JPH01503197A - Ｄｎａの生物学的活性の不活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換ＤＮＡの不活性化法 本発明はＤＮＡ、％に組換えＤＮＡの生物学的活性の不活性化法に関する。

学術及び科学技術庁長官（Ｂｕｎｄｅｓｍｉｎｉｓｔｅｒ　ｆｕｒＦｏｒｓｃｈ ｕｎｇ　ｕｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）によシ発布され九、試験管中で新友 に組換えられた核酸による危険を保護するための指導要綱によれば、核酸、すな わちＤＮＡ　ｔ−含有する廃棄物は滅菌もしくは変性されなければならない。従 って、組換えＤＮＡ含有微生物での作業の際に、有機体を不活性化することだけ ではなく、場合によシ　。

有機体中〆の組換えＤＮＡ　ｔ−破壊することも必要である。

微生物の死滅は一般に比較的簡単に行なうことができる。しかしながら、この適 用される処置により微生物中のＤＮＡは一般に破壊されない。この滅菌もしくは 変性は行なわれなければならないので、活性汚泥法による生物学的浄化装置が供 給される場合（これは有利な方法である）、例えば活性汚泥の微生物を損なった り、殺したりするバイオマスｔＶする物質が後続の浄化装置に達しないような処 置も、バイオマスを浄化装置に導入する前に行なわなければならない。すなわち 、毒性でない物質？使用するとか、又は浄化装置に達する前に分解して、これが 損害を与えないようにするというような配慮も行なわなければならない。

例えば、西ドイツ国の公衆衛生局（ＢＣ）Ａ　；Ｂｕｎｄｅｓｇｅｓｕｎｄｈｅ ｉｔａｍｔ　）によシ、及び西ドイツ国の生物学的安全に関する中央委員会（Ｚ ｋＢＳ　；Ｚｅｎｔｒａｌｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｆｆｆｉｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉ ｓｃｈｅ　５ｉｃｈｅｒｈｅｉｔ　）によシ承認された、公知の、牧菌及び不活 性化法（例えば、１２１°Ｃで２０分を越える蒸気滅菌）は非常に費用がかかる 。特に工業上通常である１０〜ｓ　ｏ　ｍ３の発酵処理においては、この方法は 装置においても高いエネルギー消費においても著しく費用が高い。

従って、本発明の課題はＤＮＡ　、特に組換えＤＮＡの生物学的活性ｔ−確冥に 不活性化することができ、不所望な、特に毒性の物質が廃水中に達しない方法を 提供することである。更に、この方法は安価に実施可能であ・　るべきである。

この課題はＤＮＡ％％に組換えＤＮＡの生物学的活性を不活性化するための方法 において、ＤＮＡｔ含有するバイオマスに炭素原子数１〜３のベルカルボン酸、 アルカリペルオキシド又はアルカリベルオキソモノスルフェートを添加し、この 混合物を６０〜１００°Ｃに加熱すること’ｔ−ｗ徴とする方法によシ解決する 。

前記化合物を使用し、かつこの配合物を加熱することにより、なお生・きている 微生物を殺すことができるだけでなく、七の中に含有されるＤＮＡ　’ｔ”　、 複製可能な断片がもはや含有されていない程十分に分解するということが意外に も確認された。

本発明による方法で、５００　ｂｐより小さいか／同じ断片へのＤＮＡの分解が 達せられ、このことはＺｋＢＳにより承認された安全法（オートクレーブ法）に よっても越えられない。この種の断片はもはや生物学的に活性ではなく、従って 、廃水中に導入しても危険ではない。

不発明による方法は動物又は人間の細胞の、並びに微生物の内側又は外側での組 換ＤＮＡの培養及び段進において生じるようなバイオマスに有利に使用すること ができる。従って、本発明による前処置を本来の浄化装置中への導入の前に、微 生物、プラスミド及び同様なりＮＡ含有材料全含有する廃水に行なうことができ 、このことはＤＮＡが複製可能な形でもはや全（存在していることができないこ とを確実にする。

例えば、微生物を含有する培養溶液のようなバイオマスを炭素原子数１〜３を有 するベルカルボン酸、アルカリペルオキシド又はアルカリペルオキソモノスルフ ェートと混合する。この際、過酢酸は１方では比較的安定でちり、他方では安価 であるので、これを使用するのが有利である。過蟻酸及び過プロピオン酸も同様 に好適である。アルカリとしては、本発明においてはＮａ、Ｋ及びＬｌが有利で ある。アンモニウム塩もここではアルカリ塩とする。０．０５〜５重量係の濃度 でベル化合物？使用するのが有利である。この際、濃度は使用し几化合物並びに 処理すべきバイオマスに依存する。

ベル化合物の添加後、この混合物を加熱する。不活性化は６０〜１００℃の温度 に加熱することにより達せられる。７０〜９０℃の温度に加熱するのが有利であ る。特に過酢酸の使用においては、混合物を少なくとも７０℃に加熱するのが有 利である、それというのもこの温度において過酢酸は迅速に完全に分解するから である。

混合物の加熱全１塩基対５００に越える鎖長のＤＮＡがもはやクロマトグラフィ ーによシ検出されなくなるまで行なう。一般に２０〜６０分後である。すべての ＤＮＡが分解されたかどうか検査するために、部分量をこの混合物から取り出し 、こうしてアガロースデル−電気泳動にかげる。分子量によるクロマトグラフィ ー分離は溶液中にどのような断片が存在するかを示す。

本発明による方法は明域６〜１１、特に７〜１０で実施するのが有利である。

本発明による方法の著しい利点は、使用したベル化合物が完全に分解されるとい うことである。使用した化合物からは生物学的に無害で毒性ｋＷさない化合物が 生じ、これを直接排水網に導び（ことができ、かつこの際に活性汚泥中に含有さ れる微生物が殺されるという危険は全くない。

次に笑施例並びに電気泳動に関する図面につき、本発明の詳細な説明する。

第１図は種々のベル化合Ｗｔ使用した種々の試料の電気泳動の結果を示す（第１ 表）。

第２図は種々のベル化合物を使用した種々の試料の電気泳動の結果を示す（第２ 表）。

第６図は種々のベル化合物をより高い濃度と変化した恒温保持時間で使用した試 料の電気泳動の結果を示す（第３茨）。

第４図は種々の過酢酸濃度を使用した試料の電気泳動の結果を示す（第４表）。

第５図は種々の濃度のベルオキシモノスルフエートを使用した試料の電気泳動の 結果を示す（第５表）。

算６図は異なる温度で過酢酸を使用した試料の電気泳動の結果金子す（第６表） 。

第７図は種々の濃度の過酢酸を使用した試料の電気泳動の結果を示す（第７表） 。

第８図は過酢酸で処理し几真核細胞系のＤＮＡの試料の電気泳動の結果を示す（ 第８及び９表）。

例　１ プラスミドＤＮＡの分解？ベル化合物により試験した。

このためにはプラスミド１）ＢＲ５２２（ＰＮＡＳ　、　ＵＳＡ第７５巻、１９ ７８年、第６７３頁）ｔ−使用し友。プラスミドＤＮＡ　５０μｇ／ｍｌを含有 する溶液をこのプラスミドに関しては使用した。この試料をベル化合物との種々 の配合において処理した。相応する配合＠１００μｌ−を次の表中でそれぞれ挙 げた条件下に恒温保持した。引＠続き配合物の各２０μｌを取り出し、試料緩衝 液５μｌと混合し、アガロースデル電気泳動プレート（アガロース０．８重量係 ；　ＴＲｌ５　／酢酸塩緩衝液、ｐＨ８０，Ｏ４Ｍｏ１／Ｊ　；　ＥＤＴＡ　Ｏ ，００１Ｍｏｌ／ｌ）上に載せ、Ｔ、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）、Ｅ 、　Ｓ、　７リツテ（Ｆｒ１ｔｓｃｈ　）及びＪ、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ　）（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｃｏ１４　Ｓｐｒｉｎｇ 　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　第１１７２４ 巻、１９８２年、第４５４頁）によると同様にして分離する。比較溶液としては ＴＥ−緩衝液２０μ！及び試料緩ｉ液５μ！中のｐＢＲ３２２０，６μｇ全使用 した。鎖長標準としては、Ｈｉｎｄｌ［で切断したファージ・ラムダ（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、第１６２巻、１９８２年、第７２９−７７３頁）　（ＤＮ Ａ−鎖長標準■、注文番号２３６２５０としてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ　ＧｍｂＨより入手可能）１−使用した。フラグメントの分子量は１５ ．２７．　６．２１゜４．４１　、　２．８８．　１．５５．　１．３４．　０ ．３７メガドルトンであり、これは塩基対２３１３０，９４１６゜６６８２．４ ３６１，２３２２，２０２７．５６４に相応する。使用したベル化合物、濃度及 び恒温保持条件を次の第１〜５表に挙げる： 索 承　尊　＊　寧　＊＊＊＊ 迄 巨　０ 部　則　の 咽　側 事　事　ζ　寧　事　＊　エ 綜　爛 巨 セ ＊　寧　＊　尊　啄　寧 Ｓ　１　ひ　１ ４ｎ　セ　掴Ｋ　セ 税 哨　澁 −へ蛸寸（イ）つトωさ 馳　煽 第４表 痕　跡　過酢酸濃度（重量幅） １　０　ｑｂ（室温） ・第５表 痕　跡　ベルフオーム（ベルオキソモノスルフェート）の濃度（重量％）１　０ 　チ（室温） ７　λ−鎖長標準 結果は第１〜５図から明らかになる。この際、第１図及び第２図からは、ベル化 合物０．１４の濃度において、３０分の恒温保持時間において、かつ８０°Ｃの 温度において、ベル化合物として過酢酸及びナトリウムペルオキシドを使用する 場合のみ、塩基対（ｂｐ　）５００を越える長さのＤＮＡ　−７ラグメントを検 出しない。舅６図は０．５　％の濃度のベルオキソモノスルフェートの使用がプ ラスミド−ＤＮＡの十分なフラグメント化を与えることを示す。第４図からは８ ０℃の温度で、恒温保持時間５０分で、濃度０．１％の過酢酸の使用がプラスミ ド−ＤＮＡの十分な分解に導びき、ゲル画像中に塩基対５００に越える長さのフ ラグメントが全く認められないということが明らかになる。第５図は温度８０’ Ｃで、かり恒温保持時間６０分で濃度０．５４のベルオキソモノスルフェートに 使用する際、同様に十分なプラスミド−ＤＮＡフラグメント化が達せられるとい うことを示します。

例　２ プラスミド１）ＢＲ３２２の溶液を、例１に記載されているように０．０５１過 酢酸で６０分間、異なる温度で恒温保持した。しかしながら、プラスミド−ＤＮ Ａ　３０μ９７ｍ１のかわりにプラスミドＤＮＡ　５　［１μ９／ｍｌ＠：使用 し友。それぞれ使用した温度を次の第６表に示す。

第６表 痕跡　温度 Ｉ　ＲＴ、過酢酸なし ２　８０°Ｃ９過酢酸なし この溶ｉｔ例１に記載したように、アガロースデル−電気泳動プレート上で分離 する。比較溶液としてはＴＥ−緩衝液２０μｌ及び試料緩衝液５μｌ中のｐＢＲ ５２２１μｇを使用した。鎖長標憔の濃度は例１と同様であった。結果を第６図 に示す。この際、６０９ｃで６０分間の恒温保持時間においてプラスミド−ＤＮ Ａの十分なフラグメント化が達せられ、かつ７０℃においてはデル画像中にはｓ 　ｏ　ｏ　ｂｐより大きいフラグメントは全（検出されなかった。

例　６ 形質転換した微生物太陽菌ＥＤ／ｐＢＴ２５Ｌ−Ｉ（ＤＳＭ　３１４５　）　ｔ −ヨーロッパ特許第１８７１３８号明細書中に記載されているように培養した。

培養液Ｑ、１ｍ！！ｉ取り出し、本発明によジ８０°Ｃで６０分間種種の濃度の 過酢酸と恒温保持し、引＠続きプロテイナーゼに１０ダ／　ｍｌ　ｆ含有する溶 液１０μｌと混合し、膜結合ＤＮＡ　ｉ分離させるために３７°Ｃ″′ｃ３０分 間恒温保持する。遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機　１４００ｒｐｍ１ ５分間）の後、このように処理した培養液各２０μｌｋ電気泳動にかげる。過酢 酸の濃度並びにそのつと使用した恒温保持条件全第７表に示す：迩 淳 安 目　額 駆 ト　論 −へ　（イ）　寸　Ｌｒ＞　つ　ト　０ｍ　爛 結果を第７図中に示しｆｃｐ３０分間の恒温保持時間及び８０　’Ｃの温度で０ ．２チ過酢酸で処理した後、培養液中にも５００　ｂｐ　’ｒ：こえるＤＮＡ− ７ラグメントは検出されないということが示された。

例　４ ａ）真核細胞の過酢酸での不活性化 ハイプリドーム細胞ＥＣＡＣＣ８４１２２００５をヨーロッパ特許第１５０３０ ９号明細書中に記載されているように培養した。種々の配合において、このハイ プリドーム細胞を過酢酸と恒温保持した。条件上次の第８表に記載する： 第８表 痕跡　過酢酸の濃度　温度／恒温保持時間１　０　チ　室　温 ２　０　係　８０’Ｃ／３０分 ６　０．２係　８０°Ｃ／３０分 試料１〜３として細胞１０７／１００μｌの葱濁液各２０μｌｆアガロースどル ー電気泳動プレート上に担持させ、かつ分離した。結果ｔ−第８図に示す。０． ２　％の濃度の過酢酸を用いて恒温保持温度８０℃、恒温保持時間３０分におい てＤＮＡは５００　ｂｐ　ｋ越える長さのＤＮＡ−フラグメントｙｋ検出するこ とができない程度に破壊される。

ｐＢＲ３２２の形質転換能力の検査 試料溶液としては、付加的にＩ）ＢＲ３２２５μｇ７０．１１？Ａｔ−含有する 、ａ）により得られたハイプリドーム細胞を０．１ｍｌあｆｃシ１０７含有する 懇濁液を使用し友。この溶液を過酢酸で処理した。恒温保持条件を次の第９表に 記載する： 第９表 痕跡　過酢酸濃度　温度／恒温保持時間４　０係　室温 ５　０　チ　８０’Ｃ／３０分 ６０．２壬　ｌ この混合初冬２０μ／にアガロースデル電気泳動法により分離した。結果は第８ 図かられかる。０．２係の濃度の過酢酸は恒温保持時間３０分間及び恒温保持温 度８０℃でＤＮＡ　’（ｉ−十分に分解し、５００　ｂｐを越えるＤＮＡ−７ラ グメントはもはや含有されない。

ｂ）により製造した試料４〜７ｔ−過酢酸で恒温保持した後、それぞれ１部’Ｉ 　Ｔ　Ｅ−緩衝液、ｐ！（７，５に対して透析した。この際得られた溶液から大 腸菌ＨＢ１０１（Ｄ！ＥＭ　１６０７　）の形質転換のために、それぞれ２０μ ｌ　ｆ　？　ニアテイスによるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″第２５０ 〜２５１頁に記載されている塩化カルシウム法により形質転換した。

使用した条件並びに得られた生写菌数（ＬＫＺ　）は次の第１０表かられかる。

眩 掌 ＠　水　＊ 噌　０　Ｆ ａ）ＴＥ−緩衝液、ｐＨ７，５２０μｌ中の純粋なプラスミド溶液１μｓ ｂ）細胞培養液中のプラスミド（ヌクレアーゼによる部分消化：透析；このうち ２０μｌを大腸菌中に形質転換） ＬＫＺの測定のために細菌を含有する溶液’ｔ１０−１〜１０−６−倍の希釈で 、ＬＢ−培地を有するアンピシリン含有（５０μｇ）又は不含寒天プレート上に ひろげ、３７℃で１夜培養し、生長したコロニーの数を視覚的に調べる。

８０００の恒温保持温度及び３０分間の恒温保持時間において０．２％過酢酸と の恒温保持は細胞の完全な死滅に導ひいたということを示す。

Ｆｉｇ、　１ ０９．２ ０９．３ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ Ｆｉｇ、　６ Ｆｉｇ、　７ Ｆｉｇ、　８ 手続補正書（自船 平成１年６月６日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡを含有するバイオマスに炭素原子数１〜３のべルカルボン酸、その塩 、アルカリベルオキシド又はアルカリベルオキソモノスルフエートを添加し、引 き続き該混合物を６０〜１００℃に加熱することを特徴とするＤＮＡ、特に組換 えＤＮＡの生物学的活性の不活性化法
2. ２．ベル化合物を０．０５〜５％の量で使用する請宗項１記載の方法。
3. ３．クロマトクラフイーにおいて塩基対５００を越える鎖長を有するＤＮＡがも はや検出されなくなるまで加熱を行たう請求項１又は２記載の方法。
4. ４．ｐＨ値が６〜１１の範囲である請求項１から３までのいずれか１項記載の方 法。
5. ５．ｐＨ値が７〜１０の範囲である請求項４記載の方法。