JPH01502477A - アルカリセリンプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 低温度活性プロテアーゼの調製 本発明は、新規アルカリプロテアーゼへその製造方法並びに他のプロテアーゼと 組合せることによるその使用に関する。

このプロテアーゼは洗剤に対する添加剤として好都合に用いることができる。典 型的洗剤は洗たく用の洗剤組成物である。

発明の前景 適当な栄養媒地中でバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の微生物を培養して得 られる蛋白分解酵素は、洗剤組成物において広く用いられている。

商業的に入手可能なプロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ ｅ　）　、エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ６　’Ｊおよびサビナーゼ（ＳＡＶ ＩＮＡＳＥ・）であり、全てノボインダスリー社から提供されている。これらの もの並びに他社から市販されている類似のバシラス由来の酵素製品は、洗剤溶液 中に通常存在する金属イオン封鎖剤、界面活性剤並びに漂白剤の存在下、ｐＨ８ 〜１１の範囲内のｐＨ（！で洗剤溶液中において酵素活性を示す。

アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥｅ　）中のプロテアーゼは、バシラスリケニフ ｔルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種の菌株を培養し て得られる。エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ＠　）およびサビナーゼ（ＳＡＶ ＩＮＡＳＥ・）中のプｔ）ｒ？−ゼは米国特許３，７２３．２５０に従い、親ア ルカリ性バシラス種を培養することによって得られ、次いでｐＨ１２で８０〜１ ００％の最大蛋白分解活性を保持しており、該活性はアンソン法によりヘモグロ ビンに対して測定されている。

上記の商業的に入手可能な最適温度は約６０℃である。しかし、これらの商業的 酵素は室温で比較的低い活性を示す。

発明の詳細な説明 この発明は、真菌微生物から得られる新規アルカリプロテアーゼの生産、単離、 特性およびその使用に関する。プロテアーゼ生産微生物は、ペシロマイセスマル クアンジー（シ猛ｊ」ｖｌｊ型」咳り硯ｙ瓜ｊ−）の単離物である。この微生物 が有用なアルカリプロテアーゼを産生ずることは従来知られていなかった。この プロテアーゼの最適温度は約４５℃であり、商業的に入手可能な洗剤用酵素のそ れよりも１５℃ばかり低い、加えて、本発明の真菌プロテアーゼは、バシラスプ ロテアーゼによってもたらされる蛋白加水分解パターンとは異ったパターンをも たらす。

本発明の真菌プロテアーゼは、低温度、例えば冷水中、つまり１５℃〜２５℃で 商業的に入手可能なバシラスプロテアーゼよりもより有効である。

、その異った加水分解パターンは、バシラスプロテアーゼの作用に対し手に負え ないある種の蛋白質に対し真菌プロテアーゼを有効にする。加えて、ペシロマイ セスマルクアンジー由来の真菌プロテアーゼおよび成る種のバシラスプロテアー ゼを用いて調製した混合物から相乗作用が認められている。

従って、バシラスブロテアーゼと組合せた真菌プロテアーゼを採用することは魅 力的でありかつ本発明者によって意図されているものである。

発明の開示 多くの商業的使用が、プロテアーゼに対して存在するけれども、洗剤の使用は主 な市場を代表し、更に適当には以下に述べるペシロマイセスマルクアンジーに関 する詳細な議論が、洗剤使用の効用に関してなされる。しかし、存在する蛋白分 解酵素に対する多（の他の使用が本発明者らによって企図されていることを理解 すべきである。また、以下の内容も理解されるべきである。すなわち、酵素はし ばしば使用条件、顕著にはｐＨ１温度に対して鋭敏であり更に洗剤の使用に対し ては例えば通常の金属イオン封鎖剤、ＥＤＴＡの存在に対して鋭敏である。従っ て、例えばｐ）１Ｂ〜９でかつ６０℃での綿布帛の洗たくに対する通常のアメリ カ人の洗たく条件に十分適合するプロテアーゼは、多（の今日の布帛を洗たくに 対して推償されている低温度洗たく条件のもとでは有効性が少ない、かくして、 ペシロマイセスマルクアンジーブロテアーゼの至適低温度が、この酵素の主な利 点である。実際的意味において、−至適低温度は以下の内容を意味する。すなわ ち、より少ないこの酵素が洗液中４５℃で所望の酵素活性レベルを生じさせるの に必要とされる（例えば洗剤の添加剤のために今日用いられているバシラスプロ テアーゼに要求されるものよりも）。

関連する実際的結果は、次の通りである。すなわち、洗剤配合者が、冷水から（ 標準の）熱水洗浄に至る全温度範囲にわたって有効であるバシラスプロテアーゼ 、例えばアルカラーゼＯ，エスペラーゼ０、又はサビナーゼ・とペシロマイセス マルクアンジープロテアーゼとの酵素組合せを今や提供できることである。更に 、ペシロマイセスマルクアンジープロテアーゼと成る種のバシラスプロテアーゼ との組合せは、混合物が、それ自身各々の酵素よりもより有効であるように相乗 作用を生ぜしめることである。これは、以下に示される例ＸおよびＸＩで明らか にされるようにそれぞれ高用量および低用量で真史である。ペシロマイセスマル クアンジー由来のアルカリ性プロテアーゼを含んで成るプロテアーゼ製品は、周 知のアルカラーゼ０プロテアーゼよりも、１５℃の模擬洗たく条件のもとで綿（ Ｅ？ＩＰＡ　１１６）上の蛋白を基にした汚れを白化するために約４０％超の能 力を示す。

発明の詳細 な説明の別の面によれば、新規アルカリプロテアーゼを製造する方法、が提供さ れ、この方法は炭素、窒素、およびリンの同化性源を含有する栄養媒地中好気性 条件のもとてペシロマイセスマルクアンジーのプロテアーゼ生産菌株を培養し、 次いで培養ブロスからプロテアーゼ調製品を回収することを特徴とする。

本発明の別の態様によれば、ペシロマイセスマルクアンジ−由来のプロテアーゼ を、バシラス由来プロテアーゼとベシロマイセスマルクアンジープロテアーゼを 含んで成る混合酵素製品に製剤化する。好ましいバシラス由来のプロテアーゼは 、アルカラーゼ・、エスペラーゼ・およびサビナーゼ・である。

更に本発明のよりよき理解のため、添付図面を参照されたし。

第１図は、ペシロマイセスマルクアンジーのプロテアーゼを用いて２時間酸化イ ンシニリンβ−鎖を処理後に得られた消化製品の溶出クロマトグラムを示し、そ して比較のため公知のプロテアーゼ、アルカラーゼ・およびサビナーゼ・で処理 後に得られた消化製品の溶出クロマドグ、ラムを示す。

第２図は、フン化フェニルメチルスルホニルＣＰ？ＩＳＦ、　１ミリモル）又は ＥＤＴＡ　（１０・ミリモル）の存在又は非存在下、種々の温度およびｐＨでペ シロマイセスマルクアンジーのプロテアーゼのプロテアーゼの活性を示すグラフ である。

第３図は、アルカラーゼ・単独並びにペシロマイセスマルクアンジープロテアー ゼのいくつかと共に比較的に高用量で行った洗浄研究の結果を示すグラフである 。

第３図に示す如くグラフ化した反射率変化の結果は以下の内容を明らかにしてい る。すなわち、ペシロマイセスマルクアンジーのプロテアーゼとバシラスプロテ アーゼとの組合せは洗浄効果の改善をもたらす、アルカラーゼ・単独の用量を０ ．４から０．６ＡＵ／Ｉ！シて増加しても反射率の変化は殆ど改善されない、同 じ全蛋白分解活性例えば０．６ＡＵ／１の酵素混合物を用いると、実質的に改善 された反射率の変化をもたらす。

第４図は、ペシロマイセスマルクアンジー由来の真直プロテアーゼおよび他のｗ ｉ菌プロテアーゼ、サビナーゼ・の混合物を用いての洗浄試験で得られた相乗効 果を示すグラフである。全酵素用量０．１ＫＯυ／Ｉ！は、商業的プロテアーゼ 含有洗浄剤によって得られるものと類領している。上方グラフ中、最初の２つの 棒グラフはそれぞれサビナーゼ・およびペシロマイセスマルクアンジーに対して 得られた反射率の変化を示す、第三者の棒グラフは、サビナーゼ・とペシロマイ セスマルクアンジーブロテアーゼ９０対１００組合せに対して期待できる理論的 ΔＲ値、すなわちサビナーゼ・単独に対するΔＲの９０％およびペシロマイセス マルクアンジー単独に対するΔＲの１０％を示す。第４の棒グラフは、このよう な９０対１０混合物が洗たく中に用いられた時に得られる実験的ΔＲ値を表わす 、得られたΔＲ値は理論値よりも５０％より大きく、これにより相乗作用が生じ ていたことが示される。

比較のため、二種の細菌プロテアーゼ、すとナーゼ・およびアルカラーゼ・の混 合物も試験した。結果を第４図の下半分に示す、この場合、サビナーゼ・および アルカラーゼ・の９０対１０混合物に対して得られた実験的ΔＲは、予期したも のよりも小さく、すなわち相乗作用は認められない。

量且上 本発明の微生物は好気性であり、ベシロマ・イセスマルクアンジーの真菌阜履物 である。

増殖のための最適温度：２０℃〜３０℃、３５℃以上で増殖せず。

増殖のための最適ｐＨ＝　７．５〜ｌＯツザペフクドンクス寒天斜面上の灰白色 コロニー；成熟コロニーの帯桃灰色の原因である豊富な胞子形成。

成る程度の菌株特異性が、ベシロマイセスマルクアンジーの場合に存在する０本 発明の酵素を生産する分離物はＮＲＲＬ１Ｂ０４８である０本発明者らが確かめ た限りにおいて、ペシロマイセスマルクアンジーの菌株は基準株として同定され ていない、基準株に最も近くに相当する分離物は、ＮＲＲＬ　９０１（ＡＴＣＣ ＬＯ５２５と同じ）であるようであり更にこの菌株は本発明のプロテアーゼを産 生ずる。　ＮＲＲＬ　１Ｂ０４ＢおよびＮＲＲＬ　９０１はペシロマイセスマル クアンジーの異うた変異株である。

１゛　に　る ベシロマイセスマルクアンジー培養物の蛋白分解活性を、周知のアンソンヘモグ ロビン法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｐｈｙｓｉｏ−１ｏｇｙ、 　１４．７９〜８９（１９５９））により測定した。１アンソン単位は、分裂生 産物が、１ミリ当量のチロシンを与えると同様のフェノール試剤を用いた同じ色 を分裂生産物が与えると同様な、三塩化酢酸で沈でんできない分裂生産物の量を 毎分光たり形成するような初期速度で１０分の反応時間中、２５℃でかつｐＨ９ ，０でヘモグロビンを消化する蛋白分解酵素の量である。

蛋白分解活性はまた、カゼインの加水分解およびその後のＴＣＡ−可溶性ペプチ ドと０−フタルジアルデヒドとβ−メルカプトエタノールとの反応により決定さ れた。得られた錯体の吸光度を３４０ｎ−で測定し、次いでセリン標準と比較す る。

反応混合物は、３−の０．８％（Ｗ　／　Ｖ　）ハメルスティン（Ｈａｍｗ＋ｅ ｒｓｔｅｉｎ）カゼイン並びに０．５−の適当な酵素希釈液０．５１１ｉから成 り、これらの双方はｐＨ９，５のブリトンおよびロビンソンのユニバーサル緩衝 液（Ｌｉｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ）　Ｉ中に存する（Ｊ、　Ｃｈｅｗ、 　Ｓｏｃ、　ｋｌ！１．１４５１頁））、混合物を２５℃で３０分間インキュベ ートし、次いで反応混合物に１．２５−の停止剤（３，６％ｗ／ｖＴＣＡ、６． ０％（ｗ　／　ｖ　）の酢酸ナトリウム、および３．７８％（Ｖ／Ｖ）の氷酢酸 を添加する０反応を制御する際、停止剤は酵素の添加前に加える。２５℃で２０ 分後、反応混合物をワットフン０口祇嵐４２で口過するか、又は遠心分離する。

ろ液のアリコー）　（２００ｉｔ１）を、０．０５Ｍのナトリウムテトラボレー ト、１％（Ｗ／Ｖ）のナトリウムドデシルスルフェート、０．８■／−００−フ タルジアルデヒド（ＯＰＡ）（最初にエタノール中４０■／−溶液として溶ｐｌ ＃）、および０．２％（Ｖ／Ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含有する３ｄの ＯＰＡ試剤に添加する。２分後、３４ｏ１の吸光度を測定する。

同様に、セリン標準液（０，２■／ｄ）の２００ｍのアリコートを、３ｍｆのＯ ＰＡ試剤に添加し、次いでＡ３４゜を測定する。

活性度をＫＯυ（キロＯＰＡ単位）で表わし、ここでＩＫＯυは定めた条件下毎 分１ミリモルのＮｈの解放を生起させる蛋白分解酵素の量として定義される。

プローアーゼコンセントレートの ペシロマイセスマルクアンジー菌株ＮＲＲＬ　１Ｂ０４Ｂを同化性炭素、窒素並 びに他の必須の栄養を含有する中性培地中好気性条件下で培養するが、培地は公 知技術の原理に従って構成されている。

適当な炭素源は炭水化物、例えばシュクロース、グルコースおよびマルトースで あり、あるいは、穀粒、麦芽、ライスおよびモロコシの如き材料を含む炭水化物 である。培地に混入される炭水化物の濃度は広範囲に変り、例えば１〜１５％で あるが、通常は８〜１０％が適当であり、％はグルコースの当量として計算する 。

栄養培地中の窒素源は有機性であるべきである。有機窒素源の内、全く多くのも のが真菌の培養を含む発酵プロセスにおいて規則的に用いられている。このよう な例は、大豆ミル、綿実ミル、ビーナツツミル、カゼイン、コーンステイープリ カー、酵母エキス、およびアルブミンである。加えて、栄養媒地は通常の微量物 質をも含むべきである。

ペシロマイセスマルクアンジーは３５℃超の温度では増殖できないのでフィジク ロフィリンク（ｐｈｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｉｃ）であり、培養は好ましくは２０ ℃〜３０℃の温度範囲およびアルカリ性のｐＨで行う、アルカリ性のｐｇは、適 当な緩衝液、例えば炭酸ナトリウム、又は炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウムの混 合物又は炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムの混合物を添加して得ることがで きる（増殖培地を滅菌後）。タンク発諺槽内での培養に対しては、人工の通気を 用いる必要がある。通気速度は通常のタンク発酵で用いられるものでよい。

発酵後、液体酵素製品を、ブロスから粗材料を除去し、次いで所望により逆浸透 により低温度で蒸発によりブロスを濃縮して製造できる。°最終的には、保存剤 および／又は酵素安定剤、例えばプロピレンゲ°リコールはコンセントレートに 添加できる。液体製品は液体洗浄液に導入して安定である。

固体酵素製品はＮａ２５Ｏ，の如き塩を用い又はエタノール又はアセトンの如き 水混和性溶剤を用いて沈でんせしめることによって精製しおよび／又は濃縮した ブロスから調製できる。

適当な乾燥方法、例えばスプレ乾燥を用いブロス中の水を除去することも行うこ とができる。このようにして得られたプロテアーゼ調製品の蛋白分解活性は通常 ０．１〜２．　ＯＡＵ／　ｇの範囲内にある。

無粉塵性粒質物が公知方法、例えばＣＢ特許１，３６２．３６５又はＵＳ特許４ ．１０６．９９１に従って得ることができる。このような粒質物は粉末洗剤に配 合するためには適当である。

さ１±上ヱユ旦ｌ久 インシュリンの酸化β鎖のプロテアーゼ−触媒消化により製造されたペプチドを 逆相１’１ＰＬｃにより分離した。例■で記載するように精製したベシロマイセ スマルクアンジープロテアーゼの作用によって得られるペプチド消化製品のクロ マトグラムを第１図に示す、比較のため、公知のアルカリプロテアーゼ、アルカ ラーゼＯおよびサビナーゼ０を用いて消化することによって得られたペプチドに ついても示される０次の内容が明らかである。すなわち、本発明のプロテアーゼ は酸化インシュリンβ鎖の消化のそのパターンに関してバシラスアルカリプロテ アーゼのいずれとも明瞭に異っている。

免１」ＪＩｌｌ性 オフテルロニー二重免疫拡散試験は、対照標準として後記のプロテアーゼに対し て調製した抗体を用いた場合、ペシロマイセスマルクアンジーとアルカリセリン プロテアーゼ、アルカラーゼｅおよびサビナーゼＯの間で交差反応は示さなかっ た。

例Ｉ ペシロマイセスマルクアンジー菌株ＮＲＲＬ　１Ｂ０４Ｂを、次の組成培地２５ ｍ１を含む、２５０ｍのバフフル化工ルレンマイヤーフラスコ中、回転振とうテ ーブル（２５０ｒｐｍ）上で２６℃で培養した： 培地の組成（ＩＩ！当りのｇ数）ニ ゲルコース　１００ 大豆粉　７５ 酵母エキス　Ｉ Ｎａ！ＨＰＯａ　−１２１１ｚＯ１０ フ）ＬｔＴ：ｊ　ニー　ｙ　り＠　２５Ｒ２０，１ナトリウムカゼイナート　５ 殺菌後、培地のｐＨを、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム緩衝液０．１モル 溶液の５Ｍ＆を添加して９．２に調節した。

７〜９日間のインキュベーシッン後、培養物の蛋白分解活性を上記のアンソン法 を用いて測定した。ブロスの酵素活性は１６〜１８Ａυ／ｌであった。

例■ ペシロマイセスマルクアンジー菌株ＮＲＲＬ　１８０４８を次の組成Ｃｇ／ｌ！ ＞から成る培地中で培養した：マルトデキストリン　２０ 大豆粉　２０ に！ＨＰ０．　９ ＣａＣ０，５ 酵母エキス　２ プルロニフク・２５Ｒ２１ オートクレーブ後、ｐＨを、ＮａｚＣＯｚ／　ＮａＨＣＯ３緩衝液を添加して９ ．２に調節し０．１Ｍの最終濃度とした。培養物を２５Ｏｒｐｍで、３０℃で２ ４時間インキュベートした。この増殖期間後、培養物（６００ｉｄ）を用い次の 媒地（ｇ／ｌ）の１（ｌを含有する発酵槽をインキュベートするために用いたニ ゲルコース　５０ 大豆粉　１００ ａｚｎｐｏａ　５ ＣａＣＯユ　５ 殺菌後、培地を２　Ｍ　（’）Ｎａ、ＣＯ，でｐＨ８，２に調節した。発酵槽内 での初期増殖中、ｐＨは約７．０に降下した。濃度は最初３０℃に制御し、ｐＨ が７．０を超えて上昇し始めるとき２５℃に低下した。この点からずっと、ＫＯ Ｈ又はＮａ、ＣＯ３を添加してｐＨが７．０未満に降下しないように制御し、更 に）１３Ｐｏ、を加えて７．６を超えないように制御した。泡を制御するのにプ ルロニックｅを用いた。酸素要求の増加に応じて撹拌および通気を増加せしめた ：発酵槽を最大酸素移動速度で２４時間まで操作した。１２０時間後、プロテア ーゼ力価をアンソン分析法を用いて測定した。２５アンソン単位／ｌの値を示し た。

培養プロスを口過し次の実施例で用いられるプロテアーゼとした。

例ｍ ｐｕおよび温度の関数として例■で得られたプロテアーゼの活性を、上記分析方 法に従って基質としてカゼインを用いて測定した。加えて、プロテアーゼ活性に 対するＥＤＴＡ　（１０ｍＭ）およびフン化フェニルメチルスルホニル（Ｐ！’ ＩｓＦ、　１　ｍＭ）の効果を調べた。結果を第２図に図示する。この図から明 らかなように、最適温度は４５℃であり、市販プロテアーゼアルカラーゼ０およ びサビナーゼ０のそれよりも少なくとも１５℃より低い。プロテアーゼはまた、 ｐＨ７〜１０．５にわたって最大活性に近い活性を示す、加えて、プロテアーゼ 活性はＥＤＴＡではなく　、Ｐ？ｌＳＦの存在下殆ど完全に制御されており、酵 素がセリンプロテアーゼであることを示している。

例■ 種々の洗剤成分の存在下２５℃又は４０℃で例■のプロテアーゼの安定性を次の 如（測定したニ ブロチアーゼを、第１表に示す付加的成分と共に又は該成分なしで０．０１Ｍボ ラート緩衝液（ｐＨ９，５）中０．５ＡＵ／／に希釈した。

サンプルを２５℃又は４０℃で３０分間インキュベートし、次いで先に記載した 如くプロテアーゼ活性に対し２５℃で分析した。結果を第１表に示す。

プロテアーゼは、試験洗剤成分のいずれかにおいて、２５特表千１−５０２４７ ７　（５） ℃又は４０℃のいずれかで少なくともその活性の８３％を保ＣａＣ１ｚ（１０＋ ｎＭ）　１０５　９９ＥＤＴＡ（１０ｍ！’ｌ）　９７　８３トリポリリン酸ナ トリウム　１０１ （ＳＴＰＰ、　０．１％） 「タイプ（Ｔｉｄｅ）Ｊ　１０４　８９（ホスフェートなし、０．１５％） 例Ｖ 洗剤の存在下、種々の蛋白基質を消化するためのプロテアーゼの安定性を試験し 次いで市販プロテアーゼ、アルカラーゼ０と比較した。用いた基質は血液、カゼ インおよび草であった。

噴霧乾燥粉末として得られた全ての牛の血液およびカゼイン（ハンアースティン （Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ））を０．０５Ｍのボラートルミｆ緩衝液に溶解し洗 剤（０，１５％ｗ　／　ｖ、ホスフェートなし）および水硬化剤（１５０ｐｐａ ＋）の存在下、０．１％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度となした０例■のプロテアーゼ並 びに比較のため、アルカラーゼＯを指示した活性レベルで添加し次いで反応混合 物を１５℃で１５分間インキュベートした０反応はＴＣＡの添加によって終了さ せ次いでＴＣＡ−可溶性アミノ基の数を０−フタルジアルデヒドを用い上述の如 く決定した。

新しく切断した草（１０ｇ）を蒸留水（５０ｗ！り中５分間均質化することによ って草抽出物を調製し、次いでチーズクロスを介してプレスした。抽出物を５０ ５Ｍのボラート、ｐｉｆｌｏの緩衝液に完全に透析した。タイド（Ｔｉｄｅ）　 （ホスフェートなし）および水硬化剤を直接抽出物に添加しそれぞれ０．１５％ および１５０ｐｐ−の濃度を得た０例■のプロテアーゼ又はアルカラーゼ０を添 加し次いで上述のように反応を行った。但し、反応条件は２５℃でかつ３０分と した。

プロテアーゼはアルカラーゼ０に対し各基質を加水分解する程度を第■表に示す 。

第■表の結果から、以下の内容は明らかである。すなわち、同じ用ｔレベルで、 ペシロマイセスマルクアンジーは通常用いられる洗剤の存在下血液、カゼインお よび草蛋白質を液化するのにアルカラーゼよりもより有効である。

第■表 洗剤の存在下血液、カゼインおよび草の蛋白分解消化全　血　０．１　１１６ ０．３　１１７ カゼイン　０．１　１６６ 例■ この例は、例■で得たプロテアーゼの血液タンパクを消化するために能力につい て種々の商業上の洗剤の効果を示す。

比較はまた、同じ洗剤中の市販プロテアーゼのアルカラーゼＯに対して行った。

反応混合物は、変性した全血（ｏ、１％ｗ／ｖ）　、０．１５％の洗剤、１５０ ｐｐ−の水硬度、８．２１１１Ｍのナトリウムボラートおよび・０．０５ＡＵ／ 　ｆのプロテアーゼを含有した。消化は、１５℃で１５分間行い、次いで前述の 如＜ＴＣＡ−可溶性反応生成物を測定した。結果を第ｍ表に示す。

第■表 ＡＬＣＡＬＡＳＥ＠　１００ ２　ヱ、マルクアンジ−１４４ ＡＬＣＡＬＡＳＥ＠　１００ ３　ヱ、マルクアンジ−１３３ ＡＬＣＡＬＡＳＥ＠　１００ ４　Ｐ、マルクアンジ−１０３ ＡＬＣＡＬＡＳＥ＠　１００ ５　ヱ、マルクアンジ−１５４ ＡＬＣＡＬＡＳＥ＠　１００ 例■ 例■で得たプロテアーゼを次のように精製した：最初に培養プロスを２５Ｉｌ１ Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５の緩衝液）に広範囲に透析した。透析中に生じた沈 殿物質を遠心分離により除去した。透析したサンプルを２５＋ｎ？！（７：酢酸 ナトリウム（ｐＨ５）　で平衡化したカルボキシメチルセルロース（ＣＭ−５ｉ １カラム）に充填した。

プロテアーゼ活性は樹脂に結合し次いで０．２　ＭのＮａＣＪ含有の２５１酢酸 ナトリウム（ｐＨ５）で連続的に溶出した。プロテアーゼ活性を有する分画を集 め、アミコン聞−２膜で濃縮した０次いでサンプルを、すでに５０ｗ＋Ｈのトリ ス−ＨＣｌ（ｐＨ７，０の緩衝液）で平衡化したセファデックスＧ−１００カラ ムに充填した。プロテアーゼを同し緩衝液を用いて溶出し、活性フランクシシン を集めた。更にプロテアーゼのサンプルを５０＋ｎＭのトリス−ＨＣ４（ｐＨ７ ，０＞で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムで更に精製した。この緩衝液中 、カラムに吸着したプロテアーゼを勾配溶出し、ここにおいてトリスのイオン強 度は減少し、ホスフェート緩衝液のそれは増加した。

プロテアーゼ活性を１０ｍ？！のホスフェート緩衝液（ｐＨ７，０）濃度で溶出 ｔた。プロテアーゼの生成特異活性は、４７アンソン／ｇであった。

第■表 例■で得たプロテアーゼの精製を第■表に要約する。

ＣＭ−５２５３，０６２，９４，２１２，５７６５，６例■ この例は、精製プロテアーゼの特異活性を測定するために行った。

変性条件下での電気泳動を、例■に記載した如く精製したプロテアーゼについて 行った。結果は主バンドの分子量が３８、０００であり、更に調製品が活性部位 の滴定に対し適当であることを示しており、完全に精製した（均質化した）プロ テアーゼの特異活性を推定するための技術を用いた。プロテアーゼの活性中心を 、ペングーの方法（Ｍ、Ｌ、等、１９６６年、Ｊ。

Ａｔａｅｒ　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、　８８．５８９９−５９１３）に従って、 Ｎ−）ランス−シンナモイル−イミダゾールで適宜した。純粋なプロテアーゼの 特異活性は、蛋白質１ｇ当たり６２ＡＵであった。

特異活性は、公知のプロテアーゼ、アルカラーゼ０に対する活性よりも幾分高い （４５ＡＩ］／ｇ）　。

例■ 洗浄試験は、ホスフェートを有しないタイド（Ｔｉｄｅ）の存在下（＜０．５％ ）、例■の酵素０．０２５　、０．０５および０．１０Ａυ／１の用量を用い、 アイゲノシェマテリアルブルフーングーウントフェルズーハンスタルト、ザンク トガレン（スイス国）より提供されている５ａｎＸ５ａ１１（血液、ミルクおよ びカーボン黒で汚染した綿）ＯＥＭＰＡ１１６試験布帛スワフ試験布帛スルフチ ローメーターで１０分間１５℃で行った。

比較のため、同様の試験を０．０２５　；　０．０５および０．１０ＡＩ！７Ｍ のアルカラーゼの用量で行った。

プロテアーゼの洗浄能力を、酵素なしで洗浄したスワソチに対する酵素洗浄試験 スワンチの反射率を比較して反射率の変化（ΔＲ）を用いた測定した。反射率の 値を、ガーディナーリフラクトメーターＸＬ８００（ベセダ、ＭＤ）を用いて読 みと結果を第７表に示す。

第７表 ０、　Ｏ２５５，０９ ０、０２５３，８４ アルカラーゼ６　０．０５　７．５ ０．１０　１１．４ 結果は、ベシロマイセスマルクアンジープロテアーゼが１５℃の洗浄試験でアル カラーゼ０よりもより秀れた洗浄効果を有していることを示している。

例Ｘ ペシロマイセスマルクアンジープロテアーゼおよびバシラスプロテアーゼ（すな わち、アルカラーゼ０）に対する加水分解パターンの差異に基づき、アルカラー ゼ０に真菌プロテアーゼを添加すると、洗浄中歪白質汚染の除去が促進せられる ことが推定された。

洗浄試験を例■に記載した如く行った。但し、アルカラーゼとベシロマイセスマ ルクアンジーの用量を変えた。ブルカラーゼ０は単独で用いるか（０〜０．６Ａ υ／ｌ）又はペシロマイセスプロテアーゼとの混合物Ｃ０，４ＡＵ／ｌのアルカ ラーゼ０プラス０．０５〜０．４ＡＵ／／のベシロマイセスプロテアーゼ）のい ずれかで用いた。

結果を第■（および第３図）に示す。真直プロテアーゼの添加は、同じ合計用量 でアルカラーゼ０のみによって得られた反射率変化よりも著るしくより大きな反 射率変化（秀れた洗浄効果）をもたらす。

第■表 ０．６　１６．０ ０．４　．０５　１６．６ ０．４　、１　１８．１ ０．４　．２　１９．５ ０．４　．４　２０．７ 例ＸＩ 細菌プロテアーゼとベシロマイセスマルクアンジーブロテ量割合での混合物をも 試験した。この試験（０，１ＫＯυ／ｌ）で用いた用量は、実際の洗浄条件下で 用いた酵素の量をもって密接に反影している。

ベシロマイセスマルクアンジーＮＲＲＬ　１８０４Ｂプロテアーゼを、血液汚染 綿を洗うためバシラスプロテアーゼ、サビナーゼ・と組合せて用いた。洗浄試験 は次の組成（ｇ　／　Ｉ！　）の洗浄剤で行った：　ＮＡＮＳＡＳ８０Ｓ　、　 ０．４　；ベロール、０．６５；牛脂石ケン、０．１５；）リポリリン酸ナトリ ウム、１．７５　：珪酸ナトリウム、０．１４；カルボキシメチルセルロース、 ０．０５　；　ＥＤＴａ、　０．０１　；およびＮａ、ＳＯ，，２，１゜水硬度 を９’ｄＨ（ドイツ硬度）に調節した０反射率の変化を、オレホトターター６０ ０を用い４６０ｎｍで測定した。

ペシロマイセス混合物を用いた結果を第１表および第４図に示す。０．１ＫＯＵ ／Ｉ！の用量で単独で用いたサビナーゼ・は２．７のＲをもたらした。同用量割 合で使用したベシロマイセスマルクアンジーは、３．５のＲ値を与えた。９０％ のサビナーゼ０と１０％のベシロマイセスマルクアンジーの混合物から成るプロ テアーゼの相当用量を用いた場合、Ｒ値は、４．２に改良された。４゜２の観察 されたＲ値は、二種のプロテアーゼを共に添加することによって予期した値より も５０％超であった。サビナーゼ０とベシロマイセスマルクアンジープロテアー ゼを混合することによって、相乗効果を得ることが明白である。９０％のサビナ ーゼｅおよび１０％のベシロマイセスマルクアンジーの組合せのみを洗浄実験で 用いた。

第二の細菌プロテアーゼ、アルカラーゼとサビナーゼ０の混合物を比較のため示 す。

第１表 ′″観 察予測 国際出願番号ＰＣＴ／Ｄ＊ａｔ１０ｏｌａｉ声＼ ｌゝノ ＦＩＧ、ＩＣ Ｈ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ 一一−−−−目−−−−−”＝　ｐｃ＝７二ｘε７１０ＯＬ４６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ベシロマイセスマルクアンジー（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｑｕ− ａｎｄｉｉ）のプロテアーゼ生産菌株を発酵させることによって得ることのでき るアルカリプロテアーゼ。
2. ２．前記菌株がＮＲＲＬ１８０４８である、請求の範囲第１項記載のアルカリプ ロテアーゼ。
3. ３．請求の範囲第１項のアルカリプロテアーゼとアルカリバシラスプロテアーゼ とを組合せてなるプロテアーゼ製品。
4. ４．前記アルカリバシラスプロテアーゼがＢ．リケニフォルミスを発酵させるこ とによって得ることのできる、請求の範囲第３項記載のプロテアーゼ製品。
5. ５．前記アルカリバシラスプロテアーゼがセリンタイプであり、約９超のｐＨ値 で最適蛋白分解活性を示しかつｐＨ１２で８０〜１００％の最大蛋白分解活性を 保持し、該活性はアンソン単位によりヘモグロビンに対し測定される、請求の範 囲第３項記載のプロテアーゼ製品。
6. ６．請求の範囲第１項記載のアルカリプロテアーゼの調製方法であって、アルカ リ性のｐＨで適当な炭素および窒素源を含有する液内条件下、嫌気的にベシロマ イセスマルクアンジーのプロテアーゼ生産菌株を培養することを特徴とする、前 記方法。
7. ７．培養を３５℃未満の温度で行う、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．培養を２０〜３０℃の温度で行う、請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項記載のアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする 、酵素洗浄剤。
10. １０．請求の範囲第３項記載のアルカリプロテアーゼを含有することを特徴とす る、酵素洗浄剤。
11. １１．液体コンセントレートの形態にある、請求の範囲第１項記載のアルカリプ ロテアーゼ製品。
12. １２．無粉塵性の粒質物の形態にある請求の範囲第１項記載のアルカリプロテア ーゼ製品。
13. １３．液体コンセントレートの形態にある、請求の範囲第３項記載のアルカリプ ロテアーゼ製品。
14. １４．無粉塵性の粒質物の形態にある、請求の範囲第３項記載のアルカリプロテ アーゼ製品。