JPH01502930A - 改良された分析技術およびそのための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良された分析技術およびそのための装置発明の分野 この発明は、試料中の化学的、生化学的または生物学的な分析対象の定性的およ び／または定量的検出が確定され得るような分析技術に関し、そしてそのような 技術が実行され得るような装置に関する。

発明の背景 言及される分析技術は、分析することになっている分析対象と、特定の種類の表 面上にコートされている受容物質、例えばリガンドまたは特異的結合相手との間 の親和力に基づいている。（ａ）基質上の予め成形された起伏断面を有する表面 の少なくとも予め決定された部分を、分析することになっている種を結合するこ とのできる薄膜材料でコーティングし、その表面部分は予め決定された波長のバ ンドを少なくとも越える輻射線に関して光学的に活性であり、そして（ｂ）コー ティングされた表面を試料と接触させ、そして該表面上の薄膜材料上への核種の 結合の結果としての光学的性質における定性的および／または定量的変化を測定 するために該表面部分の光学的性質を観察することを含んで成る分析技術の記載 については、国際特許公開ＷＯ３４１０２５７８およびＷＯ３６１０１９０１に 参照される。

これらの公開において記載されたように、予め成形された起伏断面は、典型的に は単純な単一格子または２もしくはそれより多数交差した格子でもよい光格子の 形であり、そのリッジは正方形、正弦または三角形の横断面形を有し、そして本 明細書中で使用する時、格子に対する言及はそのような格子全てを包含するつも りである。

公開ＷＯ３４１０２５７８においては、分析することになっている分析対象（例 えば血清中の特定抗原）の結合の結果としての格子の光学的性質における変化は 、本質的に（１）結合した分析対象の質量または大きさく２）それの誘電特性の 結果として引き起こされる。

公開ＷＯ３６１０１９０１においては、その結合結果が感受性表面に付着した色 素標識された結合相手の蛍光特性における変化によりモニターされる。

前述した両技術のどちらにおいても、格子面は少なくとも照射用に使用される輻 射線の波長で不透明であり、故にその格子は反射回折格子であるとみなされ得る 。分析技術の結果として分析対象または他の物質の格子上への付着の結果として 起こる格子の性質の変化は、該格子の反射の特徴（ＷＯ８４１０２５７８）およ び蛍光放出の特徴（ＷＯ８６１０１９０１）における変化として前記の明細書中 に記載されたようにして現れる。しかしながら、そのような分析技術の好結果の 操作は格子表面を照明する能力に頼っており、そしてそれ故に特異的な結合反応 を通して該表面に結合するもの以外のあらゆる物質が光の通過をさえぎるであろ うし、故にそのようなテストがいかにして“湿式において”実施できるかを考え つくことは困難であった。

“湿式において”とは、格子面と接触した液体を用いることを意味し、そして従 来の技術を使う時、励起または観察の波長で光を吸収または散乱するならば、こ のタイプの分析は特に難しい。

従、て、本発明の目的は、改良された方法および装置を提供することであり、こ れにより分析技術が“湿式において”そして液体中の浮遊粒子による吸光または 散乱の存在下においてでさえも実施され得る。

発明の要約 従って、最も広義の見方においては、本発明は試料中のリガンドについて分析す る方法を提供し、この方法は、表面プラズモン共鳴を表すことのできる光学構造 の一表面と試料を接触させてインキュベートし、前記表面は、直接的または間接 的に、検出することが望まれるリガンドのための特異的結合相手をその上に吸着 しているかまたはそれと結合しており；適当な波長の輻射線で光学構造の別の一 表面を照射し：そして、光学構造の表面プラズモン共鳴の特徴がリガンドと特異 的結合相手との間の複合体の形成により変化するかどうかそして所望であればそ の程度および／またはその速度を測定する；ことを含んで成る。

好ましくは、前記光学構造は透明なプラスチックまたはガラス材料の回折格子で あり、そして前記格子は金属または金属様の薄い層でコーティングされており、 この層は少なくとも研究目的で格子を照明または観察するために使用することに なっている輻射線の波長において部分的に反射性であり且つ部分的に透過性であ る。

好ましくは、分析されるリガンドは抗体または抗原であろうし、そしてその特異 的結合相手は相補的に抗原または抗体であろう。

本発明はさらに、試料中の１つまたは複数のリガンドを検出するための装置を提 供し、その装置は、分析することにな−っている試料を保持するための貯槽を含 んで成り、前記貯槽の少なくとも内側の表面部分は、表面プラズモン共鳴を表す ことのできる光学構造を含んで成り、使用の際に試料と接触するであろう前記貯 槽の表面は、検出することが望まれるリガンドのための特異的結合相手を直接的 もしくは間接的のどちらかでその上に吸着しているかまたはそれと結合している 。

本発明の装置の一態様は、貯槽の外側から、使用の際に試料から離れているであ ろう光学構造のその表面を照射するための手段；および、前記光学構造の表面プ ラズモン共鳴の特徴がリガンドと特異的結合相手との間の複合体の形成により変 化するかどうかそして所望であればその程度および／またはその速度を測定する ために、反射された輻射線を分析するための手段；をさらに含んで成る。

典型的には、該貯槽は平底を有する浅溝のウェルを含んで成り、そのウェルの内 側の上面において形成されそして該格子表面に適用された金属または金属様の薄 いフィルムを部分的には反射し部分的には透過する回折格子を有する。

貯槽中に入れられる液体または他の物質から金属を保護することが重要である場 合には、その金属フィルムが好ましくは不活性物質のさらなるフィルムによりコ ートされるが、この不活性物質は、適当な波長の光により活性化される時回折格 子が表面プラズモン共鳴を示すことを可能にする一方で、やはり金属と貯槽内部 の反応体との間の化学的相互作用を妨害する。

本発明の利点は、“湿式において”および液体試料中散乱粒子の存在下において 試料を使用する時に本分析技術が使用され得ることである。

さらなる利点は、反応が起こる時にそれらをモニターすることができ、そしてそ れ故に分析の終点を予測することができ、それにより分析を行うのに要する時間 の長さを縮小することができることである。

付加的な利点は、測定前にセンサーから試料を分離する必要が全くないというこ とである。゛ 本発明は、従って全血試料または光散乱化合物もしくは粒状物質を含有する他の 生物学的試料を用いる使用に適する。

本発明はまた、試薬の抗体が蛍光標識されている競合アッセイが湿式もしくは乾 式において行われ得るようにし、または二次抗体が蛍光標識されているサンドイ ッチアッセイが行われ得るようにする。

検出手段が、受けとった光の異なる波長間を識別することができ、そして特に蛍 光標識により生成されるものに相当する波長の光が格子から再放射された光の中 に存在するか否かを決定することができれば、蛍光標識された物質を使用するこ とが可能である。

典型的な装置においては、格子を照射するための一次光源として単色または半単 色の光源が使用され、そして典型的にはレーザーが使用されるけれども、光源の 選択をレーザーに限定するものではないし、そして光の入射角が変更されるとい うことが理解されるであろう。代わりに、多色の、例えば白色の光源を使用して もよく、入射角を一定に保ちそして表面プラズモン共鳴効果を検出するために反 射光に特徴的な波長が分析される。

本発明は、これから添付した図を参照にしながら簡単に説明されるだろう。

第１図は、回折格子の背面照射による表面プラズモン共鳴効果を示し；そして、 第２図は、これにより本発明に従って分析が行われるかもしれない装置および本 発明の好ましい構成の特徴を具体化したものを概略的に示す。

第１図は、真空蒸発により５０ｎｍの銀でコーティングされそしてヘリウム−ネ オンレーザ−（λ＝　６３３ｒ＋ａ＋）で格子の裏面から照射された、射出成形 された回折格子から得られた結果を示す。反射光の強度は入射角（θ）の変化を 伴ってモニターされた。特定範囲の角度にわたって表面プラズモン共鳴の反射能 特性に関するくぼみ（ｄｉｐ）が観察された。格子のないメタライジングテスト 装置の一領域を照射すると、カバーされた角度の範囲にわたって反射光の強度に 全く変化を与えなかった。

第２図において、浅溝のウェル１０は平底１２を有するプラスチック材料として 形成され、この平底の上側内部表面上に適当な方法、例えば接触圧成形または機 械加工またはその他により回折格子１４が形成されている。

格子１４の上側表面は、半一反射性の金属または金属様フグされ、そして金属フ ィルムと該ウェル中に入れられる試薬類との間に不活性中間層が必要であれば、 その表面は適当な緩衝材料、例えばケイ素酸化物の層でコーティングされる。

該格子は、蛍光化合物で標識されていてもよい特異的な抗原、抗体または他の結 合相手を含有する薄膜材料でコーティングされ、そして該ウェルは、分析される ことになっている特異的な抗体、抗原または相補的な結合相手を含む液体を入れ るように用意される。

該ウェルを含有する製品は、概略的に１６で示される装置の中に組み込まれ、こ れはレーザー光源１８を含み、そこから光が放出され、適当な光学手段（図示し ていない）を使って、適当な入射角で該ウェルの底面を照射して回折格子におけ る表面プラズモン共鳴を引き起こす。波長感受性の光検出器２０もハウジング１ ６の内部に設置され、そして該検出器２０からの出力は、該ハウジングの内部に 含まれていてもいなくてもよい２２のような電気処理および表示装置に送られる 。

検出器２０並びに処理および表示回路２２に対する調整は、該ウェルが適所にお いて照射されそしてリガンドを含有しない液体を含む時に最初の読み取りを生ず るように行われる。

リガンドを含んでいてもいなくてもよい試料をあらゆる便利な方法において該ウ ェルに添加し、そして装置２２により表示されるような検出器２０の出力をモニ ターしてあらゆる変化を測定する。

蛍光分析技術が使用されるならば、検出器は該分析において蛍光ラベルのいずれ かの波長の光が検出され得るか否かを決定するためにセットされ得る。

図中参照番号２４により記された液体試料が光散乱粒子を含有する場合、これら が液体を通る光の透過および回折格子を行きかう光の透過を妨害し、そして液体 を通した回折格子のあらゆる観察を実行不可能にするだろうと思われよう。しか しながら、検出器２０により測定されるような表面プラズモン共鳴効果は液体中 の光散乱粒子の存在により影響されず、そしてその分析技術は“湿式において” 実施され得ることが例証された。

例証された例は１つのウェルだけを示すけれども、光源１８はもちろん複数のウ ェルを同時に照射するのに使用されてもよく、そして対応する複数の検出器が使 用されてもよいし、または多数の異なる試料の分析が比較的迅速に行われ得るよ うに連続して各ウェルをスキャンするようにセットされた１つの検出器が使用さ れてもよい。

ぞれその上に異なる結合相手を有することができ、そしてこれらが多数の異なる 分析対象を同時に測定するためにも、“対照領域”との比較により非特異的結合 の規準を堤供するためにも、どちらにも使用され得る。そして、例えば分析され る試料中に存在することがあるあらゆるリガンドに対してそれ自体特異的でない 結合相手を担持していてもよい。

国際調査報告 ｍＡ＃”、ＰＣＴ／ＧＢ　８Ｂ１００１７６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中のリガンドについて分析する方法であって、表面プラズモン共鳴を表 すことのできる光学構造の一表面と接触させて試料をインキュベートし、前記表 面は、検出されることが望まれるリガンドに対する特異的結合相手を直接的もし くは間接的にその上に吸着しているかまたはそれと結合しており；該光学構造の 別の一表面を適当な波長の輻射線で照射し；そして、該光学構造の表面プラズモ ン共鳴の特徴がリガンドと特異的結合相手との間の複合体の形成により変化する かどうかそして所望によりその程度および／またはその速度を測定するために、 反射された輻射線を分析する；ことを含んで成る方法。
2. ２．前記光学構造が回折格子である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記特異的結合相手が抗原または抗体である、請求項１または２に記載の方 法。
4. ４．前記光学構造が、使用される輻射線の波長において部分的に反射性であり且 つ部分的に透過性である、上記の請求項いずれか一項に記載の方法。
5. ５．１または複数のリガンドを検出するための装置であって、この装置はテスト される試料を保持するための貯槽を含んで成り、前記貯槽の少なくとも内側の表 面部分が表面プラズモン共鳴を表すことのできる光学構造を含んで成り、使用の 際に該試料と接触するであろう前記構造のその表面が、検出することが望まれる リガンドのための特異的結合相手を直接的もしくは間接的のどちらかでその上に 吸着しているかまたはそれと結合しているような装置。
6. ６．貯槽の外側から、使用の際に試料から離れているであろう光学構造の表面を 照射するための手段および、リガンドと特異的結合相手との間の複合体の形成に より前記光学構造の表面プラズモン共鳴の特徴が変化するかどうかそして所望に よりその程度および／または速度を測定するために、反射された輻射線を分析す るための手段をさらに含んで成る、請求項５に記載の装置。
7. ７．複数の分割領域を有する貯槽を含んで成り、各分割領域が請求項５に定義さ れたような光学構造を含んで成り、使用の際に試料と接触するであろう各分割領 域の表面が異なる特異的結合相手をその上に吸着しているかまたはそれと結合し ている、試料中の複数のリガンドを検出するための請求項５に記載の装置。
8. ８．複数の請求項５に定義された貯槽を含んで成る、請求項５に記載の装置。
9. ９．前記貯槽の外側から、使用の際に試料から離れているであろう光学構造の表 面を照射するための手段；および、リガンドと特異的結合相手との間の複合体の 形成により前記光学構造の表面プラズモン共鳴の特徴が変化するかどうかそして 所望によりその程度および／またはその速度を測定するために、反射された輻射 線を分析するための複数の手段、または連続して各分割領域もしくは貯水槽をス キャンすることのできる反射された輻射線を分析するための複数の手段をさらに 含んで成る、請求項７または請求項８に記載の装置。
10. １０．前記光学構造が回折格子である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の装 置。
11. １１．前記特異的結合相手が抗原または抗体である、請求項５〜１０のいずれか 一項に記載の装置。
12. １２．前記光学構造が、使用される輻射線の波長において部分的に反射性であり 且つ部分的に透過性である金属または金属様の薄い層でコートされている、請求 項５〜１１のいずれか一項に記載の装置。
13. １３．前記照射手段が単色または半一単色の光源である、請求項５〜１２のいず れか一項に記載の装置。
14. １４．前記光源がレーザーである、請求項１３に記載の装置。