ｅ６＝４２２〜４６２位）が挙げられ
る。ＴＭの機能部位については、ＥＧＦ様ドメインのう
ちＥ２〜Ｅ６がトロンビンと結合する能力を有し、プロ
テインＣ活性化を有意に増大することが報告されており
（下記文献１５）、１６））、また、ヒト由来の組換え
ＴＭを使った実験ではＥ４〜Ｅ６（以下、Ｅ４５６）に
トロンビンと結合し、プロテインＣ活性化を有意に増大
する機能が存在することが報告されている（下記文献１
７）、１８））。このＥ４５６を含むヒト由来の組換え
ＴＭをＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）治療薬として
開発する研究も試みられている。
Ｆの前駆体と類似の６つの繰り返し構造（以下、アミノ
末端側からＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６と呼ぶ
ことにする）を有することが示されおり、ＥＧＦ様ドメ
インと呼ばれている。天然のヒトＴＭのＥ１〜Ｅ６に相
当するアミノ酸配列としては、例えば文献１４）の第１
８９４頁のFig ５に開示されているように、天然のＴＭ
の２２７位から４６２位に相当するアミノ酸配列（Ｅ１
＝２２７〜２６２位、Ｅ２＝２６３〜３０４位、Ｅ３＝
３０５〜３４４位、Ｅ４＝３４５〜３８６位、Ｅ５＝３
８７〜４２１位、Ｅ６＝４２２〜４６２位）が挙げられ
る。ＴＭの機能部位については、ＥＧＦ様ドメインのう
ちＥ２〜Ｅ６がトロンビンと結合する能力を有し、プロ
テインＣ活性化を有意に増大することが報告されており
（下記文献１５）、１６））、また、ヒト由来の組換え
ＴＭを使った実験ではＥ４〜Ｅ６（以下、Ｅ４５６）に
トロンビンと結合し、プロテインＣ活性化を有意に増大
する機能が存在することが報告されている（下記文献１
７）、１８））。このＥ４５６を含むヒト由来の組換え
ＴＭをＤＩＣ（播種性血管内凝固症候群）治療薬として
開発する研究も試みられている。
【０００８】１０）シー．ティー．エスモン エトア
ル．，プロシ．ナショル．アカド．サイ．ユーエスエ
ー．７８ ２２４９−２２５２（１９８１） （Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８ ２２４９
−２２５２（１９８１）） １１）エヌ．エル．エスモン エトアル．，ジェー．バ
イオル．ケミストリー２６１ ８ ５９−８６４
（１９８２） （Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６１ ８ ５９−８６４ （１
９８２）） １２）エイチ．ヴィ．ヤクボウスキー エトアル．，ジ
ェー．バイオル．ケミストリー ２６１ ３８７６−３
８８２ （１９８６） （Ｈ．Ｖ．Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６１．３８７６−３
８８２ （１９８６）） １３）エイチ．エイチ．サレム エトアル．，ジェー．
バイオル．ケミストリー２５９ １２２４６−１２２５
１ （１９８４） （Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９ １２２４６−１２２５１
（１９８４）） １４）ケイ．スズキ エトアル．，エンボ．ジェー．６
１８９１−１８９７（１９８７） （Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６
１８９１−１８９７ （１９８７）） １５）シー．ティー．エスモン エトアル．，ジェー．
バイオル．ケミストリー６ ３３５２−３３５６ （１
９８９） （Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６ ３３５２−３３５６ （１９８
９）） １６）特開平２−１９３９９ 号公報 １７）エム．ズシ エトアル．，ジェー．バイオル．ケ
ミストリー ２６４１０３５１−１０３５３ （１９８
９） Ｍ．Ｚｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２６４ １０３５１−１０３５３ （１
９８９）） １８）特開平２−２５５６９９ 号公報
ル．，プロシ．ナショル．アカド．サイ．ユーエスエ
ー．７８ ２２４９−２２５２（１９８１） （Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８ ２２４９
−２２５２（１９８１）） １１）エヌ．エル．エスモン エトアル．，ジェー．バ
イオル．ケミストリー２６１ ８ ５９−８６４
（１９８２） （Ｎ．Ｌ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６１ ８ ５９−８６４ （１
９８２）） １２）エイチ．ヴィ．ヤクボウスキー エトアル．，ジ
ェー．バイオル．ケミストリー ２６１ ３８７６−３
８８２ （１９８６） （Ｈ．Ｖ．Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６１．３８７６−３
８８２ （１９８６）） １３）エイチ．エイチ．サレム エトアル．，ジェー．
バイオル．ケミストリー２５９ １２２４６−１２２５
１ （１９８４） （Ｈ．Ｈ．Ｓａｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９ １２２４６−１２２５１
（１９８４）） １４）ケイ．スズキ エトアル．，エンボ．ジェー．６
１８９１−１８９７（１９８７） （Ｋ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．６
１８９１−１８９７ （１９８７）） １５）シー．ティー．エスモン エトアル．，ジェー．
バイオル．ケミストリー６ ３３５２−３３５６ （１
９８９） （Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６ ３３５２−３３５６ （１９８
９）） １６）特開平２−１９３９９ 号公報 １７）エム．ズシ エトアル．，ジェー．バイオル．ケ
ミストリー ２６４１０３５１−１０３５３ （１９８
９） Ｍ．Ｚｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２６４ １０３５１−１０３５３ （１
９８９）） １８）特開平２−２５５６９９ 号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このように、高い血栓
特異性を有し、かつ、抗凝固作用を発揮する新規な血栓
溶解タンパク質の開発が当業界で望まれているが、未だ
満足できるものは得られていないのが実情である。従っ
て、本発明の目的は、ＴＭのトロンビンに対する高い親
和性を介して血栓局所に存在するトロンビンに近づき、
そこでｔ−ＰＡの血栓溶解作用を発揮（血栓特異的な溶
解）するとともに、トロンビンが触媒する、フィブリン
形成、血液凝固第Ｖ因子の活性化および血小板の活性化
等の血液凝固反応を遮断し、さらに、ＴＭとトロンビン
の複合体がプロテインＣの活性化を増大させ抗凝固反応
を促進させる血栓溶解タンパク質を提供することにあ
る。さらには、血栓症治療において、血栓特異的な溶解
作用による副作用、すなわち、全身性出血を減じ、血栓
溶解後に生じるトロンビンの活性の遮断並びにプロテイ
ンＣ活性化増大に伴う抗凝固作用発揮による再閉塞を防
止する血栓症治療剤を提供することにある。
特異性を有し、かつ、抗凝固作用を発揮する新規な血栓
溶解タンパク質の開発が当業界で望まれているが、未だ
満足できるものは得られていないのが実情である。従っ
て、本発明の目的は、ＴＭのトロンビンに対する高い親
和性を介して血栓局所に存在するトロンビンに近づき、
そこでｔ−ＰＡの血栓溶解作用を発揮（血栓特異的な溶
解）するとともに、トロンビンが触媒する、フィブリン
形成、血液凝固第Ｖ因子の活性化および血小板の活性化
等の血液凝固反応を遮断し、さらに、ＴＭとトロンビン
の複合体がプロテインＣの活性化を増大させ抗凝固反応
を促進させる血栓溶解タンパク質を提供することにあ
る。さらには、血栓症治療において、血栓特異的な溶解
作用による副作用、すなわち、全身性出血を減じ、血栓
溶解後に生じるトロンビンの活性の遮断並びにプロテイ
ンＣ活性化増大に伴う抗凝固作用発揮による再閉塞を防
止する血栓症治療剤を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成するに
到った。即ち、本発明の要旨は、（１）ｔ−ＰＡまたは
その改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部または全
部とが結合してなる血栓溶解タンパク質、（２）前記
（１）記載の血栓溶解タンパク質をコードしている塩基
配列を含有するＤＮＡ、（３）形質転換された原核性生
物細胞または真核性生物細胞中において、前記（２）記
載のＤＮＡを発現させ得る組換え発現ベクター、（４）
前記（３）記載の組換え発現ベクターで形質転換された
原核性生物細胞または真核性生物細胞、並びに（５）前
記（１）記載の血栓溶解タンパク質を有効成分として含
有することを特徴とする血栓症治療剤に関する。
解決するために鋭意検討した結果、本発明を完成するに
到った。即ち、本発明の要旨は、（１）ｔ−ＰＡまたは
その改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部または全
部とが結合してなる血栓溶解タンパク質、（２）前記
（１）記載の血栓溶解タンパク質をコードしている塩基
配列を含有するＤＮＡ、（３）形質転換された原核性生
物細胞または真核性生物細胞中において、前記（２）記
載のＤＮＡを発現させ得る組換え発現ベクター、（４）
前記（３）記載の組換え発現ベクターで形質転換された
原核性生物細胞または真核性生物細胞、並びに（５）前
記（１）記載の血栓溶解タンパク質を有効成分として含
有することを特徴とする血栓症治療剤に関する。
【００１１】本発明において、ｔ−ＰＡはヒト由来のも
のであれば遺伝子源に特に制限されることはなく、例え
ばボーズ・メラノーマ、子宮、ヒトＴ細胞由来樹立化細
胞、ヒト胎児肺細胞等いずれの由来のものであってもよ
い。また、本発明においてｔ−ＰＡの改変体とは、天然
ｔ−ＰＡより蛋白工学の手法によって製造され得るもの
であって、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し得る
性質を有するものをいう。例えば、ｔ−ＰＡの５つのド
メイン構造のうち、クリングル２（Ｋ２）と活性ドメイ
ン（Ａ）からなる変異体（Ｋ２Ａ）、あるいはクリング
ル１（Ｋ１）、クリングル２（Ｋ２）と活性ドメイン
（Ａ）からなる変異体（Ｋ１Ｋ２Ａ）等の欠失型変異体
が挙げられる。
のであれば遺伝子源に特に制限されることはなく、例え
ばボーズ・メラノーマ、子宮、ヒトＴ細胞由来樹立化細
胞、ヒト胎児肺細胞等いずれの由来のものであってもよ
い。また、本発明においてｔ−ＰＡの改変体とは、天然
ｔ−ＰＡより蛋白工学の手法によって製造され得るもの
であって、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し得る
性質を有するものをいう。例えば、ｔ−ＰＡの５つのド
メイン構造のうち、クリングル２（Ｋ２）と活性ドメイ
ン（Ａ）からなる変異体（Ｋ２Ａ）、あるいはクリング
ル１（Ｋ１）、クリングル２（Ｋ２）と活性ドメイン
（Ａ）からなる変異体（Ｋ１Ｋ２Ａ）等の欠失型変異体
が挙げられる。
【００１２】本発明において、ＴＭのＥＧＦ様ドメイン
の一部とは、ＴＭがヒト由来のものであれば遺伝子源に
特に制限されることはなく、例えば胎盤の合胞体栄養細
胞、ヒト胎児肺細胞、リンパ管の内腔等いずれの由来の
ものであってもよい。そのようなＴＭに存在するＥＧＦ
様ドメイン（Ｅ１〜Ｅ６）中の、例えばＥ４５６やＥ４
５６を含んだものが挙げられる。また、ＥＧＦ様ドメイ
ンの全部とはＥ１〜Ｅ６をいう。
の一部とは、ＴＭがヒト由来のものであれば遺伝子源に
特に制限されることはなく、例えば胎盤の合胞体栄養細
胞、ヒト胎児肺細胞、リンパ管の内腔等いずれの由来の
ものであってもよい。そのようなＴＭに存在するＥＧＦ
様ドメイン（Ｅ１〜Ｅ６）中の、例えばＥ４５６やＥ４
５６を含んだものが挙げられる。また、ＥＧＦ様ドメイ
ンの全部とはＥ１〜Ｅ６をいう。
【００１３】本発明の血栓溶解タンパク質は、ｔ−ＰＡ
またはその改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部ま
たは全部とが結合してなる血栓溶解タンパク質である
が、具体的にはＴＭのＥ４５６に相当するアミノ酸配列
がＫ２Ａに相当するアミノ酸配列と、あるいはＴＭのＥ
４５６に相当するアミノ酸配列がＫ１Ｋ２Ａに相当する
アミノ酸配列と結合してハイブリッド体をなしているも
のが例示される。結合の態様としては、両者が直接に結
合していてもよく、あるいは１つ又は複数個のアミノ酸
を有するリンカーを介して結合させていてもよい。リン
カーとしては、本発明の血栓溶解タンパク質の作用に影
響を与えないかぎり特に制限はないが、通常アミノ酸が
１〜２０個からなるペブチドが用いられ、例えば３個あ
るいは５個のグリシンからなるものが例示される。
またはその改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部ま
たは全部とが結合してなる血栓溶解タンパク質である
が、具体的にはＴＭのＥ４５６に相当するアミノ酸配列
がＫ２Ａに相当するアミノ酸配列と、あるいはＴＭのＥ
４５６に相当するアミノ酸配列がＫ１Ｋ２Ａに相当する
アミノ酸配列と結合してハイブリッド体をなしているも
のが例示される。結合の態様としては、両者が直接に結
合していてもよく、あるいは１つ又は複数個のアミノ酸
を有するリンカーを介して結合させていてもよい。リン
カーとしては、本発明の血栓溶解タンパク質の作用に影
響を与えないかぎり特に制限はないが、通常アミノ酸が
１〜２０個からなるペブチドが用いられ、例えば３個あ
るいは５個のグリシンからなるものが例示される。
【００１４】本発明でいう、ｔ−ＰＡのＫ２Ａに相当す
るアミノ酸配列とは、例えば、天然のｔ−ＰＡの１７６
位から５２７位に相当するアミノ酸配列を含有するアミ
ノ酸配列が挙げられる。さらに、自然の変異によりまた
は人工的変異によりｔ−ＰＡのＫ２Ａの有する主たる活
性に変化を与えることなく、アミノ酸配列の一部を変異
させたアミノ酸配列から成ってもよい。本発明でいう、
ｔ−ＰＡのＫ１Ｋ２Ａに相当するアミノ酸配列とは、例
えば、天然のｔ−ＰＡの８７位から５２７位に相当する
アミノ酸配列を含有するアミノ酸配列が挙げられる。さ
らに、自然の変異によりまたは人工的変異によりｔ−Ｐ
ＡのＫ１Ｋ２Ａの有する主たる活性に変化を与えること
なく、アミノ酸配列の一部を変異させたアミノ酸配列か
ら成ってもよい。
るアミノ酸配列とは、例えば、天然のｔ−ＰＡの１７６
位から５２７位に相当するアミノ酸配列を含有するアミ
ノ酸配列が挙げられる。さらに、自然の変異によりまた
は人工的変異によりｔ−ＰＡのＫ２Ａの有する主たる活
性に変化を与えることなく、アミノ酸配列の一部を変異
させたアミノ酸配列から成ってもよい。本発明でいう、
ｔ−ＰＡのＫ１Ｋ２Ａに相当するアミノ酸配列とは、例
えば、天然のｔ−ＰＡの８７位から５２７位に相当する
アミノ酸配列を含有するアミノ酸配列が挙げられる。さ
らに、自然の変異によりまたは人工的変異によりｔ−Ｐ
ＡのＫ１Ｋ２Ａの有する主たる活性に変化を与えること
なく、アミノ酸配列の一部を変異させたアミノ酸配列か
ら成ってもよい。
【００１５】本発明でいう、ＴＭのＥ４５６に相当する
アミノ酸配列とは、例えば、天然のＴＭの３４５位から
４６２位に相当するアミノ酸配列を含有するアミノ酸配
列（配列番号１）が挙げられる。さらに、自然の変異に
よりまたは人工的変異によりＴＭのＥ４５６の有する主
たる活性に変化を与えることなく、アミノ酸配列の一部
を変異させたアミノ酸配列から成ってもよい。
アミノ酸配列とは、例えば、天然のＴＭの３４５位から
４６２位に相当するアミノ酸配列を含有するアミノ酸配
列（配列番号１）が挙げられる。さらに、自然の変異に
よりまたは人工的変異によりＴＭのＥ４５６の有する主
たる活性に変化を与えることなく、アミノ酸配列の一部
を変異させたアミノ酸配列から成ってもよい。
【化１】
【００１６】本発明の血栓溶解タンパク質の調製は、例
えば、ｔ−ＰＡの欠失型変異体をコードするｃＤＮＡ領
域のシグナル配列とそれに続く配列の間にＴＭのＥ４５
６のアミノ酸配列をコードするあるいはそれらの類似配
列をコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、あるいは合成オリゴ
ヌクレオチドを挿入することにより行うことができる。
該遺伝子は、ＰＣＲ法（後述）により増幅して得てもよ
い。ｔ−ＰＡの欠失型変異体はｔ−ＰＡをコードするｃ
ＤＮＡ領域の一部を、欠失型変異体をコードする塩基配
列を有する合成オリゴヌクレオチド又はインビトロ鎖延
長反応で得たＤＮＡ断片と置き換えることにより調製で
きる。
えば、ｔ−ＰＡの欠失型変異体をコードするｃＤＮＡ領
域のシグナル配列とそれに続く配列の間にＴＭのＥ４５
６のアミノ酸配列をコードするあるいはそれらの類似配
列をコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、あるいは合成オリゴ
ヌクレオチドを挿入することにより行うことができる。
該遺伝子は、ＰＣＲ法（後述）により増幅して得てもよ
い。ｔ−ＰＡの欠失型変異体はｔ−ＰＡをコードするｃ
ＤＮＡ領域の一部を、欠失型変異体をコードする塩基配
列を有する合成オリゴヌクレオチド又はインビトロ鎖延
長反応で得たＤＮＡ断片と置き換えることにより調製で
きる。
【００１７】さらに、ＴＭとｔ−ＰＡの配列の間にリン
カーを介して結合させた血栓溶解タンパク質の調製は、
ＴＭをコードする遺伝子とｔ−ＰＡをコードする遺伝子
の配列の間に合成オリゴヌクレオチドを挿入することに
より行うことができる。これらのハイブリッド体をコー
ドするｃＤＮＡは、適当なプラスミド又は発現ベクター
と連結することにより宿主内で増幅させる等、本発明の
最終目的物質の発現及び生産のために利用される。ま
た、宿主としては大腸菌等の原核性生物細胞及び動物細
胞、酵母等の真核性生物細胞のいずれも用いることがで
きる。本発明の血栓溶解タンパク質を生産するために必
要なｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、下記文献１９）
〜３０) に記載の手法を用いて容易に取得することがで
きる。
カーを介して結合させた血栓溶解タンパク質の調製は、
ＴＭをコードする遺伝子とｔ−ＰＡをコードする遺伝子
の配列の間に合成オリゴヌクレオチドを挿入することに
より行うことができる。これらのハイブリッド体をコー
ドするｃＤＮＡは、適当なプラスミド又は発現ベクター
と連結することにより宿主内で増幅させる等、本発明の
最終目的物質の発現及び生産のために利用される。ま
た、宿主としては大腸菌等の原核性生物細胞及び動物細
胞、酵母等の真核性生物細胞のいずれも用いることがで
きる。本発明の血栓溶解タンパク質を生産するために必
要なｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、下記文献１９）
〜３０) に記載の手法を用いて容易に取得することがで
きる。
【００１８】１９）欧州特許出願公開 Ｎｏ．００９３
６１９ Ａ１ ２０）ペニカ エトアル．，ネイチャー３０１ ２１４
−２２１（１９８３）（Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０１ ２１４−２２１（１９８
４）） ２１）国際公開 Ｎｏ．８７０３９０６ ２２）欧州特許出願公開 Ｎｏ．２３３０１３ ２３）特開昭６１−２３３６３０ 号公報 ２４）特開昭６２−４８３７８ 号公報 ２５) 特開昭６２−１３０６９０ 号公報 ２６）特開昭６２−１９２３２３ 号公報 ２７）特開昭６２−２６９６８８ 号公報 ２８）特開昭６２−２７２９７６ 号公報 ２９）特開昭６３−１３３９８８ 号公報 ３０）特開昭６３−２３００８３ 号公報
６１９ Ａ１ ２０）ペニカ エトアル．，ネイチャー３０１ ２１４
−２２１（１９８３）（Ｐｅｎｎｉｃａ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０１ ２１４−２２１（１９８
４）） ２１）国際公開 Ｎｏ．８７０３９０６ ２２）欧州特許出願公開 Ｎｏ．２３３０１３ ２３）特開昭６１−２３３６３０ 号公報 ２４）特開昭６２−４８３７８ 号公報 ２５) 特開昭６２−１３０６９０ 号公報 ２６）特開昭６２−１９２３２３ 号公報 ２７）特開昭６２−２６９６８８ 号公報 ２８）特開昭６２−２７２９７６ 号公報 ２９）特開昭６３−１３３９８８ 号公報 ３０）特開昭６３−２３００８３ 号公報
【００１９】本発明の血栓溶解タンパク質をコードする
ｃＤＮＡの調製のために必要な手法の一つとして、ゾラ
ー及びスミス（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ）あるい
はクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等による部位特異的突然変
異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）が挙げられる( 下記文献３１) 、３２）参
照) 。これにより、例えば、ｔ−ＰＡ欠失型変異体のｃ
ＤＮＡの任意の位置に任意の制限酵素切断サイトを導入
することができる。即ち、例えば、ｔ−ＰＡ欠失型変異
体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをＭ１３系のフ
ァージベクターに組み込み、その結果得られる二本鎖形
Ｍ１３ＤＮＡで形質転換した大腸菌の培養液から一本鎖
形Ｍ１３ＤＮＡを調製し、これに任意の制限酵素切断サ
イトを有する変異誘発用の合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしてアニーリング後相補鎖合成反応を行い変
異を誘発させればよい。このような、部位特異的突然変
異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）システムとして、例えば、宝酒造株式会社の
Ｍｕｔａｎ−ＧあるいはＭｕｔａｎ−Ｋを用いて行えば
よい。
ｃＤＮＡの調製のために必要な手法の一つとして、ゾラ
ー及びスミス（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ）あるい
はクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）等による部位特異的突然変
異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）が挙げられる( 下記文献３１) 、３２）参
照) 。これにより、例えば、ｔ−ＰＡ欠失型変異体のｃ
ＤＮＡの任意の位置に任意の制限酵素切断サイトを導入
することができる。即ち、例えば、ｔ−ＰＡ欠失型変異
体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡをＭ１３系のフ
ァージベクターに組み込み、その結果得られる二本鎖形
Ｍ１３ＤＮＡで形質転換した大腸菌の培養液から一本鎖
形Ｍ１３ＤＮＡを調製し、これに任意の制限酵素切断サ
イトを有する変異誘発用の合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとしてアニーリング後相補鎖合成反応を行い変
異を誘発させればよい。このような、部位特異的突然変
異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）システムとして、例えば、宝酒造株式会社の
Ｍｕｔａｎ−ＧあるいはＭｕｔａｎ−Ｋを用いて行えば
よい。
【００２０】３１) エム. ジェー. ゾラー エトア
ル．，メソッズ イン エンザイモロジー １００ ４
６８ （１９８３） （Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００ ４６８ （１
９８３）） ３２）ティー．エー．クンケル エトアル．，メソッズ
イン エンザイモロジー １５４ ３６７ （１９８
７） （Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４ ３６７
（１９８７））
ル．，メソッズ イン エンザイモロジー １００ ４
６８ （１９８３） （Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００ ４６８ （１
９８３）） ３２）ティー．エー．クンケル エトアル．，メソッズ
イン エンザイモロジー １５４ ３６７ （１９８
７） （Ｔ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４ ３６７
（１９８７））
【００２１】遺伝子の増幅の方法としてポリメラーゼ・
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が挙げられる（下
記文献３３））。即ち、遺伝子あるいはｃＤＮＡを鋳型
として、２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
してＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ法によりＤＮＡ
増幅装置を用いてインビトロで遺伝子を増幅すればよ
い。 ３３）エイチ．エー．エルリッヒ エトアル．，ピーシ
ーアール テクノロジー（１９９０） （Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０））
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が挙げられる（下
記文献３３））。即ち、遺伝子あるいはｃＤＮＡを鋳型
として、２種の合成オリゴヌクレオチドをプライマーと
してＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ法によりＤＮＡ
増幅装置を用いてインビトロで遺伝子を増幅すればよ
い。 ３３）エイチ．エー．エルリッヒ エトアル．，ピーシ
ーアール テクノロジー（１９９０） （Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０））
【００２２】オリゴヌクレオチドのホスホアミダイト法
による合成は、下記文献３４) に示される原理によるア
プライドバイオシステムズ社のモデル３８１ＡＤＮＡシ
ンセサイザーを用いて行えばよい。また、精製は同社の
オリゴヌクレオチド精製用ＯＰＣカートリッジを用いて
行えばよい。 ３４) エス．エル. ビューケージ エトアル．，テトラ
ヘドロン レターズ−２２（２０） １８５９ （１９
８１） （Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ −２２（２０） １
８５９ （１９８１））
による合成は、下記文献３４) に示される原理によるア
プライドバイオシステムズ社のモデル３８１ＡＤＮＡシ
ンセサイザーを用いて行えばよい。また、精製は同社の
オリゴヌクレオチド精製用ＯＰＣカートリッジを用いて
行えばよい。 ３４) エス．エル. ビューケージ エトアル．，テトラ
ヘドロン レターズ−２２（２０） １８５９ （１９
８１） （Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ −２２（２０） １
８５９ （１９８１））
【００２３】また、目的とする変異、あるいは挿入され
たＤＮＡ配列を確認するためには、下記文献３５）に示
されるジデオキシ法に従いＤＮＡ塩基配列の決定を行え
ばよい。 ３５）エフ. サンガー エトアル．，プロシ. ナショ
ル.アカド. サイ. ユーエスエー ７４ ５４６３
（１９７７） （Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４ ５４６３ （１
９７７））
たＤＮＡ配列を確認するためには、下記文献３５）に示
されるジデオキシ法に従いＤＮＡ塩基配列の決定を行え
ばよい。 ３５）エフ. サンガー エトアル．，プロシ. ナショ
ル.アカド. サイ. ユーエスエー ７４ ５４６３
（１９７７） （Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４ ５４６３ （１
９７７））
【００２４】ｔ−ＰＡの欠失型変異体の作製のため、ｔ
−ＰＡの欠失型変異体にＴＭ由来のアミノ酸配列を挿入
するため、あるいはＴＭとｔ−ＰＡのアミノ酸配列の間
にリンカーとしてのペプチド配列を挿入するためには、
それらのアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｃＤＮＡ，
あるいは合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例に記
載されているような制限酵素によるＤＮＡの切断、欠
失、それらにより生ずるＤＮＡ断片のアガロース又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による分離、回収、ある
いは連結等の遺伝子操作を行えばよいが、それらの個々
の技術については殆どが公知であり、主として下記文献
３６）が参照される。 ３６) ティー. マニアティス エトアル.,モレキュラー
クローニング、ア ラボラトリー マニュアル、コール
ドプリハーバーボラトリー（１９８２） （Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））
−ＰＡの欠失型変異体にＴＭ由来のアミノ酸配列を挿入
するため、あるいはＴＭとｔ−ＰＡのアミノ酸配列の間
にリンカーとしてのペプチド配列を挿入するためには、
それらのアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｃＤＮＡ，
あるいは合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例に記
載されているような制限酵素によるＤＮＡの切断、欠
失、それらにより生ずるＤＮＡ断片のアガロース又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動による分離、回収、ある
いは連結等の遺伝子操作を行えばよいが、それらの個々
の技術については殆どが公知であり、主として下記文献
３６）が参照される。 ３６) ティー. マニアティス エトアル.,モレキュラー
クローニング、ア ラボラトリー マニュアル、コール
ドプリハーバーボラトリー（１９８２） （Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））
【００２５】上記の操作により得られる挿入配列を有す
るｃＤＮＡ領域を含む二本鎖形Ｍ１３ＤＮＡからｃＤＮ
Ａ部分を切り出しプラスミドあるいは発現ベクターと連
結するのも、前記文献３６）に従って行えばよい。また
その様にして得られる発現プラスミドを用い適当な宿主
を形質転換するには、電気パルス法（下記文献３７))を
用いればよい。 ３７) 高山慎一郎、細胞工学６ ７７１ （１９８７）
るｃＤＮＡ領域を含む二本鎖形Ｍ１３ＤＮＡからｃＤＮ
Ａ部分を切り出しプラスミドあるいは発現ベクターと連
結するのも、前記文献３６）に従って行えばよい。また
その様にして得られる発現プラスミドを用い適当な宿主
を形質転換するには、電気パルス法（下記文献３７))を
用いればよい。 ３７) 高山慎一郎、細胞工学６ ７７１ （１９８７）
【００２６】例えば、ｔ−ＰＡ欠失型変異体のシグナル
配列とＫ１の間にＴＭのＥ４５６領域を挿入した、本発
明の血栓溶解タンパク質のｃＤＮＡを含む発現プラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII を用い電気パルス法によ
りＣＯＳ−１細胞を形質転換すればよい。形質転換され
た細胞の培養上清は、適当な希釈によりそのまま種々の
活性測定に使用され得る程度の血栓溶解タンパク質を含
んでいる。
配列とＫ１の間にＴＭのＥ４５６領域を挿入した、本発
明の血栓溶解タンパク質のｃＤＮＡを含む発現プラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII を用い電気パルス法によ
りＣＯＳ−１細胞を形質転換すればよい。形質転換され
た細胞の培養上清は、適当な希釈によりそのまま種々の
活性測定に使用され得る程度の血栓溶解タンパク質を含
んでいる。
【００２７】生産のための各過程で用いられる各種ベク
ターＤＮＡ（あるいはプラスミドＤＮＡ）及びそれらの
宿主となる大腸菌株や動物細胞株の入手は特に記載のな
い限り既に広く普及しており入手は容易であり、例えば
ベクターＤＮＡ及び大腸菌株は宝酒造株式会社または東
洋紡績株式会社より、また動物細胞株は大日本製薬株式
会社より容易に入手可能である。本明細書で示す発現ベ
クターＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）は原核性および真核性生物
の宿主細胞内で用ることのできるシャトルベクターであ
る。このベクターの使用に適した宿主原核性生物として
は大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株（下記文献３８））をは
じめとした宿主細胞内にサプレッサー（ｓｕｐＦ）で復
帰される様なアンバー変異を含むマーカー遺伝子を有す
る微生物株が有効である。 ３８）ビー．シード，ネイチャー ３２９ ８４０−８
４２ （１９８７） （Ｂ．Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２９ ８４０−８４
２ （１９８７））また真核性の宿主細胞として有用な
ものにはＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，ＣＯＰＳ，ＷＯＰ，
およびチャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）セル
ライン等の動物培養細胞株が含まれる。
ターＤＮＡ（あるいはプラスミドＤＮＡ）及びそれらの
宿主となる大腸菌株や動物細胞株の入手は特に記載のな
い限り既に広く普及しており入手は容易であり、例えば
ベクターＤＮＡ及び大腸菌株は宝酒造株式会社または東
洋紡績株式会社より、また動物細胞株は大日本製薬株式
会社より容易に入手可能である。本明細書で示す発現ベ
クターＣＤＭ８（ｏｒｉ- ）は原核性および真核性生物
の宿主細胞内で用ることのできるシャトルベクターであ
る。このベクターの使用に適した宿主原核性生物として
は大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株（下記文献３８））をは
じめとした宿主細胞内にサプレッサー（ｓｕｐＦ）で復
帰される様なアンバー変異を含むマーカー遺伝子を有す
る微生物株が有効である。 ３８）ビー．シード，ネイチャー ３２９ ８４０−８
４２ （１９８７） （Ｂ．Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ ３２９ ８４０−８４
２ （１９８７））また真核性の宿主細胞として有用な
ものにはＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，ＣＯＰＳ，ＷＯＰ，
およびチャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）セル
ライン等の動物培養細胞株が含まれる。
【００２８】この様にして得られた本発明の血栓溶解タ
ンパク質は、常法により容器に必要量分注し、凍結乾燥
を行うことにより製剤として極めて容易に得ることがで
きる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認されるキャリ
アー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内または動
脈または心臓内への注射によって投与される。投与方法
は、持続静注あるいは投与予定量の一部を最初に静注し
残りを持続静注する等の方法で行われる。
ンパク質は、常法により容器に必要量分注し、凍結乾燥
を行うことにより製剤として極めて容易に得ることがで
きる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認されるキャリ
アー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内または動
脈または心臓内への注射によって投与される。投与方法
は、持続静注あるいは投与予定量の一部を最初に静注し
残りを持続静注する等の方法で行われる。
【００２９】
【実施例】以下に、本発明の一例として実施例を示す
が、本発明はこれに限定されるものではない。 １．Ｅ４５６遺伝子のクローニング ヒト胎児肺由来ＷI −３８細胞からヒト染色体ＤＮＡを
前記文献３６）に記載された方法に従って調製した。Ｔ
Ｍ遺伝子の塩基配列は下記文献３９）に記載されてお
り、ＴＭのｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの塩基配列（前
記文献１４）に記載）との比較から、ＴＭ遺伝子は１個
のエクソンからなりイントロンは含まない。そこで下記
文献３９）及び図１に記載された制限酵素地図をもと
に、ＴＭのＥ４５６をコードする遺伝子配列を含む領域
を、ＰＣＲ反応で増幅した。この増幅された遺伝子は該
領域に対するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡと同一の塩基
配列を有する。 ３９）ティー．シライ エトアル．，ジェー．バイオケ
ム．１０３ ２８１−２８５（１９８８） （Ｔ．Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１０３ ２８１−２８５（１９８８））
が、本発明はこれに限定されるものではない。 １．Ｅ４５６遺伝子のクローニング ヒト胎児肺由来ＷI −３８細胞からヒト染色体ＤＮＡを
前記文献３６）に記載された方法に従って調製した。Ｔ
Ｍ遺伝子の塩基配列は下記文献３９）に記載されてお
り、ＴＭのｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡの塩基配列（前
記文献１４）に記載）との比較から、ＴＭ遺伝子は１個
のエクソンからなりイントロンは含まない。そこで下記
文献３９）及び図１に記載された制限酵素地図をもと
に、ＴＭのＥ４５６をコードする遺伝子配列を含む領域
を、ＰＣＲ反応で増幅した。この増幅された遺伝子は該
領域に対するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡと同一の塩基
配列を有する。 ３９）ティー．シライ エトアル．，ジェー．バイオケ
ム．１０３ ２８１−２８５（１９８８） （Ｔ．Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１０３ ２８１−２８５（１９８８））
【００３０】具体的には、まず、２種のプライマーＰ−
Ｐｓｔ１（配列番号２）及びＰ−Ｐｓｔ２（配列番号
３）を合成した。この２種のプライマーと、上記手法に
より得たヒト染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応に供し、
両端にＰｓｔI 部位を有する遺伝子を増幅した。
Ｐｓｔ１（配列番号２）及びＰ−Ｐｓｔ２（配列番号
３）を合成した。この２種のプライマーと、上記手法に
より得たヒト染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲ反応に供し、
両端にＰｓｔI 部位を有する遺伝子を増幅した。
【化２】
【化３】
【００３１】ＰＣＲ反応の条件は、上記方法によりヒト
胎児肺由来ＷI −３８細胞から調製したヒト染色体ＤＮ
Ａを０．１μｇ、プライマーＰ−Ｐｓｔ１及びＰ−Ｐｓ
ｔ２を各５０ｐｍｏｌｅｓ、ｄＮＴＰを６００μＭ、反
応緩衝液〔ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．５）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン
０．２ｍｇ／ｍｌ〕、Ｔａｑポリメラーゼ２ｕｎｉｔｓ
（宝酒造株式会社製）を１００μｌとなるように混合
し、９４℃１分、５５℃１分、７２℃５分の反応を２９
サイクル行い、続いて９４℃１分、５５℃１分、７２℃
１０分の反応を１サイクル行った。増幅した遺伝子をＰ
ｓｔI で消化し、得られたフラグメントをフラグメント
ＰＰと名付け、ポリアクリルアミドゲルより標準的な手
法により単離した。このフラグメントと、市販プラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）をＰｓｔI で消化
後、５’末端を脱リン酸化したものとをライゲートさ
せ、これで大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造株式会社製）を
形質転換させ、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｅ４５６を得
た。図２にプラスミドｐＵＣ１１８−Ｅ４５６の組み立
て模式図を示した。
胎児肺由来ＷI −３８細胞から調製したヒト染色体ＤＮ
Ａを０．１μｇ、プライマーＰ−Ｐｓｔ１及びＰ−Ｐｓ
ｔ２を各５０ｐｍｏｌｅｓ、ｄＮＴＰを６００μＭ、反
応緩衝液〔ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ
８．５）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン
０．２ｍｇ／ｍｌ〕、Ｔａｑポリメラーゼ２ｕｎｉｔｓ
（宝酒造株式会社製）を１００μｌとなるように混合
し、９４℃１分、５５℃１分、７２℃５分の反応を２９
サイクル行い、続いて９４℃１分、５５℃１分、７２℃
１０分の反応を１サイクル行った。増幅した遺伝子をＰ
ｓｔI で消化し、得られたフラグメントをフラグメント
ＰＰと名付け、ポリアクリルアミドゲルより標準的な手
法により単離した。このフラグメントと、市販プラスミ
ドｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）をＰｓｔI で消化
後、５’末端を脱リン酸化したものとをライゲートさ
せ、これで大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造株式会社製）を
形質転換させ、プラスミドｐＵＣ１１８−Ｅ４５６を得
た。図２にプラスミドｐＵＣ１１８−Ｅ４５６の組み立
て模式図を示した。
【００３２】２．Ｅ４５６遺伝子の増幅 Ｅ４５６をコードする遺伝子をＰＣＲ反応で増幅させ
た。この増幅させた遺伝子をカセット化するために、配
列内部に制限酵素認識配列を含むようなプライマーＰ−
ＳｐｅI （配列番号４）、Ｐ−ＸｂａI （配列番号５）
およびＰ−ＥＴ１４I （配列番号６）を合成した。
た。この増幅させた遺伝子をカセット化するために、配
列内部に制限酵素認識配列を含むようなプライマーＰ−
ＳｐｅI （配列番号４）、Ｐ−ＸｂａI （配列番号５）
およびＰ−ＥＴ１４I （配列番号６）を合成した。
【化４】
【化５】
【化６】
【００３３】ＰＣＲ反応は鋳型にプラスミドｐＵＣ１１
８−Ｅ４５６を用い、プライマーにはＰ−ＳｐｅI とＰ
−ＸｂａI 、およびＰ−ＳｐｅIとＰ−ＥＴ１４I の組
み合わせを使用した。ＰＣＲ反応の条件は、プラスミド
ｐＵＣ１１８−Ｅ４５６を１０ｎｇ、プライマーを各５
０ｐｍｏｌｅｓ、ｄＮＴＰを２００μＭ、反応緩衝液
〔ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１
０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン０．２ｍｇ／
ｍｌ〕、Ｔａｑポリメラーゼ２ｕｎｉｔｓ（宝酒造株式
会社製）を１００μｌとなるように混合し、９４℃１
分、５５℃１分、７２℃３分の反応を２９サイクル行
い、続いて９４℃１分、５５℃１分、７２℃５分の反応
を１サイクル行った。増幅した遺伝子を図３に示すよう
に、それぞれＳｐｅI とＸｂａI 、およびＳｐｅI とＥ
ｃｏＴ１４I で消化し、これらのフラグメントをそれぞ
れフラグメントＳＸおよびフラグメントＳＥと名づけ、
ポリアクリルアミドゲルより標準的な手法により単離し
た。
８−Ｅ４５６を用い、プライマーにはＰ−ＳｐｅI とＰ
−ＸｂａI 、およびＰ−ＳｐｅIとＰ−ＥＴ１４I の組
み合わせを使用した。ＰＣＲ反応の条件は、プラスミド
ｐＵＣ１１８−Ｅ４５６を１０ｎｇ、プライマーを各５
０ｐｍｏｌｅｓ、ｄＮＴＰを２００μＭ、反応緩衝液
〔ＫＣｌ５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１
０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ２．５ｍＭ、ゼラチン０．２ｍｇ／
ｍｌ〕、Ｔａｑポリメラーゼ２ｕｎｉｔｓ（宝酒造株式
会社製）を１００μｌとなるように混合し、９４℃１
分、５５℃１分、７２℃３分の反応を２９サイクル行
い、続いて９４℃１分、５５℃１分、７２℃５分の反応
を１サイクル行った。増幅した遺伝子を図３に示すよう
に、それぞれＳｐｅI とＸｂａI 、およびＳｐｅI とＥ
ｃｏＴ１４I で消化し、これらのフラグメントをそれぞ
れフラグメントＳＸおよびフラグメントＳＥと名づけ、
ポリアクリルアミドゲルより標準的な手法により単離し
た。
【００３４】３．Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミド
ｐＣＤＭ８−１０１の構築 ここで以下に述べる内容の理解を容易にするために、本
構築法の概念図を図４〜図６に示す。まず、２種のオリ
ゴヌクレオチドＤ５（配列番号７）およびＤ２（配列番
号８）を合成した。
ｐＣＤＭ８−１０１の構築 ここで以下に述べる内容の理解を容易にするために、本
構築法の概念図を図４〜図６に示す。まず、２種のオリ
ゴヌクレオチドＤ５（配列番号７）およびＤ２（配列番
号８）を合成した。
【化７】
【化８】
【００３５】このうちＤ５は、ｔ−ＰＡのシグナルペプ
チドとＫ２をコードする配列をつなげた配列になるよう
に、また両合成オリゴヌクレオチドＤ５およびＤ２の
５’末端はそれぞれ制限酵素ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲI
の認識部位となるようにデザインされている。この２種
のオリゴヌクレオチドを等モルずつ混合しアニーリング
させた後、ＤＮＡポリメラーゼI （Ｋｌｅｎｏｗｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）で相補鎖を延長し、２本鎖化した。この２
本鎖化したＤＮＡをＥｃｏＲI およびＢｇｌIIで消化
し、９８ｂｐのフラグメントＤ２５をポリアクリルアミ
ドゲルより単離した。一方、市販のベクターｐＵＣ１９
のマルチクローニングサイト内のＨｉｎｄIII 認識部位
をＢｇｌII認識部位に置き換えたベクターｐＵＣ１９Ｈ
- Ｂ+ を作製した。このベクターｐＵＣ１９Ｈ- Ｂ+ を
ＥｃｏＲI およびＢｇｌIIで消化後、５’末端を脱リン
酸化したものと、先に調製したフラグメントＤ２５をラ
イゲートさせ、これで大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造株式
会社製）を形質転換させ、プラスミドｐＵＣＤ２５を得
た（図４）。このプラスミドの挿入配列領域をジデオキ
シ法を用いた塩基配列の決定法で確認した。
チドとＫ２をコードする配列をつなげた配列になるよう
に、また両合成オリゴヌクレオチドＤ５およびＤ２の
５’末端はそれぞれ制限酵素ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲI
の認識部位となるようにデザインされている。この２種
のオリゴヌクレオチドを等モルずつ混合しアニーリング
させた後、ＤＮＡポリメラーゼI （Ｋｌｅｎｏｗｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）で相補鎖を延長し、２本鎖化した。この２
本鎖化したＤＮＡをＥｃｏＲI およびＢｇｌIIで消化
し、９８ｂｐのフラグメントＤ２５をポリアクリルアミ
ドゲルより単離した。一方、市販のベクターｐＵＣ１９
のマルチクローニングサイト内のＨｉｎｄIII 認識部位
をＢｇｌII認識部位に置き換えたベクターｐＵＣ１９Ｈ
- Ｂ+ を作製した。このベクターｐＵＣ１９Ｈ- Ｂ+ を
ＥｃｏＲI およびＢｇｌIIで消化後、５’末端を脱リン
酸化したものと、先に調製したフラグメントＤ２５をラ
イゲートさせ、これで大腸菌ＨＢ１０１株（宝酒造株式
会社製）を形質転換させ、プラスミドｐＵＣＤ２５を得
た（図４）。このプラスミドの挿入配列領域をジデオキ
シ法を用いた塩基配列の決定法で確認した。
【００３６】ｔ−ＰＡのｃＤＮＡを含有するプラスミド
ｐＴＺＢ−０００は下記文献４０）記載の方法で得られ
た。このプラスミドｐＴＺＢ−０００をＥｃｏＲI およ
びＢｇｌIIで消化したものと、前記プラスミドｐＵＣＤ
２５をＥｃｏＲI 、ＢｇｌIIおよびＳｃａI で消化した
ものとをライゲートさせた後、さらにＮａｒI で消化
後、これで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラス
ミドｐＴＺＢ−１０１ΔＥＥを得た。 ４０）特願平２−２６８８１６号明細書 プラスミドｐＴＺＢ−０００をＥｃｏＲI で消化し、４
７２ｂｐのフラグメントＥＥをポリアクリルアミドゲル
より単離した。このフラグメントと、プラスミドｐＴＺ
Ｂ−１０１ΔＥＥをＥｃｏＲI で消化し、５’末端を脱
リン酸化したものとをライゲートさせ、これで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴＺＢ−１０
１を得た（図５）。
ｐＴＺＢ−０００は下記文献４０）記載の方法で得られ
た。このプラスミドｐＴＺＢ−０００をＥｃｏＲI およ
びＢｇｌIIで消化したものと、前記プラスミドｐＵＣＤ
２５をＥｃｏＲI 、ＢｇｌIIおよびＳｃａI で消化した
ものとをライゲートさせた後、さらにＮａｒI で消化
後、これで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラス
ミドｐＴＺＢ−１０１ΔＥＥを得た。 ４０）特願平２−２６８８１６号明細書 プラスミドｐＴＺＢ−０００をＥｃｏＲI で消化し、４
７２ｂｐのフラグメントＥＥをポリアクリルアミドゲル
より単離した。このフラグメントと、プラスミドｐＴＺ
Ｂ−１０１ΔＥＥをＥｃｏＲI で消化し、５’末端を脱
リン酸化したものとをライゲートさせ、これで大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴＺＢ−１０
１を得た（図５）。
【００３７】このプラスミドｐＴＺＢ−１０１をＢａｍ
ＨI で消化し、約１６５０ｂｐのフラグメント１０１を
ポリアクリルアミドゲルより単離し、このフラグメント
１０１とプラスミドｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢｇｌIIで
消化後、５’末端を脱リン酸化したものとをライゲート
させ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換さ
せ、プラスミドｐＣＤＭ８−１０１を得た（図６）。こ
のプラスミドｐＣＤＭ８−１０１はｔ−ＰＡのシグナル
ペプチドとＫ２およびＡドメインをコードする遺伝子を
含有している。シグナルペプチドとＫ２ドメインをコー
ドする遺伝子のつなぎ目およびその前後の配列を配列番
号９に示した。
ＨI で消化し、約１６５０ｂｐのフラグメント１０１を
ポリアクリルアミドゲルより単離し、このフラグメント
１０１とプラスミドｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢｇｌIIで
消化後、５’末端を脱リン酸化したものとをライゲート
させ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換さ
せ、プラスミドｐＣＤＭ８−１０１を得た（図６）。こ
のプラスミドｐＣＤＭ８−１０１はｔ−ＰＡのシグナル
ペプチドとＫ２およびＡドメインをコードする遺伝子を
含有している。シグナルペプチドとＫ２ドメインをコー
ドする遺伝子のつなぎ目およびその前後の配列を配列番
号９に示した。
【化９】
【００３８】４．Ｋ１Ｋ２Ａ変異体をコードするプラス
ミドｐＣＤＭ８−３０１の構築 本構築法の概念図を図７〜図１０に示す。まず、２種の
オリゴヌクレオチドＤ３（配列番号１０）およびＤ４
（配列番号１１）を合成した。
ミドｐＣＤＭ８−３０１の構築 本構築法の概念図を図７〜図１０に示す。まず、２種の
オリゴヌクレオチドＤ３（配列番号１０）およびＤ４
（配列番号１１）を合成した。
【化１０】
【化１１】
【００３９】このうちＤ３は、ｔ−ＰＡのシグナルペプ
チドとＫ１をコードする配列をつなげた配列になるよう
に、また両合成オリゴヌクレオチドＤ３およびＤ４の
５’末端はそれぞれ制限酵素ＢｇｌIIおよびＡｐａＬI
の認識部位となるようにデザインされている。この２種
のオリゴヌクレオチドを等モルずつ混合しアニーリング
させた後、ＤＮＡポリメラーゼI （Ｋｌｅｎｏｗｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）で相補鎖を延長し、２本鎖化した。この２
本鎖化したＤＮＡをＢｇｌIIおよびＡｐａＬIで消化
し、８９ｂｐのフラグメントＤ３４をポリアクリルアミ
ドゲルより単離した。また、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＵＣ−０００（下記文献４１）参照）
をＳａｃI およびＥｃｏＲI で消化し、ポリアクリルア
ミドゲルより約８００ｂｐのフラグメントＳｃＥを単離
し、これとプラスミドｐＵＣ１９をＳａｃI およびＥｃ
ｏＲI で消化したものをライゲートさせ、大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換してプラスミドｐＵＣ１９ＳＥを得た
（図７）。 ４１）特願平２−８７００５号明細書
チドとＫ１をコードする配列をつなげた配列になるよう
に、また両合成オリゴヌクレオチドＤ３およびＤ４の
５’末端はそれぞれ制限酵素ＢｇｌIIおよびＡｐａＬI
の認識部位となるようにデザインされている。この２種
のオリゴヌクレオチドを等モルずつ混合しアニーリング
させた後、ＤＮＡポリメラーゼI （Ｋｌｅｎｏｗｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）で相補鎖を延長し、２本鎖化した。この２
本鎖化したＤＮＡをＢｇｌIIおよびＡｐａＬIで消化
し、８９ｂｐのフラグメントＤ３４をポリアクリルアミ
ドゲルより単離した。また、ｔ−ＰＡのｃＤＮＡを含有
するプラスミドｐＵＣ−０００（下記文献４１）参照）
をＳａｃI およびＥｃｏＲI で消化し、ポリアクリルア
ミドゲルより約８００ｂｐのフラグメントＳｃＥを単離
し、これとプラスミドｐＵＣ１９をＳａｃI およびＥｃ
ｏＲI で消化したものをライゲートさせ、大腸菌ＪＭ１
０９株を形質転換してプラスミドｐＵＣ１９ＳＥを得た
（図７）。 ４１）特願平２−８７００５号明細書
【００４０】このプラスミドｐＵＣ１９ＳＥをＡｐａＬ
I およびＥｃｏＲI で消化し、２７６ｂｐのフラグメン
トＡＬＥをポリアクリルアミドゲルより単離した。これ
とは別にプラスミドｐＵＣ１９ＳＥをＢｇｌIIおよびＥ
ｃｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化し、これと、
先に調製したフラグメントＤ３４およびフラグメントＡ
ＬＥを三者でライゲートさせ、これで大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ−３０１ΔＥＥを
得た（図８）。このプラスミドの挿入配列領域をジデオ
キシ法を用いた塩基配列の決定法で確認した。
I およびＥｃｏＲI で消化し、２７６ｂｐのフラグメン
トＡＬＥをポリアクリルアミドゲルより単離した。これ
とは別にプラスミドｐＵＣ１９ＳＥをＢｇｌIIおよびＥ
ｃｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化し、これと、
先に調製したフラグメントＤ３４およびフラグメントＡ
ＬＥを三者でライゲートさせ、これで大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ−３０１ΔＥＥを
得た（図８）。このプラスミドの挿入配列領域をジデオ
キシ法を用いた塩基配列の決定法で確認した。
【００４１】このプラスミドｐＵＣ−３０１ΔＥＥをＢ
ｇｌIIおよびＥｃｏＲI で消化し、３６５ｂｐのフラグ
メントＢｇＥをポリアクリルアミドゲルより単離した。
前記したプラスミドｐＴＺＢ−０００をＢｇｌIIおよび
ＥｃｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化したもの
と、フラグメントＢｇＥをライゲートさせ、これで大腸
菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴＺＢ−
３０１ΔＥＥを得た（図９）。
ｇｌIIおよびＥｃｏＲI で消化し、３６５ｂｐのフラグ
メントＢｇＥをポリアクリルアミドゲルより単離した。
前記したプラスミドｐＴＺＢ−０００をＢｇｌIIおよび
ＥｃｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化したもの
と、フラグメントＢｇＥをライゲートさせ、これで大腸
菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴＺＢ−
３０１ΔＥＥを得た（図９）。
【００４２】プラスミドｐＴＺＢ−３０１ΔＥＥをＥｃ
ｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化したものと、前
項で既述したフラグメントＥＥをライゲートさせ、これ
で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴ
ＺＢ−３０１を得た。このプラスミドｐＴＺＢ−３０１
をＢａｍＨI で消化し、約１８４０ｂｐのフラグメント
３０１をポリアクリルアミドゲルより単離し、このフラ
グメント３０１とプラスミドｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢ
ｇｌIIで消化後５’末端を脱リン酸化したものとをライ
ゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質
転換させ、プラスミドｐＣＤＭ８−３０１を得た（図１
０）。このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１はｔ−ＰＡの
シグナルペプチドとＫ１、Ｋ２およびＡドメインをコー
ドする遺伝子を含有している。シグナルペプチドとＫ１
ドメインをコードする遺伝子のつなぎ目およびその前後
の配列を配列番号１２に示した。
ｏＲI で消化し、５’末端を脱リン酸化したものと、前
項で既述したフラグメントＥＥをライゲートさせ、これ
で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＴ
ＺＢ−３０１を得た。このプラスミドｐＴＺＢ−３０１
をＢａｍＨI で消化し、約１８４０ｂｐのフラグメント
３０１をポリアクリルアミドゲルより単離し、このフラ
グメント３０１とプラスミドｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢ
ｇｌIIで消化後５’末端を脱リン酸化したものとをライ
ゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質
転換させ、プラスミドｐＣＤＭ８−３０１を得た（図１
０）。このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１はｔ−ＰＡの
シグナルペプチドとＫ１、Ｋ２およびＡドメインをコー
ドする遺伝子を含有している。シグナルペプチドとＫ１
ドメインをコードする遺伝子のつなぎ目およびその前後
の配列を配列番号１２に示した。
【化１２】
【００４３】５．Ｅ４５６−Ｋ２Ａをコードするプラス
ミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築 本構築法の概念図を図１１〜図１３に示す。まず、プラ
スミドｐＴＺＢ−１０１のシグナル配列とＫ２配列をコ
ードする塩基配列の間に存在するＥｃｏＴ１４Ｉ認識配
列である”ＣＣＡＡＧＧ”を”ＣＣＴＡＧＧ”に置換し
た。それには、部位特異的突然変異誘発の手法を用い
た。ｐＴＺＢ−１０１をＢａｍＨI およびＳｍａI で消
化し、約１．２ＫｂのフラグメントＢＳｍをポリアクリ
ルアミドゲルより単離した。これと、Ｍ１３ｔｖ１８を
ＢａｍＨI およびＳｍａI で消化したものとをライゲー
トさせ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、Ｍ１３ｔ
ｖ１８ＢＳｍを得た（図１１）。
ミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築 本構築法の概念図を図１１〜図１３に示す。まず、プラ
スミドｐＴＺＢ−１０１のシグナル配列とＫ２配列をコ
ードする塩基配列の間に存在するＥｃｏＴ１４Ｉ認識配
列である”ＣＣＡＡＧＧ”を”ＣＣＴＡＧＧ”に置換し
た。それには、部位特異的突然変異誘発の手法を用い
た。ｐＴＺＢ−１０１をＢａｍＨI およびＳｍａI で消
化し、約１．２ＫｂのフラグメントＢＳｍをポリアクリ
ルアミドゲルより単離した。これと、Ｍ１３ｔｖ１８を
ＢａｍＨI およびＳｍａI で消化したものとをライゲー
トさせ、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、Ｍ１３ｔ
ｖ１８ＢＳｍを得た（図１１）。
【００４４】部位特異的突然変異誘発の鋳型として一本
鎖形Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍを前記文献４１）に記載の方
法に従って得た。Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍ（ＥＴ）はこの
一本鎖形Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍを鋳型として、合成した
オリゴヌクレオチドＭ−ＥＴ（配列番号１３）とアニー
ルさせ、前記文献３１）および３９）記載のＭｕｔａｎ
−Ｇシステム（宝酒造株式会社製）を用いて得られた。
１塩基置換の確認は、ジデオキシ法を用いた塩基配列決
定の手法を用いた。Ｍ１３ｍｐ１８ＢＳｍ（ＥＴ）をＢ
ａｍＨI およびＳｍａI で消化し、得られた約１．２Ｋ
ｂのフラグメントＢＳｍ（ＥＴ）を標準的手法によりポ
リアクリルアミドゲルより単離した。このフラグメント
ＢＳｍ（ＥＴ）とプラスミドｐＵＣ１１８をＢａｍＨI
およびＳｍａI で消化したものとをライゲートさせ、こ
れで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐ
ＵＣＢＳｍＥＴを得た（図１２）。
鎖形Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍを前記文献４１）に記載の方
法に従って得た。Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍ（ＥＴ）はこの
一本鎖形Ｍ１３ｔｖ１８ＢＳｍを鋳型として、合成した
オリゴヌクレオチドＭ−ＥＴ（配列番号１３）とアニー
ルさせ、前記文献３１）および３９）記載のＭｕｔａｎ
−Ｇシステム（宝酒造株式会社製）を用いて得られた。
１塩基置換の確認は、ジデオキシ法を用いた塩基配列決
定の手法を用いた。Ｍ１３ｍｐ１８ＢＳｍ（ＥＴ）をＢ
ａｍＨI およびＳｍａI で消化し、得られた約１．２Ｋ
ｂのフラグメントＢＳｍ（ＥＴ）を標準的手法によりポ
リアクリルアミドゲルより単離した。このフラグメント
ＢＳｍ（ＥＴ）とプラスミドｐＵＣ１１８をＢａｍＨI
およびＳｍａI で消化したものとをライゲートさせ、こ
れで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐ
ＵＣＢＳｍＥＴを得た（図１２）。
【化１３】
【００４５】このプラスミドｐＵＣＢＳｍＥＴをＥｃｏ
Ｔ１４I で消化後、５’末端を脱リン酸化したものと、
既述のフラグメントＳＥとをライゲートさせ、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＵＣＢＳｍＴ
Ｍを得た。このプラスミドｐＵＣＢＳｍＴＭをＢｇｌII
およびＳｍａI で消化の後、ポリアクリルアミドゲルよ
り約１．４ＫｂのフラグメントＢｇＳｍを得た。これと
既述のプラスミドｐＣＤＭ８−１０１をＢｇｌIIおよび
ＳｍａI で消化後、５’末端を脱リン酸化したものとを
ライゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を
形質転換させ、プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭを得
た（図１３）。このプラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ
は、アミノ末端側からｔ−ＰＡのシグナルペプチド、Ｔ
ＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメインとｔ−ＰＡのＫ２および
Ａドメインをコードする遺伝子を含有している。ＴＭの
Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６ドメインをコードする遺伝子およびそ
の前後の配列は配列番号１４に示した。
Ｔ１４I で消化後、５’末端を脱リン酸化したものと、
既述のフラグメントＳＥとをライゲートさせ、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換させ、プラスミドｐＵＣＢＳｍＴ
Ｍを得た。このプラスミドｐＵＣＢＳｍＴＭをＢｇｌII
およびＳｍａI で消化の後、ポリアクリルアミドゲルよ
り約１．４ＫｂのフラグメントＢｇＳｍを得た。これと
既述のプラスミドｐＣＤＭ８−１０１をＢｇｌIIおよび
ＳｍａI で消化後、５’末端を脱リン酸化したものとを
ライゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を
形質転換させ、プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭを得
た（図１３）。このプラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ
は、アミノ末端側からｔ−ＰＡのシグナルペプチド、Ｔ
ＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメインとｔ−ＰＡのＫ２および
Ａドメインをコードする遺伝子を含有している。ＴＭの
Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６ドメインをコードする遺伝子およびそ
の前後の配列は配列番号１４に示した。
【化１４】
【化１５】
【００４６】６．Ｅ４５６−Ｋ１Ｋ２Ａをコードするプ
ラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIIIの構築 本構築法の概念図を図１４〜図１７に示す。プラスミド
ｐＴＺＢ−３０１のシグナル配列とＫ１配列をコードす
る塩基配列の間にＸｂａI 部位を挿入するために、前記
文献３２）および４１）記載のＭｕｔａｎ−Ｋシステム
（宝酒造株式会社製）を用いる部位特異的突然変異誘発
を行った。まず、配列の中にデオキシウリジンを含む一
本鎖形ｐＴＺＢ−３０１（ｄＵ）を得た。このデオキシ
ウリジンを含む一本鎖形ｐＴＺＢ−３０１（ｄＵ）を鋳
型に、合成したオリゴヌクレオチドＭ−Ｘｂａ（配列番
号１５）をアニールさせ、既述のＭｕｔａｎ−Ｋシステ
ムを用いてｐＴＺＢ−３０１Ｘを得た。
ラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIIIの構築 本構築法の概念図を図１４〜図１７に示す。プラスミド
ｐＴＺＢ−３０１のシグナル配列とＫ１配列をコードす
る塩基配列の間にＸｂａI 部位を挿入するために、前記
文献３２）および４１）記載のＭｕｔａｎ−Ｋシステム
（宝酒造株式会社製）を用いる部位特異的突然変異誘発
を行った。まず、配列の中にデオキシウリジンを含む一
本鎖形ｐＴＺＢ−３０１（ｄＵ）を得た。このデオキシ
ウリジンを含む一本鎖形ｐＴＺＢ−３０１（ｄＵ）を鋳
型に、合成したオリゴヌクレオチドＭ−Ｘｂａ（配列番
号１５）をアニールさせ、既述のＭｕｔａｎ−Ｋシステ
ムを用いてｐＴＺＢ−３０１Ｘを得た。
【化１６】 これをＸｂａI で消化後５’末端を脱リン酸化し、これ
と既述のフラグメントＳＸとをライゲートさせ、大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換させ、ｐＴＺＢ−３０１ＴＭを
得た（図１４）。
と既述のフラグメントＳＸとをライゲートさせ、大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換させ、ｐＴＺＢ−３０１ＴＭを
得た（図１４）。
【００４７】ｐＴＺＢ−３０１ＴＭをＢａｍＨI で消化
後、約２．１Ｋｂのフラグメントをポリアクリルアミド
ゲルより標準的な手法を用いて得、このフラグメントと
ｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢｇｌIIで消化し5'末端を脱リ
ン酸化したものとをライゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ
１０６１／ｐ３株を形質転換させ、ｐＣＤＭ８−３０１
ＴＭを得た（図１５）。
後、約２．１Ｋｂのフラグメントをポリアクリルアミド
ゲルより標準的な手法を用いて得、このフラグメントと
ｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ）をＢｇｌIIで消化し5'末端を脱リ
ン酸化したものとをライゲートさせ、これで大腸菌ＭＣ
１０６１／ｐ３株を形質転換させ、ｐＣＤＭ８−３０１
ＴＭを得た（図１５）。
【００４８】このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭの
塩基配列を制限酵素による消化あるいはジデオキシ法を
用いた塩基配列決定により確認を行ったところ、Ｂｇｌ
II認識部位に１塩基欠失が認められた。そこで、ｐＣＤ
Ｍ８−３０１ＴＭの１塩基欠失部位を含む領域（Ｈｉｎ
ｄIII からＮｈｅI までの領域）を、前項記載のプラス
ミドｐＵＣＢＳｍＴＭのマルチクローニングサイト内部
のＨｉｎｄIII からＥ４５６をコードする領域の内部に
あるＮｈｅI までの領域と乗せ換え、欠失塩基の復活を
行った。すなわち、プラスミドｐＵＣＢＳｍＴＭをＨｉ
ｎｄIII およびＮｈｅI で消化後、ポリアクリルアミド
ゲルより約０．４ＫｂのフラグメントＨＮを単離した。
このフラグメントＨＮと、プラスミドｐＣＤＭ８−３０
１ＴＭをＨｉｎｄIII およびＮｈｅI で消化後５’末端
を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、大腸菌ＭＣ
１０６１／ｐ３株を形質転換させ、プラスミドｐＣＤＭ
８−３０１ＴＭIIを得た（図１６）。
塩基配列を制限酵素による消化あるいはジデオキシ法を
用いた塩基配列決定により確認を行ったところ、Ｂｇｌ
II認識部位に１塩基欠失が認められた。そこで、ｐＣＤ
Ｍ８−３０１ＴＭの１塩基欠失部位を含む領域（Ｈｉｎ
ｄIII からＮｈｅI までの領域）を、前項記載のプラス
ミドｐＵＣＢＳｍＴＭのマルチクローニングサイト内部
のＨｉｎｄIII からＥ４５６をコードする領域の内部に
あるＮｈｅI までの領域と乗せ換え、欠失塩基の復活を
行った。すなわち、プラスミドｐＵＣＢＳｍＴＭをＨｉ
ｎｄIII およびＮｈｅI で消化後、ポリアクリルアミド
ゲルより約０．４ＫｂのフラグメントＨＮを単離した。
このフラグメントＨＮと、プラスミドｐＣＤＭ８−３０
１ＴＭをＨｉｎｄIII およびＮｈｅI で消化後５’末端
を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、大腸菌ＭＣ
１０６１／ｐ３株を形質転換させ、プラスミドｐＣＤＭ
８−３０１ＴＭIIを得た（図１６）。
【００４９】さらに、塩基配列の確認を行っていない領
域を前記文献４０）に記載したプラスミドｐＴＺＢ−０
００の相当領域と乗せ換えた。プラスミドｐＣＤＭ８−
３０１ＴＭIIをＨｉｎｄIII およびＮａｒI で消化後、
ポリアクリルアミドゲルより約０．７Ｋｂのフラグメン
トＨＮａを単離した。また、プラスミドｐＴＺＢ−００
０をＮａｒI およびＢａｍＨI で消化しポリアクリルア
ミドゲルより約１．７ＫｂのフラグメントＮａＢを単離
した。この両フラグメントと、プラスミドｐＣＤＭ８
（Ｂｇｌ）をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで消化後５’
末端を脱リン酸化したものとを三者でライゲートさせ、
これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、プ
ラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII を得た（図１
７）。このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII はｔ
−ＰＡのシグナルペプチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ド
メインとｔ−ＰＡのＫ１、Ｋ２およびＡドメインをコー
ドする遺伝子を含有している。ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６
ドメインをコードする遺伝子およびその前後の配列は配
列番号１６に示した。
域を前記文献４０）に記載したプラスミドｐＴＺＢ−０
００の相当領域と乗せ換えた。プラスミドｐＣＤＭ８−
３０１ＴＭIIをＨｉｎｄIII およびＮａｒI で消化後、
ポリアクリルアミドゲルより約０．７Ｋｂのフラグメン
トＨＮａを単離した。また、プラスミドｐＴＺＢ−００
０をＮａｒI およびＢａｍＨI で消化しポリアクリルア
ミドゲルより約１．７ＫｂのフラグメントＮａＢを単離
した。この両フラグメントと、プラスミドｐＣＤＭ８
（Ｂｇｌ）をＨｉｎｄIII およびＢｇｌIIで消化後５’
末端を脱リン酸化したものとを三者でライゲートさせ、
これで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、プ
ラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII を得た（図１
７）。このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII はｔ
−ＰＡのシグナルペプチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ド
メインとｔ−ＰＡのＫ１、Ｋ２およびＡドメインをコー
ドする遺伝子を含有している。ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６
ドメインをコードする遺伝子およびその前後の配列は配
列番号１６に示した。
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【００５０】７．グリシンリンカーを包含するプラスミ
ドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇ、−１０１ＴＭ５Ｇ、−
３０１ＴＭ３Ｇ、−３０１ＴＭ５Ｇの構築 ｐＣＤＭ８−１０１ＴＭでＥ４５６とＫ２Ａをコードす
る遺伝子の間に連続した３個、あるいは５個のグリシン
を含む配列をコードする遺伝子（リンカー）を挿入した
プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３ＧおよびｐＣＤＭ
８−１０１ＴＭ５Ｇを構築した。また、ｐＣＤＭ８−３
０１ＴＭIII でＥ４５６とＫ１Ｋ２Ａをコードする遺伝
子の間に連続した３個、あるいは５個のグリシンを含む
配列をコードする遺伝子（リンカー）を挿入したプラス
ミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３ＧおよびｐＣＤＭ８−３
０１ＴＭ５Ｇを構築した。まず、本構築に必要なグリシ
ンリンカー配列を有する４種のオリゴヌクレオチドを合
成した（３Ａ：配列番号１７、３Ｂ：配列番号１８、５
Ａ：配列番号１９、５Ａ：配列番号２０）。
ドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇ、−１０１ＴＭ５Ｇ、−
３０１ＴＭ３Ｇ、−３０１ＴＭ５Ｇの構築 ｐＣＤＭ８−１０１ＴＭでＥ４５６とＫ２Ａをコードす
る遺伝子の間に連続した３個、あるいは５個のグリシン
を含む配列をコードする遺伝子（リンカー）を挿入した
プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３ＧおよびｐＣＤＭ
８−１０１ＴＭ５Ｇを構築した。また、ｐＣＤＭ８−３
０１ＴＭIII でＥ４５６とＫ１Ｋ２Ａをコードする遺伝
子の間に連続した３個、あるいは５個のグリシンを含む
配列をコードする遺伝子（リンカー）を挿入したプラス
ミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３ＧおよびｐＣＤＭ８−３
０１ＴＭ５Ｇを構築した。まず、本構築に必要なグリシ
ンリンカー配列を有する４種のオリゴヌクレオチドを合
成した（３Ａ：配列番号１７、３Ｂ：配列番号１８、５
Ａ：配列番号１９、５Ａ：配列番号２０）。
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【００５１】これら４種のオリゴヌクレオチドの５’末
端をリン酸化し、３Ａと３Ｂ、５Ａと５Ｂの組み合わせ
でアニーリングさせ、２本鎖化したリンカー３ＡＢおよ
び５ＡＢを得た。プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３
ＧあるいはｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇの構築について
はその概念図を図１８に示す。既述のプラスミドｐＵＣ
ＢＳｍＴＭをＥｃｏＴ１４I で消化し５’末端を脱リン
酸化したものと、リンカー３ＡＢあるいは５ＡＢをライ
ゲートさせ、これで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換さ
せ、それぞれのリンカーを１個有するプラスミドｐＵＣ
１０１ＴＭ３ＧあるいはｐＵＣ１０１ＴＭ５Ｇを得た。
これらのプラスミドのリンカーを含む領域の塩基配列を
ジデオキシ法を用いて確認した。両プラスミドをＢｇｌ
IIおよびＳｍａI で消化したものそれぞれと、既述のプ
ラスミドｐＣＤＭ８−１０１をＢｇｌIIおよびＳｍａI
で消化したものとをライゲートさせ、これらで大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、ｐＣＤＭ８−１０
１ＴＭ３ＧあるいはｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇを得
た。このプラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇあるい
はｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇはｔ−ＰＡのシグナルペ
プチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメイン、グリシンリ
ンカーとｔ−ＰＡのＫ２およびＡドメインをコードする
遺伝子を含有している。グリシンリンカーをコードする
遺伝子およびその前後の配列はｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ
３Ｇについては配列番号２１に示し、ｐＣＤＭ８−１０
１ＴＭ５Ｇについては配列番号２２に示した。
端をリン酸化し、３Ａと３Ｂ、５Ａと５Ｂの組み合わせ
でアニーリングさせ、２本鎖化したリンカー３ＡＢおよ
び５ＡＢを得た。プラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３
ＧあるいはｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇの構築について
はその概念図を図１８に示す。既述のプラスミドｐＵＣ
ＢＳｍＴＭをＥｃｏＴ１４I で消化し５’末端を脱リン
酸化したものと、リンカー３ＡＢあるいは５ＡＢをライ
ゲートさせ、これで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換さ
せ、それぞれのリンカーを１個有するプラスミドｐＵＣ
１０１ＴＭ３ＧあるいはｐＵＣ１０１ＴＭ５Ｇを得た。
これらのプラスミドのリンカーを含む領域の塩基配列を
ジデオキシ法を用いて確認した。両プラスミドをＢｇｌ
IIおよびＳｍａI で消化したものそれぞれと、既述のプ
ラスミドｐＣＤＭ８−１０１をＢｇｌIIおよびＳｍａI
で消化したものとをライゲートさせ、これらで大腸菌Ｍ
Ｃ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、ｐＣＤＭ８−１０
１ＴＭ３ＧあるいはｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇを得
た。このプラスミドｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇあるい
はｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇはｔ−ＰＡのシグナルペ
プチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメイン、グリシンリ
ンカーとｔ−ＰＡのＫ２およびＡドメインをコードする
遺伝子を含有している。グリシンリンカーをコードする
遺伝子およびその前後の配列はｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ
３Ｇについては配列番号２１に示し、ｐＣＤＭ８−１０
１ＴＭ５Ｇについては配列番号２２に示した。
【化２４】
【化２５】
【００５２】プラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３Ｇあ
るいはｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇの構築についてはそ
の概念図を図１９、図２０に示す。まず、プラスミドｐ
ＵＣ１９のＨｉｎｃII認識部位をＢｇｌII認識部位に変
換したプラスミドｐＵＣ１９ＡｆＢｇを作製し、これを
ＳａｃI およびＢｇｌIIで消化したものと、既述のプラ
スミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIIIをＳａｃI およびＢ
ａｍＨI で消化したものとをライゲートさせ、反応後Ｂ
ａｍＨI で消化し，これで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換させ、プラスミドｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃを作製した
（図１９）。
るいはｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇの構築についてはそ
の概念図を図１９、図２０に示す。まず、プラスミドｐ
ＵＣ１９のＨｉｎｃII認識部位をＢｇｌII認識部位に変
換したプラスミドｐＵＣ１９ＡｆＢｇを作製し、これを
ＳａｃI およびＢｇｌIIで消化したものと、既述のプラ
スミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIIIをＳａｃI およびＢ
ａｍＨI で消化したものとをライゲートさせ、反応後Ｂ
ａｍＨI で消化し，これで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換させ、プラスミドｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃを作製した
（図１９）。
【００５３】プラスミドｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃをＸｂ
ａI で消化し５’末端を脱リン酸化したものと、既述の
リンカー３ＡＢあるいは５ＡＢをライゲートさせ、これ
で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、それぞれのリン
カーを１個有するプラスミドｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃ３
ＧあるいはｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃ５Ｇを得た。これら
のプラスミドのリンカーを含む領域の塩基配列をジデオ
キシ法を用いて確認した。両プラスミドをＢｇｌIIおよ
びＮａｒI で消化したものそれぞれと、既述のプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１をＢｇｌIIおよびＮａｒI で消化
し５’末端を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、
これらで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、
ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３ＧあるいはｐＣＤＭ８−３０
１ＴＭ５Ｇを得た（図２０）。
ａI で消化し５’末端を脱リン酸化したものと、既述の
リンカー３ＡＢあるいは５ＡＢをライゲートさせ、これ
で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させ、それぞれのリン
カーを１個有するプラスミドｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃ３
ＧあるいはｐＵＣＡｆＢｇ−ＢＳｃ５Ｇを得た。これら
のプラスミドのリンカーを含む領域の塩基配列をジデオ
キシ法を用いて確認した。両プラスミドをＢｇｌIIおよ
びＮａｒI で消化したものそれぞれと、既述のプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１をＢｇｌIIおよびＮａｒI で消化
し５’末端を脱リン酸化したものとをライゲートさせ、
これらで大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３株を形質転換させ、
ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３ＧあるいはｐＣＤＭ８−３０
１ＴＭ５Ｇを得た（図２０）。
【００５４】このプラスミドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ３
ＧあるいはｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇはｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメイン、グ
リシンリンカーとｔ−ＰＡのＫ１、Ｋ２およびＡドメイ
ンをコードする遺伝子を含有している。グリシンリンカ
ーをコードする遺伝子およびその前後の配列はｐＣＤＭ
８−３０１ＴＭ３Ｇについては配列番号２３に示し、ｐ
ＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇについては配列番号２４に示
した。
ＧあるいはｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇはｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、ＴＭのＥ４、Ｅ５、Ｅ６ドメイン、グ
リシンリンカーとｔ−ＰＡのＫ１、Ｋ２およびＡドメイ
ンをコードする遺伝子を含有している。グリシンリンカ
ーをコードする遺伝子およびその前後の配列はｐＣＤＭ
８−３０１ＴＭ３Ｇについては配列番号２３に示し、ｐ
ＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇについては配列番号２４に示
した。
【化２６】
【化２７】
【００５５】８．本発明の血栓溶解タンパク質のＣＯＳ
−１細胞内での発現および分泌 前記の８種の発現プラスミド、ｐＣＤＭ８−１０１，−
１０１ＴＭ，−１０１ＴＭ３Ｇ，−１０１ＴＭ５Ｇ，−
３０１，−３０１ＴＭIII ，−３０１ＴＭ３Ｇ，−３０
１ＴＭ５Ｇを用いて既述の電気パルス法によりＣＯＳ−
１細胞を形質転換した。牛胎児血清１０％およびアプロ
チニン２．５μg ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４
時間培養後、培地を無血清かつアプロチニン無含有ＤＭ
ＥＭ培地に交換し、さらに９６あるいは１２０時間培養
を継続した。培養液を遠心後その上清を回収した。この
ようにして得られた培養上清中に含まれるｔ−ＰＡはそ
の９０％以上が一本鎖の形で存在していた。回収した上
清に１％牛血漿アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭ倍地
を１／９量添加し、凍結保存した。この凍結保存上清を
以後の活性測定に用いた。
−１細胞内での発現および分泌 前記の８種の発現プラスミド、ｐＣＤＭ８−１０１，−
１０１ＴＭ，−１０１ＴＭ３Ｇ，−１０１ＴＭ５Ｇ，−
３０１，−３０１ＴＭIII ，−３０１ＴＭ３Ｇ，−３０
１ＴＭ５Ｇを用いて既述の電気パルス法によりＣＯＳ−
１細胞を形質転換した。牛胎児血清１０％およびアプロ
チニン２．５μg ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４
時間培養後、培地を無血清かつアプロチニン無含有ＤＭ
ＥＭ培地に交換し、さらに９６あるいは１２０時間培養
を継続した。培養液を遠心後その上清を回収した。この
ようにして得られた培養上清中に含まれるｔ−ＰＡはそ
の９０％以上が一本鎖の形で存在していた。回収した上
清に１％牛血漿アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭ倍地
を１／９量添加し、凍結保存した。この凍結保存上清を
以後の活性測定に用いた。
【００５６】９．蛋白量の定量 前記の各培養上清中の各蛋白量は、酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）により測定され（バイオプール社製）、各上
清中の蛋白量を確認した。測定結果の代表的な例を表１
に示す。
ＬＩＳＡ）により測定され（バイオプール社製）、各上
清中の蛋白量を確認した。測定結果の代表的な例を表１
に示す。
【００５７】１０．測定（アッセイ）法 本発明の血栓溶解タンパク質のプラスミノーゲン活性化
活性は以下に記した方法で測定した。合成発色基質Ｓ−
２２５１を用いたインダイレクトクロモゲニックアッセ
イ（下記文献４２）に示される方法）に基づきプラスミ
ンに特異的なカビ（Ｋａｂｉ）社製の合成トリペプチド
色素原基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ・Ｈ2 Ｏ）を用いて定量的に測
定された。 ４２）ジェー．エイチ．ヴェルヘイジェン エトア
ル．，トロンボ．ヘモスト．４８（３） ２６６−２６
９ （１９８２） （Ｊ．Ｈ．Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４８（３） ２６６−２６９
（１９８２）） Ｓ−２２５１を用いた測定は、希釈した試料２０μｌを
反応混合液〔プラスミノーゲン１２５ｎＭ、Ｓ−２２５
１ ３５０μＭ、フィブリンフラグメント６ｍｇ／ｍｌ
（０．１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および５．０ｍ
ｇ／ｍｌゼラチン含有０．１５ｍＭトリスｐＨ７．８溶
液）、およびプラスミン（２．６９ＣＵ／ｍｌ）〕２０
０μｌと混合し、３７℃でインキュベートし、プレート
リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を
用いて経時的に４０５ｎｍにおける吸光を測定し、同社
の解析ソフトウェア、ソフトマックスを用いてデータ処
理を行った。この結果と上記蛋白量の測定結果から、一
定蛋白量当たりの活性（比活性）が決定された。その代
表的な例を表１に示す。
活性は以下に記した方法で測定した。合成発色基質Ｓ−
２２５１を用いたインダイレクトクロモゲニックアッセ
イ（下記文献４２）に示される方法）に基づきプラスミ
ンに特異的なカビ（Ｋａｂｉ）社製の合成トリペプチド
色素原基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ・Ｈ2 Ｏ）を用いて定量的に測
定された。 ４２）ジェー．エイチ．ヴェルヘイジェン エトア
ル．，トロンボ．ヘモスト．４８（３） ２６６−２６
９ （１９８２） （Ｊ．Ｈ．Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒ
ｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４８（３） ２６６−２６９
（１９８２）） Ｓ−２２５１を用いた測定は、希釈した試料２０μｌを
反応混合液〔プラスミノーゲン１２５ｎＭ、Ｓ−２２５
１ ３５０μＭ、フィブリンフラグメント６ｍｇ／ｍｌ
（０．１０％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０および５．０ｍ
ｇ／ｍｌゼラチン含有０．１５ｍＭトリスｐＨ７．８溶
液）、およびプラスミン（２．６９ＣＵ／ｍｌ）〕２０
０μｌと混合し、３７℃でインキュベートし、プレート
リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を
用いて経時的に４０５ｎｍにおける吸光を測定し、同社
の解析ソフトウェア、ソフトマックスを用いてデータ処
理を行った。この結果と上記蛋白量の測定結果から、一
定蛋白量当たりの活性（比活性）が決定された。その代
表的な例を表１に示す。
【表１】
【００５８】
【発明の効果】本発明の血栓溶解タンパク質は、ｔ−Ｐ
Ａまたはその改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部
または全部とが結合してなるハイブリッド体であり、Ｔ
Ｍの持つ抗凝固作用を発揮させるとともに、ＴＭを介し
た高血栓特異性を有するｔ−ＰＡとしての作用を同時に
併せ持つという特性を有する。従って、本発明の血栓溶
解タンパク質を有効成分として含有する血栓症治療剤
は、臨床においては再閉塞を生じ難く、かつ、副作用を
減じる効果が期待されるものである。
Ａまたはその改変体と、ＴＭのＥＧＦ様ドメインの一部
または全部とが結合してなるハイブリッド体であり、Ｔ
Ｍの持つ抗凝固作用を発揮させるとともに、ＴＭを介し
た高血栓特異性を有するｔ−ＰＡとしての作用を同時に
併せ持つという特性を有する。従って、本発明の血栓溶
解タンパク質を有効成分として含有する血栓症治療剤
は、臨床においては再閉塞を生じ難く、かつ、副作用を
減じる効果が期待されるものである。
【図１】ヒトＴＭ遺伝子およびその周辺の染色体ＤＮＡ
の制限酵素地図を示す。黒いボックス部分は、ヒトＴＭ
遺伝子を示す。
の制限酵素地図を示す。黒いボックス部分は、ヒトＴＭ
遺伝子を示す。
【図２】プラスミドｐＵＣ１１８−Ｅ４５６の構築概念
図を示す。
図を示す。
【図３】Ｅ４５６をコードする遺伝子部分をカセット化
したフラグメントＳＸ、フラグメントＳＥの構築概念図
を示す。
したフラグメントＳＸ、フラグメントＳＥの構築概念図
を示す。
【図４】Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣＤＭ
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
【図５】Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣＤＭ
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
【図６】Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣＤＭ
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
８−１０１の構築概念図の一部を示す。
【図７】Ｋ１Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣ
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
【図８】Ｋ１Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣ
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
【図９】Ｋ１Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐＣ
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
ＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
【図１０】Ｋ１Ｋ２Ａ変異体をコードするプラスミドｐ
ＣＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
ＣＤＭ８−３０１の構築概念図の一部を示す。
【図１１】Ｅ４５６−Ｋ２Ａをコードするプラスミドｐ
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
【図１２】Ｅ４５６−Ｋ２Ａをコードするプラスミドｐ
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
【図１３】Ｅ４５６−Ｋ２Ａをコードするプラスミドｐ
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
ＣＤＭ８−１０１ＴＭの構築概念図の一部を示す。
【図１４】Ｅ４５６−Ｋ１Ｋ２Ａをコードするプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
【図１５】Ｅ４５６−Ｋ１Ｋ２Ａをコードするプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
【図１６】Ｅ４５６−Ｋ１Ｋ２Ａをコードするプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
【図１７】Ｅ４５６−Ｋ１Ｋ２Ａをコードするプラスミ
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
ドｐＣＤＭ８−３０１ＴＭIII の構築概念図の一部を示
す。
【図１８】グリシンリンカーを包含するプラスミドｐＣ
ＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図を示す。
ＤＭ８−１０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−１０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図を示す。
【図１９】グリシンリンカーを包含するプラスミドｐＣ
ＤＭ８−３０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図の一部を示す。
ＤＭ８−３０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図の一部を示す。
【図２０】グリシンリンカーを包含するプラスミドｐＣ
ＤＭ８−３０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図の一部を示す。
ＤＭ８−３０１ＴＭ３Ｇ、ｐＣＤＭ８−３０１ＴＭ５Ｇ
の構築概念図の一部を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 9050−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 9/64 Ｚ 7823−4Ｂ 15/58 15/62 15/70 15/81 15/85 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｊ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 安喰 英夫 大阪市此花区春日出中３丁目１番98号 住 友製薬株式会社内
Claims (8)
- 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子または
その改変体と、トロンボモジュリンの上皮細胞増殖因子
様ドメインの一部または全部とが結合してなる血栓溶解
タンパク質。 - 【請求項２】 組織プラスミノーゲン活性化因子または
その改変体と、トロンボモジュリンの上皮細胞増殖因子
様ドメインの一部または全部とが１つまたは複数個のア
ミノ酸を有するリンカーを介して結合されていることを
特徴とする請求項１記載の血栓溶解タンパク質。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の改変体が、組織
プラスミノーゲン活性化因子のクリングル２および活性
ドメインからなる変異体（Ｋ２Ａ）、またはクリングル
１、クリングル２および活性ドメインからなる変異体
（Ｋ１Ｋ２Ａ）である請求項１または２記載の血栓溶解
タンパク質。 - 【請求項４】 請求項１または２記載の上皮細胞増殖因
子様ドメインの一部が、Ｅ４５６を含むものである請求
項１、２または３記載の血栓溶解タンパク質。 - 【請求項５】 請求項１、２、３または４記載の血栓溶
解タンパク質をコードしている塩基配列を含有するＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 形質転換された原核性生物細胞または真
核性生物細胞中において、請求項５記載のＤＮＡを発現
させ得る組換え発現ベクター。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換え発現ベクターで形
質転換された原核性生物細胞または真核性生物細胞。 - 【請求項８】 請求項１、２、３または４記載の血栓溶
解タンパク質を有効成分として含有することを特徴とす
る血栓症治療剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3029624A JPH0578397A (ja) | 1991-01-29 | 1991-01-29 | 血栓溶解タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3029624A JPH0578397A (ja) | 1991-01-29 | 1991-01-29 | 血栓溶解タンパク質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0578397A true JPH0578397A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=12281246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3029624A Pending JPH0578397A (ja) | 1991-01-29 | 1991-01-29 | 血栓溶解タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0578397A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0714982A3 (de) * | 1994-11-30 | 1999-09-08 | Grünenthal GmbH | Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften |
| JP2005538046A (ja) * | 2002-05-01 | 2005-12-15 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化されたトロンボモジュリン融合タンパク質 |
| EP0966545B1 (en) * | 1997-07-23 | 2006-01-04 | Rijksuniversiteit Leiden | Method for typing of minor histocompatibility antigen ha-1 |
-
1991
- 1991-01-29 JP JP3029624A patent/JPH0578397A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0714982A3 (de) * | 1994-11-30 | 1999-09-08 | Grünenthal GmbH | Chimäre Proteine mit fibrinolytischen und thrombinhemmenden Eigenschaften |
| EP0966545B1 (en) * | 1997-07-23 | 2006-01-04 | Rijksuniversiteit Leiden | Method for typing of minor histocompatibility antigen ha-1 |
| JP2005538046A (ja) * | 2002-05-01 | 2005-12-15 | シエーリング アクチエンゲゼルシャフト | 抗凝固剤としての新規組織因子標的化されたトロンボモジュリン融合タンパク質 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2610783B2 (ja) | ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター | |
| EP0227462B1 (en) | Novel peptide plasminogen activators | |
| JP2851423B2 (ja) | 活性化可能なフィブリン溶解および抗血栓症タンパク質 | |
| EP0365568A1 (en) | Proteins and derivatives thereof | |
| CA1341446C (en) | Tissue plasminogen activator analogs having modified growth factor domains | |
| AU624158B2 (en) | Variants of plasminogen activators and processes for their production | |
| EP0323149B1 (en) | Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C | |
| EP0297066B1 (en) | Novel fibrinolytic enzymes | |
| HK1007333B (en) | Variants of plasminogen activators and processes for their production | |
| JPH05194264A (ja) | 血栓塞栓障害治療剤 | |
| JPH03505967A (ja) | 組織プラスミノーゲン活性化因子類似体 | |
| JP2983997B2 (ja) | 脱―表皮細胞成長因子プラスミノーゲンアクチベーター | |
| JPH0578397A (ja) | 血栓溶解タンパク質 | |
| US5595736A (en) | Compounds and methods for treatment of thromboembolic disorders | |
| EP0316068A1 (en) | Modified low molecular weight plasminogen activator and method of preparation | |
| US5556621A (en) | Tissue plasminogen activator and method of use | |
| CA2162986A1 (en) | Proteins having fibrinolytic and coagulation-inhibiting properties | |
| CA1341445C (en) | Improved t-pa lacking the first kringle domain | |
| US5409700A (en) | Pharmaceutical compositions comprising modified and unmodified plasminogen activators | |
| JPH06133780A (ja) | 新規なｔ−ＰＡ改変体 | |
| US6682733B1 (en) | Fibrinolytic enzymes | |
| JPH0739374A (ja) | 新規なｔ−ＰＡ改変体 | |
| JPH04500752A (ja) | 修飾ｔＰＡをコードする修飾遺伝子配列、並びにその産物 | |
| US5045315A (en) | Process for treating thrombosis by administering poly-kringle plasminogen activator | |
| JPH01160482A (ja) | 新規なポリペプチド、その製法及び用途 |