NO884985L - Forbedret evalueringsteknikk og apparat for utoevelse av denne. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår undersøkelsesteknikker (assay techniques) hvor kvalitativ og/eller kvantitativ deteksjon av kjemiske, biokjemiske eller biologiske analytter i en prove kan bestemmes, og angår også et apparat som slike teknikker kan utøves med.

Undersøkelsesteknikker som det her henvises til, er basert på affiniteten mellom den analytt som skal undersøkes eller testes, og et reseptivt materiale, f.eks. en ligand eller en spesifikk bindingspartner som er belagt på en spesiell type overflate. Det henvises til de internasjonale patentpublika-sjonene WO84/02578 og WO86/01901 når det gjelder beskrivelser av undersøkelsesteknikker som omfatter (a) belegging av minst en forutbestemt del av en overflate som har en relieff-profil som er tildannet på forhånd på et substrat, med en tynn film av et materiale som er i stand til å binde seg til det stoff som det skal undersøkes eller testes etter, idet overflatedelen er optisk aktiv når det gjelder stråling over minst ett forutbestemt bånd av bølgelengder, og (b) det at den belagte overflaten settes i kontakt med prøven og de optiske egenskapene til overflatedelen observeres for å bestemme en kvalitativ og/eller kvantitativ forandring i optiske egenskaper som et resultat av at stoffet er bundet til den tynne filmen av materiale på overflaten.

Som beskrevet i disse publikasjonene, har relieff-profilen som er dannet på forhånd, typisk form av et optisk gitter, som kan være et enkelt, eneste gitter eller to eller flere kryssede gittere, hvis ribber kan ha kvadratiske, sinusformede eller trekantede tverrsnitts-fasonger, og slik det anvendes her, er henvisninger til et gitter ment å innbefatte alle slike gittere.

I publikasjonen WO84/02578 frembringes endringen i gitterets optiske egenskaper, som resultat av bindingen av en analytt som skal undersøkes (slik som et spesifikt antigen i et blodserum), hovedsakelig som et resultat av (1) massen eller volumet av den bundne analytten og (2) dens dielektriske egenskaper.

I publikasjonen WO86/01901 overvåkes bindings-forløpet ved hjelp av endringer i de fluorescerende egenskapene til en fargemerket bindingspartner som er knyttet til sensorens overflate.

I hver av de beskrevne teknikkene er hovedsakelig gitteroverflaten ugjennomsiktig, i det minste ved den strålingsbølge-lengde som benyttes til belysning, og gitteret kan derfor betraktes som et reflekterende diffraksjonsgitter. Endringer i gitterets egenskaper som oppstår som resultat av avsetning på gitteret av analytter eller andre materialer som resultat av undersøkelses- eller testteknikken, fremtrer som endringer i gitterets refleksjonsegenskaper (for WO84/02578) og fluorescens-emisjonsegenskaper (WO86/01901), på den måte som beskrives i de forannevnte publikasjonene. Imidlertid er vellykket gjennom-føring av slike undersøkelses- eller testteknikker avhengig av evnen til å belyse gitteroverflaten, og derfor vil alle andre materialer enn det som er bundet til overflaten gjennom en spesifikk bindingsreaksjon, avbryte lysgjennomgangen, og derfor har det vært vanskelig å finne ut hvordan en slik test kunne utføres "i det våte". "I det våte" betyr med en væske i kontakt med gitteroverflaten, og ved bruk av konvensjonell teknikk, er en undersøkelse av denne typen spesielt vanskelig dersom væsken absorberer eller sprer lys ved eksitasjons- eller observasj onsbølgelengden.

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en alternativ fremgangsmåte og apparat som en undersøkelses- eller testteknikk kan utføres med "i det våte", og til og med i nærvær av absorpsjon eller spredning fra partikler suspendert i væsken.

Oppfinnelsen tilveiebringer således i sin videste forstand en fremgangsmåte for testing eller undersøkelse etter en ligandi i en prøve, hvilken fremgangsmåte omfatter å legge prøven i kontakt med en overflate av en optisk struktur som er i stand til å oppvise overflate-plasmonresonans, idet nevnte overflate har adsorbert på seg eller bundet til seg, enten direkte eller indirekte, en spesifikk bindingspartner for den ligand det er ønskelig å detektere; å bestråle den andre overflaten av den optiske strukturen med stråling med en passende bølgelengde; og å analysere den reflekterte strålingen for å bestemme om, og om ønskelig i hvilken grad og/eller med hvilken hastighet den optiske strukturens egenskaper i forbindelse med overflate-plasmonresonansen endres ved dannelse av et kompleks mellom liganden og den spesifikke bindingspartneren.

Fortrinnsvis er den optiske strukturen et diffraksjonsgitter av et klart plast- eller glassmateriale, og gitteret er belagt med et tynt metall- eller metall-lignende lag, som er delvis reflekterende og delvis transmitterende, i det minste ved den strålingsbølgelengde som skal benyttes for å belyse og observere gitteret av undersøkelsesformål.

Fortrinnsvis vil den ligand som det testes etter, være et antistoff eller et antigen, og den spesifikke bindingspartner vil da være det komplementære antigen eller antistoff.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre et apparat for deteksjon av en eller flere ligander i en prøve, hvilket apparat omfatter et reservoar innrettet for å inneholde prøven som skal testes, idet minst en del av en innvendig overflate i nevnte reservoar omfatter en optisk struktur som er i stand til å oppvise overflate-plasmonresonans, og idet den overflaten av nevnte struktur som under bruk vil stå i kontakt med prøven, har adsorbert på seg eller bundet til seg, enten direkte eller indirekte, en spesifikk bindingspartner for den ligand det er ønskelig å detektere.

En utførelse av apparatet ifølge oppfinnelsen omfatter videre en anordning for fra utsiden av reservoaret å bestråle den overflaten av den optiske strukturen som under bruk vil ligge fjernt fra prøven, og en innretning for å analysere den reflekterte strålingen for å bestemme om, og om ønskelig i hvilken grad og/eller med hvilken hastighet egenskapene til nevnte optiske struktur når det gjelder overflate-plasmonresonans endres ved dannelse av et kompleks mellom liganden og den spesifikke bindingspartner.

Typisk omfatter reservoaret et grunn brønn med en flat

bunn som har et diffraksjonsgitter tildannet på sin øvre overflate inne i brønnen, og en delvis reflekterende, delvis transmitterende, tynn metall- eller metall-lignende film påført på gitteroverflaten.

Der hvor det er viktig å beskytte metallet fra væsken

eller andre materialer som skal legges i reservoaret, belegges

fortrinnsvis metallfilmen med en ytterligere film av et inert materiale som, selv om det muliggjør at diffraksjonsgitteret oppviser overflate-plasmonresonans når det aktiveres av lys med passende bølgelengde, ikke desto mindre forhindrer kjemisk vekselvirkning mellom metallet og reaktantene i reservoaret.

Fordelen med oppfinnelsen er at undersøkelsesteknikken kan benyttes når man benytter prøver "i det våte", og i nærvær av spredende partikler i væskeprøven.

En ytterligere fordel er at reaksjoner kan overvåkes mens de foregår, og derfor kan sluttpunktet for testen forutsis, og derved reduseres lengden av den tid det tar å utføre under-søkelsen.

En tilleggs-fordel er at det ikke er nødvendig å adskille prøven fra sensoren før målingen.

Oppfinnelsen er således velegnet til benyttelse med prøver av fullblod og andre biologiske prøver som inneholder lysspredende forbindelser eller partikkelformet materiale.

Oppfinnelsen muliggjør også utførelse av en konkurranse-undersøkelse i våt eller tørr tilstand, hvor et reagens-antigen fluorofor-merkes, eller utførelse av en lagvis undersøkelse (sandwich assay) hvor et andre antistoff fluorofor-merkes.

Bruken av fluorofor-merkede materialer er mulig under den forutsetning at deteksjonsmidlene er i stand til å skille mellom forskjellige lysbølgelengder som de mottar, og spesielt i stand til å bestemme om lys av en bølgelengde som tilsvarer den som frembringes av fluorofor-merkestoffet, er tilstede i det lys som gjenutstråles fra gitteret, eller ikke.

I et typisk apparat benyttes en monokromatisk eller kvasi-monokromatisk lyskilde som primær kilde for belysning av gitteret, og en laser benyttes typisk til dette formål, skjønt det må forstås at dette på ingen måte begrenser valget av lyskilde til en laser, og innfallsvinkelen for lyset varieres. Alternativt kan en polykromatisk lyskilde, dvs. hvitt lys, benyttes, innfallsvinkelen holdes konstant og bølgelengde-egenskapene til det reflekterte lyset blir analysert for å detektere virkninger av overflate-plasmonresonans.

Oppfinnelsen skal nå beskrives kort med henvisning til de medfølgende tegningene, hvor:

Fig. 1 viser virkningen av overflate-plasmonresonans

via bak-belysning av et diffraksjonsgitter, og

Fig. 2 illustrerer skjematisk et apparat som en undesøkelse kan utføres med i samsvar med oppfinnelsen, og som omfatter de foretrukne konstruksjonsmessige trekkene ifølge oppfinnelsen. Fig. 1 viser resultater oppnådd fra et sprøytestøpt diffraksjonsgitter som ble belagt med 50 nm av sølv ved vakuum-pådamping og avsøkt fra undersiden av gitteret med en helium-neonlaser (y=633 nm). Den reflekterte lysintensiteten ble overvåket med varierende innfallsvinkel (5). Fallet i reflek-tivitets-egenskapen for overflate-plasmonresonans ble observert over et spesifikt område av vinkler. Avsøking av et område av den metalliserte testanordningen uten gitteret gav ingen forandring i intensitet av reflektert lys over det vinkelområde som ble dekket.

I Fig. 2 er det dannet en grunn brønn 10 i et klart plastmateriale med en flat bunn 12, og på dennes øvre, innvendige overflate er det annet et diffraksjonsgitter 14 ved hjelp av en eller annen passende prosess, slik som trykk-støping (impression moulding), fresing eller på annen måte.

Gitterets 14 øvre overflate er belagt med en halvreflek-terende metall- eller metall-lignende film, f.eks. av sølv, aluminium, kopper eller gull, og dersom et mellomliggende,

inert lag er nødvendig mellom den metalliske filmen og reagensene som skal plasseres i brønnen, belegges selve overflaten med et lag av et passende buffermateriale, slik som et oksyd av silisium.

Gitteret er belagt med en tynn film av materiale som omfatter spesifikke antigener, antistoffer eller andre bindingspartnere, som kan være merket med en fluorescerende forbindelse, og brønnen er nå klar til å motta en væske som inneholder det spesifikke antistoff eller antigen eller de komplementære bindingspartnere som skal testes.

Artikkelen som inneholder brønnen, settes inn i et apparat som er vist skjematisk med henvisningstall 16, og omfatter en laser-lyskilde 18, som lys projiseres fra idet passende, ikke viste optiske innretninger benyttes, slik at lyset faller inn mot undersiden av brønnen med en passende innfallsvinkel for å danne overflate-plasmonresonans i diffraksjonsgitteret. En bølgelengde-følsom lysdetektor 20 er også plassert inne i huset 16, og utgangssignalet fra detektoren 20 føres til et apparat for elektrisk behandling og fremvisning slik som 22, som kan, men ikke trenger å være innbefattet i huset.

Justeringer utføres på detektoren 20 og på behandlings- og displaykretsene 22 for å frembringe en første avlesning når brønnen er i posisjon og belyses og inneholder en væske som ikke inneholder noen ligand.

En prøve som kan inneholde, men ikke nødvendigvis inneholder en ligand, tilføres så til brønnen på en passende måte, og utgangssignalet fra detektoren 20, slik det fremvises av apparatet 22, overvåkes for å bestemme om noen forandring stejer.

Dersom det benyttes en fluorescens-undersøkelsesteknikk, kan detektoren innstilles for å bestemme om noe lys med bølgelengden til den fluorescerende merkingen i testen kan detekteres eller ikke.

Man kan se at dersom væskeprøven som i tegningen er gitt referansetall 24, inneholder lysspredende partikler, vil disse innvirke på lystransmisjonen gjennom væsken, og således til og fra diffraksjonsgitteret, og vil gjøre en observasjon av diffraksjonsgitteret gjennom væsken upraktisk. Imidlertid når den belysningsmetode benyttes som er illustrert, vil overflate-plasmonresonanseffekten, slik den bestemmes av detektoren 20, ikke bli påvirket av nærvær av lysspredende partikler i væsken, og undersøkelsesteknikken kan utføres "i det våte".

Selv om det viste eksemplet bare viser én brønn, kan selvfølgelig lyskilden 18 benyttes til belysning av flere brønner samtidig, og enten kan tilsvarende mange detektorer benyttes, eller et detektor-sett som avsøker hver brønn i rekkefølge, slik at en undersøkelse eller test av et stort antall forskjellige prøver kan utføres relativt hurtig.

Alternativt kan et antall definerte områder på overflaten av én enkelt brønn ha forskjellige bindingspartnere på seg, og disse kan benyttes til enten å måle et antall forskjellige analyttér samtidig, eller å tilveiebringe et mål på den ikke-spesifikke binding, ved sammenligning med "kontroll"-områder som f.eks. kan ha en bindingspartner som ikke selv er spesifikk for noen ligand som kan være tilstede i prøven som skal testes.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for å teste etter en ligand i en prøve, karakterisert ved at prøven legges i kontakt med en overflate av en optisk struktur som er i stand til å oppvise overflate-plasmonresonans, hvilken overflate har adsorbert på seg eller bundet til seg, enten direkte eller indirekte, en spesifikk bindingspartner for den ligand det er ønskelig å detektere, at den optiske strukturens andre overflate bestråles med stråling som har en passende bølgelengde, og at den reflekterte strålingen analyseres for å fastlegge om, og om ønskelig i hvilken grad og/eller med hvilken hastighet, egenskapene til den optiske strukturen angående overflate-plasmonresonans blir endret ved dannelse av et kompleks mellom liganden og den spesifikke bindingspartner.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den optiske strukturen er et diffraksjonsgitter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den spesifikke bindingspartner er et antigen eller et antistoff.

4. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at den optiske strukturen er belagt med et tynt metall- eller metall-lignende lag som er delvis reflekterende og delvis transmitterende ved den strålings-bølgelengde som benyttes.

5. Apparat for deteksjon av en eller flere ligander i en prøve, karakterisert ved at det omfatter et reservoar for å inneholde den prøve som skal testes, idet minst endel av en innvendig overflate i nevnte reservoar omfatter en optisk struktur som er i stand til å oppvise overflate-plasmonresonans, og idet den overflate av nevnte struktur som i bruk vil stå i kontakt med prøven, har adsorbert på seg eller bundet til seg, enten direkte eller indirekte, en spesifikk bindingspartner for den ligand det er ønskelig å detektere.

6. Apparat ifølge krav 5, karakterisert ved at det omfatter en anordning for fra reservoarets utside å bestråle den overflate av den optiske strukturen, som i bruk vil ligge fjernt fra prøven, og en innretning for å analysere den reflekterte strålingen for å bestemme om, og om ønskelig i hvilken grad og/eller med hvilken hastighet egenskapene til den optiske strukturen hva angår overflate-plasmonresonans blir endret ved dannelse av et kompleks mellom liganden og den spesifikke bindingspartner.

7. Apparat ifølge krav 5 for deteksjon av flere ligander i en prøve, karakterisert ved at det omfatter et reservoar med flere diskrete områder, idet hvert diskrete område omfatter en optisk struktur slik den er definert i krav 5, og idet den overflaten på hver optisk struktur som i bruk vil stå i kontakt med prøven, har en forskjellig spesifikk bindingspartner adsorbert på seg eller bundet til seg.

8. Apparat ifølge krav 5, karakterisert ved at det omfatter flere reservoarer som definert i krav 5.

9. Apparat ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at det omfatter en anordning for fra utsiden av reservoaret å bestråle den overflaten av den optiske strukturen som i bruk vil ligge fjernt fra prøven og flere innretninger for å analysere den reflekterte strålingen eller én enkelt innretning for å analysere den reflekterte strålingen som er i stand til å avsøke hvert diskret område eller reservoar i rekkefølge for å bestemme om, og om ønskelig i hvilken grad og/eller med hvilken hastighet den optiske strukturens egenskaper hva angår overflate-plasmonresonans blir endret ved dannelse av et kompleks mellom liganden og den spesifikke bindingspartner.

10. Apparat ifølge et av kravene 5-9, karakterisert ved at den optiske strukturen er et diffraksjonsgitter.

11. Apparat ifølge et av kravene 5-10, karakterisert ved at den spesifikke bindingspartner er et antigen eller et antistoff.

12. Apparat ifølge et av kravene 5-11, karakterisert ved at den optiske strukturen er belagt med et tynt metall- eller metall-lignende lag som er delvis reflekterende og delvis transmitterende ved den strålings-bølgelengde som benyttes.

13. Apparat ifølge et av kravene 5-12, karakterisert ved at bestrålingsanordningen er en monokromatisk eller kvasi-monokromatisk lyskilde.

14. Apparat ifølge krav 13, karakterisert ved at lyskilden er en laser.