JPH01502194A - 肝細胞内で亜三日熱マラリヤ原虫により生成されたタンパク質の特微的なエピトープを単数又は複数有する少なくとも１つのペプチド配列を含む分子、及びこれらの分子を含む化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 肝細胞内で亜三日熱マラリヤ原虫に より生成されたタンパク質の特徴的な エピトープを単数又は複数有する少なくとも１つのペプチド配列を含む分子、 及びこれらの分子を含む化合物 主要なものだけでも亜三日熱マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉ ｐａｒｕｍ）又は良性三日熱マラリヤ原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｖｉｖａｘ ）を挙げることのできるヒトにおけるマラリャの原因となる寄生虫は、ヒトとい う宿主の中でさまざまな形を呈し感染した宿主の有機体内におけるその場所に応 じて異なる抗原を表わす、形及び抗原面におけるこれらの寄生虫のヒトの体内で のそのライフサイクル中の相違により、我々は明確に異なる少なくとも４つの発 達段階を定義づけることができる。

ヒトの体内での寄生虫の発達のごく最初の段階は、寄生虫をもつ昆虫の刺し傷に より宿主の血液中に導入されたスポロゾイト形に相当する。第２の段階は、寄生 虫の肝臓内通過ならびに肝細胞の感染に相当し、この肝細胞内で寄生虫は発達し て肝性のシゾント（分裂小体）を形成し、このシゾントが破裂により肝性のメロ ゾイトを産生ずる。第３段階は、寄生虫の無性形（メロゾイト）による赤血球の 感染により特徴づけられる；寄生虫の発達のこの赤血球段階は、疾病の病因段階 に相当する。第４段階は、蚊において細胞外生殖体となる有性形（又は生殖母細 胞）の形成に相当する。

一方では相応する抗体の検出によりマラリャの試験管内診断を行なうため、又他 方ではマラリャ予防ワクチンの接種を試みるため、ヒト宿主に対する伝染性寄生 虫の株からポリペプチド部分を分離するべく、数多くの研究が行なわれてきた。

例えば、亜三日熱マラリャ原虫のスポロゾイトから誘導されたクローニングされ たｃＤＮＡのバンクがＥＮＥＡその他（１９８４年１．５ｃｉｅｎｃｅ、第２２ ５巻、６２８−６３０により立証された。これらのバンクは、スポロゾイト抗原 （亜三日熱マラリャ原虫の）の特異的アミノ酸４つの反復性単位を含む免疫学的 ポリペプチドを表現する可能性のあるクローンを有していることが認められてい る。

しかしながら、マラリャの原因である寄生虫の肝性形については、はとんど研究 が行なわれていない、肝性形の形態学については１９４８年に初めて、感染した 志願者の生検に基づいて記述された（Ｔｒａｎｓ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ。

Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、、　４１．７８５（１９４８）ｌ　、亜三日熱 マラリャ原虫の肝ｌ！段階の特異的抗原は、寄生虫の血液形には無感覚であるが 肝性形が発達しうる南アフリカ産のサルの肝臓内において記述されることができ た。　（Ａｍ、　Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、、　３Ｈ３）　３３６ −３４１（１９８４）ｌ　。

単数又は複数の肝臓特異抗原（以下、肝臓特異抗原なＬＳＡと言う）の局在性の 検出は、シゾントの成熟段階全体を通して蛍光抗体法によって行なわれた。これ は５〜４０ミクロンのサイズの寄生虫の周辺に局在化されている０次にこれは、 シゾントが５０〜１００ミクロンに達した時点で、胞子虫生殖体又は大量のメロ ゾイトの間に分布させられる。これは、スポロゾイト表面抗原及び寄生虫内部の 蛍光抗体法の画像を与える血液及び肝臓のシゾントにより共有される抗原とは異 なる。

ヒトの肝細胞内で亜三日熱マラリャ原虫の肝性形を培養することはそれ以後可能 になっているものの（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２２７．４４０　（１９８５））、試 験管内及び生体内での培養方法により寄生虫の成熟した形を得る率は低いもので あるため、肝臓段階で生成された抗原の生化学的分析は不可能である。

また、マラリャにかかった人は、ＬＳＡ　（肝特異抗原）に対する抗体をきわめ て高い比率でもっていることもわかった。ＬＳＡは、寄生虫のさまざまな発達段 階において合成される全ての抗原のうちもつとも強いものの中でも、きわめて強 い免疫原であると思われる。これに対して、寄生虫の血液段階の形に対する抗体 の率は時として非常に低く、このため血液段階の特異抗原に基づいて行なわれる 診断は時として誤ってマイナスになることがある。

本発明の目的の１つはまさに、現在の方法では不可能である最も敏感な条件の下 での亜三日熱マラリャ原虫による人間の感染の試験管内診断を可能にすることに ある。

同様に、本発明の目的は、亜三日熱マラリャ原虫によりひきおこされるマラリャ に対する人間のワクチン接種を目的とする新しい化合物にもある。

さらに限定的に言うと、本発明は、肝細胞内の亜三日熱マラリャ原虫の伝染性活 性の結果として得られるタンパク質の特徴的エピトープ、特にＢエピトープを単 数又は複数頁する単数又は複数のペプチド配列がその構造中に存在することを特 徴とする、ペプチド又はポリペプチドの分子又は化合物に関するものである。

本発明に基づくポリペプチド化合物は基本的に、以下の式の１７のアミノ酸配列 が１つ存在することをその特徴とする： Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌ ｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇなおこの式中、 ＸはＧｌｕ又はｃｔｙである。また、ｒＬｅｕＪはロイシン、ｒＳｅｒＪはセリ ン、ｒＬｙｓＪはリジン、ｒＧｌｕＪはグルタミン酸、ｒＧｌｎＪはグルタミン 、ｒＡｓｐＪはアスパラギン酸そしてｒＡｒｇＪはアルギニンである。ＸがｒＧ ｌｕＪである場合、この本文中これに相応するペプチドを「ペプチドエ」そして ＸがｒＧｌｙＪ　（グリシン）である場合、「ペプチドＩＩ　Ｊと呼ぶ。

本発明は先ず第１に、上述の式をそれぞれ満たしかつその末端アミノ酸がそれぞ れ遊離アミン及びカルボキシル基の端部を有している１７個のアミノ酸の独特の ペプチド配列を含む合成単量体、或いは１７個のアミノ酸の上述のペプチド配列 Ｉ及びＨのうちのいずれか１つの倍数を特に含むオリゴマーに関するものである 。

当然のことながら、本発明に基づく分子の構成に入るいくつかのアミノ酸を有す る反応性の遊離官能基、特にＧｌｕ基或いはＣ末端アミノ酸が有する！雌カルボ キシル基及び／又はＮ末端アミノ酸又は例えばＬｙｓのようなペプチド鎖内部の アミノ酸が有する遊離基は、その変更がその分子全体の抗原性ひいては、免疫原 的特性の変更をひきおこさないかぎりにおいて、変更されることができる、こう して変更された分子は当然。

「請求の範囲」により本発明に与えられる保護の範囲内に入る。これらのカルボ キシル官能基は、場合によっては、アシル化又はエステル化されている。

その他の変更態様も又本発明の範囲に入る。特に末端アミノ酸のアミン官能基又 はエステル官能基或いはその両方はそれ自体、その他のアミノ酸との結合の中に 組み込まれうる０例えば、Ｎ末端酸は、それについてすでに述べた定義づけに合 致するもう１つのペプチドのＣ末端領域の一部分に相当する単数又は複数のアミ ノ酸を含む１つの配列に結合され得る。その逆も又同様である。

同様に当然のことながら、１７個のアミノ酸の２つのペプチド配列Ｉ及びＨのい ずれか一方の単数又は複数のアミノ酸の置換及び／又は付加及び／又は削除によ る変更の結果得られる全てのペプチド配列も、かかる変更がポリベブチドエ及び Ｈの抗原的又は免疫原的特性を変えないかぎりにおいて、特にこれらの免疫原特 性が例えば適当な免疫学的補助薬（例えばムラミルペプチド）とこれらポリペプ チドエ又は■を会合させることにより又はさらに高い分子量をもつ分子（例えば 血清アルブミン又はポリ−リジン）又はテタニー性タイプの毒素又はその他の亜 三日マラリャ原虫抗原との結合により適切に強化された場合、「請求の範囲」に より本発明に対し与えられる保護の範囲内に入る。

さらに一般的に言うと、本発明は、２つのペプチド配列により生体内で誘導され うる抗体に関して上述の式を満たす２つのペプチド配列とかけ合わされた免疫学 的反応を呈する単数又は複数のペプチド配列がその構造内に存在することを特徴 としている。

本発明は又、単数又は複数のアミノ酸の環状置換により上述のものから得られる 構造をもつ全てのペプチドに関するものでもある。特に本発明は、以下の式のペ プチドにも関連する： Ａｌ　ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｘ−Ｇ１　ｎ−Ｇ１　 ｎ　−５ｅｒ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−ＬｅｕＬ ｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ’−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌ　ｎ−Ｇｉｎ　−Ｓｅ ｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＡｌａＧ　１ ｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｘ−Ｇｉｎ　−Ｇｌ　ｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ　−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｙｓＬｙｓ− Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉ ｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＧｌｕＬｅｕ−ＧＩｎ−Ｘ−Ｇ ｉｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ　− Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−ＬｙｓＧｌｎ−Ｘ−ＧＩｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ −Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ ｒＧｌｕ−Ｌｙｓ−ＬｅｕＸ−Ｇｌｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ−ＧｌｎＧｌｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ −Ｇ　Ｉｎ−Ｓｅｒ−ＡＩｎ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌ ｕ−Ａｒ　ａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｎ Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ− Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌ ｙｓ−Ｌｅｕ−ＧｌｒｒＸ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ −Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ −Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ Ｇ　ｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ 　−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−ＬｅｕＧｌｎ−Ｇ ｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ− Ｘ−Ｇ１　ｎ　−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−ＧｌｕＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ −Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＧｌｎＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ −Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ｘ−Ｇ１　ｎ−Ｇｌｎ−５ｅｒ　−Ａｓ ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕなお式中、Ｘは前述の式と同じ意味をもつ 。

上述の第１のペプチドの場合と同様に、上に挙げられたさまざまなペプチドは、 その構造変更がその抗原特性を著しく変えないかぎりにおいて、本発明の範囲か ら逸脱することなく変更を加えることができる。

本発明に基づくペプチドは、ペプチド合成の分野内で従来の方法により調製され うる。この合成は、均質溶液又は固体相にて行なうことができる。

例えば、Ｅ、　Ｗｕｎｓｃｈ監修のｒＭｅｕｔｈｏｄｅ　ｄｅｒＯｒｇａｎｉｓ ｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ　（有機化学方法）」とイウ題ノ著書（第１５−１及び １１巻、ＴＨＩＥＭＥ、ストゥットガルト。

１９７４年）の中でＨＯＬＩＢＥＮＷＥＹＬが記している均質溶液での合成技法 を利用することができる。

この合成方法は、必要とされる順番で連続するアミノアシルを２つずつ連続的に 縮合させること、或いは予め形成されすでに適切な順序で複数のアミノアシルを 又はこうして予め調製された複数のフラグメントを含んでいるアミノアシル及び フラグメントを縮合させることから成る８なおここで当然のことながら、ペプチ ド合成においてよく知られた方法に従い、特にカルボキシル官能基の活性化の後 ペプチド結合の形成に通常介入してくるべき、一方のもののアミン官能基ともう 一方のもののカルボキシル官能基又はその逆を除くこれらのアミノアシル又はフ ラグメントがもつ反応性官能基金てを予め保護する配慮が払われている。変形実 施態様としては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）− 力ルポジイミドのようなカルボジイミドタイプの従来のカップリング試薬を使用 するカップリング反応を利用することもできる。使用されるアミノアシルが補足 的な酸性官能基を有する場合（特にグルタミン酸の場合）、これらの官能基は、 例えばｔ−ブチルエステル基により保護される。

アミノ酸１つずつの漸進的合成の場合、合成はできればＣ末端アミノ酸の、望ま しい配列内の隣接するアミノアシルに相当するアミノ酸との縮合により始まり、 同様にして次々と近づいてＮ末端アミノ酸に至るまで続く０本発明の好ましいも う１つの技法に従うと、「固体相ペプチド合成」という題の論文（Ｊ、　Ａｍ。

Ｓｏｃ、、　４５．２１４９−２１５４１の中でＲ，Ｄ、　ＭＥＲＲＩＦＩＥＬ Ｄにより記されている技法が利用される。

ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤの方法に従ってペプチド鎖を製造するためには、非常に多 孔質の重合体樹脂を用いてその上に、鎖の最初のＣ末端アミノ酸を固定させる。

このアミノ酸はそのカルボキシル基を介して樹脂の上に固定され、そのアミン官 能基は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基により保護される。

第１のＣ末端アミノ酸がこのようにして樹脂上に固定されると、この樹脂を酸で 洗うことによりアミン官能基の保護基をとり除く。

アミン官能基の保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基である場合、これはトリ フルオロ酢酸を用いて樹脂処理により除去されうる。

次に、鎖上に固定された第１のＣ末端アミノ酸から保護解除されたアミン官能基 上のＣ末端アミノアシル残基から請求められている配列の第２のアミノアシルを 提供する第２のアミノ酸をカップリングする。できれば、この第２のアミノ酸の カルボキシル官能基は、例えばジシクロへキシルカルボジイミドなどにより活性 化され、アミン官能基は、例えばｔ−ブチルオキシカルボニルなどにより保護さ れていることが望ましい。

こうして２つのアミノ酸をもちその末端アミン官能基が保護されているような所 望のペプチド鎖の第１の部分が得られる。前述の場合と同様、アミン官能基を保 護解除し、次に第２のＣ末端アミノ酸の付加の条件と同様の条件の下で第３のア ミノアシルの固定を行なうことができる。

こうして次々とアミノ酸を固定し、これらのアミノ酸は、すでに形成され樹脂に 再度付着させられたペプチド鎖の部分から毎度予め保護解除されるアミン基上で ペプチド鎖を構成することになる。

望まれるペプチド鎖の全てが形成されると、ペプチド鎖を構成するさまざまなア ミノ酸の保護基を除去し、例えばフッ化水素酸を用いて樹脂からペプチドを離脱 させる。

本発明はまた、上述の単量体ペプチドの水溶性オリゴマーにも関係する。オリゴ マー化は、本発明に基づく単量体ペプチドの免疫原性の増大を誘発させうる。

決して制限的な意味で示すわけではないが、これらのオリゴマーが例えば２〜１ ０単位の単量体を含みうるということを言っておきたい。

このオリゴマーの中に入る単量体単位は、全て配列Ｉのポリペプチド又は配列Ｈ のポリペプチドで構成されているか、或いはこれらのポリペプチドの両方で構成 されているものである。

オリゴマー化を行なうためには、現在ペプチドの分野で一般に用いられているあ らゆる重合技法を利用することができる。なおかかる重合は、望ましい免疫原性 を得るのに必要な単量体モチーフ数を含むオリゴマー又は重合体を得るまで行な われる。

単量体のオリゴマー化又は重合の方法は、グルタルアルデヒドのような架橋剤（ 網状化剤）と単量体の反応から成る。

また、例えば同質（ホモ）又は異質（ペテロ）の三機能性カップリング剤を加え た状態でのそのカルボキシル及びアミン末端官能基を介しての単量体単位の連続 的カップリングを利用するもののような、その他のオリゴマー化又はカップリン グ方法を利用することもできる。

さらにまた、上述のような１７のアミノ酸の単数又は複数のモチーフを含む分子 を生成するためには、相応する適当なヌクレオチド配列を含む一定の核酸により 形質転換された微生物を用いる遺伝子工学の技法を利用することもできる。

このため、本発明は、各々上述の種類の１７のトリブレットを含むこれらの反復 性配列を単数又は複数含む核酸に関するものでもある。

さらに本発明は、それぞれ担体分子とペプチドが運ぶ補足的反応基（原子団）を 介して、生理学的に受容可能でかつ毒性の無い担体分子（天然の又は合成の）に 対し本発明に基づくペプチド（又は上述のオリゴマー）を共有結合（カップリン グ）させることにより得られる複合体にも関するものである。該当する基（原子 団）の例は、以下に示すとおりである。

本発明に基づく複合体の構成の中に入る担体分子または高分子支持体の例として 、チクニー性アナトキシン、卵アルブミン、血清アルブミン、ヘモシアニンなど の天然タンパク質を挙げることができる。

合成の高分子支持体としては、例えば、ポリリジン又はポリ（Ｄ−Ｌ−アラニン ）−ポリ（Ｌ−リジン）などを挙げることができる。

文献をみると使用することのできるその他のタイプの高分子支持体について言及 されており、これらは一般に２００００以上の分子量を有する。

本発明に基づく複合体を合成するためには、ｒＩｎｆｅｃｔ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ」３３．１９３−１９８（１９８１年）中にＦＲＡＮＴＺ及びＲＯＢＥ ＲＴＳＯＮが記しているもの或いはｒＡｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎ ｍｅｎｔａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＪ　［１９８１年ｌＯ月）、第４２＠ 　、　Ｎｏ、４．　６１１−６１４にＰ、　Ｅ、　ＫＡＵＦＦＭＡＮが記してい るもののような、適切な担体分子及びペプチドを使用する周知の方法を利用する ことができる。

実際には、共役剤としては、以下に制限的な意味なく示される化合物を用いるこ とが望ましいニゲルタルアルデヒド、クロル」酸エチル、水溶性カルボジイミド ［Ｎ−エチル−Ｎ′　（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド、ＨＣ ｌ２］　、ジイソシアン酸塩、ビス−ジアゾベンチジン、ジ及びトリクロロ−５ −トリアジン、臭化シアンならびに５ｃａｎｄ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　（１９７８年１．第８巻、　ｐ？−２３１（ＡＶＲＡＭＥ ＡＳ。

ＴＥＲＮＹＮＣＫ、　ＧＵＥＳＤＯＮｌ内に言及されているカップリング剤。

また、一方ではペプチドの単数又は複数の反応性官能基、他方では支持分子の単 数又は複数の反応性官能基を介入させるあらゆるカップリング方法を利用するこ とができる。有利なことにここで問題となっているのは、カルボキシル官能基及 びアミン官能基であり、これらは、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）−力ルポジイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのタン パク質合成内で用いられる種類のカップリング剤を加えた状態でカップリング反 応を起こさせることができるものである。さらに、特にそれぞれペプチド及び支 持分子が有するアミノ基を互いに結びつける場合、グルタルアルデヒドを利用す ることもできる。

本発明に基づく望ましい分子団は、これらの分子の抗原性及び免疫原性を強化す るαらせん立体配座な有するものから成る。αらせん立体配座を有するかかる分 子は、トリフルオロエタノール中又は水溶液状態で、環状二色性により立証され た。

本発明に基づく分子は、亜三日熱マラリャ原虫の発達の肝臓段階の特異ＬＳＡ抗 原の特徴的抗原性を有する。

実際、以下に続く詳しい説明において本発明に基づく分子の例を用いてより限定 的に記されているように、本発明に基づく分子は、亜三日熱マラリャ原虫により 生成されるＬＳＡ抗原に対する抗体と特異的に反応し、亜三日熱マラリャ原虫に より生成されるその他の抗原に対する又はその他の種類の原生動物住血胞子虫類 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）により生成される抗原に対する抗体とは反応しない。

従って本発明に基づくこれらの分子は、そのきわめて強い免疫原性について前述 してきたＬＳＡ抗原の効果の下で、亜三日熱マラリャ原虫に感染した人間の免疫 系が生成した抗体を特定的に認識する。

こうして、本発明に基づく分子は大量に生産することができるものであることそ して人間が亜三日熱マラリャ原虫に感染したとき最も活発に生成される抗体を特 定的に認識する特性を持つものであることから、これらの分子は、亜三日熱マラ リャ原虫に感染した人間におけるマラリャの試験管内診断のための特選試薬とな っているのである。

従って、本発明は、それを含む可能性のある生物学的組織又は流体内における亜 三日熱マラリャ原虫による人間の感染に由来するマラリャに相関関係づけること のできる抗体の試験管内検出方法に関するものである。かかる方法は、生物学的 流体又は組織内に場合によって存在する抗体と本発明に基づく分子の間の試験管 内での免疫学的反応を可能にする条件の下でかかる分子とかかる組織又は流体を 接触させる段階、ならびに場合によって形成される抗原抗体複合体の試験管内検 出の段階を含んでいる。

できれば、生物学的媒質は、ヒト血清で構成されていることが望ましい。

このような検出を行なうためには従来のあらゆる手順を利用することができる。

一例を挙げると、好まれる一方法は、ＥＬＩＳＡ技法（固相酵素免疫測定法）に よる免疫酵素方法、又は免疫蛍光測定法又は放射免疫測定法（ＲＩ　Ａ）又はそ れと同等のものを用いる。

従って、本発明はまた、酵素、蛍光、放射性タイプの適当な標識を用いて標識付 けされた本発明に基づく全ての分子にも関するものである。

このような方法には例えば以下のような段階が含まれるニ ー　滴定用マイクロプレートのウェルの中に本発明に基づくポリペプチド化合物 を一定量沈積させる段階。

−　かかるウェルの中に、診断の対象となる血清の増大する希釈物を導入する段 階。

−マイクロプレートのインキュベーション段階。

−マイクロプレートをくり返し洗浄する段階。

−血液の免疫グロブリンに対して標識づけされた抗体のマイクロプレートをウェ ル内に導入する段階。

なお、これらの抗体の標識付けは、少な（とも一定の波長にて、基質の放射線吸 収を変えることによりこの基質を加水分解することのできる酵素の中から選定さ れた酵素を用いて行なわれている。

−対照との比較による、加水分解された基質の量の横比段階。

本発明は又、以下のものを含む、亜三日熱マラリャ原虫によりひきおこされたマ ラリャの試験管内診断のためのキットにも関するものであるニ ー　本発明に基づくポリペプチド化合物。

−免疫学的反応の実現に好都合な媒質を構成するための試薬。

−免疫学的反応により生成された抗原抗体複合体の検出を可能にする試薬、なお かかる試薬は同様に標識を有していてもよく又特に上述のポリペプチド化合物に 標識が無い場合、それ自体が標識付試薬により認識されうるものであってもよい 。

−上述のポリペプチド化合物により認識される抗体を含んでいない基準となる生 物学的流体又は組織。

本発明は、それ自体本発明に基づくポリペプチドに対抗して形成された抗体に関 するものである。

当然のことながら、この生成は多クローン性抗体に限られていない。

さらに又本発明は、一方では本発明に基づく純化されたポリペプチドの１つに対 して免疫にされた特にマウス又はラットといった動物の牌臓細胞から又他方では 適当な骨髄腫細胞系列の細胞から従来の方法を用いて形成され、動物の免疫のた めに当初用いられたポリペプチド、限定的にいうとポリペプチドエヌはポリペプ チド■を認識する単クローン性抗体を生成するその能力により選定される可能性 の高い全てのハイプリドーマにより生成される全ての単クローン性抗体に適用さ れる。

最後に、本発明は、亜三日熱マラリャ原虫による人間の感染に由来するマラリャ に対する免疫を与える新しい成分の完成への道を切り開くものである。

本発明は又、薬学的に受容できる適当な賦形剤及び場合によってはマラリャに対 する免疫性あるその他の有効成分と結びつけて、本発明に基づくペプチド又はこ のペプチドのオリゴマー或いは又このペプチド又はオリゴマーと担体分子の複合 体を含むワクチンの形で調製された化合物にも関するものである。

有利な薬学的化合物は、本発明に基づく製剤を少なくとも１つ有効な用量だけ含 んでいる注射可能な溶液、懸濁液又はリポソームで構成されている。できれば、 これらの溶液、懸濁液又はリポソームは、できれば塩を含むか又はグルコースを 含む殺菌された等張水相内で作られるのが望ましい。

さらに限定的にいうと、本発明は、皮肉注射、筋肉的注射又は皮下注射或いは又 乱切法により投与することのできる上述のような懸濁液、水溶液又はリポソーム 形に関するものである。

同様に本発明は、その他の経路、特に経口、肛門経路を通して或いは又粘膜特に 目、鼻、肺又は腟の粘膜と接触するエアロゾルの形で投与することのできる薬学 的化合物にも関するものである。

従って、本発明は、本発明に基づく製剤のうち少なくとも１つが、口、目又は鼻 からの投与形態の組成に適合させられた固体又は液体の薬学的に受容できる賦形 剤、又は肛門投与形態の組成に適合させられた賦形剤或いは又膣投与用のゼラチ ン状の賦形剤に結びつけられているような薬学的化合物に関するものである。

又、本発明は、特に目又は鼻の粘膜上への投与に適合させられた本発明に基づく 複合体のうち少なくとも１つを含む等張液化合物にも関係する。

本発明に基づくワクチン接種用化合物にはさらに、ワクチン投与を容易にするポ リビニルピロリドンといった賦形剤（溶液）も含まれていることが望ましい、ポ リビニル・ピロリドンの代わりに、以前用いていた従来の意味でのあらゆるタイ プの補助薬すなわち薬をより容易に吸収させ人体内でのその作用を容易にするこ とのできる物質を用いることができる。このりイブのその他の補助薬の例として は、カルボキシメチルセルロース、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム 或いは当該分野の専門家にはよく知られたこのタイプのその他の補助薬を挙げる ことができる。要するに、これらには必要−とあらば、特にムラミルペプチドタ イプの免疫学的補助薬が含まれている。

当然のことながら、本発明は例として以上に記されている実施態様に限られるわ けではなく、当該分野の専門家は以下に示す請求の範囲から逸脱することなくこ れに変更を加えることができる：特に、本発明に基　。

づくペプチド配列に介入するアミノ酸のいくつかを同機能体（１ｓｏｆｏｎｃｔ ｉｏｎｎｅｌ）又は同配体（ｉｓｏｓｔｅｒｉｑｕｅ）のアーミノ酸で置換する こともできる０例えば以下のような単数又は複数の置換が考えられるニー　Ｇｌ ｕをＡｓｐ又はＧｉｎで置換する。

−ＬｅｕをＡｌａなどで置換する。

又当然のことながら、かかる置換の結果書られるペプチドは、それ自体又はこれ らのペプチドから形成されるオリゴマ又は複合体が免疫原的に同じような特性を 有するかぎりにおいて、より限定的に請求されているペプチドの等価物で構成さ れている。

本発明はさらに限定的に言うと、それぞれ本発明に基づく配列の１７のアミノ酸 を有しβ−ガラクトシダーゼ以外のペプチドフラグメントに統合又は付着させら れた単数又は複数のペプチド配列を含みうる、遺伝子工学技法を用いて得ること のできる「キメラタンパク質」に関するものでもある。上述のペプチドフラグメ ントはできれば、本発明に基づくペプチド配列の免疫原性を強化するのに充分な 分子量を有し、免疫学的見地からみてめられる免疫原性の発現と干渉しないこと が望ましい。

本発明の補足的特性は、本発明に基づいて得られた１７個のアミノ酸の配列を複 数含むポリペプチドの条件についての以下に記す説明からさらに理解できること だろう。

以下では１次のものを含む図面が参照されているニ ー　第１図は、それ自体亜三日熱マラリャ原虫の肝性形の特徴的なポリペプチド に対し暗号づけする特異的配列を含む、研究中の組換え型拡散の１つ（クローン ＤＧ３０７）のヌクレオチド配列を示している。

−第２図は、上述の特異ヌクレオチド配列に対し暗号づけされたアミノ酸の配列 を示している。

風土病のある地帯に住み、血液段階のシゾントに対する薬を用いた連続的予防療 法を受けているヨーロッパ人から採った血清が選定され、スポロゾイト段階（Ｃ ３抗原）、肝臓段階（ＬＳＡ抗原）そして血液段階の抗原を用いてテストに付さ れた。これらの血清の大部分は、恐らくは予防療法が中断されたことが原因で、 あらゆる段階の抗原と反応している。熱帯アフリカの農村に住んでいて２３年か ら２６年の間中断熱く毎日１００１４のクロロキンを摂取してきた人から採取し た３つの血清は免疫螢光測定法（ＩＦＡ）に従って、血液段階の抗原と反応しな い、それでも、これら３つの血清は、スポロゾイト及びＬＳＡタンパク質に対し て向けられた抗体の高い滴定濃度を有している（それぞれＩＦＡ希釈度１／３２ ００及び１／６４００）。

特異性が減少した前述の３つの血清のうちの１つを用いて、以下のような要領で λｇｔｌｌバンクをスクリーニングした： ｌ）　三日、マラリャ　のゲノムＤＮＡバンクの成 亜三日熱マラリャ原虫のタイ株Ｔａｋｇのクローン９６のゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（ Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１２．１．３７−１３８　（１９８１））を従来の方法で分 離した。

亜三日熱マラリャ原虫のＤＮＡ１８Ｊ４の試料を、　ｐＨ７，５のＴｒｉｓＨＣ ｊ　５０ｉ＋Ｍ、　ＭｎＣム１　ｍＬ　ウシ血清アルブミン２０Ｊ４／ＩＩＩＩ の緩衝液内で、ＤＮＡａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　） 　５　ｐｇの場合５分、　３．　！５ｐｇの場合５〜１０分の間１５℃でインキ ュベーションした。ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）５ｍＭを加えた 後、ＤＮＡの試料を合わせて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー ル（体積比２５：２４：１）の混合物での抽出により次にエーテルにより純化さ せる。ＤＮＡを、酢酸アンモニウム２，５Ｍを加えた状態で一２０℃におけるエ タノールによる沈殿により濃縮させる。

こうして処理したＤＮＡ４５μｇを、３７℃で１５分間、さらにＤＴＴ　（ジチ オスレイトール）を付加して、供給業者の勧める条件の下でＥｃｏＲ１メチラー ゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ　）　１８０単位でメチル化した。上述のようにＤＮＡを純 化した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１０単位（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｂ）及び大腸菌ＤＮＡリガーゼ１０単位（Ｂｉｏｌａｈｓ）を加えた状態で、ｐ Ｈｓ、ｏのＴｒｉｓ　ＨＣｆｉ４０ｍＭ、硫酸アンモニウム１０＋ｎＭ、２−メ ルカプトエタノールｌｏｍＭ。

ＥＤＴＡｏ、５＋ｎＭ、ＮＡＤ　にコチンアミドアデニンジヌクレオチド）　０ ．０５ｍＭ、　ｄＸＴＰ　Ｏ、ｌ　ｍＭ（４つの三重燐酸デオキシヌクレオ　ｄ ＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む）と共に、ＤＮＡ　１０μｇをインキュ ベーションした。このＤＮＡは、上述のとおり純化させ濃縮させた。

次にＤＮＡ　ａｕｇを、ｐＨ８，０のＴｒｉｓ　ＨＣｌ２５０ｍＭ、　ＭｇＣＪ ２　ｔ　１０ｍＭ、　ＤＴＴ　２０ｍＭ、　ＡＴＰｌ　ｍＭ、ウシ血清アルブミ ン５０μｇ／艷の緩衝液中で４単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｔｅａ）に より、０．４μｇのアダプターすなわち「リンカ−Ｊ　Ｅｃ。

Ｒ１（Ｂｉｏｌａｈｓから市販されているリン酸化されたアダプタＥｃｏ　Ｒ１ ）と結合させた。

４℃で５時間インキュベーションした後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを２単位付加し、 １６時間４℃で反応を続ける０反応を停止させるため試験管を一８０℃での凍結 と解凍の数回のサイクルに付す１次にＤＮＡを希釈させ、Ｅｃｏ　Ｒ１酵素を使 用するのに供給業者が推奨している条件が得られるようにインキュベーション用 緩衝液を調整する。１００単位の酵素Ｅｃ。

Ｒ１（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）を付加し、３７℃で３時間インキュベー ションする１反応は、６０°Ｃで１０分間加熱することにより停止させられ、上 述のようにＤＮＡを純化し濃縮させる。

ＤＮＡを、ｐＨ８，０のＴｒｉｓ　ＨＣｌ２　５０ｍＭ。

Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１　ｍＭの緩衝液１００μの中で再度懸濁させ、酢酸ナトリウ ム２５ｍＭ、　ＥＤＴＡ　１０ｍＭで調整させたサッカロースの５〜２０％の勾 配上で沈殿させ、次に１５０分間１分あたり４５，０００回転でＢｅｃｋｍａｎ 　Ｓ　Ｗ　５０　、　１の回転子内で遠心分離させる。

分画け、アガロースゲル上で分析し、約３ｏｏｐｂか６２．５００ｐｂまでのサ イズのＤＮＡフラグメントを含む分画を集めて、ｐＨ８−０のＴｒｉｓ　ＨＣｌ ２５０ｍＭ、ＥＤＴＡ　１ｍＭの緩衝液に対し４℃で透析する。ＤＮＡは、エタ ノール沈殿で濃縮させる。このＤＮＡ約４００ｎｇを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ１ 単位（Ｂｉｏｔｅｃ）により１０ｄの体積の中で（ｐＨ８，０のＴｒ　ｉ　ｓ　 ＨＣｌ２５０ｍＭ、ＭｇＣ１ｔ　１　０　ｍＭ。

ＤＴＴ　２０＋ｎＭ、ＡＴＰ　１ａＭ、ウシ血清アルブミン５０ｍ／−のν衝液 ）、Ｅｃｏ　Ｒ１より切断され脱リンされた（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃの Ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ）賦形剤ｇｔ１１のＤ　Ｎ　Ａ　１　ｕｘ　（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８０゜１１９４−１１９８（１ ９８３）　）に対し結合させた。

結合生成物を、Ｍａｎｉａｔｉｓ他が記している技法（分子クローニング、実験 所マニュアル、ｐ２６４．ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ（１９８２））に従ってＢ、　Ｈａｈｎ（）ｌｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、６８．２９９）により作られた細菌株から調整された大腸菌の抽出物の 中で試験管内で色版させた。こうして約７００万個の組換え型バクテリオファー ジが得られた。

２）バンクの　−・スクリーニング 組換え型バクテリオファージを、９０ｍｍのベトリ皿１枚につき５０，０００の ゾーン密度で表示用細菌Ｙ１０９０を含む培養基上に延展させ、３時間４２℃で インキュベーションした。０．ＯＩＭのＩ　ＰＴＧイソプロピル−β−チオガラ クトピラノ・シト（Ｓｉｇｍａ　）で飽和されたニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅ ｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　ＢＡ８５　）のフィルターを、３時間３７℃ にインキュベーションされたベトリ皿の上に置く、このインキュベーションの終 了時点でニトロセルロースのフェルクーを採取し、ペトリ皿は４℃に保つ。

ニトロセルロース・フィルクーを、ｐＨ８，０のＴｒ　ｉ　ｓ　ＨＣｆｆ　５０ ｍＭ、　ＮａＣｎ　ｌ　５０　ｍＭ。

５％の脱脂乳、０．０５％のＴ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０　（Ｓｉｇｍａ）の緩衝 液ＴＬのバス内に置く、フィルターなＴＬ緩衝液内で４℃に１５時間、その後２ ０℃に１５分間２回のインキュベーションに付す０次に、これらのフィルターを 、尾崎他により記されている技法（Ｊ。

Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８９．２１３−２１９．１９８６年） に従って抗大腸菌抗体量を減らすよう予しめ処理された亜三日熱マラリャ原虫の 全ての発達段階の抗原に対して向けられた免疫になったヒトの抗血清のプールを 用いて、一時間インキュベーションする。ヒトの抗血清プールはＴＬ緩衝液での １／２００の希釈度で用いられた。又、インキュベーションは１時間２０度で行 なわれた。

フィルターを４度ＴＬ縁衝液で４度洗浄し、次にワサビダイコンのペルオキシダ ーゼ（Ｂｉｏｓｙｓ）に共役されヨウ素１２ｓＩでヨード化されたヒトの抗免疫 グロブリン抗体を用いて、２０℃で１時間インキュベーションに付した。ＴＬ緩 衝液、次にｐＨ８，０のＴｒｉｓＨＣＩ２５０ｍＭ、ＮａＣ４２１５０ｍＭの緩 衝液です数回洗浄した後、ペルオキシダーゼの酵素活性が明らかになり（前述の 尾崎他）、フィルターは自由空気で乾燥させられ、増幅スクリーンを用いてＫｏ ｄａｋ　ＲｏｙａｌＸ−ＯＭａｔ　ＡＲフィルム上にオートラジオグラフィー撮 影される。

陽信号に相応する溶解ゾーンを採取することにより、組換え型のバクテリオファ ージのクローン約１．２００の集合体が構成された０次にこれらのクローンを第 ２の免疫学的スクリーニングのサイクルに付すが、今度は、亜三日熱マラリャ原 虫の赤血球形に対して向けられた抗体を全く又はほとんど呈さす寄生虫の肝性形 に対する高い滴定濃度を呈する上述の（ｐ１６及び１７）３つのヒト血清のうち の１つを用いる。この免疫学的スクリーニングは、上述のプロトコルに従って行 なわれた。この血清は、亜三日熱マラリャ原虫の特異抗原の生産的クローンのう ちわずか１５％（試験された４００中６０）とのみ反応し、最も活性の高いクロ ーンの中から２２のクローンが選ばれ以下のように特徴づけされた。

組換え型クローンにより表わされる抗原決定基と反応するヒト抗体は（前述）の 尾崎その他により記されている技法に従い、組換え型タンパク質に対する親和力 により純化された。これらの特異抗体は、さまざまな発達段階での（スポロゾイ ト肝臓段階、赤血球段階）寄生虫の製剤と共にインキュベーションに付され、反 応は間接的免疫螢光測定法により検討された。

肝臓段階の特異抗体が親和力によりその上に保留されている。すなわちこの段階 に特有の決定因子を表わしている組換え型クローンが検討された：すなわちクロ ーンＤＧ３０７．ＤＧ１９９及びＤＧ１４５である。これら３つのクローンに特 異的なこれらの抗体は、ヒト又はサルの肝細胞が亜三日熱マラリャ原虫のスポロ ゾイトにより感染した後掲られるような肝性シゾントと特異的に反応する。螢光 の局在性は、ＬＳＡの特徴として考えられているものと同じであるものとして決 定された。

３つのクローンＤＧ１４５．ＤＧ１９９及びＤＧ３０７の段階及び種類の特異性 は以下の要領でテストされた。第１に、親和力により純化されＩＦＡによりＬＳ Ａと反応する（或いは又ＩＦＡ陽性である）同じ抗体は、アセトンに寄生虫を定 着させた状態でＩＦＡによりテストされたか或いはＳＤＳで抽出された全ての段 階のタンパク質を用いてイムノトランスファ（免疫プロット法）によりテストさ れたかに関わらず、乾性又は湿性のスポロゾイト製剤とも、血液段階の抗原とも 反応しないということが見極められた。親和力により純化された抗体は、Ｓａｉ ｍｉｒｉ　５ｃｉｕｒｅｕｓザルから調整された良性三日熱マラリャ原虫の肝性 シゾンテとも、Ｌｕ虱旦の肝Ｗａ段階の抗原とも反応しない。

第２にＤＧ１４５．ＤＧ１９９及びＤＧ３０７の組換え型クンバク質は、偶発的 な輸血によりマラリャ（亜三日熱マラリャ原虫によりひき起こされたマラリャ） に感染し従って定義上その前の段階に特異的な抗原（肝臓段階の抗原及びスポロ ゾイト）をもたない二人の患者から採った血清と反応しない、これらのタンパク 質は、組換え型Ｃ８抗原Ｒ３２を及び３２で免疫されたマルスの血清で、ＯＳテ トラペプチドを認識する２つの基クローン性抗体と反応しない（Ｓｃｉｅｎｃｅ 。

２２８．９５８（１９８５］　）　、さらに、組換え型タンパク質はテストされ た抗亜三日熱マラリャ原虫のヒト血清全てについて陽性であるのに対し、免疫ド ツトプロット法によりテストされたとき、良性三日熱マラリャ原虫（Ｐ。

Ｖｉｖａｘ）　（ただし血清は良性三日熱マラリャ原虫の肝性シゾントについて は陽性であった）、卵形マラリャ原虫（Ｐ、　ｏｖａｌｅ）及びＰ、　Ｃｙｎｏ ｍｏｌｇｉ　（本来は短尾ザルに見出されるがまれにヒトにも感染する種）に対 して向けられたヒト抗血清と反応しなかった（Ａｎｎ。

Ｓａｃ、　Ｂｅ１ｇ、　１Ａｅｄ、　Ｔｒｏｐ、　６０．３４８（１９８０）） 　。

成熟ＬＳＡの一つの特徴として知られている熱に対する安定性（Ａｎｎ、　Ｊ、 　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、、　３３（３１３３６−３４１（１９８４） 　）　、も又クローンＤＧ３０７により生成された溶解タンパク質について実証 された。これは、１００℃１５分間の処理の後も、抗原的に活性でありつづける 。このような理由から、クローンＤＧ３０７がさらに１羊しく分析された。

亜三日熱マラリャ原虫の１９６の塩基対の１ｎｓｅｒａｔが、純化され、プラス ミドｐＵｃ１３とバクテリオファージＭ１３ｍｐ８の内部で再クローニングされ た（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　９．３０９−３２１（ １９８１））　、その後、ＤＮＡ配列及びＬＳＡ遺伝子のゲノマ組織が見極めら れた。第１図は、クローンＤＧ３０７が全体的に５１対の塩基のモチーフの反復 で構成されたＤＮＡフラグメントを含んでいることを示している。

ただ１つの読みとり相が、Ｂ−ガラクトシダーゼのラック（ｌａｃ）　Ｚ遺伝子 と同相であり、これは、クローンがヒト血清によりＶＷａされたエピトープを有 する溶解タンパク質を生成することがら°、望まれる特徴である。このフラグメ ントに相当するアミノ酸の配列は第２図に示されている。これは、グルタミン、 グルタミン酸及びロイシンが豊富な１７のアミノ酸のくり返しで構成されている 。この配列をコンビニーり解析すると、これがβ−ひだ無しαらせん構造を持っ ている確率がひじょうに高いことがわかる。さらに、これまでにわかっているＤ ＮＡ配列と、上記タンパク質に対して暗号づけするＤＮＡ配列の間には、Ｌｏｓ 　Ａｌａｍｏｓ及びＮＢＲＦのデータバンクによる解析によっても、いかなる相 応関係も見出されていない、このことは、ＬＳＡクンバク質の肝臓段階の特異性 と合致している。

ｐＵｃ１３内でクローニングされた１９６対のベースのフラグメントを用いる５ ｏｕｔｈｅｒｎの方法に従ったトランスファによる分析は、このフラグメントが 、独特のフラグメントＥｃｏ　ＲＩ　（６，５ｋｂ）　とＤｒａＩ　（４，５ｋ ｂ）に交雑することからみて独特の遺伝子の誘導体であること、を示している。

他の株からのＤＮＡを用いた場合異なるサイズのフラグメントＲ５ａ　Ｉが見ら れたことから、この遺伝子は多型性であると思われる。この遺伝子は、今までに 研究された亜三日熱マラリャ原虫の株全ての中に、最も大きい染色体の１つの上 に局在化されて見い出されている。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション（交雑）研究によると、３つのクローンＤＧ３ ０７，１４５及び９９は同じ遺伝子から誘導された別々のフラグメントである。

ＤＧ３０７により暗号づけされた反復のタイプは保たれるように思われ、相応す る単数又は複数のエピトープが亜三日熱マラリャ原虫の全ての株に存在すること を暗に示している。このことは、タイ株Ｔａｋｇ、９６から誘導された遺伝子が アフリカのヒト血清すなわちアフリカ株で免疫された人の血清を用いて検出され たことから、観察と一致する。

反復性エピトープは亜三日熱マラリャ原虫の抗原の一般的持性であると思われる ため（［Ｎａｔｕｒｅ、　３０６゜７５１−７５６（１９８３１；　Ｎａｔｕｒ ｅ、３１１．３８２−３８５（１９８４）：５ｃｉｅｎｃｅ、　２２５．５９３ −５９９［１９８４１：　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１５９５−１５９７（１ ９８５）：　Ｃｅ１１．４０．７７５−７８３（１９８５））　、人間において ひじように免疫原性の高いＬＳＡが同様に反復性の構造をもっているということ は驚くべきことではない、クローンＤＧ３０７のヒト抗血清との強い反応は、天 然エピトープが４回未満の反復により規定されることを表わしている。

ＤＧ３０７の組換え型タンパク質により表現される単数又は複数のエピトープと 、肝臓段階の成熟タンパク質的に存在するエピトープの間の関係が、以下の要領 で研究された：象牙海岸、ガボン及びザイールからきた、上述の成熟タンパク質 に対して向けられた抗体を高い滴定量含んでいる１０個のヒト血清を、肝臓段階 の抗原との明確なＩＦＡ陽性反応を呈する希釈度に調整した８次にこれらの血清 を、Ｉ　ＰＴＧによりもたらされたクローンＤＧ３０７のタンパク質抽出物が加 わった状態で、或いは血液段階の抗原決定基を表わす他の２つのクローンからの タンパク質を用いた状態で、インキュベーションに付した。抗原の濃度は、免疫 ドツトプロット法により複数の希釈度をテストし、高度免疫血清プールを用いて 結びつけられた抗体を明らかにすることによって、前述のものと同じ反応性レベ ルまで調整された。大気温で２時間のインキュベーションの後、さまざまな溶液 の肝性シゾントに対する特異性をＩＦＡでテストした。その結果、ＫＧ３０７で 予じめインキュベーションに付された抗体はもはやＩＦＡ反応性を全くもたず、 一方、その他２つの抽出物でインキュベーションに付されたものは、その肝性抗 原に対する活性が低下していなかったということがわかった。

従ってＤＧ３０７はＬＳＡの主要エピトープに対して暗号づけすると思われる。

というのは、これらの吸収実験において、成熟タンパク質に対するＩＦＡ反応性 が、テストされた１ｏのヒト血清のうち９つについ゛て消滅していたのに対し、 ＤＧ３０７のものと異なる組換えタンパク質が加わった状態でのこれらの同じ１ ０の血清の予備インキュベーションの後ＩＦＡ活性の低下は全くみられなかった からである。

本発明は又、ポリペプチド配列工又はＩＴのうちの少なくとも１つ又はその両方 を含む組換え型核酸、ならびにこれらの組換え型核酸により変換され上記ポリペ プチドを表現することのできる特に大腸菌のような微生物にも関係する。

本発明は、これらの核酸配列或いは、合成可能でしかも同じアミノ酸について暗 号づけする同等の配列に関するものである。

当該分野の専門家であれば、これらの配列において、暗号づけされたペプチドを 変えることなく遺伝暗号の変性性に応じていくつかのヌクレオチドを他のヌクレ オチドと置換することができるということは直ちに明らかである。これらのヌク レオチド配列全てならびにその固有の免疫原性活性が著しく変わることなく単数 又は複数のアミノ酸だけ前のものと異なっているポリペプチドについて暗号づけ するヌクレオチド配列は、本発明の一部を成すものである。当然のことながら、 最構成可能で、先に述べたようなオリゴマについて暗号づけすることのできるヌ クレオチド配列についても同様である。単量体モチーフは直接突き合わせて或い はペプチド配列を介して結びつけられ、こうして形成されたオリゴマーの免疫原 性には影響がない。

最後に、本発明はこれらの微生物により変性された賦形剤に関するものである。

なお当然のことながら、これらの賦形剤には、能力ある細胞有機体内における上 述のヌクレオチド配列の発現を可能にする、このヌクレオチド配列の前後の調節 及び終結が備わっている。

以上に規定されてきた特徴的なペプチドについて暗号づけするヌクレオチド配列 のうち、以下のトリブレットの配列により特徴づけされるものを挙げることがで きる。これらの配列は特に最初の三つについてはペプチドＩに、最後のものにつ いてはペプチドＨに相当している。その式は前述した。（ただし、以下の配列中 点で置換わっているヌクレオチドは、その真上にある第１の配列のものと同じで ある）。

（１）　ＣＴｒ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＭＧ　ＴｒＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　Ｃ ＡＧ　ＣＭ　ＡＧＣＧＡＴ　ＴｒＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＡf　ＡＧＡ （２）・・・・・・・・・・・・・・・・・Ｇ・・・・・Ａ・・Ａ・・・・・・ ・・・Ｃ・・・・・・・・・・・・・・（３）・・・・・・・・・・・・・・・ ・・Ｇ・・・・・Ａ・・Ａ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ （４）・・Ａ・・・・・・・・・・・・・・・・・Ｇ−Ｇ・・・Ａ・・・・・・ ・・・Ｃ・・・・・・・・・・・・・・上述のクローンＤＧ１９９とＤＧ３０７ を含む細菌は１９８６年７月２２日にそれぞれｌ−５８０及びニー５８１の番号 でパリ、パスツール研究所のフランス微生物培養コレクションに登録された。細 菌ＤＧ１４５は１９８ｆｌ１９月１５日、ｌ−６０６（７）番号で登録されてい る。

国際調査報告 −一一−−＾帥に一一＋ｗＰｃＴ／ｒＲ８Ｂ１０００７４　−国際調査報告　Ｆ Ｒ８８０００７４

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．亜三日熱マラリア原虫に感染した肝細胞内に生成されたタンパク質の特徴的 なエピトープを単数又は複数有するペプチド配列を少なくとも１つ含み、このペ プチド配列が以下の式により表わされることを特徴とする、ポリペプチド分子又 は化合物：【配列があります】 なお式中： Ｘは「Ｇｌｕ」（グルタミン酸）（ペプチド配列Ｉ）又は「Ｇｌｙ」（グリシン ）（ペプチド配列ＩＩ）である。
2. ２．前記、１７個のアミノ酸を含むペプチド分子１つから成り、このペプチドに は上記配列Ｉ及びＩＩのうちいずれが１つが含まれていることを特徴とする、請 求項１に記載の分子。
3. ３．前記、上述の２つの配列Ｉ及びＩＩのいずれかに相当する構造をもつ１７個 のアミノ酸のペプチドで構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記 載の分子。
4. ４．前記、上述の２つの配列Ｉ及びＩＩのいずれが１つのみ或いはその両方に相 当する複数の反復性ペプチド配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の分 子。
5. ５．特に以下のものの中から選ばれた環状置換を介して、請求項１から５までの いずれかに記載の分子から誘導された分子： 【配列があります】【配列があります】なお式中ＸはＧｌｕ又はＧｌｙの残基で ある。
6. ６．前記、上述の２つのペプチド配列Ｉ及びＩＩのうちの１つ又は２つのオリゴ マーから構成されていることを特徴とする、請求項１から５までのいずれかに記 載の分子。
7. ７．前記、１つの支持体に固定されていることを特徴とする、請求項１から６ま でのいずれかに記載の分子。
8. ８．薬学的に受入れることのできる賦形剤と結びつけた状態の、請求項１から７ までのいずれかに記載の分子の会合を特徴とする免疫原性化合物。
9. ９．その他の免疫原性成分の中でも請求項１から７までのいずれかに記載の分子 を含む、マラリヤ予防ワクチン用化合物。
10. １０．請求項１に規定されているペプチド配列Ｉ及びＩＩのいずれか一方に対す る暗号ヌクレオチド配列。
11. １１．人間から採取された生物学的流体又は組織を、請求項１から１０までに記 載のポリペプチド化合物と生物学的組織中に場合によって存在する抗体の間の試 験管内の免疫学的反応を可能にする条件の下で、上記ポリペプチド化合物と接触 させる段階、ならびに場合によって形成された抗原抗体複合体の試験管内検出の 段階を含む、亜三日熱マラリヤ原虫に感染した可能性のある人についてのアラリ ヤの試験管内診断方法。
12. １２．以下のものを含む、亜三日熱マラリヤ原虫に感染した可能性のある人につ いてのマラリヤの試験管内診断用のキット： −請求項１から１０までに記載のポリペプチド化合物。 −免疫学的反応の実現に好都合な媒質を構成するための試薬。 −免疫学的反応により生成された抗原抗体複合体の検出を可能にする試薬。なお かかる試薬は同様に標識を有していてもよく又、特に上述のポリペプチド化合物 に標識が無い場合それ自体が標識付試薬により認識されうるものであってもよい 。
13. １３．請求項１から５までのいずれかに記載のペプチド配列を特定的に記識する 多クローン性又は単クローン性抗体。
14. １４．請求項１から５までのいずれかに記載のポリペプドのための暗号づけＤＮ Ａ。
15. １５．請求項１４に記載のＤＮＡを少なくとも１つ含む絹換え型ＤＮＡ。