JPH01503299A - 生物学的対象物からホスファチジルイノシトールを製造するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的対象物からホスファチジルイノシトールを製造するだめの方法 発明の分野 本発明は脂質の製造技術に関し、更に詳しくは生物学的対象物からホスファチジ ルイノシトールを製造するための方法に関する。

ホスファチジルイノシトールはリン脂質の分類に属し、生体におけるプロセスを シミュレートする膜系の作製；外来遺伝情報を生体細胞中に移すように機能する リポソームの形成：膜バリアーを介する外来タンパク質、ワクチン及び酵素の輸 送；標的組織に向けた薬学的製剤及び他の薬剤の放出；のための生化学的試薬と して有用である。

従来技術 動物の心臓及び脳のような様々な生物学的対象物から、また細菌及び種子からホ スファチジルイノシトールを製造するためのいくつかの方法が当業界で公知であ る。酵母菌からホスファチジルイノシトールを製造する方法も当業界で公知であ る〔脂質の製造化学１編集エル・デー・バーゲルソン（Ｌ、Ｄ、Ｂｅｒｇｅｌｓ ｏｎ）及びイー・ブイ・シアトロビスカヤ（Ｅ、Ｖ、Ｄｙａｔｌｏｖｉｔｓｋａ ｙａ）、１９８１年、モスクワ、　°ノーカ′出版社（−Ｎａｕｋａ　’　Ｐｕ ｂｌｉｓｈｅｒｓ）　、第１７８頁参照〕。

酵母菌からホスファチジルイノシトールを製造する方法は、トルエンで５時間酵 母菌を自己分解させ、クロロホルム：メタノール（１：　１）混合物で７時間か けてリン脂質を抽出し；抽出物を濾過して上記有機溶媒混合物で濾過ケーキを洗 浄し；濾液を蒸溜水と共に２０時間攪拌し；濾液をクロロホルム相及び水相中に 分離し；クロロホルム相を蒸発させ；蒸発せしめられたクロロホルム相をイソプ ロパツールで処理し、しかる後それをガラスフィルターで濾過することからなる 。次いで、リン脂質は得られた濾液からシリカゲルカラムにおいて最初にクロロ ホルム−メタノール−アンモニア（８０：　２０　：　２）混合物５〜７リツト ルでしかる後エタノール１〜２リツトルでそれを連続的に溶離することにより分 離されるが、この方法においてはホスファチジルイノシトールのアンモニウム塩 が回収され、しかる後ナトリウム塩に変換される。

この方法では、非常に高い消費率で高価な有機溶媒を必要とする。したがって、 ホスファチジルイノシトール１ｇの製造のためには、５ｇ以上のクロロホルム、 ３９以上のメタノール、約１Ωのエタノール及び他の溶媒を使用することが必要 になる。しかも、その方法は時間のかかる多くの労働集約的な操作を要する。こ れらすべては最終製品のコストに著しく影響を与える〔カルビオケム（Ｃａｌｂ ｉｏｃｈｅｍ）のカタログによれば、ホスファチジルイノシトール１ｇが６．９ ５０ＵＳドルである〕。多量の有機溶媒を用いる操作は、作業者にとって正常な 環境条件を妨げる有害な労働条件を作出することになる。

発明の開示 労働強化及び消費時間を低下させ、労働条件を改善し、かつ製品コストを著しく 低下させるために、有機溶媒の消費率を実質上減少させうるようなホスファチジ ルイノシトールの製造方法を提供することが、本発明の目的である。

この目的は、生物学的対象物からのホモゲナイズ及び生成物の抽出によるホスフ ァチジルイノシトールの製造方法によって達成され、即ち本発明によればその方 法はニーｐＨ５，０〜１１．０の範囲内においてモル濃度０．００５〜ＩＭの塩 水溶液中における生物学的対象物のホモゲナイズ； 一重力加速度３，０００〜３０，０００ｇでの遠心分離又は孔径３〜５０μｍの フィルターでの濾過による、タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体の 粒子を含む無細胞塩水相と非破壊細胞及び他のリン脂質粒子を含む沈澱物とへの 、得られたホモゲネートの分離；−無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチ ジルイノシトール複合体粒子の回収； 一回収されたタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子からのホスフ ァチジルイノシトールの抽出；を含むことを特徴とする。

無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の回収 は、分子質量１００万ダルトン以上の物質を分離しうる吸着剤でのゲルクロマト グラフィーによるか、又は孔径０．２μｍ以下のフィルターでの限外濾過によっ て行うことができる。更に、上記塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノ シトール複合体粒子の回収は、アルカリ又は中性プロテアーゼによるその処理に よって行われ、その結果これらの粒子が凝集して、容易に分離しつるようになる 。タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子を回収するためにはこの 方式が好ましいが、その理由は実施が簡単であって、しかも上記試薬、特にプロ テアーゼが容易に入手可能でかつ比較的安価だからである。

回収されたタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子から、メタノー ル又はそれとクロロホルムもしくは蒸溜水との混合物での抽出によって、所望の 生成物が単離される。生物学的対象物として、イネ科植物の種子の加工製品を用 いることが望ましいが、その理由はこれらの原料が比較的容易に入手でき、安価 で、しかも高収率で所望の生成物を得ることができるからである。

本発明の方法によれば、従来技術の方法と比較して、有機溶媒の消費率を数百倍 低下させ、操作時間を２〜４倍短縮化し、製造コストを著しく低下させ、しかも 労働条件を改善することを可能にすることができる。

操作は商業的規模で容易に実施することができる。

本発明の利点は、ホスファチジルイノシトールの製造方法に関する以下の詳細な 説明から更に一層明らかとなるであろう。

生物学的対象物として、植物の種子、それらの加工製品、根、葉、茎、並びに動 物組織及び微生物を使用することができるが、しかしながらイネ科植物の種子及 びふるい分は品（ｓｉｆｔｉｎｇｓ）のようなその加工製品を使用することが好 ましい。これは、それらの原料が容易に入手でき、安価で、しかも高収率でホス ファチジルイノシトールを得ることができるという事実によるものである。

生物学的対象物は、乳鉢もしくはプレードホモゲナイザー又は他のいずれかの適 切な装置においてそのすりつぶしによるホモゲナイズに付される。

本発明の方法による生物学的対象物のホモゲナイズは、モル濃度０．００５〜Ｉ 　Ｍの塩水溶液中において行われる。この塩濃度範囲は、０．００５ｋｉ未満の 水中塩濃度が望ましくないという事実に基づき決定されており、即ちその場合に タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体の溶解を引き起こして、これが 製品の製造を妨げるからである。塩のモル濃度の上限は、室温で用いられる塩の 最大溶解に達するまで１　ｈ１以上の値となり得る。

しかしながら、塩濃度の上限はＩ　Ｎｉに設定することが望ましい。Ｉ　Ｍを超 えるほど塩モル濃度を高めると、望ましい生成物の収率を高めることができず、 試薬の過度の高消費率を招く。塩の最適モル濃度は０．０５〜０．ＩＮｌの範囲 内である。

塩水溶液の調製のためにはいずれの有機又は無機塩も使用することができるが、 但しタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体を分解することができかっ カオトロピズムの（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）性質を有する塩は除く。塩化ナトリ ウム、リン酸のナトリウムもしくはカリウム塩、並びにトリスヒドロキシアミノ メタンクロリド、ホスフェートもしくはサルフェートのような中性又は弱アルカ リ性の塩を用いることが最も好ましい。

本発明によれば、生物学的対象物のホモゲナイズは５〜１１の範囲内のｐＨをも つ塩水溶液中で行われる。塩水溶液におけるｐＨのこの限定は、５未満及び１１ を超えるｐＨの場合にタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子か破 壊されてしまい、これは許容しえないという事実から決定されている。

上記塩水溶液中でのこの対象物のホモゲナイズによって、生物学的対象物の細胞 は分解されて、タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子を塩水相中 へ遊離させる。非破壊細胞及び他のリン脂質含有粒子からタンパク質−ホスファ チジルイノシトール複合体粒子を分離するために、本発明によるホモゲネートは 遠心分離又は濾過に付される。ホモゲネートの遠心分離は、３．０００〜３０， ０００ｇの範囲内の重力加速度値で行われる。この限定は、３，０００ｇ未満の 遠心分離の場合に、他のリン脂質含有粒子が沈澱せずに塩水相中に残留し、その 結果ホスファチジルイノシトールを他のリン脂質で汚染してしまうという事実か ら決定されている。

３０．０００ｇを超える遠心分離の場合には、タンパク質−ホスファチジルイノ シトール複合体粒子が沈澱して、生成物の収率を実質上低下させてしまう。重力 加速度値の最適範囲はｓ、ｏｏｏ〜１０，０００ｇである。

ホモゲネートの分離は、孔径３〜５０μｍのフィルターでの濾過により行うこと ができる。孔径３μｍ未満のフィルターによるホモゲネートの濾過は望ましくな いが、その理由はフィルター上にタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合 体粒子を残留させて、結果的に望ましい生成物の収率を低下させてしまうからで ある。孔径５０ｕｍを超えるフィルターによるホモゲネート濾過も望ましくない が、その理由は他のリン脂質含有粒子が塩水相中に移動して、望ましい生成物の 品質を実質上劣化させてしまうからである。

上記技術によるホモゲネート分離の結果として、タンパク質−ホスファチジルイ ノシトール複合体粒子を含有する無細胞塩水相が得られるが、一方残留する他の リン脂質含有沈澱物は廃棄される。

タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子は、分子質量１００万ダル トン以上の物質を分離しうる吸着剤でのゲルクロマトグラフィーにより、塩水相 から回収することができる。分子質ｆｆ１１００万ダルトン未満の物質を分離し つる吸着剤は、タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子を分離しえ ないことから許容することができない。最良の吸着剤は、“ファルマシア”　（ ＰｈａｒｌＩａｃｉａ）　（スウェーデン社）市販（７）”−ｔ’７７０−ス° （Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、“セファクリル”　（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）、“ウル トロゲル−（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）　（″ＬＫＢ−社、スウェーデン）、“バイオ ゲルＡ”　（Ｂｉｏｇｅｌ　Ａ）　［”バイオラッド’　（”Ｂｊｏｒａｄ”　 ）社、ＵＳＡ）、“トヤバール”（Ｔｏｙａｐｅａｒｌ）　Ｃ’トヤソーダ°　 （”Ｔｏｙａｓｏｄａ’　）社１日本〕のようなゲルである。

無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の分離 は、孔径０．　２μｍ以下のフィルターでの限外濾過によって行うことができる 。孔径０．２μｍを超えるフィルターを用いることは望ましくなく、その理由は タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子が濾液中に移動（浸透）し て望ましい生成物の収率を低下させてしまうからである。

無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の回収 は、超遠心機中において重力加速度値３０，０００〜１００，０００ｇでのそれ らの沈降によっても行うことができる。この限定は、３０．０００ｇ未満の値だ と粒子か沈降するものの不完全であり、一方１００．０００ｇを超える値だと限 外濾過が望ましい生成物の収率を高めることができずに電力消費率を過度に高め てしまうという不都合さがある、という事実から決定されている。

タンパク質−ホスフ７チジルイノシトール複合体粒子の分離に関する上記態様以 外に、本発明ではアルカリ又は中性プロテアーゼでの無細胞塩水相の処理による それらの分Ｍ！３様をも提供する。かかるプロテアーゼの存在下、大部分のタン パク質がこれらの粒子から除去されるが、その際に粒子は凝集して、紙もしくは ガラスフィルターでの簡単な濾過によって容易に分離されるか、又はそれらは５ ００〜１０．０００ｇの低重力加速度値での遠心分離によって沈降せしめられる 。この態様の場合、プロテアーゼは塩水相１ｇにつき５〜１００μｇの量で使用 される。この限定は、５μｇ／Ｄ未満のプロテアーゼ量だとタンパク質−ホスフ ７チジル複合体粒子の完全な回収のためには不十分であり、一方それらの１００ μｇ／Ｉ）を超える量だと追加効果を発揮せずに試薬使用率を過度に高めてしま うという不都合さがある、という事実から決定されている。

上記プロテアーゼによるタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の 分離は、それらの分離に関する他の態様と比較して好ましい。これは、アルカリ 又は中性プロテアーゼの存在下でタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合 体粒子が互いに付着し、容易かつ簡単な方法で紙又はガラスフィルターにより分 離されうるようになる、という事実による。プロテアーゼは比較的安価でかつ入 手しやすい製品である。

次いで、分離されたタンパク質−ホスフ７チジルイノシトール複合体粒子はそこ から脂質不純物を除去するためにジエチルエーテル、アセトン又は他のいずれか の同様の有機溶媒で処理される。しかる後、生成物はメタノールで又はそれとク ロロホルムもしくは蒸溜水との混合物で抽出される。ホスファチジルイノシトー ルの収率は、出発生物学的対象物中のその含有量のうち９０％以上である。

本発明の詳細な説明から明らかなように、本発明の方法によればその実施操作が 簡単であって、高い有機溶媒消費率を必要とせず、労働条件を改善し、操作時間 を２〜４倍短縮し、製品コストを著しく低下させる。

発明を実施するための最良の態様 生物学的対象物として、穀物ふるい分は品、例えば小麦ふるい分は品が使用され る。それらは、ホモアネートが得られるまでｐ！（ｓ、３〜８．５のトリスヒド ロキシアミノメタンクロリド０．０５〜０．１Ｍ水溶液中ですりつぶすことによ りホモゲナイズされる。そのようにして、ふるい分は品の細胞が破壊され、タン パク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子が塩水相中に移る。

得られるホモアネートは１０．０００ｇで１０分間遠心分離に付される。これに よって、非破壊細胞及び他のリン脂質含有粒子からタンパク質−ホスファチジル イノシトール複合体粒子含有無細胞塩水相が分離される。このようにして得られ る無細胞塩水相から、タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子は０ ．０５ｍｇ（即ち５０ｇｇ）／相１ｍｌの量のアルカリ又は中性プロテアーゼで この相を処理することにより分離される。

かかる処理でタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子は互いに付着 し合い、それらは１０，０００ｇの遠心分離により上記相から分離される。得ら れたタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子残渣は、生成物に混入 する脂質不純物を゛除去するためにジエチルエーテルで洗浄される。タンパク質 −ホスファチジルイノシトール複合体粒子の精製残渣から、生成物がメタノール で抽出される。生成物の収率は、小麦ふるい分は品中のその初期含有量の約９３ ％である。

本発明のより良い理解のために、ホスファチジルイノシトールの製造方法につい て説明するいくつかの具体例が以下に記載されている。

例］ コーン粉１０ｋｇを、磁器製乳鉢においてｐＨ９，０のリン酸二ナトリウム０． ０５Ｍ水溶液中で均一状態となるまですりつぶす。無細胞塩水相を回収するため 、ホモアネートを孔径５μｍのフィルターで濾過する。無細胞塩水相をセファロ ース４Ｂカラムによるゲルクロマトグラフィーに付し、タンパク質−ホスファチ ジルイノシトール複合体粒子含有画分を回収する。この画分を減圧エバポレータ で濃縮乾固する。乾燥残渣をアセトン５０ｍ１で処理し、脂質不純物を除去する 。望ましい生成物を蒸溜水で抽出する。望ましい生成物の収量は０．０９ｇ　（ ８，９％）である。

例２ エントウ粒子１０ｇをミルで粉砕し、しかる後粉砕塊をｐＨ１１，０のＮ　ａ　 ２Ｃ０３０、１Ｍ溶液中ブレード型ホモゲナイザーでホモゲナイズする。ホモア ネートを１０．０００ｇで１０分間遠心分離する。得られた無細胞塩水相を３０ ，０００ｇの超遠心分離に付す。残渣をジエチルエーテル５０ｍ１で洗浄する。

生成物をメタノール５ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．　０２ｇ（６５％） である。

例３ どんぐり１０ｇをミルで粉砕する。得られた粉末をｐＨ５で濃度０．ＩＭの酢酸 ナトリウム水溶液中ですりつぶす。このようにして得られたホモゲネートを１０ ．０００ｇで１０分間の遠心分離に付す。無細胞塩水相を吸着剤トヤパールＨＷ ６５でゲルクロマトグラフィーに付す。タンパク質−ホスファチジルイノシトー ル複合体粒子含有画分を真空エバポレータで蒸発させ、ジエチルエーテル５０ｍ １で処理し、脂質不純物を除去する。生成物をメタノール５ｍｌで抽出する。生 成物の収量は０．Ｏｌｇ　（２０％〕である。

例４ 大麦穀物のふるい分は品１０ｇをｐＨ７の塩化カリウム０．００５Ｍ水溶液中で すりつぶす。得られたホモゲネートを１０，０００ｇで１０分間の遠心分離に付 す。

タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子含有無細胞塩水相を、５０ ｇｇ／上記相１ｍｌの量のパパインで４時間処理する。タンパク質−ホスファチ ジルイノシトール複合体の凝集粒子を１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によ り沈降させる。沈澱物をジエチルエーテル５０ｍ１で洗浄して脂質不純物を除去 し、生成物をメタノール−クロロホルム（２：１）混合物５ｍｌで抽出する。生 成物の収量は０．０５ｇ　（５０％）である。

例５ コーン穀物１０ｇを粉砕し、ｐＨ７の塩化ナトリウム０．０５Ｍ水溶液中でホモ ゲナイズする。得られたホモゲネートを３，０００ｇで１０分間の遠心分離に付 す。

無細胞塩水相を分離し、５０ｇｇ／上記相１ｍｌの量のトリプシンで処理する。

タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体の凝集粒子を濾紙での濾過によ って集める。濾過ケーキを石油エーテル５０ｍ１で洗浄して脂質不純物を除去す る。生成物をメタノール５ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．７ｇ　（９０％ ）である。

例６ コーンふるい分は品１０ｇを磁器製乳鉢において濃度０．０５Ｍのトリスヒドロ キシアミノメタンホスフェート水溶液中でホモゲナイズする。得られたホモゲネ ートを３０，０００ｇで１０分間の遠心分離に付す。無細胞塩水相を５０ｇｇ／ ｍ＋の二のキモトリプシンで８時間処理する。タンパク質−ホスファチジルイノ シトール複合体の凝集粒子を１０，０００ｇで１０分間の遠心分離により沈降さ せる。残渣をジエチルエーテル５０ｍ１で処理して脂質不純物を除去する。生成 物をメタノール５ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．０２ｇ　（１８％）小麦 ふるい分は品１０ｇをｐＨ８，５で濃度０．１Ｍのトリスヒドロキシアミノメタ ンサルフェート水溶液中で１０分間ホモゲナイズする。得られたホモゲネートを 孔径５０μｍのフィルターで濾過する。分離された無細胞塩水相を５０ｇｇ／上 記相１ｍｌの量のパパインで４時間処理する。タンパク質−ホスファチジルイノ シトール複合体の付着粒子を１０．０００ｇで１０分間の遠心分離により沈降さ せる。

得られた残渣をジエチルエーテル２０ｍ１で洗浄して脂質不純物を除去する。生 成物をメタノール２ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．０７ｇ　（８５％）で ある。

■旦 小麦ふるい分は品１０ｇをｐＨ８，５で濃度０．０５Ｍのトリスヒドロキシアミ ノメタンクロリド水溶液中ですりつぶす。得られたホモゲネートを１０．０００ ｇで１０分間の遠心分離に付す。無細胞塩水相を５０ｇｇ／ｍｌの量のパパイン で８時間処理する。タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体の凝集粒子 を１０．０００ｇで１０分間の遠心分離により沈降させる。

沈澱物をジエチルエーテル５０ｍ１で洗浄して脂質不純物を除去する。生成物を 沈澱物からメタノール５ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．ｌ１ｇ　（９５％ ）である。

凰２ 小麦ふるい分は品１０ｇをホモゲナイザー中においてｐＨ７で濃度０．０５Ｍの 塩化ナトリウム水溶液中でホモゲナイズする。得られたホモゲネートを１０，０ ００ｇで１０分間の遠心分離に付す。分離された無細胞塩水相を孔径０．２μｍ の限外濾過膜による濾過に付す。ケーキをフィルターから取出し、ジエチルエー テル５０ｍ１で洗浄して、脂質不純物を除去する。沈澱物から生成物をメタノー ル２ｍｌで抽出する。生成物の収量は０．０６ｇ　（６３％）である。

産業上の利用可能性 本発明は、化学工業、バイオテクノロジー及び医薬において実施することができ る。

Ｉ際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的対象物からのこの対象物のホモゲナイズ及び生成物の抽出によるホ スファチジルイノシトールの製造方法であって、 −ｐＨ５．０〜１１．０の範囲内においてモル濃度０．００５〜１Ｍの塩水溶液 中における生物学的対象物のホモゲナイズ； −重力加速度値３，０００〜３０，０００ｇでの遠心分離又は孔径３〜５０μｍ のフィルターでの濾過による、タンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体 の粒子を含む無細胞塩水相と非破壊細胞及び他のリン脂質粒子を含む残渣とへの 、ホモゲネートの分離；−無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノ シトール複合体粒子の分離； −分離されたタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子からのホスフ ァチジルイノシトールの抽出；を含むことを特徴とする方法。
2. ２．生物学的対象物のホモゲナイズがモル濃度範囲０．０５〜０．１Ｍの塩水溶 液中で行われる、請求項１に記載の方法。
3. ３．無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の 分離が、分子質量１００号ダルトン以上の物質の分離を可能にする吸着剤でのゲ ルクロマトグラフィーにより行われる、請求項１に記載の方法。
4. ４．無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の 分離が、孔径０．２μｍ以下のフィルターでの限外濾過により行われる、請求項 １に記載の方法。
5. ５．無細胞塩水相からのタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子の 分離が、アルカリ又は中性プロテアーゼにより行われる、請求項１に記載の方法 。
6. ６．分離されたタンパク質−ホスファチジルイノシトール複合体粒子からのホス ファチジルイノシトールの抽出が、メタノール又はそれとクロロホルムもしくは 蒸溜水との混合物により行われる、請求項１に記載の方法。
7. ７．植物対象物としてイネ科植物の種子の加工製品を使用する、請求項１〜５の いずれか一項に記載の方法。