JPH01502076A - プロテインｇをコ−ドするクロ−ン化されたストレプトコッカス遺伝子及びプロテインｇを生産するために組み替え微生物を構築するための用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コツカス遺伝子及びプロティンＧを生産するためにＡえ微生物を構築するための 用途 技術分野 この発明は、ストレプトコッカスのプロティンＧの生合成を司る遺伝子のクロー ニング及びこのクローン化された遺伝子によって形質転換された生物の、プロテ ィンＧ及びプロティンＧ様ポリペプチドを生産するための用途に関する。

最近、非免疫的機構によって抗体と結合する分子である。細菌性Ｆ、レセプター に対する興味が増大している。この結合は、抗体分子のＦａｂ部分に位置する抗 原認識部位に対するものではなく、抗体のＦ、部分に対するものである　Ｆ　、 領域は多くの型の抗体に共通であり。

従って細菌性Ｆｃレセプターは多くの塁の抗体と結合することができる。この性 質の故に細菌性Ｆ、レセプターは多くの免疫化学的用途において有用である。

細菌性Ｆ、レセプターは、主として抗体の検出、抗体の精製及び疾病の治療に対 して多くの一有用又は潜在的に有用な用途を有する。抗体の検出は、バイプリド ーマクローンについて特異的モノクローナル抗体の分泌を行なっているか否かの スクリーニング、免疫した動物の免疫応答の測定及び競合的結合分析による抗原 の定量な包含する。免疫学における実験室研究のいくつかの場面において必要と なる。細菌性Ｆｃレセプターを用いた抗体の検出方法は、他の検出方法によるよ りも感度が高く、妨害や高いバックグランドシグナルを受けにくいことかわかっ ている（ボイル、Ｍ、Ｄ、Ｐ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２：３３４−： １４０　（１９８４））。

Ｆｅレセプターはまた。蛋白薬剤の精製に用いられ、又は医薬として用いられる 抗体の精製に有用である。多くの方法が知られているが、一般的な方法は不動化 細菌性Ｆｅレセプターのカラム上でのアフイニテイクロマトグラフイーな用いる 。この方法は、カラムを何度も再使用することができ、精製の費用を下げること かてきるので好ましい。

細菌性Ｆｅレセプターの多くの潜在的な用途が現在研究されている。それらは、 生体外の不動化Ｆｅレセプターカラム上にプラズマを流通させ、処理したプラズ マを再び体内に戻すことを包含する０、例えばテナン・ディー・ニスら、Ｎ、　 Ｅｎｇ−Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０５：１１９５−１２００（１９８１）を参照のこ と。

最も良く知られた細菌性Ｆｃレセプターは、免疫グロブリンＧのＦｅ領域に結合 する、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）のプロ ティンＡである。他の細菌性ＦＣもまた同定されている。これらのうちの１つは グループＧストレフブトコツカスのプロティンＧとして知られている。プロティ ンＧはプロティンＡに類似しているが、プロティンＧはいくつかの重要な利点を 有する０例えば、プロティンＧは全てのヒトＩｇＧサブクラスに結合するが、一 方、プロティンＡは１ｇＧ３サブクラスに対して特異的であり、プロティンＡの ようにＩｇＡや１ｇＭ型の抗体と交差反応しない（マイレ・イー・ビーとクロン バール・ジー、”Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｊｅｓ 　ｏｆＤｅｆｉｎｅｄ　Ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｉｇ 　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ″■ｎ：ン編、レッドブック・リミテッド、チャートシイ 、サーレイ；　ｐｐ、　２０９−２１０　（１９８３））　、さらに、プロティ ンＧは、プロティンＡが弱く結合するか又は全く結合しないある動物のＩｇＧに 結合する。これらはウシ、ヒツジ及びヤギのＩｇＧ並びにウマＩｇＧのいくつか のサブクラスを包含する（レイス・ケイ・ジェイら、前掲）、プロティンＧはま た。ネズミのモノクローナル抗体のいくつかのサブクラスに対する結合において プロティンＡよりも優れていることがわかっている（ブジョーク・エル及びクロ ンバール・ジー、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３３：　９６９−９７４　（１ ９８４））。

これらの理由で、プロティンＧは種々の用途において選択される細菌性Ｆｃレセ プターとなりそうである。

現在、プロティンＧは、これを天然に産生ずるストレプトコッス菌株から精製に よって研究のために研究者によって得られている０例えば、ストレプトコッカス 細胞をタンパク質分解酵素（例えばパパイン又はトリプシン）で処理してプロテ ィンＧ（これは細胞壁タンパク質である）を可溶化し１次いで公知のタンパク質 精製操作（例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過及びアフィニティク ロマトグラフイー）によつてさらにプロティンＧを精製する（欧州特許出願、公 開番号０１３１１４２）。

プロティンＧの利点用途及び潜在的用途が与えられているので、このタンパク質 を組換えＤＮＡ法を用いて生産することが望まれる。従って、この発明の目的は プロティンＧをコードする遺伝子をクローニングし、このクローン化遺伝子で細 菌性宿主を形質転換してこれをプロティンＧ産生条件下で培養することによって プロティンＧを生産することである。

発明の開示 この発現は、プロティンＧのＩｇＧ結合性質を有するＦｅレセプターをコードす るクローン化された遺伝子を提供する。この遺伝子はストレプトコッカスＳｐ、 ランスフィールド拳グローブＧ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｓｐ＋＊Ｌａ ｎｃｅｆｉｅｌｄ　Ｇｒｏｕｐ　Ｇ）菌株から誘導され、クローニングベクター 中に挿入されている０組換えベクターによって安定的に形質転換された原核生物 の細胞が開示されている。１つの形質転換株は、プロティンＧの性質を有するタ ンパク質をコードする遺伝子を担う第１のベクターと、この遺伝子を含まず、第 １のベクターを宿主株中で安定に維持するための潜在的（ｅｒｙｐｔｉｃ）ヘル パープラスミドとして作用する第２のベクターとを含む、他の形質転換株は、ヘ ルパープラスミドを必要としないように。

プロティンＧタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ挿入物が修飾されたベ クターを有する。形質転換株はプロティンＧ産生条件下で培養される。

この発明はまた、この分子の活性結合部位のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列 の同定を提供する０発明者によつてクローンかされた１つの遺伝子は２つの活性 部位を有する。第２のクローン化された遺伝子は３つの活性部位を有する。

この発明はさらに、組換えビクターを用いたプロティンＧ様ポリペプチドの生産 を提供する。プロティンＧ様ポリペプチドは、プロティンＧのＩｇＧ結合特性を 示す１又は２以上のアミノ酸配列を含む。

図面の簡単な説明 第１図はプロティンＧをコードするＤＮＡ挿入物片のクローニングに用いるのに 適当なベクターであるプラスミドｐＧＸ１０６６の顕著な特徴を示す図である。

第２図はプロティンＧをコードするＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドベクター であるプラスミドｐＧＸ４５３３の部分的制限酵素地図を示す。

第３図はプロティンＧ遺伝子のＤＮＡ配列及び該遺伝子によってコードされるア ミノ酸配列を示す。

第４図はクローニングされたプロティンＧ遺伝子の制限、Ｍ素地図及びＩｇＧ結 合を担当するそのタンパク質産物の繰り返し構造を示す。

第５図はプロティンＧをコードする断片を含むバクテリオファージベクターであ る一ＧＸ４Ｓ４７の部分的制限酵素地図を示す。

第６図はＢ構造の２つの完全なコピーを含む末端からＢｌ及びＢ２の間の全ての アミノ酸配列を各バクテリオファージである■ＧＸ７８８０の部分的制限酵素地 図を示す。

第７図はプロティンＧをコードする断片を含むバチルス・ズブチルスを形質転換 するために用いられる組換えプラスミドベクターであるプラスミドｐＧＸ４５８ ２の制限酵素地図を示す。

第８図はストレプトコッカスから誘導されたクローニングされたプロティンＧ遺 伝子によってコードされるプロティンＧ上の活性部位であるＢｌ及びＢ２の位置 を示す。

第９図はストレプトコッカスから誘導されたクローニングされたプロティンＧ遺 伝子のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す、この遺伝子は３つの活性部位を含む プロティンＧをコードする。

第１Ｏ図はＧＸ８０５株及びＧＸ７８０９株から誘導されたプロティンＧ遺伝子 の繰り返し構造間の関係を示す。

この発明はクローニングされたプロティンＧ遺伝子に関する。プロティンＧ遺伝 子を含むＤＮＡ断片はストレプトコッカスＳＰ、　、ランスフィールド・グルー プＧ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｓｐ、、　Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ　Ｇｒｏ ｕｐ　Ｇ）株から単離されクローニングベクターに挿入された。この発明の他の 局面は、クローニングされたプロティンＧ遺伝子を含む組換えベクターて宿主細 胞を形質転換し、形質転換された細胞をタンパク賀産生条件下にて培養すること によりて細胞にプロティンＧを生産させることによる。プロティンＧの生産に関 する。

この発明のもう１つの局面は、１分子当たり工ないし２０のタンパク質Ｇ結合部 位を含むプロティンＧ類似物質の生産に関する。このプロティンＧ類似物質は次 の式で表わされる。

−（−Ｂ−ｂ−）ゎ− ここで、Ｂは第９図に示されるＢｌ若しくはＢ２又はＢ３で示されるＢｌ及びＢ ２を含むハイブリッド配列を示し、ｂは第８図で示されるとおりであり、ｎは１ ないし２０である。

「へイブリット配列」という語は、Ｂ１及びＢ２に対応するそれぞれの配列の部 分を含むＤＮＡ配列又はアミノ酸配列であって、プロティンＧの免疫グロブリン 結合性を保持するものを意図する。このようなへイブリッド配列は第９図に示さ れＢ３とラベルされている。このハイブリッド配列はＢ１の２４５−２８２の配 列と融合したＢ２の２９８−３１４のアミノ酸配列に対応するＢ１の部分を含む 、従って、プロティンＧの免疫グロブリン結合性を保持した全てのこのようなハ イブリッド配列がこの発明の範囲内に入ることを意図する。

プロティンＧ遺伝子をクローニングし、大腸菌や枯草菌のような細菌宿主中でプ ロティンＧを生産させるこの発明の方法は、このタンパク質な得るための現在の 方法に比べて多くの利点を有する。この発明の方法によると、比較的高濃度の細 菌性プロティンＧ産生を得ることができ、タンパク質はより容易に単離できる条 件下で生産され、そしてタンパク質は非病原性宿主中で生産することができる。

クローニングされた遺伝子は種々の多コピー発現ベクター中に挿入し、組換え発 現ベクターで形質転換された培養された大腸菌中てこの貴重なＩｇＧ結合タンパ ク質を高められた濃度で得ることができる。プロティンＧを大腸菌又は枯草菌細 胞中で行なうことは、共通的に病原性の菌株であるプロティンＧ産生ストレプト コッカス菌株を培養することよりも好ましい。

さらに、ストレプトコッカス細胞の細胞壁からプロティンＧを遊離させるために 用いられているパパインやトリプシンのようなタンパク質分解酵素はプロティン Ｇ産物を分解するかもしれない、従ワて、ストレプトコッカス細胞からプロティ ンＧを単離する公知の方法は低分子量の分解された形態にあるプロティンＧであ るかもしれない。

この発明において、プロティンＧ遺伝子をクローニングする最初の工程は、プロ ティンＧを産生ずるストレプトコッカス菌株を単離することである。これは、い ずれかの適当な免疫分析技術を用いて、種々の菌株についてＩｇＧ結合活性を調 べることによって行なうことができる。出願人によって採用された方法は、以下 の実施例の部分で詳細に記載されているコロニー免疫分析法である。　ＩｇＧ結 合活性を有することがわかった菌株について、次に１ｇＧ３及び非分画１ｇＧ　 （ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎｅｄ　ＩｇＧ）との結合性を調べた。なぜなら１ｇＧ３ に対する結合性はプロティンＧに付随する望ましい性質であるからである。　１ ｇＧ３又は非分画１ｇＧでコーティングされた赤血球を用いる赤血球凝集分析（ 下記実施例において詳述する）はプロティンＧ産生菌株を同定する便利な方法で ある。黄色ブ（１９７７）］のような公知のプロティンＡ産生菌株を対照として 用いることができる。なぜなら、プロティンＡは非分画ＩｇＧと結合するが１ｇ Ｇ３とは結合しないからである。

プロティンＧを産生ずることがわかった菌株からの染色体ＤＮＡの単離は、所望 の細胞密度にまでその菌株を栄養培地中で培養し、この分野において知られたい ずれかの従来の化学的、４１１械的及び／又は酵素的方法によって細胞を溶解す ることによって行なわれる。従来の抽出及び沈殿操作が染色体ＤＮＡを単離する ために用いられる。クローニングにとって適当な大きさのＤＮＡ断片は、超音波 崩壊又はブレングー中での高速攪拌のような公知の機械的方法によって、又は、 ランダムな断片を与える、ＤＮＡ５ｅ　Ｉによる部分的消化若しくは特異的部位 で開裂する制限エンドヌクレアーゼのような酵素的方法によって得られる。

次に染色体ＤＮＡはクローニングベクター中に挿入される。いずれの適当なプラ スミド又はバクテリオファージをも用いることができる。適当なベクターである ためには、いくつかの有用な性質を有しているべきである。ベクターは意図する 細菌性宿主細胞中で機能する複製開始点を有しているべきであり、また、ベクタ ーで形質転換された宿主細胞の同定を助ける選択マーカー（抗生物質耐性のよう な）を有しているべきである。ベクターは挿入されたＤＮＡ断片を受け入れるこ とができ、それでもなお正常に複製することができるべきである。

好ましくは、ベクターは、その複製能力を破壊することなくＤＮＡ断片を挿入す ることができるｌ又は２以上の固有の制限エンドヌクレアーゼ認識蔀位を有して いる。

適当なりローニングベクターは、ラムダｇｔｌ１Ｍ１３■ｐ９　（ベセスダ・レ サーチ・ラボラトリーズから市販）のような種々のファージＭ１３　ｉ導ベクタ ー、ｐＢＲ３２２のようなプラスミド及び他の多くのもの［０１ｄ　ａｎｄＰｒ ｉｍｒｏｓｅ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔ ｉｏｎ、　２ｎｄ。

Ｅｄ、、　Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆ、　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｇｓ、　２３− ３５　ａｎｄ　４６−４７（１９８１）］を包含する。出願人は第１図に示すｐ ＢＲ３２２誘導プラスミドｐＧＸ１０６６を用いた。

ストレプトコッカスＤＮＡはホモポリメリックティリング（ｈｏｓｏｐｏｌｙｍ ｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ）のような方法又はリンカ−分子（０１ｄとＰｒｉｍ ｒｏｓｅ、前掲９２頁）を用いることによってクローニングベクター中に挿入さ れる。ベクターを制限エンドヌクレアーゼで直線化し、染色体ＤＮＡをまた。直 線化されたベクター分子の末端に連結可能なりＮＡ断片を与える制限エンドヌク レアーゼで消化することが有利である。ストレプトコッカス誘導ＤＮＡ断片はこ のようにして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ酵素を用いて標準的な反応でクローニングベ クター中に挿入される。

細菌細胞は組換えクローニングベクターで標準的な方法を用いて形質転換され、 細菌コロニーは、プロティンＧを産生じているかどうかクローニングされる。下 記の実施例において記載されているコロニー免疫分析や赤血球凝集分析はプロテ ィンＧを産生ずる組換え菌株の同定に適当である。下記の実施例Ｉにおいてより 詳細に説明するように、最初の同定された陽性コロニーは不安定である。このク ローンを数回再画線培養することを含む精製によって、安定でプロティンＧを産 生ずるこのクローンの誘導体が得られた。この菌株を大腸菌ＧＸ７８２０と命名 した。

この菌株からのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分析し次いでゲル電気泳動 を行なった。この菌株は２つのプラスミドを含むことがわかつた。　ｐＧＸ１０ ６６Ｘと命名された１つのプラスミドは９ＧＸ１０６６クローニングベクターと ほぼ同じ大きさであり、ＰＧＸ４５３０と命名された他方のプラスミドはｐＧＸ １０６６が１１キロ塩基対（ｋｂｐ）の挿入断片を含むものと思われる。出願人 は特定の理論に拘束されることを望まないが、実施例においてより詳細に例示す るように、　ｐＧＸ１０６６Ｘは、アンピシリン耐性遺伝子がもはや無傷の状態 ではなくなったｐＧＸ１０６６の誘導体である、「潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）ヘ ルパープラスミド」であるように思われる０元の形質転換株はおそら＜　ｐＧＸ １０６６とｐＧＸ４５３０を含んでおり、　ｐＧＸ１０６６が存在することによ って与えられるアンビシジン耐性に基づく選択圧力の欠如の故にｐＧＸ４５３０ が失われてしまうために不安定であったのであろう、アンピシリン耐性遺伝子を 不活性化する突然変異を有すルｐＧＸ１０６６Ｘが一旦現ｔ）れると、ｐＧＸ４ ｓ３０（無傷のアンピシリン耐性遺伝子を有する）を保持した宿主細胞のみがア ンピシリンプレート上で生き延びることができる。プラスミドｐＧＸ１０６６Ｘ は１両方のプラスミドを含む細胞中に保持される。これはおそらく、ｐＧＸ１０ ６６Ｘが細胞内でのｐＧＸ４５３０のコピー数を制限する働きをするからであろ う、プラスミドｐＧＸ４５３０のみが存在する場合、宿主は死ぬ（実施例Ｉ＃照 ）が、ｐＧＸ１０６６Ｘの存在により宿主中のｐＧＸ４５：１０のコピー数が許 容できる程度に抑制される。これらのプラスミドは同一の「非適合的グループ」 からのものであり、すなわち、これらのプラスミドは細胞中に維持されることを 互いに競合し、そのため、それぞれのプラスミドは他のプラスミドの宿主細胞中 でのコピー数を制限する。大腸菌株ＧＸ７８２０がメリーランド州ロックビルの アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、その受託番号は５ ３４６０である。

大Ｂ菌菌株を菌株ＧＸ７８２０から単離したプラスミドの混合物で形質転換した 。形質転換により、多数の小さな強い陽性のコロニーが得られ、それらのうちの わずかなもの（約２０％）がＧＸ７８２０に似ていた。これらの小さな陽性コロ ニーから、ヘルパープラスミドを含まず、元のＧＸ７８２０よりもプロティンＧ についてより強い陽性を示す２つの安定な変異株が単離された。　ＧＸ７８２３ と命名された１つの菌株は、ＰＧＸ４５３０プラスミド中の挿入断片から２キロ 塩基対（ｋｂｐ）の断片が欠失したプラスミドｐＧＸ４ｓ３３）を有している。

大ＩＩ　＠　ＧＸ７８２３株はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクションに寄託され、その受託番号は５３４６１である。Ｇ Ｘ７８２２と命名された他方は、ＧＸ７８２３株によって担持されるプラスミド 中の欠失部位の末端に非常に近接した部位に３　ｋｂｐの挿入ＤＮＡを元の挿入 断片中に獲得していた。プロティンＧ遺伝子は、　ｐＧＸ４５３３のストレプト コッカスＤＮＡ挿入断片上の１．９キロ塩基対（ｋｂｐ）の位置にあることがつ きとめられた。

プロティンＧの産生レベルを高めるために、クローニングされたプロディンＧ遺 伝子を種々の発現ベクター中に挿入することができる０発現ベクターは、遺伝子 発現、すなわちＤＮＡのｍ　ＲＮ　Ａへの転写及びそれに統く、ｍＲＮＡの、遺 伝子がコードするタンパク質への翻訳に必要なりＮＡ配列を含む「調節領域」を 含む、プロティンＧ遺伝子はその天然の発現シグナルを含んでいるかもしれない し、あるいはこれらのシグナルを除去し、クローニングされたプロティンＧ遺伝 子の構造部分（すなわち、遺伝子のタンパク質をコードする部分）が従来の方法 に従フて、選択された宿主生物中でプロティンＧ遺伝子を支配することができる 、発現ベクター中に含まれる他の発現シグナルと操作的に融合することがてきる ０例えば、宿主微生物が大腸菌である場合には１発現ベクターは、虫プロモータ ー／オペレーター、撫プロモーター／オペレーター、バクテリオファージラムダ Ｐｔ、プロモーター／オペレーター及び他の多くのような、公知の調節領域を含 んでいてよい。

この発明の１つの具体例において、発現ベクターはさらに、宿主微生物の染色体 の１つの領域と類似するＤＮＡ配列を含む、この構成により、ベクターが宿主染 色体のホモロジーを有する領域中に直線的に一体化することが可能になる。この 方法の１つの利点は、ベクターを含まない細胞にとって好適な負の選択の故に、 宿主からプロティンＧ配列が消失する可能性が低いことである。

クローニングされたプロティンＧ遺伝子を含む形質転換された細胞は、該細胞に よつてプロティンＧが産生される条件下で培養される。大規模発酵操作を包含す る培養条件はこの分野においてよく知られている。細胞は、生理的に適合性を有 するあらゆるｐｔｉ及び温度条件下において、同化可能な炭素原、窒素源及び必 須の無機物を含む、細胞の生育を支持するあらゆる適当な栄養培地中で培養する ことができる。プロティン産生培養条件は、宿主細胞を形質転換するのに用いら れたベクターのタイプによフて異なる０例えば、ある発現ベクターは、遺伝子の 発現を開始してその結果プロティンＧの生産をもたらすのに、ある温度での細胞 増殖を必要としたり。

あるいは細胞増殖培地にある化学物質を添加することを必要とする。従って、「 プロティン産生条件」という語は、いずれの１つの培養条件にも限定される意味 では用いていない。

クローニングされた遺伝子を、先にプロティンＡをコードする遺伝子に対して適 用され、共通の譲受人に譲渡された米国特許第４，６１７，２６６号（１９８５ ）　（その全体がこの明細書に組み入れられたものとする）に記載された方法に より枯草菌に移入することが有利である。これらの方法に従９て、プロティンＧ は枯草菌中で合成することができる。

プロティンＧの機能的に活性な部分は、修飾された形態のクローン化されたプロ ティンＧ遺伝子を有する大腸菌株によって産生されるタンパク質のＩｇＧ結合活 性を調べることによって、繰り返し構造に存在することがつきとめられた。従っ て、この発明はまた、プロティンＧの１又は２以上の機能的に活性な部分をコー ドするクローン化された遺伝子、及びプロティンＧの免疫グロブリン結合性質を 有する。このようにして生産されたタンパク質にも関する。プロティンＧの活性 部位をコードする遺伝子の同定及び単離は下記実施例ｍに詳細に述べられている 。プロティンＧ中の２つ及び３つの活性部位をそれぞれコードする２つの遺伝子 のＤＮＡ配列及びそれによってコートされるアミノ酸配列が第８図及び第９図に 示されている。この情報により、プロティンＧ活性の複数の部位を有するプロテ ィンＧ類似分子を生産することか可能になった。公知の合成方法を用いて、１つ のアミノ酸配列中に１ないし２０又はそれ以上の活性部位をコードする合成遺伝 子を構築することもでき、それによってより高い結合効率を与え、得られる物質 の能力を高めることができる。好ましいプロティンＧ類似物質は１ないしｌＯの 活性部位を有し、より好ましい物質は工ないし５の活性部位を有する。

また、プロティンＧの免疫グロブリン結合性質を有し、アミノ酸の欠失若しくは 置換され又はアミノ末端若しくはカルボキシル末端にさらなるアミノ酸が付加さ れたタンパク質もこの発明の範囲に入る。

宿主細胞からプロティンＧを回収し精製するために、いずれの公知のタンパク質 精製方法をも用いることができる。必要ならば、細胞は、公知の化学的、物理的 及び／又は酵素的手段を用いて溶解することができる。

プロティンＧは次に、スジョクイストによって米国特許第３，８５０，７９８号 （１９７４）に記載されたような固定化免疫グロブリンへの吸着、イオン交換又 はゲルクロマトグラフィー、沈殿（例えば硫酸アンモニウムて）又はこれらの方 法の組合せのような、標準的な方法を用いて細胞溶解物から精製することができ る。

次の実施例はこの発明を例示するものであり、この発明の範囲を限定するものと 解釈されない。

実施例■ ストレプトコッカスＧ遺伝子の大腸菌へのクローニングランスフィールドグルー プＧのストレプトコッカスを病院から得、臨床単離物から１１の独立した単離菌 株を得た。それぞれの菌株について、次のコロニー免疫分析法を用いてＩｇＧへ の結合能力を調べた。菌株を、ニトロセルロースのシート及び（上層）酢酸セル ロースのシートがその上に積層されたＬ−Ｂｒｏｔｈ寒天プレ寒天プレー線上養 した。細菌コロニーが酢酸セルロースシート上に見えるようになるまで、プレー トを３７℃でインキュベートした。

次にニトロセルロースシートをプレートから除去し、　ＩｇＧ結合結合タンパク リ下の免疫化学的方法を用いてシート上て検出した。シートを先ず、ウシ血清ア ルブミ：／　（０，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，０及び０．１５　Ｍ 　ＮａＣ１を含む３、Ｏｗ／ｖ　Ｚ　ｒ　）リス塩水」中）で処理してニトロセ ルロース部位をブロックし、以下の工程においてニトロセルロースに抗体が非特 異的に結合されることを最小化した。このシートを次に正常ウサギ血清（３ｗ／ ｖ＄のウシ血清アルブミンを含むトリス塩水で１：１０００に希釈）で２３℃で １時間処理し、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗つイサギＩｇＧ　（同様に希釈）で 処理し、最後に４−クロロ−１−ナフトール（０，６ｍｇ／■ｌ）及び過酸化水 素（０，２体積のメタノールを含む０．０６　ｗ／ｖ　ｚトリス塩水中）で処理 し、インキュベーション工程間にシートをトリス塩水で洗った。ニトロセルロー スシート上のブルーのスポットがＩｇＧ結合結合タンパクリ在を示し、ブルーの 領域はＩｇＧ結合結合タンパクリ生じた細菌コロニーに対応する。

菌株のうち９つが陽性、すなわちＩｇＧに結合することがわかった。もっともそ の程度は異なっていた。数個の菌株を次の赤血球凝集分析を用いて１ｇＧ３と結 合する短刀を試験した。ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）　（カッペル・ラボラトリーズ 、ペンシルベニア州マルバーン）をアドラーとアドラーによって記載された方法 ［Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ■ｏ１．７０＝４５５−４６６　（１９８０）］に本質 的に従って免疫グロブリンでコーティングした。　ＲＢＣをリン酸緩衝液（ＰＢ Ｓ、８．４　ｇ／ＩのＮａＣ１，１，１ｇ／ｌのＮａ、ＨＰＯ，及び０．２７　 ｇ／ＩのＮａＨｔＰＯｎを含む）で洗い、２．５■ｇ／＋ｓｌのスズ酸ＰＢＳ溶 液で３７℃で１５分間処理した。細胞を遠心によつて集め、　Ｃａ）　ｍヒト免 疫グロブリンＧ（シグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリー州セント・ルイス から入手可能）、（ｂ）又は１ｇＧ３ミエローマタンパク質又は（ｃ）ＰＢＳの みを０．２６／ｍｌの濃度で含むＰＢＳ中に再懸濁した。３７℃で３０分間イン キュベートした後、遠心によってＲＢＣを集めＰＢＳで洗った。凝集分析のため に、コートＲＢＣの１％懸濁液５０ＩＬ＋を被検細胞抽出物５０．１と混合し、 多穴ディツシュの円錐ウェル中でＰＢＳ中で低減希釈した。凝集しなかつたＲＢ Ｃはウェルの底に落ち着き小さなベレットを形成し、一方、凝集したＲＢＣはウ ェルの壁上により拡散した沈殿を形成する。

陽性のグループＧストレプトコッカス菌株は非分画ＩｇＧでコートされた赤血球 と同様に効率的に１ｇＧ３でコートされた赤血球を凝集した。これはプロティン Ｇ産生菌株について予想されることである。対照的に、プロティンＡを産生ずる 黄色ブドウ球菌コワン■細胞は予想された通り、非分画ＩｇＧでコートされた赤 血球を凝集したが、１ｇＧ３でコートされた細胞に対しては活性を示さなかった 。どの細胞も、ＰＢＳのみでインキュベートされた赤血球、すなわち、コートさ れていない赤血球を凝集しなかった。

同じ赤血球凝集試験を単離されたストレプトコッカス培養物からの上清画分及び 細胞抽出物について行なったところ、これらの単離物は異なる位置にＩｇＧ結合 活性を有しているように思われた。いくつかの菌株では、活性は主として細胞に 結合して現われ、いくつかの菌株では主として培養上清中に活性が見出され、ま たいくつかの菌株はその中間であった。異なる位置にＩｇＧ結合活性を有する３ つの菌株をプロティンＧ遺伝子のクローニングのためのＤＮＡ源として選択した 。

それぞれの菌株の細胞を、２０ｍＭのり、Ｌ−スレオニンを含む２５０１のトッ ド−ヒユーウィツト汁（Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ　ｂｒｏｔｈ）　（フィッシャ ー・サイエンティフィック、バージニア州すッチモンドから市販）中で培養した 。４時間培養後、グリシンを培地に５％　（ｗ／ｖ）の濃度になるように添加し た。５時間培養後、細胞を遠心によって回収した。この時、細胞密度は６００　 ｎｍの吸光度が約０．５ないし１．０に達していた。細胞ベレットをＰＢＳで洗 い、液体窒素中で凍結させ、−７０℃で貯蔵した。解凍後、２００ＩＬｌの５■ ｇ／ｍｌのムタノリシン（■ｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）（シグマ・ケミカル・カン パニーから市販）が添加されている、０．５１１のショ糖を含む１０１の８７培 地［バサンタとフリース、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１４４：１１１ ９−１１２５　（１９８０）］で洗い、同培地中に再懸濁した。

３７℃で４５分間インキュベートした後、得られたプロトプラストを遠心により ベレット化し１次いで１００　ｍＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０、１５０ａＭ　Ｎ ａＣ１及びＱ、５　Ｂ／＋ｍｌ　（７）ブ０テイナーゼＫを含む溶液中に再懸濁 することによって浸透圧的に細胞を溶解したい３７℃で５５分間インキュベート した後、アルファートルエンスルホニルフロリド（フェニルメタンスルホニルフ ロリド又はＰＭＳＦとも呼ばれ、例えばシグマから市販）を最終濃度か２１にな るように加え、この混合物を７０℃で１．５分間インキュベートしてプロテイナ ーゼＫを不活性化した。細胞溶解物をクロロホルム／イソアミルアルコール（２ ４：Ｉ）で３回抽出してさらにタンパク質を除き１等体積のイソプロパツールを 水層に加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡはスプール」二に巻き取るこ とによって回収し、７０％エタノールで洗い、真空中で乾燥した。

ＤＮＡベレット（３つの菌株のそれぞれからのもの）を、　０．５　＋ｉｌの０ ．０Ｉ　Ｍｌ−リス−〇ＣＩ　（ｐ）ｌ　８．０）ハ１ＥＤＴＡ／ロ１口Ｓ　Ｍ 　ＮａＣ１溶液に再懸濁した。　１００　ｍＭトリス−ＨＣｌ　、　ｐｌ　７． ８．１５０　ｍ１ｌｌＮａＣＩ及び１０　ｍＭ　ＭｇＣＩｚを含む緩衝液１００ ＪＬｌ中に懸濁された懸濁液の２５ＡＬ１に２単位の制限エンドヌクレアーゼＭ ｂｏｌ（市販）を加えることにより、単離された染色体ＤＮＡの一部を部分的に 消化した０反応混合物を３７℃て１３分間インキュベートし、次いで７０°Ｃで １０分間インキュベートした。消化したＤＮＡを０．８＄　アガロースゲル上で １５時間、０．３５ボルト／Ｃ璽で電気泳動に付した。約４ないし９キロ廖基対 （ｋｂｐ）のＤＮＡ断片を含むゲルの部分をゲルから切り出し、つぶしてＤＮＡ の回収を容易にした。Ｈ２Ｏで飽和した同体積のフェノールをつぶしたゲル部分 に加え、この混合物を一７０℃で１時間凍結した。予備解凍なしに、混合物をエ ッペンドル７マイクロ遠心機中で１５分間遠心し、水層を同体積のフェノールで ２回、同体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４ ：ｌ）で１回抽出した。水層からのＤＮＡは２．５体積の９５％エタノール及び 担体としての３０．ｇのグリコーゲンを加えることによフて沈殿させた。

染色体ＤＮＡ断片が挿入されたクローニングベクターは第１図に示すプラスミド ｐＧＸＩ０６６であった。このプラスミドは、クローン化されるＤＮＡｌｉ片の 挿入に有用な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を近接した列として有している。

クローニング部位の列は２つの転写ターミネータ−によって区切られている。プ ラスミドｐＧＸ１０６６で形質転換された菌株ＧＸ１１７０を構成する大ＩＩ菌 株ＧＸ１１８６はＡＴＣＣに寄託され、その受託番号は３９９５５である。：３ ｕ−ｇのプラスミドｐＧＸ１０６εＤＮＡを削成エンドヌクレアーゼＢａｍ［（ 市販されており、製造者の使用書に従ワて用いた）で消化した。消化したプラス ミドＤＮＡを次に１単位の仔つシ腸アルカリフォスファターゼ（ベーリンガーー マンへイムから入手し、製造者の使用書に徒って用いた）で３７℃で３０分間処 理した０反応混合物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５ ：２４＝１）で抽出した後、Ｏ−１体積の２Ｍ酢酸す　〜トリウム、１０　ｍＭ 　ＥＤＴＡ　、　２．５体積の９５％エタノ−Ｊし及び担体としての１０　ｐｇ のグリコーゲンを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。０．５μｇのｐＧＸ １０６６ベクターＤ　Ｎ　Ａ　（ＢａｍＨＩ消化、７オスフアターゼ処理）を次 いでｏ、ｚ　＃Ｌｇの部分的にＭｂｏｌで消化した。上記のように調製したスト レプトコッカス染色体ＤＮＡに連結した。

１０ＪＬＩの反応混合物は１単位の７４ＤＮＡリガーゼ（市販されており、製造 者の指示に従って用いた）を含んでおり、これを４℃で２０時間インキュベート した。

大腸菌５Ｋ２２６７　（Ｆ−ｇｉリ−ｔｈｉ　ＴｌゝｈｓｄＲ４ｅｎｄＡｇｂｃ Ｂｌｓ、大Ｓ菌ジェネティック・ストック・センター、エール大学、コネクチカ ット州二ニー・バーベンかう入手）細胞を標準的な塩化カルシウム処理により形 質転換に対してコンピーテントな状態にし、標準的な形質転換操作［Ｌｅｄｅｒ ｂｅｒｇとＣｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１１９：１０７２−１ ０７４（１９７４月に従って、０−２５　ｍｌのコンビ−テント細胞を２０ｐ＋ のライゲーション混合物と混合した。細胞を次いで遠心によってベレット化し、 ０．３１のＬ　ｂｒｏｔｈ中で再懸濁した。　１００　ｐｇ／ｍｌのアンピシリ ンを含み、ニトロセルロースシート及び（上層）酢酸セルロースシートをその上 に積層した３つのＬ　ｂｒｏｔｈ寒天プレート（免疫分析プレート）上に細胞を ０．１１づつプレートした。プレートは、酢酸セルロースシート上にｍ菌コロニ ーが見えるようになるまで３７℃でインキュベートした。

ニトロセルロースシートを次いでプレートから除去し、上記した免疫化学的操作 を用いてシート上のＩｇＧ結合タンパク質を検出した。シートを先ずウシ血清ア ルブミン（トリス塩水中３．０＄　ｗ／ｖ）で処理してニトロセルロース部位を ブロックして以下の工程において抗体がニトロセルロースに非特異的に結合され ることを最小化した。シートを次に、　３．０＄　ｗ／ｖウシ血清アルブミンを 含むトリス塩水で１＝１０００に希釈された正常ウサギ血清て２３℃で１時間処 理し１次いでパーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ　（同様に希釈）で処理 し、最後に４−クロロ−１−ナフトール（０，６Ｉｇ／ｍｌ）及び過酸化水稟（ ０，２体積メタノールを含むトリス塩水中ｏ、ｏｓｓ豐／ｖ　）て処理し、イン キュベーション工程間はトリス塩水で洗った。

１つの陽性コロニーが同定され、これは、ストレプトコッカス菌株ＧＸ７８０９ 　（クローニングのためのＤＮＡが単離された３つのストレプトコッカス菌株の １つ）から誘導された形質転換株を含むプレート上に位置することが確かめられ た。この陽性コロニーを免疫分析グレート（上述のように１００　ｔｈｇ／■ｌ アンピシリンを含む）上で画線培養し、精製された形質転換株を得た。ニトロセ ルロースシートを上述のようにして処理すると、何間６の陰性コロニーの間にわ ずかに数個の陽性コロニーが見出された０元の形質転換株が不安定であると思わ れたので、画線培養を繰り返したところ、何間６の陰性コロニーに混じってわず かに１つだけ陽性コロニーが見出された。他の再画線培養のシリーズではほとん どのコロニーが陽性であった０元の陽性形質転換株よりも明らかに安定な誘導体 である１つの陽性コロニーを単離し、大腸菌ＧＸ７８２０株と命名した。大腸菌 ＧＸ７８２０株はメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクションに寄託されており、その受託番号はＡＴＣＣＮｏ。

５３４６０である。

元の陽性コロニーに加え、いずれのコロニーとも関連づけることができなかった 、数個の小さな、しかし強い陽性を示すスポットが観察された。これらのスポッ トは、再画線培養において陽性の娘細胞を与えなかった。

標準的な方法を用いて大腸菌ＧＸ７８２０からプラスミドＤＮＡを単離し、プラ スミドＤＮＡを制限酵素分析し。

次いで電気泳動に架けた。菌株は２つの型のプラスミドを含むことが見出された 。１つのプラスミド（ｐＧＸ１０６６Ｘと命名）はｐＧＸ１０６６と同じサイズ であり、一方、他のもの（ｐＧＸ４５３（ｌと命名）は明らかに１ｌｋｂｐの挿 入断片を含むＩ）ＧＸ１０６６であった。コンビ−テントな大腸菌５Ｋ２２６７ を次いてＧＸ７８２０から単離されたプラスミドの混合物で再形質転換し、形質 転換株を１００　ｐｇ／ｍｌアンピシリン含有免疫分析プレート上で選択した。

２つのタイプの陽性形質転換株が得られた。多数派のものは、小さな強い陽性の コロニーを形成し、それらのほとんどは増殖しなかった。少数派のものは正常な サイズを有する点でＧＸ７８２０に類似しており、より容易に増殖することがで きた。これらの結果の原因を明らかにするために、コンビ−テントな大腸菌Ｓに ２２６７を、ゲル精製プラスミドで以下のようにして形質転換した。

形質転換Ａ　：　ｐＧＸ４５３０　（Ｄミ形質転換Ｂ　二ｐＧＸ１０６６Ｘ（７ ）ミ形質転換Ｃ：　ｐＧＸ４５３０とｐＧＸ１０６６Ｘとの混合物結果は以下の 通りであった。

形質転換Ａ：小さな、強い陽性のコロニーでそのほとんどは増殖できなかった。

形質転換Ｂ：形質転換株なし 形質転換Ｃ：多くの小さな、強い陽性の増殖できないコロニー（形質転換Ａと同 様）が得られたが、約２０％の陽性コロニーはＧＸ７８２０に類似し、すなわち 正常なサイズを有し増殖可能であった。

小さな、強い陽性の数個のコロニーを上記再形質転換プレートから選択しくすな わち、ｐＧＸ１０６６ＸとｐＧＸ４５３゜の混合物を含む菌株ＧＸ７８２Ｄから 誘導された非分画プラスミドプレバレージョンで形質転換された大腸菌から得ら れた形質転換株）、再画線培養して増殖可能な菌株を単離した。プラスミドＤＮ Ａを２つの菌株から単離し、これらの両方ともｐＧＸ１０６６Ｘヘルパープラス ミドを消失していることがわかった。１つの菌株（大腸菌ＧＸ７８２３と命名） は、ｐＧＸ４５３Ｇ中に見出された１ｌｋｂｐの挿入断片から約２　ｋｂｐが欠 失したプラスミドｐＧＸ４５３３を含んでいた。大腸菌ＧＸ７８２３の試料はメ リーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄 託され、その受託番号はＡＴＣＣＮｏ、　５３４６１である。第２の菌株（大腸 菌ＧＸ７８２２と命名）は、元の１ｌｋｂｐの挿入断片中に、　ｐＧＸ４５３３ の欠失の１つの端部に極めて近接した部位に未同定の追加的な３　ｋｂｐのＤＮ Ａが挿入されたプラスミドであるｐＧＸ４５３２を含んでいた。

大腸菌ＧＸ７Ｂ２３　（ｐＧＸ４ｓ３３を含む）及び大腸菌ＧＸ７８２Ｇ（ｐＧ Ｘ４ｓ３０を含む）をＬ　ｂｒｏｔｈ＋アンピシリン中で培養した。細胞を遠心 によりてベレット化し、５０　ｍＭ　ＥＤＴ＾。

ｐＨ８，０及び２　ａｌｌ　ＰＭＳＦを含む緩衝液中で０．５■ｇ／ｍｌのりゾ チームの存在下で３７℃で３０分間インキュベートすることによって溶解した。

スタブイア−によって記載された緩衝液［Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　７９： ２３７−２４８　（１９７３）Ｉ中で、１００°Ｃで５分間加熱することによっ て、電気泳動のために抽出物の試料を調製し、スタブイア−によって記載された （前掲）ように、試料を１２．５％のアクリルアミドＳＤＳゲル上て電気泳動に 架けてタンパク質を分離した。標準的な電気泳動技術（ウェスタンブロッティン グ）を用いてゲルからニトロセルロース紙へタンパク質を移動した。ニトロセル ロースを次に連続的に、ＢＳＡ、正常ウサギ血清、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗 ウサギＩｇＧ及び４−クロロ−１−ナフトール十ＨｘＯｘとインキュベートした （上述した免疫化学的操作と同しニトロセルロース処理）０両方の菌株とも１分 子量約９万ないし約３万、主として５７，０００に対応する移動度を有する同一 のＩｇＧ結合結合タンパクンバンドえた。

挿入断片中の１．９　ｋｂｐの旧ｎｄｍ断片をｐＧＸ１０６６中にサブクローニ ングし、得られた組換えプラスミド（ｐＧＸ４５４７）を大腸菌に形質転換した 。この形質転換株（大腸菌ＧＸ７８４１）によって産生されたタンパク質につい て上述のようにウェスタンブロッティングを行なったところ、主たる５７，００ ０のバンドを含む、同一のＩｇＧ結合結合タンパクンバンド在した。形質転換株 はまた。上述のように赤血球凝集分析した。形質転換株からの抽出物は１ｇＧ３ 　（ヒトミニローマタンパク寅）でコートされたなめされた（ｔａｎｎｅｄ）ヒ ツジ赤血球及び非分画ヒトＩｇＧでコートされたヒツジ赤血球を凝集したが、コ ートされていない赤血球は凝集されなかった。プロティンＡ産生大腸菌株からの 抽出物は非分画１ｇＧでコートされた赤血球を凝集したが、１ｇＧ３でコートさ れた赤血球及びコートされていない赤血球を凝集しなかった。プロティンＡもプ ロティンＧも産生じない対照大腸菌株は、いずれの赤血球試料をも凝集しなかっ た。

コレラノ結果は大腸菌株ＧＸ７１１１４１．　ＧＸ７８２０及びＧＸ７８２３は プロティンＧに特徴的な性質を有するＩｇＧ結合タンパク質であることを示して いる。

実施例■ ＤＮＡ及びアミノ酸配列データ クローン化された遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。

この配列は、該ＤＮＡ配列によってコートされるアミノ酸配列と共に第３図に示 しである。第３図に示したデータは、上述のようにクローン化されたプロティン Ｇ遺伝子を含む１．９　ｋｂ、の旧ｎｄｍ　断片全体についてのものである。

遺伝暗号の縮重の故に、遺伝子のヌクレオチド配列は実質的に変化する１例えば 、適正なコドン−アミノ酸割当が観察されるならば、第３図に示すものと異なる ヌクレオチド配列を有するが同一のアミノ酸配列を与える遺伝子の一部又は全部 を化学的に合成することができる。プロティンＧ遺伝子のヌクレオチド配列及び 該タンパク質のアミノ酸配列を確立したので、この発明の遺伝子は特定のヌクレ オチド配列に限定されず、遺伝コードによって許容される全ての変異を包含する 。

この発明のプロティンＧタンパク質は、第３図に示すものと完全に同一のアミノ 酸配列を有するタンパク質に限定されない、第３図に示す配列に欠失又はＭ換を 有するタンパク質も、該タンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に追加的 なアミノ酸を有するタンパク質も、上述したプロティンＧの所望のＩｇＧ結合性 質を有する限りこの発明に含まれる。こわらのアミノ酸配列の変異は例えば遺伝 子の化学合成によって、又は公知の生体外突然変異操作によフて達成することが できる。

第３図には以下の略号を用いている。

Ａ＝ニブオキシアデニ ル＝チミジル Ｇ＝ニブオキシグアニ ル；デオキシシトシル ＧＬＹ＝グリシン　ＣＹＳ＝システィンＡＬＡ＝アラニン　ＭＥＴ＝メチオニン ＶＡＬ＝バリン　ＡＳＰ＝アスパラギン酸ＬＥＵ＝ロイシン　ＧＬＵ＝グルタミ ン酸ＩＬＥ＝イソロイン　ＬＹＳ＝リジン ５ＥＲ＝セリン　ＡＲＧ＝アルギニン ＴＨＲ＝スレオニン　ＨＩＳ＝ヒスチジンＰＨＥ＝フェニルアラニンＰＲＯ＝プ ロリンＴＹＲ＝チロシン　ＧＬＮ＝グルタミンＴＲＰ＝）−リブトファン　ＡＳ Ｎ＝アスパラギン実施例■ ＩｇＧ結合活性を担当するプロティンＧ分子部分の同定クローン化されたプロテ ィンＧ遺伝子の欠失した又は修飾された形態のものを含む大腸菌株によって産生 されるタンパク質のＩｇＧ結合活性を調べることにより、活性は、アミノ酸残基 ２２８と３５２との間の繰り返し構造にあることがつきとめられた（第８図）、 Ｂｌ及びＢ２債域のアミノ酸配列は、それぞれの、対応する５５の位置のうち４ ９が同一てあった。この繰り返し構造は第４図に示され、ここでＢｌ及びＢ２が 示されている。

元々ストレプトコッカスＧＸ７８０９から単離され、プロティンＧをコードする 全配列を含む、第２図に示される１、９　ｋｂｐの旧ｎｄｍｌｌｉ片をバクテリ オファージＭ１：ｌ＋ｐ９［Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ ｚｙ＋ｓｏ１．１０１＝２０　（１９８３））にサブクローニングした。プラス ミドｐＧＸ４５４７をエンドヌクレアーゼ旧ｎｄｍで消化し、バクテリオファー ジ嬉１３■ｐ９の２本鎖複製型ＤＮＡも同様に消化した。後者はまた、仔ウシア ルカリフォスファターゼ（１５！１中２単位）を旧ｎｄｍによる消化中に存在さ せて処理し、ベクターの再環化を防止した。フェノールで抽出し、エタノールで 沈殿させた後、２つの消化したＤＮＡＥＩ製物を泥合し、連結条件下でＤＮＡリ ガーゼと共にインキ、エベートした。

連結されたＤＮＡ調ｆ！Ｉｌ物は大腸菌ＧＸ１２１０株（Ｆ’　ｔｒａＤ３５ｐ ｒｏＡ＋Ｂ＋　Ｉａｃｌｑ／デルタ−１ａｃＺ１５　デルタ−（ｌａｅ−ｐｒｏ ）ｓｕｐＥ　ｔｈｉ　ｚｉｇ：ＴｎｌＯｈｓｄＲ２）をトランスフェクトするの に用いた。プラークからのトランスフェクトされた細胞について、コロニー免疫 分析によってプロティンＧの生産を調べた。陽性の分析結果を示したものをｍＧ Ｘ４５４７と命名し、その部分的制限酵素地図を第５図に示した。

■ＧＸ４５４７でトランスフェクトされた大腸菌から単離された２本鎖複製型Ｄ ＮＡをエンドヌクレアーゼｐＳＴＩで消化した。フェノールで抽出し、エタノー ル沈殿を行なった後、消化したＤＮＡを連結条件下でＤＮＡリガーゼと共に希溶 液（１１当たり約ｓｇｇの消化ＤＮＡ）中でインキュベートした。再連結したＤ ＮＡ調製物を用いて大腸菌ｃｘｔｚｉｏをトランスフェクトした。数個のプラー クからの感染細胞から複製型ＤＮＡを調製し、同じ感染細胞についてコロニー免 疫分析によりてＩｇＧ結合タンパク質の産生を調べた。複製型ＤＮＡを制限エン ドヌクレアーゼＰｓｔｌで分析することによって、第５図及び第６図に示す２１ ０　ｂｐ及び４１５　ｂｐの両方のＰｓｔｌ断片を失っていることがわかった。

これらのクローンはコロニー免疫分析により、活性なＩｇＧ結合タンパク質な産 生じないことが示された。これらのクローンによって産生される切除されたタン パク質は構造Ｂｌの一部のみを含み、末端からＢｌまでの全てのアミノ酸配列を 欠くものと思われる。

上述のトランスフェクションによって得られた１つのクローンは、コロニー免疫 分析において陽性の結果を与えた。このクローンからの複製型ＤＮＡの制限酵素 分析により、このファージＤＮＡは４１５　ｂｐのＰｓｔＩ断片を欠くが２１０ 　ｂｐの断片は保持していることがわかった。さらに、臭化エチジウム染色アガ ロースゲル電気泳動上での２ｔＯｂｐ　Ｐｓｔｌバンドの相対強度から、このＤ ＮＡは２１０ｂｐの断片を２コピー含んでいることがわかった。このファージＤ 　Ｎ　Ａ　（ｍＧＸ７８８０）の構造は第６図に示されるものであることが確認 された。このファージＤＮＡ上に担持されたプロティンＧ遺伝子によってコート されるタンパク質は、２つの完全なり構造のコピーを有し、無傷のＢ１配列とそ れに続＜ＢｌとＢ２のキメラを有するものと思われる。これは末端から８２まで の全てのアミノ醸配列を欠くであろう、この構造は、２１０　ｂｐ！ｌｒ片を規 定するＰｓｔ１部位が、相同配列に対応する位置にＢ繰り返し構造中に存在し、 かつタンパク質のリーディングフレームと同一の関係で有することに起因する。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、このＤＮＡを含む大有するタンパ ク質を産生ずることがわかった。

これらの結果は、Ｂ繰り返し構造の存在がプロティンＧのＩｇＧ結合活性のため の必要かつ充分な条件であることを示している。従って、Ｂａり返し構造が、こ の分子中でのＩｇＧ結合活性部位であることが結論づけられる。

実施例ＩＶ 枯草菌中でのプロティンＧ遺伝子の発現転写ターミネータ−に類似する配列を有 する合成オリゴヌクレオチドを先ず５ｉＧＸ４５４７中に挿入した。オリゴヌク レオチドの配列は次の通りであった。

５’−ｐＴＣＧＡＡＡ＾＾ＡＧＡＧＡＣ（：ＧＧＡＴＡＴＣＣＧＧＴＣＴＣＴＴ ＴＴＴ−３゜これは自己相補的であり、２本鎖にするとエンドヌクレアーゼ５ａ ｉｌによつて形成されるのと同じ配列の一本鎖末端を与える。これをｍＧＸ４ｓ ４７中に挿入するために、ファージＤＮＡをエンドヌクレアーゼ５ａｌｌで消化 し、フェノールで抽出し、エタノール沈殿し１次いてこの合成オリゴヌクレオチ ド（７０℃に加熱して変性させゆりくりと２３℃に冷却したもの）及びＤＮＡリ ガーゼと共に連結条件下でインキュベートした。連結したＤＮＡを用いて大腸菌 ＧＸ１２１０をトランスフェクトし、クローンについて５ａ１１部位の欠失と１ 合成オリゴヌクレオチド上に存在する認識配列であるＥｃｏＲＶ部位の獲得とを スクリーニングした。所望の構造を有する１つのクローンな■Ｇｘ７８７２ト命 名シタ。

次に末端から８２繰り返し配列までの配列な■ＧＸ７８７２から除去した。これ は、オリゴヌクレオチド−誘導生体外突然変異発生により行なった０次のオリゴ ヌクレオチドを合成した。

５’　−ｐＣＧＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣＴＧＴＡＡＣＣ− ３゜この配列はその半分が■ＧＸ４Ｓ４７中の丁度末端からＢ２配列までの配列 と相補的であり、もう半分はプロティンＧのＣ末端付近をコートする配列と相補 的である。このオリゴヌクレオチドは、標準的方法による。■ＧＸ４５４７　Ｄ 　ＮＡを鋳型として用いた、２本鎖複製型ＤＮＡの生体外合成にプライマーとし て用いた。このＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０をトランスフェクトした。プ ラークが産生ずるファージＤＮＡについて、所望の欠失配列と相補的な放射性オ リゴヌクレオチド５°−（３２Ｐ）＾ＧＣＧＡＣＣＧＧＡＡＣＣＴＣ−３’とパ イプリダイズするかどうかをスクリーニングした。所望の構造を有する１つのク ローンが同定され、■ＧＸ７８７７と命名した。その構造はＤＮＡ配列分析によ って確認された。欠失は第３図の配列の１６５１−１８９６の間で起きていた。

プロティンＧをコードする配列と発現及び分泌ベクターとの融合を行なうために 、オリゴヌクレオチド誘導生体外突然変異発生によってｍＧＸ７８７７の配列中 にＲａｍ）１１部位を創製した０次の配列を有するプライマーオリゴヌクレオチ ドを用いて生体外でｍＧＸ７８７７の一本鎖ＤＮＡを２本ｆｉＤＮＡに転換する ことを促進した。

５　’　−ｐＧ　ＧＴＡＴＣＴＴＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＴＣＡＡ ＣＡＧＣＧＡＡＴＡＣＣＧ　−３゜このオリゴヌクレオチドは履ＧＸ７８７７中 のプロティンＧをコートする配列と相補的であるが、成熟プロティンＧ（分泌シ グナル配列の除去産物）をコードする配列の開始点付近に、エンドヌクレアーゼ ＢａｍＨＩの認識配列である６つの追加的なヌクレオチドＧＧＡＴＣＣを含む、 得られた２本鎖ＤＮＡを用いて大腸菌ＧＸ１２１０をトランスフェクトした。プ ラークから得られた感染細胞から回収された複製型ＤＮＡについて、Ｂａ■旧部 位の存在なスクリーニングした。所望の構造を有する１つのものをｍＧＸ８４０ ２　ト命名Ｌ／　タ。

ズブチリシン（ａｐｒ）をコートするバチルス・アミロリクエファシェンス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の遺伝子から誘導され たプロモーター及び分泌シグナル配列を含む分泌ベクターがバサンサとトンプソ ンによって記載されている［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６５＝８３７−８ ４２　（１９８４）；並びに米国特許出願第６１８，９０２号（１９８４年６月 ８日出願）及びその一部ｌ！１続出願である特許出願第７１７，８００号（１９ ８５シグナル配列をコードする配列の末端付近にＢａｇ）１１部位を有し、枯草 菌中での発現及び細胞からのタンパク質産物の分泌を促進するためにここに外来 性遺伝子を融合することができる。プロティンＧをコードする配列をこのベクタ ーに融合するために、ｐＧＸ２１３４　Ｄ　Ｎ　ＡをエンドヌクレアーゼＲａｍ 旧及びＰｖｕ　ＩＩで消化した。■ＧＸ８４０２からの複製型ＤＮＡをエンドヌ クレアーゼＲａｍ旧及び５ｅａｌで消化した。フェノールで抽出し、エタノール 沈殿を行なった後、消化されたＤＮＡ調製物を混合し、連結条件下でＤＮＡリガ ーゼと共にインキュベートし、連結されたＤＮＡを用いて標準的な方法により枯 草菌ＧＸ８００８　（ａｐｒ欠失、ｎｐｒ欠失、　５ｐｏＯＡ６７７）プロトプ ラストを形質転換した。形質転換株をクロラムフェニコール耐性に基づいて選択 し、コロニー免疫分析によってプロティンＧの産生をスクリーニングした。１つ の陽性形質転換株が同定されＧＸ８４０８　（ｐＧＸ４５８２）と命名した。グ ラＸミドｐＧＸ４５８２は制限酵素分析により、第７図に示される構造を有する ことが示された。これは、ｐＧＸ２１３４のＢａｍＨＩとＰｖｕ１１部位との間 に、−ＧＸ８４０２のプロティンＧコード配列を有するＢａｇ旧断片と、ｍＧＸ ８４０２中のコード配列の末端の小さなＨａ厘Ｈ１−５ｅａｌ断片とが挿入され ることによって形成されたものと思われる。

菌株ＧＸ８４０８はプロティンＧのＩｇＧ結合活性を有するタンパク質を産生す ることが示された。適当な培地（Ｆａｈｎｅｓｔｏｅｋ　と　Ｆｉｓｈｅｒ、Ｊ 、Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、１旦ｊ：　７９６−８０４（１９８４）］中て増やさゼ た後、培養」−清及び細胞（ｉ随画分を回収し、ドデシル硫酸すＩ−・リウムー ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に付し１と。電り泳動分屋の後、タンパク 質バントな二りロセルロースに移し、実施例Ｉど同様にして免疫化学的に染色し た。ＩｇＧ結合活性を＃する物質は、培養１〜清及び細胞付随画分の両方に見出 された。

実施例■ 実施例Ｉと同様Ｇ二して、ＧＸ７８０Ｓと命名されたグル・−ブＧスト・レブト コッカス臨床中蔑物から染色体ｆ）ＮＡ＠単離したいこのＤＮＡの試料を制限エ ントヌ！２１／アーゼ１１ｉｎｄｍで消化り、、標準的条件下におい下１％アガ ロースゲル中で電気泳動に伺した４、電気泳動後、ＤＮＡ断片をサザンによって 記載され１こ・ように【へ臀λＬユｊｉｏ−１，！−纏５０３　（１９７５）ｌ 　シてニトロセルロースに移した。プロディンＧをコートする配列を含む約２． ４　ｋｂｐのハンｌ−を、元のスト・レブトコッカスＧＸ７８０９から単離され た第２図に示１−ｘ、ｑ　ｋｂｐの旧ｎｄｍｌｌｆｉ片から成る放射性グローブ を用いたパイプリダイゼーシＨンによ・ノて位置決め１．た。１゜９ｋｂｐ断片 プローブをアガロースゲル電気泳動によ−〕て精製し、実施例Ｉに記ｉｔ、、た ように１ノてゲルから溶離し・、リフビーら［む−１し一吋見Ｌニー３−１３： ２３７　（１９７７）１に木質的に記載された方法に基づき、３２Ｐてニックト ランスレージ、ンによって放射標識した。へイブリダイゼーションをワールらに よって木質的に記載された方法［Ｐｒｏｅ−Ｎａｔｉ　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　７６：３６１１３−：１６８７　（１９７９）ｌにより行なった。ハイ ブリダイゼーション及びへイブリダイズしなかったプローブを除去した後、放射 バンドを２．４　ｋｂｐの長さに対応する位置にオー１−ラジオグラフィ・−に より位置をつきとめた。

同しＧＸ７ＢＯ５の染色体ＤＮＡのより大量の試料（６μ、１）享・エンドヌク レアーゼ旧ｎｄｌｌＩて消化し、断片を１％アガロースゲル中ての電気泳動（０ ，３５ボルト／ｃｙａて１６時間）によって分離１／た。臭化エチジウムで染色 した後、２−３ｋｂのＵさのバンド（エンドヌクｌ／アーゼ旧ｎｄｍ消化バクチ リオファ・−シラムダＤＮＡから成る対照に対応１７て位置する）を含むゲルを 切り出し、ＤＮＡの回収を助けるためにつみした。ＤＮＡを実施例■て記載１ノ だようにフェノールで抽出ｔｉた後回収１ノだ。

プラスミドヘク９−　ｐＧＸ１０６６　ＤＮＡ　（１ｕｌｇ）をエンドヌクレア ーゼ旧ｎｄ爪で消化した。反応混合物をフェノール／クロロポルム／イソアミル アルコール（２５：２４＝１）で抽出した後、０．１体積の４　Ｍ　ＬｉＣ１， １１１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２０３７−ｇのグリコーゲン担体、及び２．５体積の ９５％エタノールを加えることによフてＤＮＡを沈殿させた。０．４　ｕｇの消 化されたベクターＤＮＡを、　ＧＸ７８０５Ｄ　Ｎ　Ａの回収され　・た旧ｎｄ ｍ断片（＆　ｐＬｇの染色体ＤＮＡから回収された物質の９０％）と共に、製造 者によって勧められる連結条件下で２０μ４１中で１５℃て１６時間インキュベ ー）−１７だ。

１５ＪＬｌの連結されたＤＮＡで実施例Ｉに記載し・たようにして大腸菌５Ｋ２ ２６７を形質転換し、形質転換細胞をコロニー免疫分析ブ１／−トＬにプレート し、実施例Ｉに記載したようにして免疫グロブリン結合タンパク質を産生じてい るか否かを調べた。１′″）の陽性コロニーが同定された。この形質転換株から 単離されたプラスミドＤＮＡは２．４　ｋｂｐ　（１）　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入断片を 有ずルｐＧＸ１０６６から成ることがわかった。この挿入断片を含むエンドヌク レアーゼ旧ｎｄｍ断片をバクテリオファージＭ１３■ｐ９ベクター中にサブクロ ーニングした。　２．４　ｋｂｐの旧ｎｄｍ断片のＤＮＡ配列が決定され、これ は第９図に示されている。

プラスミド〆；Ｘ４５３３の部分缶怨じｂＵ包図８８ｇ８９８ｇ８８８　ｇ　宮 ｒ　＋−四　へ　０　０　寸　寸　の　ｎ　のト ＰＣ）　（７１胃　。

の　ト　０ （００トトト ２　品　目　ツ　８　、　。

国際調査報告 １パ”１°０”°“１°”””””’　ＰＣＴ／１１５８７７００３２９

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．クローン化されたプロテインＧ遺伝子。
2. ２．以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項記載のプロテ インＧ遺伝子。 【配列があります】 ただし、５′から３′への鎖であってアミノ末端から始まり、それぞれのトリプ レットがコードするアミノ酸も併せて示されており、それぞれのトリプレットに おいて、 ＸはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ ＹはＴ又はＣ ＹがＣのときはＺはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧ ＹがＴのときはＺはＡ又はＧ ＨはＡ、Ｔ又はＣ ＱはＴ又はＡ ＱがＴのときはＲはＣでＳはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧＱがＡのときはＲはＧでＳはＴ又 はＣ ＭはＡ又はＧ ＬはＡ又はＣ ＬがＡのときはＮはＡ又はＧ ＬがＣのときはＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧである。
3. ３．以下のデオキシリボヌクレオチド配列を合む請求の範囲第２項記載のブロテ インＧ遺伝子。 【配列があります】
4. ４．プロテインＧをコードするヌクレオチド配列と、大腸菌中で機能する複製開 始点と、抗生物質耐性をコードする遺伝子とを含む第１のベクターと 大腸菌中での複製開始点を含むが第１のベクターによって担持される抗生物質耐 性をコードする遺伝子を欠く第２のベクターとの組合せであって、前記第２のベ クターは、宿主中での保持を前記第１のベクターと競合して前記第１のベクター のコピー数を制限することによって前記第１及び第２のベクターで形質転換され た大腸菌宿主菌株を安定化し、そして前記形質転換された宿主菌株は前記抗生物 質の存在下での生存能力によって同定され得る、ベクターの組合せ。
5. ５．前記第１のベクターはｐＧＸ４５３０の同定特徴を有し、第２のベクターは ｐＧＸ１０６６Ｘの同定特徴を有する請求の範囲第４項記載のベクターの組合せ 。
6. ６．請求の範囲第４項記載のベクターによって形質転換され、ＧＸ７８２０の同 定特徴を有する大腸菌宿主菌株。
7. ７．プロテインＧの免疫グロブリン結合性質を有するコードするデオキシリボヌ クレオチド配列又はその機能的に活性な部分を含み、潜在的ヘルパープラスミド の非存在下で原核微生物中に安定に保持され得る、原核微生物中で複製する能力 を有するベクター。
8. ８．プロテインＧの免疫グロブリン結合性質を有する前記タンパク質は、プロテ インＧのアミノ酸が欠失し若しくは置換され又はそのアミノ末端若しくはカルボ キシル末端に付加的なアミノ酸が付加されたものである請求の範囲第７項記載の ベクター。
9. ９．プロテインＧの免疫グロブリン結合性質を有する前記タンパク質は以下のア ミノ酸配列を有する、請求の範囲第７項記載のベクター。 【配列があります】
10. １０．請求の範囲第２項又は第３項に記載されたデオキシリボヌクレオチド配列 を含み、潜在的ヘルパープラスミドの非存在下で原核微生物中に安定に保持され る、原核微生物中で複製する能力を有するベクター。
11. １１．前記原核微生物は大腸菌である請求の範囲第７、８、９又は１０項記載の ベクター。 １１．ｐＧＸ４５３３の同定特徴を有するベクター。
12. １２．ｐＧＸ４５４７の同定特徴を有するベクター。
13. １３．請求の範囲第１１項又は第１２項のベクターによって形質転換された大腸 菌菌株。
14. １４．請求の範囲第４、５又は６項に記載されたベクターであって、前記第１の ベクターが前記宿主菌株によって認識される発現シグナルであってプロテインＧ をコードするデオキシリボヌクレオチド配列の発現を支配するものをさらに含む もので形質転換された大腸菌宿主菌株をプロテインＧ産生条件下で水性栄養培地 中で培養し、産生されたプロテインＧを回収することを含むプロテインＧの生産 方法。
15. １５．前記形質転換された大腸菌宿主菌株はＡＴＣＣＮｏ．５３４６０として寄 託されたＧＸ７８２０の同定特徴を有する請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．請求の範囲第７、８、９又は１０項に記載されたベクターであって、前記 第１のベクターが前記宿主菌株によって認識される発現シグナルであってプロテ インＧの免疫グロブリン結合性質を有するタンパク質をコードするデオキシリボ ヌクレオチド配列又はその機能的に活性な部分の発現を支配するものをさらに含 むもので形質転換された大腸菌宿主菌株をプロテインＧ産生条件下で水性栄養培 地中で培養し、産生されたタンパク質を回収することを含む、プロテインＧの性 質を有するタンパク質の生産方法。
17. １７．プロテインＧの免疫グロブリン結合性質を有する前記タンパク質は、プロ テインＧのアミノ酸が欠失し若しくは置換され又はそのアミノ末端若しくはカル ボキシル末端に付加的なアミノ酸が付加されたものである舌請求の範囲第１６項 記載の方法。
18. １８．生産されたタンパク質が以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１６項 記載の方法。 【配列があります】
19. １９．生産されたタンパク質が以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１６項 記載の方法。 【配列があります】
20. ２０．生産されたタンパク質が以下のアミノ酸配列を有する請求の範囲第１６項 記載の方法。 【配列があります】
21. ２１．前記ベクターは、プロテインＧをコードする前記デオキシリボヌクレオチ ド配列の前記細菌宿主の染色体中への一体化を促進する請求の範囲第１６項記載 の方法。
22. ２２．前記細菌宿主は大腸菌である請求の範囲第１６項記載の方法。
23. ２３．前記宿主は枯草菌である請求の範囲第１６項記載の方法。
24. ２４．前記形質転換された大腸菌宿主菌株はＡＴＣＣＮｏ．５３４６１として寄 託されたＧＸ７８２３の同定特徴を有する請求の範囲第１６項記載の方法。
25. ２５．前記形質転換された大腸菌宿主はＧＸ７８４１の同定特徴を有する請求の 範囲第２２項記載の方法。
26. ２６．前記形質転換された枯草菌菌株はＧＸ８４０８の同定特徴を有する請求の 範囲第２３項記載の方法。
27. ２７．請求の範囲第１４項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
28. ２８．請求の範囲第１５項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
29. ２９．請求の範囲第１６項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
30. ３０．請求の範囲第１８項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
31. ３１．請求の範囲第１９項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
32. ３２．請求の範囲第２０項記載の方法によって生産されたプロテインＧ。
33. ３３．第９図に示すＤＮＡ配列又はそのプロテインＧ類似物貫コーディング部分 を含む組換えベクター。
34. ３４．第９図に示すアミノ酸配列又はプロテインＧのＩｇＧ結合性質を有するそ の部分を有するプロテインＧ類似物質。
35. ３５．式 −（−Ｂ−ｂ−）ｎ− （ただし、ＢはＢ１，Ｂ２又はＢ３、ｎは１〜２０、Ｂ１及びＢ２及びＢ３は下 記塩基配列、Ｂ３はＢ１とＢ２とのハイブリッドＤＮＡ、ｂは下記ＤＮＡ配列を 示す）で表わされる組換えＤＮＡベクター。 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】
36. ３６．前記ハイブリッドＤＮＡ配列Ｂ３は以下の配列を有する請求の範囲第３５ 項記載の組換えＤＮＡ。 【配列があります】
37. ３７．式 −（−Ｂ−ｂ−）ｎ− （ただし、ＢはＢ１，Ｂ２又はＢ３、ｎは１〜２０、Ｂ１及びＢ２及びＢ３は下 記塩基配列、Ｂ３はＢ１とＢ２とのハイブリッドＤＮＡ、ｂは下記ＤＮＡ配列を 示す）で表わされるプロテインＧ類似物質。 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】
38. ３８．前記ハイブリッドアミノ酸は以下の配列を有する請求の範囲第３７項記載 のプロテインＧ類似物質。 【配列があります】
39. ３９．前記タンパク質は、アミノ酸が欠失し若しくは置換され又はそのアミノ末 端若しくはカルボキシル末端に追加的なアミノ酸が付加されたものであり、プロ テインＧの免疫グロブリン結合特性を有するものである請求の範囲第３７項記載 のブロテインＧ類似物質。