JPH01503381A - 免疫原ならびに改良された免疫原製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫原ならびに改良された免疫原製造法この出願は１９８６年７月２３日に出願 された係属中の出願、出願番号第８８９，４２４号の部分継続出願である。

発明の技術分野 この発明は、新しい型の免疫原ならびに関与する作用物質の受容体特異性の結合 部位の模擬前となる免疫原の製造法に関する。これらの免疫原は、受容個体中に おいて作用物質に対する活性免疫反応を誘起する！こめに用いることができる。

さらに特定的には、この発明は、関与する作用物質に対する活性免疫反応を引き 出すことが可能な抗体の生産のための単純化された工程に関し、この工程におい ては、受容個体の抗体は、作用物質の配位子の、受容個体の標的細胞受容体との 結合を阻止する。

発明の背景 この発明は、関与する作用物質に対する哺乳動物の活性免疫化において有用な免 疫原の製造法に関する。ｔ；とえば、これらの免疫原は、種々の病原体もしくは 病原性作用物質による感染に対するワクチンとして用いることができる。加える に、それらは、ホルモンもしくは酵素の過剰生産または望ましくない生産に対す る保護、ならびに受容体特異性結合部位を有するどのような他の作用物質に対す る保護としても用いることができる。

免疫原は、一般的には、ワクチン接種、すなわち感染症に対してヒトおよび動物 の集団を保護するための主要な手段に関連するものとされている。典型的には、 そのような免疫原もしくはワクメンは、感染性作用物質そのものを殺滅し、また は弱毒化したもの、無毒化されｔ；その生産物あるいはそれらから導かれる抗原 の精製物であって天然に出現する病原性作用物質と免疫化学的同一性を保持して いるもので構成されている。

抗原を入手し、かつそれに対する免疫を誘起する伝統的な方法は、抗原の精製が 困難であることを含めて多くの不利な点を伴っている。

それに加えて、ある種の弱毒化された微生物がその毒性を回復することも知られ ている。したがって、免疫化のｌ；めの伝統的な研究法は、臨床的に有効であり 、経済上も寅用的な、ヒトおよび動物の主要病原体のすべてに対するワクチンの 開発に適当であるとは立証されていないこととなる。さらに、免疫の対象とされ ることが望ましい多くの作用物質は抗体反応を引き出すのに充分なほどには抗原 性を持たない。種々の欠点を考慮に入れて、次々と異なった型の免疫原が案出さ れている。

たとえば、ある作用物質の生化学的な「模擬前」となるような、内部写像抗イデ イオタイプ性抗体が、その作用物質に対する免疫反応を誘起するために用いられ てきている。内部写像は抗原性決定因子（すなわちエピトープ）であり、外部抗 原上に見出されるエピトープに免疫化学的に近似するかまたは同一である抗体分 子上に発現する。内部写像免疫原を用いることの利点には、モノクローナル抗体 技術による生産が比較的容易であることと安全性とが含まれる。すなわち、それ らは回避しまたは処置しようとしている疾病を引き起こし得るものではない。さ らに、そのような内部写像抗イデイオタイプ性ワクチンは、伝統的な免疫原より もはるかに高い特異性を有内部写像抗イディオタイプ性抗体による免疫化に対応 して引き出される抗体は、免疫原ならびに内部写像がその模擬前となっているエ ピトープを表現するどのような外部抗原とも結合することが可能である。実験的 条件の下においては、そのような免疫原は、多様な病原性作用物質に対する保護 的な免疫反応を誘起するものであることが示されている［Ｒ，Ｃ，Ｋｓ＋＋ｎｅ ｄｙら、“Ｖｘｃｃｉｎｓｓ　ＩＩｔｉｌｉｚｉＢ　Ｉ＋ｊｓｒ−＋ｕｌ　Ｉｍ Ｂｔ　Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔｙｐｉｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｔｈａｔ　Ｍｉ ｍｉｃ　ＡｎＬｉｇ！ｎｓ　ｏｆＩｎｆＣｃ４ｉｏｎｓ　Ｏｒｇｘｎｉｓｍｓ” 、　Ｂｉｏ−Ｔｓｃｈｎｉｑａ？ｓ、　Ｌ　ｐ、４０４　（＋９１５）　；Ｒ， Ｃ，Ｋｅｎｏｅｄｙら、”Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｉｙｐＣｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｎ＋ ＋ｉｔｙ”、　５ｃｉＣｏｔ百ｉｃＡｍｅｒｉｃｘｎ、　２５５．　ｐｐ、４ｇ −５６（＋９０）］。

好都合なことには、内部写像抗イデイオタイプ性抗体免疫原は、疾病もしくは、 酵素的にまｔ；はホルモン的に媒介されｔ；状態の発現に機能的な役割を演する 抗原構造を選択的に標的とすることを見込んでいる。たとえば、多くの感染なら びに中毒における初期に必ず起こる事象は、作用物質によって表現される受容体 特異性の抗原決定因子と、標的組織によって表現される受容体との間の特異的な 結合関係から戊立っている。この結合関係を阻止する抗体は、疾病に導くことと なる事象の連鎖を中断し得るものである。

内部写像抗イデイオタイプ性抗体は、病原体に対抗するワクチンとしての応用に 特に適している。標的組織の結合に関与するものとして知られる病原に関連する エピトープの内部写像は、病原体がその標的組織と結合することを阻止する病原 体特異性抗体を選択的に放出し得るものである。このような研究方法の有効性は 実験的に示されてしする。［Ａ、Ｂ、　５ｂｓｒｐｅら、”５ｙＢｅｎｅｉｅ　 Ｍｏｎｏｃｌｏ＋ａｌ　Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏ＋ｙｐｅ　Ｃａｎ　Ｉｎｄｕｃｅ　 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｔｏ　Ｒｅｏｖｉｒｕｓ”、Ｊ、　Ｅｘ ｐ。

匹、■、　Ｐ、ｌ］９Ｓ　（１９Ｒ４）］。

しかしながら、免疫原の開発に対してこの技術を応用することは、内部写像抗イ デイオタイプ性抗体の産生において遭遇する実際上の困難によって妨害されてい る。このことは、一つには、今口に至るまで内部写像を得るために用いられてき た工程の煩雑さによるものである。関与する作用物質から直接に誘導される伝統 的なワクチンとは異なって、内部写像抗イデイオタイプ性抗体は、２段工程によ って製造される。これには関与する作用物質に対抗する特異性抗体の生産が含ま れており、その抗体はつぎに抗イデイオタイプ性抗体を取り出すために用いられ 、それはその後、内部写像が発現しているかどうかを棟定されなければならない 。

たとえば、作用物質の受容体特異性抗原決定因子の結合部位と結合するエピトー プの内部写像を表現する抗イデイオタイプ性抗体を作成するためには、作用物質 の標的組織との結合を選択的に阻止する抗体の一覧表が最初に入手されねばなら ない。実験動物は、作用物質まＩ；は（もし利用可能ならば）その配位子によっ て免疫化され、免疫動物から得られた抗体生産細胞を用いて細胞融合が行なわれ る。

雑種細胞系列はそれぞれ、つぎに、作用物質−受容体間結合の阻止能力があるモ ノクローナル抗体を分泌するものを選び出される。

伝統的な方法に従うならば、雑種細胞系統が確立され、作業量のモノクローナル 抗体が生産されたのちに、工程の第２の主要段階が開始される。この第２段階は 、それぞれのモノクローナル抗体による実験動物の免疫化を必然的に伴なうもの である。ついで、配位子特異性モノクローナルの作用物質との結合を選択的に阻 止するモノクローナル抗イデイオタイプ性抗体を分泌する雑種細胞系列が産生さ れる。抗体の抗イデイオタイプ性群の中には、配位子特異性モノクローナルの抗 原結合部位と結合する抗体の下位群が含まれる。抗イデイオタイプ性のこの下位 群は、作用物質の配位子エピトープの内部写像を表現する。

不都合なことには、抗イデイオタイプ性反応において引き出される特異性体の総 数と比較すると、内部写像を表現する抗イデイオタイプ性のものの割合は一般に 小さい。それでも、内部写像を表現しない抗イデイオタイプ性のものの多くは、 配位子特異性モノクローナル抗体の配位子との結合を立体的に阻止することが可 能であろう。

それ故に、封鎖性を持つ抗イデイオタイプ性のもののそれぞれから免疫原内部写 像の表現のあるものを選び出さなければならない。このことは、実験動物へ接種 した場合に作用物質特異性抗体を放出するそれらの能力を追跡することによって 寅現される。免疫原内部写像を表現するモノクローナルの抗イデイオタイプ性の ものが最終的に確認されたとき、それらは免疫原またはワクチンに組入れられる ことができる。

理想的条件の下においてさえも、伝統的方法によると、内部写像抗イデイオタイ プ性抗体を得るためには多大の努力が払われなければならない。２段階研究法の 主要な欠点は、作用物質特異性七ツクローナルの数の増大にともなって、それに 対応して産出されｊ；抗イデイオタイプ性のものを生産し選別するために要する 労力が増大することである。この欠点は、今日の技術が、免疫化に応じて放出さ れる抗体の特異性を細かく支配するようにはなっていないことによってなおさら 大きいものになっている。ある作用物質の受容体特異性結合部位に関して特異的 な抗体が、ある抗配位子反応において存在するであろうという保証はない。した がって、多数の動物から産出される配位子特異性モノクローナルが抗イデイオタ イプ性反応を誘起するのに用いられねばならないということにもなりがねない。

抗イデイオタイプ性反応の特異性をコントロールすることが同じようにできない ことによって、内部写像を発生させるために必要とされる試みの数がしばしば倍 加している。その上、免疫化と選別の各段階において、所望の特異性を持つ抗体 が得られる確率は極めて低い。したがって、免疫原製造の「２段階」工程は、所 望の抗体が得られる確率を実質的に低下させる。２段階研究法では必然的に複雑 さが増大するので、その結果、選択された内部写像を生成させるために必要な時 間と労力が実質的に増加し、また、内部写像抗体の生成量が低下することになる 。場合によっては、伝統的な方法に従って所望の内部写像を製造することはまっ たく不可能であるという本発明は、種々の作用物質によって表現される受容体特 異性結合部位の模擬態である抗体のＷ、、接的生産のＩ；めの方法を提供するこ とによって、上記で言及された問題を解決する。より特定的に８うならば、標的 細胞受容体分子に対してただ１段階だけの免疫化しか必要としない単純化された 工程を経ることによって免疫原もしくは免疫原組成物を得ることが、この発明に よって可能となったのである。

この発明の方法に従うと、特定の作用物質が特異的に結合する相手となる受容体 に対して抗体反応が誘起される。受容体特異性の抗体をここに記述された選別工 程に付することによって、作用物質の配位子によって表現される受容体結合部位 の免疫化学的な模擬態である抗体が得られる。そのような「内部写像」は、つづ いて、作用物質の受容体結合部位に関し５て特異的であり、作用物質すなわち病 原体、ホルモン、酵素などとその標的組織との間の特異性結合を阻止する能力を 持つ抗体を放出するように設計されＩ；免疫原に組み入れることができる。

発明の詳細な説明 ここに記述される発明が一層完全に理解されるように、つぎの詳細な記載を示し ておく。

作用物質　−細胞表面の受容体との結合が可能な実体。この出願において用いら れている限りにおいて、用語「作用物質」は、病原体、ホルモン、酵素、神経調 節物質、神経毒ならびにその他の細胞毒を包含するが、それらに限定されるもの ではない。

病原体、病原性作用物質　−疾病を引き起こす感染性の生物（ウィルス粒子、バ クテリア、かび、原虫ならびに多細胞生物を含む）もしくは毒性物質。

１！生　−作用物質が特異的に結合する対象である細胞まｔ；は組織上に発現す る分子状の実体。

ＥＱ土　−病原体などの作用物質の特定の受容体との特異的な結合の原因となる 分子状の実体。

標的組織　−感染性の、毒性の、ホルモン的に媒介されＩ；、酵素的に媒介され た、もしくはその他の方法で媒介された過程において作用物質が特異的に結合す る対象である組織または細胞群。

内部写像　−作用物質が保有するエピトープの免疫化学的模擬態である、抗体分 子によって表現される抗体構造。

本発明は、種々の作用物質に対抗して活性免疫化を行なう際に用いられる免疫原 もしくは免疫原性組成物、ならびにこれらの免疫原もしくは免疫原性組成物を製 造する方法に関する。その工程は、作用物質の受容体特異性結合部位の模擬態で ある抗体を、単一段階で得ることを包含する。免疫原は、特定の作用物質の結合 対象である細胞の表面受容体に対して抗体を放出することによって形成される。

これらの抗体は、形成されｔ；後に、受容動物中で特定の作用物質に対する活性 免疫を誘起するための免疫原として用いられる。

この発明の方法に従うと、作用物質が特異的に結合する対象となる受容体に対す る抗体反応を最初に発生させることになる。

受容体が確認されたならば、抗体を純粋な状態、学績製状態もしくは未精製状態 で注射してよい。もし受容体そのものが未知であるならば、その場合には、一般 的にこの最初の免疫原の源として標的組織を用いることができる。この場合には 、免疫原は、標的組織から抽出された化合物を精製したものあるいは学績製のも の、標的組織抽出物の未精製分画物、細胞切片、全細胞体、もしくは多細胞組織 調製物からなるものでよい。

杭受容体抗体反応は、通常標的とされるどのような種においても、また、どのよ うな標準的な免疫化方法によってでも発生させることができる。好ましい態様と しては、７０インドの完全補助剤中に乳化した、受容体含有細胞群または組織１ ００＋＋１ｍでマウスをｊｌ［腔内的に免疫化し、つぎにリン酸塩で緩衝されｔ ；生理食塩水中懸濁物としての受容体含有細胞体または組織の投与量各１００ｍ ｇｍの３適間隔での定間隔腹腔内投与によって促進する。

免疫化動物の血清中に受容体特異性の抗体が存在することは、通常利用されてい るどのような抗体検出検定法によってでも証明することができる。典整的な試験 方法としては、沈殿法、膠着法、免疫電気泳動法、免疫抹消法、ＲＩＡ、ＥＬ　 Ｉ　ＳＡ、免疫細胞化学的染色技術、あるいは抗体が受容体と結合する能力を検 定し、それによって作用物質の受容体との結合を防止するように考案された各種 生物的検定法があろう。

受容体免疫マウスを抗体生産細胞供与者として用いることにより、ハイブリドー マ細胞系統を作出するための細胞融合を実施する。標準的な細胞雑種化過程に従 って行なえばよい［たとえば、Ｐ、Ｂ。

ＭｉｓｂｓｌｌおよびＳ、Ｍ、　５ｈｉｉＨｉ、　５ｅｌｅｅｔｅｄ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｏ−Ｖユｏ（ｙ、　ｐｐｊ５１−７１ ．　Ｓ＊ｎ　Ｆｒ１ｎｅｉｓｅｏ　（１０Ｇ）を見よ。］つぎの段階は、作用物 質がその受容体と結合することを特異的に阻止する抗体を生産するためのハイブ リドーマ細胞の選別に関わるものである。この発明の一つの実施態様においては 、その選別過程は、作用物質の受容体特異性抗体による結合の阻止を検出するこ とが可能な検定システムを利用するものであればよく、その検定システムには種 々の免疫細胞化学的技術、オートラジオグラフィ、沈殿法および膠着検定法が含 まれるが、それらに限定されるものではない。

細胞系統が確立されＩ；のち、確立されＩ；過程［上記Ｍｉｓｂｓｌ＋］を用い ることにより、実用量のモノクローナル抗体が生産される。

つぎの段階では、受容体特異性モノクローナル抗体が作用物質の受容体結合部位 の内部写像を表現するかどうかの決定がかかわっている。多数の受容体特異性モ ノクローナル抗体が確認されることになるであろうから、どのモノクローナル抗 体が内部写像を表現するとするのがより確からしいかを決定するための方法を用 いるのが好ましい。この方法は、作用物質によって表現されるエピトープの撲擬 態であるモノクローナル抗体により表現されるエピトープを検出することが可能 ならばどのような検定法であってもよい。たとえば、この最初の選別段階は、作 用物質に対して免疫化された動物から得られた作用物質特異性抗体との、受容体 特異性抗体の結合を検定することによってもできるであろう。作用物質の受容体 結合部位の内部写像を表現する受容体特異性モノクローナル抗体は、作用物質の 受容体結合部位に対向する作用物質特異性抗体と結合するであろう。

受容体特異性抗体は、つぎに最終的で決定的な選別過程に付される。この過程に おいては、受容体特異性抗体は実験動物を免疫化するｔ；めに用いられ、それに よって生成する抗血清から作用物質とその標的組織との結合の阻止能力を持つ作 用物質特異性抗体の存在するものを選び出す。標準的な動物種と免疫化過程とを 採用すればよい。たとえば、ミ２ウバンに吸収されたかまたは７０インドの完全 補助剤中で乳化されたモノクローナル抗体１００＋＋１ｍをウサギに対して皮下 注射し、さらに投与量１００　ｕｔｍを３週間ごとに皮下投与することによって 促進する。上記の選別段階において用いられた検定法を適用すれば、作用物質に 特異的な阻止能力がある抗体を検出できる。しかしながら、この場合には、（受 容体というよりは）作用物質が標的組織との接触の前に抗血清により処理される 。

こうして確認された内部写像は、つぎにワクチン試験の試行に付される。

この発明の好ましい一実施態様においては、モノクローナル内部写像を分泌する 細胞系統が作出されるという結果を生ずる。しかしながら、血清からの内部写像 の生産のためにも、同様の基本的研究法が利用されてよい。そのような場合には 、受容体に対抗させるｔ；めには、より大型の種（ｔ；とえばヤギ、ブタまたは ウシ）を免疫化することが好ましく、それは大型の動物はど個体当りの抗体生産 量が大きいからである。

この発明と内部写像を得るための標準的方法との間の主な相違は、この技術が、 作用物質の特異的結合の対象となる受容体に対抗する抗体の発生に基礎を置いて いるということである。上記のように、この点は、あらかじめ発生させｔ；作用 物質特異性抗体からの抗イデイオタイプ性抗体の生成に依存している標準的方法 を実質的に改良するものである。従来技術の方法に従うならば、特定の作用物質 の結合部位に対抗する抗体がまず第一に形成されなければならない。

を誘起するワクチンが造られる前に、他の抗体を放出するために用いられねばな らない。明らかに、２通りの免疫化系列のうちの第一のものによって課されてい る労力と時間の増加を回避することになるので、本発明は優れｔ；研究方法を与 えるものである。その上に、所望の内部写像抗体が得られる確率も増大する。

この発明の方法は、それに対する受容体が存在するような配位子分子の実際上ど のようなものの結合も阻止する内部写像免疫原の開発に応用することができる。

もしも受容体を表現する標的組織が知られているならば、受容体が特定的に確認 されるということは必要でない。潜在的な標的としては、毒素、ウィルス粒子、 バクテリア、かび、原虫類および多細胞寄生虫類によって表現される配位子の受 容体結合部位が含まれる。

たとえば、ＨＴＬＶ−１１１によって表現されるＴ−４結合部位の内部写像すな わちエイズの原因作用物質は、ＨＴＬＶ−ｍによって標的とされたヒトのＴ細胞 下位群に見出されるＴ−４抗原で免疫化することによって生産することができる 。ＨＴＬＶ−ＩＩＩ配位子の内部写像は、つぎに、ウィルスとＴ−４細胞との結 合を阻止する能力を持つ抗体を放出するように設定されたワクチン中に組み込ま れる。

このようにして、Ｔ−４細胞はＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ［による感染から保護され るが、それは配位子特異性の抗体がウィルス粒子が細胞と結合することを防止す るからである。

この発明は、他の受容体−配位子特異性を阻止し得る免疫原を含むものであり、 それらはホルモン配位子の結合、Ｂ細胞８よびＴ細胞によって表現される抗原受 容体と結合する配位子、ならびに酵素の触媒作用部位と結合する配位子によって 例示されるが、それらに限定されるものではない。

この発明の主要な利点は、遺伝的に安定なエピトープの模擬前である免疫原を提 供することＳある。本発明の一実施態様においては、病原体に対するワクチンを 製造するために免疫原が用いられる。多くの病原体は、かつては感染性であった 受容個体集団の免疫性の水準が高まることによって生じてくる選択的な圧力によ ってもたらされる「抗原浮動」のために、潜在的な受容個体を引き続いて感染さ せることができる。抗原浮動を起こすような病原性エピトープに対する免疫を誘 起する免疫原は、時間と共にエピトープが変化するのにつれて効果がなくなる。

しかしながら、特定の作用物質の抗原構造のすべてが、同程度に突然変異を起こ す自由をもっているわけではない。ある種の構造、たとえば病原体中で重大な機 能を旦しているようなものは、生理学的な役割が失なわれる程度にまで改変され ることはない。抗原決定因子のこのカテゴリーの中には、標的受容個体細胞によ り表現される受容体に対する病原体の特異的結合の主因となる諸構造が含まれる 。感染過程における標的細胞の結合の重要性は、結合に関与する病原体のエピト ープが、もしあるとしても、わずかな修飾を受けるに過ぎないということを結論 づけるものである。もし何らかの修飾が病原体のエピトープに生じｔ；とすると 、標的細胞の受容体を結合させる能力は失なわれることになる。

本発明は、抗原浮動による影響を最小限にしか受けることがない免疫原を生産す るために、遺伝的に安定なこれらのエピトープを特異的に目標とする。実際的な 感覚からすると、この研究方法は、抗原浮動を受けるエピトープを標的とする免 疫原と比べて非常な利点を提供する。

内部写像抗体の特異性、注射法、投与量、投与の径路、補助剤ならびに賦形剤、 およびアイソタイプの内部写像を注意深く選択することによって、この発明は安 全で有効な免疫原を与えるものであり、それらの免疫原は、さもなければ正常体 抗原と結合する抗体を注射したときに起こるかもしれない自己免疫性疾病または 他の病原性過程が誘起されることを回避するものである。

これらの免疫原、それらを含む組成物、または薬学的に許容できる免疫学的に有 効なそれらの誘導体の投与は、免疫原性を示す作用物質の投与のｔ；めに通常認 められたいずれ・かの方法によって行なわれるべきである。それらの中には、経 口的もしくは非経口的投与法が含まれる。

これらのワクチンに用いられる組成物には多様な形態のものがある。たとえば、 それらの中には固体、半固体ならびに液体の投与形態、たとえば粉末、溶液また は懸濁液、座薬、注射用溶液ならびに浸出溶液が含まれる。好ましい形態は、目 的とする投与方式ならびに治療上の適用形態に応じて定められる。

組成物にはまた、通常薬学的に認められた担体を含有させることが好ましく、ま Ｉ；、他の医薬物質、担体、補助剤、賦形剤など、たとえばヒト血清アルブミン または血漿製剤を含有するものとすることができる。本発明の組成物は、単位投 与量の形態のものとすることが好ましい。接種目的で、または医薬として１回に 、あるいは一定期間内に投与される活性化合物の量は、処置を受ける主体、投与 の方法と形態、ならびに処置をする医師の判断に従って定められる。

しかしながら、有効薬量は、この発明の組成物の約１ｎｇから約１ｍｇまで、好 ましくは約１００１から５００ｍｇまでの範囲である。これよりも少ないがまＩ ；は多い量であっても有効であることもわかっている。

このように、本発明は免疫原ならびに免疫原の製造法を提供するものである。そ の免疫原は、ヒトを含む哺乳動物において、特定の作用物質に対する活性免疫反 応を引き起こすことが可能である。

ここに記載された発明がさらに完全に理解されるように、下記の実施例を提示す る。これらの実施例が説明の目的のみのためのものであり、いかなる意味におい てもこの発明に限定を加えるものと解されるべきでないことが理解されなければ ならない。

実施例１ この例においては、ベネズエラ馬脳を髄炎ウィルス（Ｖ　Ｅ　Ｅ　Ｖ）に対する 防衛的抗体反応を引き出す能力を持つワクチンの生産のためにこの発明の方法を 用いる手段を示す。大まかに述べると、マウスをまずＶＥＥＶの標的となった細 胞に対して免疫化する。抗標的細胞抗体反応が培養細胞のＶＥＥＶ感染を阻止す るということを示したのち、ウィルス（Ｖ　Ｅ　Ｅ　Ｖ）受容体特異性結合部位 の模擬前であるモノクローナル抗体を生成するために細胞融合が行なわれる。

これらの七ツクローナル抗体は、生体外で感受性細胞のＶＥＥＶ感染を防止する 能力により確認される。つぎに、モノクローナルは、ＶＥＥＶと結合する抗体を 放出する能力を評価するｔ；めに、第２の選別過程に付される。この段階では、 標的細胞のＶＥＥＶに対する受容体に類似し、ウィルスと結合して中性化する抗 体の形成を引き起こすための免疫原として用いることのできる受容体特異性モノ クローナル抗体が確認される。最後に、杭受容体モノクローナルによって放出さ れる抗体がＶＥＥＶ感染に対して防衛的であることを示すためには、生体外、生 体内のどちらの方法でも使用できる。

１、ＶＥＥＶ感受性細胞によるマウスの免疫化ＶＥＥＶ感受性標的細胞を用いて マウスを免疫化する。ＢＨＫ−２１細胞（幼若ハムスターの腎臓細胞；　ＡＴＣ Ｃ，Ｒｏｅｋｌａｎｄ、　Ｍｄ、）およびＶ　ｅｒｏ細胞（ＶＥＥＶに対して感 受性のヒト細胞、ＡＴＣＣ。

Ｒｏｃｋｌａｏｄ、　Ｍｄ、）を、５０ａｇ／！１ｎゲンタマイシンを含有する ２％ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）で補力されたＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ　Ｌ＊ｂｏ ｒ＊ｔ’ｏ−ｒｉｅｓ）中で育成する。つぎに、１２週令のメスのＣＡＦ、マウ スをＢＨＫ−２１細胞で免疫化する。組織培養フラスコからＢＨＫ−２１細胞を 回収し、ＰＴＡ赤血球凝集用緩衝液（ＰＴＡ）中で４回遠心分離（４００Ｘ　ｇ 、５分間）することにより洗浄する。ＰＴＡ中に細胞を２Ｘ１０’個／ｍＱの濃 度で再懸濁する。尾部静脈からの採血により、免疫化前（正常）血清の試料を得 Ｉ；のち、それぞれのマウスニ対し、ＰＴＡｏ、５ｍｆｆ１中のＢＨＫ−２１細 胞１０’−個を腹腔的接種する。２１日の間隔で２回、同様にしてマウスの強化 をする。第３回の注射の１４日後、尾部静脈からの採血によって血清の試料を得 る。

■、血清抗ウィルス受容体抗体の検定 血清抗ウイルス受容体抗体に対する検定において、ＴＣ−８３（トリニダードロ ）つワクチン株ＶＥＥＶを用いる。［Ｔ、Ｏ，Ｂｅｒｇｅら、Ａｔｔｅ＋ｕ＋１ ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｓ＋＋ｅｚｕｅｌｔ＋＋　Ｅｑ＋＋ｉｎｅ　Ｅｎｅｅｐｌｉ ｉｌｏ＋ａｙｅｌｉＬｉｓＶｉｒｕｓ　Ｂｙ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｕｌ目ｖｘ ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｇｕｉｎｅ＊　Ｐｉｇ　Ｈｔａｒｔ　Ｃｅ１ｌｓ”。

Ａ＋ａ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｈｙ（ｉｅｎ＊、　７３　ｐ、２０９　（＋９６１）］ 　、　ＴＣ−８３ワクチン株ＶＥＥＶのＷｅｒｅ細胞との結合を阻止する能力を 持つ抗体を検定するために、Ｐａｎ　Ａ＋ｅｓｒｉｃｓｎ　５ｘｎｉｔ＊ｒｙ　 Ｂｕｒｅ＊ｕの出版物である“Ｉｎｔｅｒ−＋５ｔｉｏｎｓｌ　Ｃａｎｆｅｒｅ ｎｅｓ　＋ｕ　Ｅｑ＋＋ｉｎｓ　Ｅｎｃｓｐｂ！１ｉｔｉｓ　Ｖ＊ｅｃｉｎｓ” （＋９７４）に記載されＩ；標準的なウィルス溶菌斑減少中性化法（Ｐ　ＲＮＭ ）の変形法を用いる。

Ｖｅｒｏ細胞の単層を１００ｍｍの培養血中で育成し、ついでＭ１９９栄養培地 を用いて４回洗浄する。ＢＫＨ−２１で免疫化されたマウスから得Ｉ；免疫化前 および免疫化後の血清試料を、Ｍ２Ｏ３中で１：１Ｏｊ−ｉよび１：５０に希釈 する。それぞれの希釈血清２．０＋ｕｌをＶｅｒｏ＃ａｌ胞培養に添加し、希釈 血清を加えられた細胞を、５％ＣＯ１の下で１時間、３７℃に保温する。

つぎに、（２％ＦＣ３および５０％ｇ／ｖａＱのゲンタマイシンで補力されｆ： ）Ｍ　１９９　２．０ｙｒＱ中に含有させたＴＣ−８３ウイルスの溶菌床形成単 位（ｐｆ＋＋）のおよそ５０単位をそれぞれの培養皿に加える。細胞は、ウィル スと抗体を存在させて、５％ＣＯ２の下で１時間、３７℃に保温される。

保温の終了後、ウィルスの溶菌環を計数する。（免疫化前の血清でル理されｔ； プレート上の溶菌環の数と比較して）５０％以上の溶菌真数の減少を引き起こす 免疫化血清は、Ｖ　ｔｒｏ細胞の表面に表現されたウィルス受容体に関して特異 的な抗体を含有するものと考えられる。

■、抗受容体モノクローナル抗体の生成ＰＲＮＭによって受容体特異性抗体反応 を持っていると確認されたマウスに対し、先に記したように、ＢＨＫ−２１細胞 で４回目の補強を行なう。

３日後に、これらのマウスから牌臓細胞を取出し、Ｂ、Ｂ、　ＭｉｓｈｃＩＩう 。培養培地は、ｌＯ％ＦＣ３および５０　ｍｙ／　ｔａｌｌ、のゲンタマイシン で補力されｔ；ＲＰＭ　Ｉ　１６４０　（Ｇｉｂｅｏ　Ｌａｌ＋ｏｒｚｌｏｒｙ ）からなるものとする。

ＰＲＮＭにより選別されるべき混成物の上澄み液の数を制限するｌ；めに、まず Ｖ　ｓｒｏ細胞の表面に表現されＩ；抗原に関して特異的な抗体についての上澄 み液の選別を下記のＥＬ　！　ＳＡによって行なう。

つぼ穴９６個を持つミクロ凝集価プレート中で成長させたＶ　ｅｒｏ細胞単層を 、ＰＲＭＩ　１６４０で４回すすぎ洗いする。ハイブリドーマ細胞培養物の上澄 液１００ｕｆｆｉをＶ　ｅｒｏ細胞の単層に添加し、そのプレートを１時間４℃ に保持する。つぎに、５％ウシ血清アルブミンを加えたＦＴＡ中で１　：　１０ ００に希釈されたベルオキシダニゼ接合のウサギの抗マウス免疫グロブリン１０ ０ｏｆｉをそれぞれのっぽ穴に添加する。つぼ穴を１時間４°Ｃに保持し、その 後、それぞれのっぽ穴を４℃で３回、ＰＴＡを用いてすすぎ洗いする。つぎに、 つぼ穴１個につきペルオキシダーゼ基質１００　Ｑを添加し、プレートを３０分 間２２°Ｃで保温する。それぞれのっぽ穴から５０＋＋ｆｆｉをＩｍｍｕｌｏｎ 　Ｕプレートの対応するつぼ穴に移し、Ｍｉｃｒｏｓｌｉｓｘ読取器で吸光度を 測定する。それによって、細胞面抗原に関して特異的な抗体を含有する雑種体上 澄みが確認される。

ＶＥＥＶ受容体に対抗する抗体を生産するＥＬ　Ｉ　ＳＡ陽性のハイブリドーマ を確認するためにＰＲＮＭ中で上澄み液を試験する。培養ハイブリドーマからの 上澄み液を先に試験されたマウス血清に置き換えること以外は、これは前に記載 した通りにして行なわれる。

モノクローナル抗体特異性の抗体を腹水抗体として生産するために、その後Ｖ　 ｔｒｏ細胞のＴＣ−８３ＶＥＥＶ感染を阻止する抗体を生産する雑種を用いる。

つぎに、受容体特異性モノクローナルがマウス中で抗ウイルス抗体を放出する能 力を下記のようにして評価する。

受容体特異性のモノクローナルを、スカシガイの血清素（ＫＬＨ）と複合させる ことによって、マウスに対し免疫原性とする。このことによって、モノクローナ ルに対する抗体反応を発生させるために、異なる種を用いることが必要でなくな る。飽和硫酸アンモニウムを４０％飽和濃度まで添加することによってモノクロ ーナル抗体を腹水から沈殿させ、ついで、生理食塩水に対して透析する。１−エ チル−３−（３−ジメチルアミノグロビル）カルボジイミド塩酸塩５゜ｌｌ１ｇ を添加することにより、４．０ｍｌの生理食塩水中で、モノクローナル５．０ｍ ｇをＫＬＨ１０１１１９と複合させる。反応混合物を２２℃で１２時間かきまぜ たのち、それをＰＴＡに対して４℃で透析する。

７０インドの完全補助剤Ｈ３７Ｒａ　（Ｄｉｒｃｏ）中で１：１に乳化された、 抗受容体モノクローナルーＫＬＨ複合体１１００ｕを用いてマウスを免疫化する 。これを行なうのにはエマルジョン　０　、１　Ｐａｎヲそれぞれのマウスの腹 腔内に注射する。それらの動物は、２１日の間隔で２回、ＦＴＡ中に加えられた 抗原それぞれ１ｏＯＢの腹腔内注射を追加として受ける。３回目の注射の１４日 後に、尾部静脈からの採血により血清試料が得られる。

その後、ＶＥＥＶ特異性抗体の存在に関して、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、免疫化前 および免疫化後の血清を検定する。ＴＣ−８３ＶＥＥＶは、グリシン緩衝液（０ ，ＩＮ、ｐＨ＝９．５）中で、１１１１１１当りたん白質２０ｕｇの濃度で懸濁 し、Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｕプレートのっぽ穴１個につき２Ｓｕｌｌずつ添加する。

−夜４℃に保持したのち、０．０５％のＴｒｅｅ＋＋−２０および０．０２％の ＮａＮ、を含有する生理食塩水を用いて、そのプレートを４回洗浄する。

その血清試料を、１０−１から１０−８まで、１０倍ずつ順次希釈する。希釈は 、（Ｏ，ＯＳ％のＴｖｅｅｎ−２０および０．０２％のＮａＮ。

で補力された）ＰＴＡからなる希釈用緩衝液中で行なわれる。抗ぶて被覆された Ｕプレートのっぽ穴に、それぞれの血清希釈液２５ＩＩＩｌずつを加え、１時間 ２２°Ｃに保温する。その後、つぼ穴を１回洗浄する。ついでビオチン−ウサギ 抗マウス免疫グロブリンの１　：　１０００希釈液２５ｕＱをそれぞれのっぽ穴 に加える。１時間の２２°Ｃ保温に統いて、つぼ穴を４回洗浄する。アビディン −アルカリ性ホスファターゼの１　：　１０００希釈液２５＋＋Ｑをそれぞれの っぽ穴に加え、１／２時間、２２℃に保温する。その後、つぼ穴を４回洗浄し、 ＭｇＣ１□０．０５ｍＭおよびＮａＮ３０．０２％を添加し、ｐＨ−９．８とさ れｔ；１０％ジェタノールアミン液中でｌＩｎｇ／ａｌｌとしたｐ−ニトロフェ ニルリン酸２５ａｌｌを各つぼ穴に加える。２０分間２２℃に保温したのち、Ｍ ｉｅｒｏｅｌｉｓ！読取器で吸光度の値２ｏを測定する。

免疫化前の血清と比べて、抗ＶＥＥＶについて１００倍の増加を示した免疫化血 清は、抗ＶＥＥＶ抗体に関して陽性であると考えられる。

■、受容体特異性モノクローナルでの免疫化により誘起される抗体反応が、ＶＥ ＥＶに対して保護的であることの論証Ａ、生体外 受容体特異性モノクローナル−ＫＬＨ複合体（上記）に対して免疫化されたマウ スから得Ｉ；血清を、１：２から１：３２まで２倍ずつＭ１９９中で順次希釈す る。対照として、無関係な抗原、たとえば鶏卵リゾチームに関して特異的なモノ クローナル抗体と複合されたＫＬＨで免疫化されたマウスからの血清を使用する 。各希釈液２．０ｍｌを有毒野性型ＶＥＥＶ株２．０ｍＱと混合してＶＥＥＶの 最終濃度を約２５　ｐｌｕ、／ｍＱとし、１時間３７°Ｃに保温する。

つぎに各混合液２．０ｒｎＱを、１００ｍ１＋１の培養皿中の、洗浄後のＶ　ｅ ｒｏ細胞単層に添加する。５％ｃｏ２の下で１時間、３７℃に保温しＩ；のち、 Ｖ　ｅｒｏ細胞単層をＭ１９９で４回すすぎ洗いする。

つぎに、ｖｓｒｏ細胞を寒天被覆用培地４．０ｖａｌで被覆し、５％ｃｏ２の下 で４８ないし７２時間３７℃に保温する。

保温処理後、ウィルスの溶菌斑を計数する。免疫化前の血清ならびに非特異的に 免疫化された対照群と比較して、溶菌斑の数において５０％の減少をもたらす抗 血清は、ＶＥＥＶ感染に対して保護的であると考えられる。

Ｂ、生体内 上記に示されたようにして、ＫＬＨ複合受容体特異性モノクローナルおよびＫＬ Ｈと複合された非特異性モノクローナルに対してマウスを免疫化する。第３回の 接種の１０日後に、ＶＥＥＶの有毒野性型株の腹腔内ＬＤ、、値（注射された動 物の５０％を殺す投与量）がｌＯＯのものを用い、マウスに対して腹腔内注射を 施す。補足的対照群には、同様にしてＴＣ−８３ＶＥＥＶを接種する。

その後１４日間死亡率を評価する。生存率８０％は保護力を示すこの例において は、同一の細胞面受容体抗原に関して特異的なモノクローナル抗体のイディオタ イプに対する免疫化が、受容体抗原を表現する細胞の正常な機能を妨げることは ないということを示す。

この実験においては、Ｌｙｔ−１に関して特異的な、ラットのモノクローナル抗 体（ＢｓｃＬｏｕ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｏ）を用いる免疫化に関連する系を選択す る。Ｌ７１−１は、細胞受容体になぞらえられるネズミ科ヘルパーＴ細胞の表面 に表現された抗原構造である。大量の可溶性抗Ｌｙｔ−ｉ抗体でマウスを処理す ると、ヘルパーＴ細胞の活性を機能的に消耗させることがある。この消耗は、Ｔ 依存性抗原に対する抗体反応における減損として証明できる。本実験においては 、抗原量ならびにラット抗ｔ、ｙｔ−１モノクローナル抗体の形態の、２種のＴ 依存性抗原に対する抗体反応に及ぼす影響について評価した。

不ズミ科Ｔ細胞によって表現されるｔｙｔ−１表面抗原に関して特異的なモノク ローナルラット抗体が、ヘルパーＴ細胞に依存して他の抗原に対抗する抗体反応 に影響を及ぼすことなく、イディオタイプについて特異的な抗体を放出するため に用いられｔ；。得られｔ；結果は、以下に示すように、適切に選択された受容 体特異性モノクローナル抗体は、特定された受容体を表現する細胞の正常機能に 変更を加えることなく、抗イデイオタイプ性免疫反応を引き出すｊ；めに用い得 ることを示している。

４ケ月令のメスのＣＡＦ、マウスを、鶏卵リゾチーム（ＭｉｌｓｓＳｃｉｅｎｔ ｉｌｉｃ）　、ラットの抗Ｌｙｔ−ｔモノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ。

ＬＯＵ−Ｗｓ！／Ｍ系ラットから得たもの（Ｂｔｃｔｏｎ　Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ 　Ｍｏｎｏ−ｃｌｏｎ＊ｌｓ、　Ｉｎｃ、）または正常ラットの免疫グロブリン のいずれかで免疫化した。正常ラット免疫グロブリンは、ＬＯＵ−Ｗｓｌ／Ｍ正 常ラット血清（Ｃｈｘｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌ＆ｂｓ）を正常Ｓｐｒ＊ｇａｔ −Ｄｘｖｌｓｙラット血清（Ｒｏｃｋｌｘｎｄ　５ｃｉｔｎｔｉｌｉｃ）と１： １に混合したもので、これを４０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、ＰＴＡ赤血球 凝集用緩衝液に対して透析した。

０　、１　ｍｌ＋のアルヒドロゲル（Ｓ＋ｐｅｒｆｏｓ　Ｌｔｄ、）に吸収させ た、ラットの抗Ｌｙｉ−１抗体２５９を、１０頭のマウ・スに対して腹腔内注射 しｔ；。これら１０頭のマウスは、その後、生理食塩水に加えたラットの抗Ｌｙ ｔ−１抗体２５ｕｇを用いて、腹腔内投与により２回補強された。２回の補強は ２１日の間隔で行なわれた。さらに、１０頭の対照群マウスに対し、正常ラット 免疫グロブリンにより、ラットの抗Ｌ７ｉ−１をマウスに与えたときと同一の手 順を用いて免疫化を行なった。

上記各群の５頭ずつのマウスに対し、リゾチームに対する追加の免疫化を施した 。アルヒドロゲル０．１１１１１１に吸収させｊ；リゾチーム２５ｕ９の初回注 射による腹腔内投与を、ラット抗体の第１回注射の７日後に行なっＩ；。生理食 塩水に加えｔ；リゾチームを用いる１回の促進を２１日後に腹腔内投与によって 行った。（生理食塩水中）抗原による促進を行なうごとに、エピネフリン（０， １＋ｌ１ｌｌ、１　：　５０００）の腹腔内注射を行なった。

血清抗体反応を追跡する！こめ、実験の全過程にわたり７日の間隔で尾部静脈か ら採血して血清試料を得た。

マウスが抗リゾチーム抗体、抗ラット免疫グロブリン抗体または抗うット抗Ｌｙ ｔ−１イディオタイプ特異性抗体を生産しつつあるかどうかを確認するために、 酵素結合免疫吸着剤測定法（“ＥＬＩＳＡつを実施した。この検定においては、 抗体は（放射免疫検定において用いられる放射性標識の代りに）共有結合的に結 合させた酵素にょ）て標識づけされる。抗体と結合された酵素は、無色の基質と 反応して有色生成物を与え得るものである。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定において、一定 時間内に放出される生成物の量は、酵素の濃度に依存しており、それはまた、存 在する抗体の量の尺度となるものである。らいで、結合した抗体の量と関係する 光学濃度（０，Ｄ、）を読み取るために、専用の分光光度測定装置が用いられる 。

確立されたＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法はつぎのとおりである：Ｉａｖｕ＋ｌｏｎ　（ ＤｙＩｊｅｅｂ製）Ｉ［ｉＵプレートのっぽ穴に、ｌＯｕｇ／ｌａｎの濃度で塗 抹用緩衝液（０，１Ｍグリシン、ｐＨ−９，５）中の溶液とした２５ｕｌの抗原 （リゾチーム、ラットの免疫グロブリンまたはラットの抗Ｌｙｔ−１モノクロー ナル抗体）を塗抹し、塗抹されたつぼ穴を、−夜、４℃に保持した。あらかじめ ０．５％Ｔｖｓｓｎ　−２０および０．０２％ＮａＮ、を加えた生理食塩水を洗 浄液として、そのっぽ穴を４回洗浄した。

Ｕプレートのっぽ穴に塗抹された抗原に関して特異的な抗体が血清中に存在する かどうかを試験するＩこめに、つぼ穴１個ごとに、２５ｎｌｌｉの（代表例とし ては０．０５％のＴｖｔｅｎ　−２０および０．０２％のＮａＮ、を含有するＰ ＴＡ赤血球凝集用緩衝液中で、１０−”から１０−ｓまで１０倍ずつ段階的に希 釈された）血清を加え、それらのっぽ穴を１時間２２℃に保温した。ラットの抗 Ｌ７ｉ−１抗体を塗抹されたつぼ大中の抗イデイオタイプ抗体の存在について血 清（１次抗体）を試験した。これを行なうｔ：めには、Ｕプレートのっぽ穴への 添加に先立って、その血清を、正常ラットの血清に、１ｒａｇ／ｒＲ１！の濃度 で２２℃においてあらかじめ１時間吸収させｔ；。１次抗体の保温期間が終った のち、再びつぼ穴をすすぎ洗いしＩ；。

ついで、ビオチン化されたウサギの抗マウスＩ　ｇ　（ＰＴＡ赤血球凝集用緩衝 液＋０．０５％Ｔｖｅｅｎ　−２０＋　０．０２％ＮａＮ３＋５％正常ラット免 疫グロブリン中１：１０００）からなる２次抗体２５ｕｌをつぼ穴ごとに添加し た。ついでそれらのっぽ穴を１時間２２°Ｃに保温しｌ；。再びつぼ穴をすすぎ 洗いした。それぞれのっぽ穴にアビディン−アルカリ性リン酸塩複合体（１：　 １０００）２５ｕｌｌを添加したのち、つぼ穴を１時間２２℃に保温した。再び つぼ穴をすすぎ洗いし、ついで１ｍｇ／ｌＩｌのｐ−ニトロフェニルリンａ（１ Ｏ％ジェタノールアミン中、０．５＋ＩＩＭＭｇＣ１ｚ　、０．０２％ＮａＮ、 、ｐＨ＝９．８）２５ｔＱを各つぼ穴に添加し、５〜３０分間発色させた。Ｄｙ ｎｘｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｃｌｉｓａ読取器で光学濃度を測定しｔ；。

第１表について述べるならば、ラットの抗Ｌｙ＋−１モノクローナル抗体で免疫 化した後の不ズミ科抗うット免疫グロブリン反応をここに描写している。

第１表 ラットの抗Ｌｙｔ−１（ｘ）および正常ラットの免疫グロブリン（０）で免疫化 されたマウスの、抗正常ラット免疫グロブリン抗体力価時間＠ １群中のマウス数のｎ＝１０ プロットされｔ；値は、それぞれの力価平均値士探準誤差である。

矢印は、ラット抗体（Ｉｇ）の投与が行なわれた日を示した。

認め得るように、ラットの抗Ｌｙｔ−を抗体（第１表中においては“Ｉｇ”とし て描かれている）の２回の注射で１０’に近い抗ラット免疫グロブリン抗体力価 を誘起した。正常ラット免疫グロブリンで免疫化された対照群動物は、１０６に 近い力価の反応を示した。両群間の１０倍の差は、それぞれの群に対する注射に 用いられｔ；抗原製剤の不均質性によって説明することができる。正常ラット免 疫グロブリン製剤は、モノクローナル抗体よりもさらに大きい不均質性を持つも のである。したがって、正常ラット免疫グロブリンは、より多くの不均質反応を 誘起する。このことは、免疫血清が正常ラット免疫グロブリンに対抗する活性に 関して検定されたとき、より大きい力価として検出される。

第２表について述べると、その中には正常ラット免疫グロブリンでの吸収の効果 が記載されている。ラットの抗Ｌｙｔ−１モノクローナル抗体に対する結合性に 関して血清を検定すると、両群において引き出されＩ：抗１ｇＧ２ａ反応が本質 的には同一であることは明らかであっｔ；。このことは、ＯＩｌ１ｇ／Ｉ＋１１ の正常ラット免疫グロブリンに吸収されｔ；血清に対応するデータの点により描 写されている。このような結果は、抗Ｌ７ｔ−１抗体が、このような条件の下で 正常に引き起こされる抗免疫グロブリン反応を改変しなかったことを立証してい る。

第２表 ラットの抗Ｌｙｔ−を抗体（０）または正常ラット免疫グロブリン（ロ）で免疫 化されｔ；マウスの血清中における抗（ラット抗Ｌｙｔ−１）抗体力価：正常ラ ット免疫り一ロプリンによる吸収の効果０　０．１　１．０　１０．０ 免疫化されたマウスからの血清の吸収に用いられｔ；正常ラット免疫グロブリン の濃度（＋ｕ／＋ｃ） ０日後および６３０後に得られた血清は、正常ラットの免疫グロブリンに吸収さ れ、ついで２Ｘ１０””の最終希釈度で、ラット抗Ｌｙｔ−１モノクローナル抗 体を塗抹されたつぼ穴に添加されｔ；、（検体数４）プロットされた吸光度は、 ６３日後に得られた血清についての平均値（±標準誤差）から０日後に得られた 血清についての平均値を減じｔ；ものである。

その後、ラット抗ＬＦｔ−１抗体免疫化が、無関係な抗体に対する体液反応に及 ぼす影響を調べた。第３表に示されているように、ラットの抗Ｌｙ＋−１抗体で 免疫化されたマウスと正常ラット免疫クロプリンを注射されたマウスとの間で、 ひき起される抗リゾチーム抗体反応において有意差はなかった。第１表及び第２ 表に示された抗ラット免疫グロブリン反応は、抗Ｌ４ｔ−１の投与の時点におい て、動物がＴ依存性抗原に対して反応できたことを示している。ラット抗Ｌｙｌ −１抗体がラット免疫グロブリンまｌ；はリゾチームに対抗するマウスの抗体生 産を減退させることができないということは、抗ｌ４ｔ−１抗体での免疫化がＬ ｙｔ　１”Ｔ細胞の正常なヘルパー機能を阻止するものではないことを示してい る。

第３表 正常ラット免疫グロブリン（０）で免疫化されｔ；マウスにおける抗リゾチーム 抗体力価 時間０ １群中のマウス数ｎ−５ プロットされた値は、個々の力価の平均値土探池誤差である。

矢印は指示された抗原が注射された日を示す。

この免疫化方式によって、我々がめていｔ；特定の抗イデイオタイプ反応が誘発 されたことを示す目的で、ラットモノクローナル抗体に対して免疫化されたマウ スおよび正常ラット免疫グロブリンを注射されたマウスから得られた血清を吸収 するのに正常ラット血清を用いた。ついでラット抗、Ｌ７ｔ−１抗体に関して特 異的な抗体の存在についての検定を行なった。

第４表 第４表に示されているように、ラット抗Ｌ７ｔ−１製剤の３回の注射で抗イデイ オタイプ性抗体反応が誘起された。正常ラット免疫グロブリンに対する結合は無 視できる程度であった。このことは、反応のイディオタイプ的特異性を明らかに するものであった。正常ラット免疫グロブリンで免疫化されたマウスから５６日 後および６３日後に得られた血清による結合が僅かに増加することをを観察しＩ ；。

抗＝（ラット抗Ｌｙ！−１）活性に関する検定に先立ち、６３日後に得られた血 清を種々の濃度の正常ラット血清で吸収することによって立証したように、これ は正常ラット免疫グロブリンによる吸収が不完全であったことによるものである 。先に第２表中で描写したように、正常ラット免疫グロブリンで免疫化されたマ ウスから得られた血清による結合は、いずれも吸収によって排除されていた。こ の吸収はまた、ラットの抗Ｌｙｔ−１免疫血清中に存在する非イディオタイプ的 に特異な活性のいくらかを中和した。これらの結果は、したがって、免疫反応の 抗イデイオタイプ性の割合を示していＩ；。

最後に、作成したマウス抗イデイオタイプ性血清が、ラット抗Ｌｙｔ−１モノク ローナル抗体のネズミ科胸腺細胞の表面に表現されたｒ−ｙｔ−ｉとの結合を阻 止し２得るものであっことを示すため、免疫細胞蛍光検定を実施した。

ラット′ｖｃＬｙｔ−１で免疫化されたマウスから免疫化日程の４２日後に行わ れた尾部静脈からの採血により、ネズミ科抗イディオタイプ性抗血清を得た（上 記第１表に関する論述を見よ、）、、正常ラット免疫グロブリンにより免疫化さ れたマウスから、同様にして対照血清を得た。両方の抗血清製剤は、抗ｒ−ｙｉ −ｉイディオトーブ以外のラット免疫グロブリン決定因子に関して特異的な抗体 を除去するｔ；め、正常ラット免疫グロブリンにあらかじめ吸収させた。このこ とは、それぞれの血清を０．０２％のナトリウムアジドを含むＰＴＡ赤血球凝集 用緩衝液（ＰＴＡ／Ｎ３）中で１１００に希釈し、ついでそれぞれの希釈されｌ ；血清０．５ｍｌを０．２５ｍｇ／ｍＱの正常ラット免疫グロブリン（Ｐ　Ｔ　 Ａ　／　Ｎ　ｓ中）０．５ｍｌ＋、！：混合することによって行なわれた。吸収 段階は０℃で１時間進行させＩ−０つぎに、吸収された血清を、それぞれの血清 ０．５ｍＱとあらかじめＰ　Ｔ　Ａ／Ｎ　、中でｌ　：　１０００に希釈された ラット抗ｔｙｔ−ｉ０．５ｍｌと混合することにより、ラット抗ｔｙｔ−ｉモノ クローナル抗体と反応させｊ；。陰性の染色対照として、正猟ラット免疫グロブ リンの０．００２ｍｙ／ｍＱ溶液０．５ｍｌを、吸収された抗イデイオタイプ血 清０６５ｍ１と混合した。反応は０°Ｃで１時間進行させた。

つぎに３種の混合物のそれぞれをネズミ科の胸腺細胞と反応させた。胸腺細胞を 調製するためにＣＯ２で安楽死させたＣＡＦ、マウスから胸腺を採取し、それか らリンパ節を取り除いた。つぎに胸腺をＰＴＡ／Ｎ、中で０°ｃｉ：Ｂいてすり つぶしｌ：。残片を３分間沈降させｔ；のち懸濁する細胞をＰ　Ｔ　Ａ　／　Ｎ 　ｓ中で２回洗浄し、遠心分離（４００Ｘｇ、５分間）した。最終の遠心分離の 後では、３種の抗血清混合物のそれぞれ１．０ｍｌ中には５ＸｌＯ’個の胸腺細 胞が懸濁しており、Ｂｓ１ｌｃｏ振とう機の台座上で、４℃において１時間、中 等度の速度で混合した。

細胞は、つぎｉｌ：　Ｆ　Ｔ　Ａ　／　Ｎ　ｓ中で遠心分離（４００Ｘｇ、５分 間）により２回洗浄され、その後、フルオレラセン処理されＩ；ヤギ抗うット免 疫グロブリン抗体（Ａｏｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　ｈｖｉｓ、　Ｃａｌ 目ｏｒｎｉａから購入）１．０ｍｌ中に再懸濁された。その細胞をＰＴＡ／Ｎ３ 中でさらに１８１００に希釈した。細胞懸濁液は、振とう機台座上で、４℃にお いて１時間混合された。

最後に、遠心分離によって２回細胞を洗浄し、Ｐ　Ｔ　Ａ　／　Ｎ　３中に１ｍ Ａｍ胸中細胞１０７個の濃度になるよう再懸濁した。ＬｅｉｔｚＬａｂｏｒｌｕ χ１２顕微鏡の下で、それらの細胞の蛍光染色の有無を検査しｊ二。

さて、第５表について述べるならば、これはわれわれの検定の結果を示したもの である。

第５表 抗体処理 本　１ｇ−免疫グロブリン 毒本　蛍光： ０：蛍光なし ＋１：きわめて微弱な蛍光性 ＋２：中程度に蛍光性 ＋３：強度に蛍光性 ＋４：きわめて強い蛍光性 ラット抗Ｌｙｔ−１モノクローナル抗体にさらされ、かつ、マウス抗イデイオタ イプ性血清と混合された胸腺細胞上には蛍光が総められなかっｔ；。マウス抗ラ ット免疫グロブリンと混合されたラット抗Ｌｙｔ−ｉにさらされた陽性対照細胞 は明るく蛍光を発した。陰性対照群には非特異的蛍光は検出されなかった。

このように、われわれの得た結果は、抗イデイオタイプ性抗体がラット抗体のＬ ｙｔ−ｉとの結合を禁止する能力を持つものであることを示している。これらの 結果は、受容体特異性抗体での免疫化が、免疫原の受容体特異性結合能力を機能 的に中和する抗イデイオタイプ抗体反応を誘発し得るものであることを立証して いる。

実施例３ この実施例においてはこの発明の方法を黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲ Ｈ）に対する抗体反応を引き起し得るワクチンを生産するのに使えるようにする ための手段を示す。

まずマウスをＬＨＲＨに対する受容体に対して免疫化する。生成する抗ＬＨＲＨ 受容体抗体反応が、ＬＨＲＨ受容体によって表現されるＬＨＲＨ結合部位に関し て特異的な抗体を含むものであることを明らかにしＩ；のち、ホルモン（ＬＸ（ ＲＨ）の模擬前であり、したがって受容体の結合部位と結合するモノクローナル 抗体を発生させるために細胞融合が行なわれる。これらのモノクローナル抗体は 、受容体上のＬＨＲＨとの結合部位と相互作用する能力によって識別される。つ ぎに、ＬＨＲＨと結合する抗体を放出する能力を評価する！こめ、モノクローナ ル抗体が第２の選別過程に付される。この段階は、ＬＨＲＨワクチンとして用い ることのできる受容体特異性モノクローナル抗体を識別する。そのような抗体は 、したがってＬＨＲＨに対する受容体に類似し、Ｉ、ｆ−かってホルモンと結合 してこれを中°和する抗体の形成を誘起するための免疫原として用いられる。

Ｉ−ＬＨＲＨ受容体によるマウスの免疫化ＬＨＲＨ受容体によってマウスを免疫 化するのには、まずＬＨＲＨに対する受容体結合部位を含む免疫原を調製する。

これにはいくつかのやり方がある。１つの方法はＬＨＲＨに対する機能的受容体 を表現する細胞を含み、したがって免疫原を得るための源として役立ち得る下垂 体組織および性腺組織を利用することである。

この実施例においては、下垂体ＬＨＲＨ受容体が免疫原として用いられている。

しかし、卵巣受容体もまた用いることができる。

下垂体と性腺とのＬＨＲＨ受容体の間には、そのＬＨＲＨとの結合部位に関して 僅かながら相違があるかもしれない。特定の応用の場合においては、これらの源 のそれぞれから得られる受容体に関して特異的な抗体を含む２価ワクチンを組立 てることが好ましいかもしれない。そのような２価ワクチンは、ＬＨＲＨに対す る抗体の特異性に関して、より不均質な免疫反応を誘起することであろう。そこ でこの発明の方法は、異種の受容体に関しても特異的な抗体を含む多価ワクチン を構成するのに用い得ることにもなる。２種以上のをの受容体と結合する病原体 の場合には、病原体によって標的とされるそれぞれの受容体に対応する抗受容体 抗体を含有する多価ワクチンが、病原体によって表現される異種配位子のそれぞ れに対する免疫を誘起することになり、それによってワクチンの保護価値が高揚 される。

この実施例において免疫原としての使用に供されるＬＨＲＨ受容体製剤は、純化 されＩ；数種の受容体からなるものである。できるだけ純粋な受容体製剤を入手 することは望ましいことではあるが、必要ではない。たとえば、下垂体細胞の分 散体および／または可溶化された下垂体膜の製剤であってＬＨＲＨ受容体を含有 するものは、いずれも抗ＬＨＲＨ受容体抗体を誘起するために用い得るであろう 。

他方、受容体の配位子との結合部位を純化し、純粋な受容体を免疫原として使用 することは、もつとも望ましいことであろう。

ＬＨＲＨ受容体からＬＨＲＨ結合部位を得る方法はまだ開発されていないけれど も、ＬＨＲＨを符号化するｍ　ＲＮ　Ａに対して補足的なｍＲＮＡヌクレオチド 配列により符号化されｔ；ペプチドが、ＬＨＲＨ受容体のＬＨＲＨ結合部位に類 似しているという仮定もなされてきている。（Ｊｊ、　Ｍｕｌｃｂｓｂｅｙら、 ”Ａ１１ｂｏｄｉｅｓ　ｔ＋＋　ｔｈｅ　Ｂｉｎｄ−ｉＢ　Ｓｉｔ！ｏ！　ｔｈ ｅ　Ｒｅｃｔｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｌｕｔｅｉｎｉｘｉｎ（１Ｉｏｒ＋ａｏｎｅ− Ｒｔｌｅａｓｉｎ（Ｈｏｒｍｏｎｅ　（ＬＨＲＩＩ）　ｍＲＮＡ”　Ｆｒｅｅ、 ’　Ｎａｔｌ−Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、、　［ＩＳＡ、　＄３．　ｐｐ。

９７目−９７１８，１９８６を見られたい。）したがって、相補的ペプチドは、 分離されたＬＨＲＨ受容体部位として役立てることができ；免疫原担′体と組合 されＩ；ときに抗ＬＨＲＨ受容体抗体を誘起するために用いられる。寅際、相補 ペプチド的方法が他の配位子−受容体相互作用にもあてはまるとすれば、相補ペ プチド的方法は、この発明の方法によって抗受容体抗体を生産するための手段と して広範に適用できるであろう。

Ｅ、Ｈａｚｕ＋ａら、　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｒｏｄ　Ｃｂａｒｘｃｔｅｒｉ ｘｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ムｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏ　Ｇｏｎａｄｔｒｏｐｉｎ−Ｒ ｅｌＣａｓｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”、　Ｊ、　ａｌ　Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｓｍｉｓｔｒｙ、　２６２．　ｐｐ、５３］−５３１，１ ９８６に記載されｔ；方法に従って、ウシ下垂体からの精製を行な）ことにより 、ＬＨＲＨ受容体を得ｔ；。

これらの方法は、均質化とその後の分画遠心分離とによって、ウシ下垂体膜の製 剤を与えるものである。膜製剤は、つぎに界面活性剤を用いて可溶化し、さらに 超遠心分離にかけ、最後にアビディン−アガロースに固定された［ビオチニル− 〇−Ｌｙｓ’］　ＬＨＲＨを装入した親和クロマトグラフィカラムを通過させた 。ＬＨＲＨ受容体は生理食塩水を用いてカラムから溶離され、生理食塩水に対し て透析され、限外濾過によって濃縮され、最後に検定を行ってその濃度を決定し た。

精製されたＬＨＲＨ受容体は、つぎｌ＝、Ｅ、　Ｈａｚｕｍら、”Ｓａｌｕｂｉ −１ｉｚｇｌｉｏｎ　ｓａｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｉｊ　Ｐｉ ｌｕ口ａｒｙ　Ｇｏｏａｄｏｊｒｏｐｉｎ−Ｒｅｌｔａｓｉｎｘ　Ｈｏｒｍｏｎ ｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”、　Ｊ、−リ１−ム士＋ｇｉｅａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ。

ｐ↓、　ｐｐ、１３０４３−１３０４８．１９８６に概略が記載された方法によ り、そのＬＨＲＨ結合能力が保持されていることが示される。この方法では放射 能標識されたブセレリン（ＬＨＲＨの作用物質）をＬＨＲＨ受容体製剤の試料と 混合する。結合されないブセレリンは活性炭を添加して吸収させる。活性炭を除 いたあと、受容体結合放射能標識ブセレリンは、適当な検出器で上澄液の計数を 行なうことによって定量される。結合の特異性は、標識されていないＬ　ＨＲＨ とのブセレリンの結合を禁止することによって確かめられる。ＬＨＲＨを特異的 に結合する能力を保持している受容体製剤のみが免疫原としての使用に適してい る。

つぎに１２週生のメスＣＡ　Ｆ　、マウスを、精製されｔ；受容体製剤を用いて 免疫化する。尾部静脈からの採血によって免疫化前６（正常な）血清を得たのち 、フロイントの完全補助剤（Ｆ　ＣＡ）中で乳化（１：ｌ）され！；精製ＬＨＲ Ｈ受容体の５−２５１１９を全容積０．２ｍｆｔとして、それぞれのでウスに腹 腔内接種する。マウスは、つぎに生理食塩水０　、２　ｍｌと生理食塩水でｌ　 ：　５０００に希釈されたエピネフリン０　、１　ｍ（ｔの混合液に加えられた の精製ＬＨＲＨ受容体５−２５１１ｇを３適間隔で腹腔内注射することｊ二よっ て強化される。各回の注射の２週間後に、尾部静脈から採血して血清の試料を得 た。

■、血清抗ＬＨＲＨ受容体抗体の検定 マウスが、受容体上のＬ　ＨＲＨ結合部位に関して特異的な抗体を生産しつつあ るかどうかを確認するために、酵素結合免疫吸着剤検定法（”ＥＬＩＳＡ”）を 実施する。この検定においては、抗体は（放射免疫検定法において用いらねる放 射能標識の代りに）共有結合的に結合された酵素によって標識される。抗体に結 合された酵素は、無色の基質と反応して有色の生成物を与え得るものである。一 定の期間内に放出される生成物の量は、酵素の濃度に依存し、そのことはまた、 存在する抗体の量の尺度ともなる。分光光度測定装置では光学濃度（０，Ｄ、） を読み取るが、これは結合された抗体の量と関係する。

検定法は、次のように確定される。

この検定における標的抗原は、好ましくは、Ｅ、　Ｈｓｚａｍｉ：：より、”５ ｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒａ ｔ　ＰｉＬｎｉｔｔｒｙ　Ｇｏｎａｄｉｒｏ−ｐｉｎ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｉ ｌｏｒｍｏｏｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”、　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

υユ、　ｐｐ、１３０４３−１３ＱｊＪ　１９８６に記載されたようにして調製 されたラット下垂体ＬＨＲＨ受容体からなるものである。それほど好ましいとは 言えないが、標的抗原は、ウシＬＨＲＨ受容体に関して上記されたのと同様にし て精製された、ブタ下垂体ＬＨＲＨ受容体からなるものであってもよい。ＥＬ　 Ｉ　ＳＡを実施するのには、Ｉ　ｍｍｕｌｏａＩＩＵプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ ｈ製）のっぽ穴に、ＬＨＲＨ受容体の塗抹用グリシン緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ− ９，ｓ）中２■／１の溶液２５ｎ（ｔを塗抹し、その塗抹されたつぼ大を、４℃ において〜夜保持する。つぼ穴は、０．０５％のＴｖｅｅｎ−２０と０．０２％ のＮａＮ３を添加した生理食塩水を洗浄液として４回すすぎ洗いする。つぎに１ 武技体（ＬＨＲＨ受容体免疫原で免疫化されたマウスから得た抗Ｌ　ＨＲＨ受容 体血清を１０−１からｌＯ″−で１０倍ずつ数階的に希釈しＩ−もの、または、 モノクローナル抗ＬＨＲＨ受容体抗体を試験するときには、細胞培養基の上澄液 ）の２５ｕＱをつぼ大ごとに加え、１時間２２℃に保温する。抗血清の希釈はす べて、０．０５％のＴｖｔｅｎ　−２０および０．０２％ＮａＮ３を加えたＰＴ Ａ赤血球凝集用緩衝液からなる希釈用緩衝液中で行われる。

抗体の特異性を立証するためには、１武技体の添加の前に、希釈用緩衝液に加え ｆ：、　Ｌ　ＨＲＨ（通常１　、０１１１９／　Ｉ’ｌｌ）　２５　ａ４を最初 に各つぼ穴に加えることによって結合を禁止しなければならない。これらのっぽ 穴から得られるＥＬＩＳＡ　Ｏ，Ｄ、値は、希釈用緩衝液だけの２５ｕＱを加え たつぼ穴から得られる０、Ｄ、値と比較される。その後再びつぼ穴をすすぎ洗い する。そのつぎには、ビオチン化されたウサギ抗マウスＩｇ（希釈用緩衝液中で １　：　１０００に希釈されｔ；もの）からなる第２武技体２５ｕ！をつぼ穴ご とに加え、１時間２２°Ｃに保温する。つぼ穴を再びすすぎ洗いし、その後、ア ビディン−アルカリ性すン酸塩複自物（１：　１０００）２５ｄをつぼ穴ごとに 加えて、１時間２２°Ｃに保温する。再びつぼ穴をすすぎ洗いし、さらに各つぼ 穴に対し、ｌａｇ／ｍＱのｐ−ニトロフェニルリン酸（１０％ジェタノールアミ ン中、０．５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２，０，０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｍ、ｐＸ（＝９．８ ）２５＋＋Ａを添加し、５−３０分間発色させる。Ｄｙ＋＋ｘｔｅｃｈ檀ｃｒｏ ｅｌｉｓａ読取器を用いて光学濃度を測定する。他のたん白質抗原、たとえば鶏 卵リゾソーム、ウシ血清アルノミン、およびウシ黄体形成ホルモンを、抗体特異 性についての陰性対照としてプレートに塗抹し、上記と同様の方法で解析する。

もしＬＨＲＨが最仲にＬＨＲＨ受容体と結合し、したがって受容体のＬ　ＨＲＨ 結合部位を占有するよりになると、ＬＨＲＨ結合部位に関して特異的な抗体がそ の次に結合することができなくなる。このようにＬＨＲＨに依存して阻止が起こ ることは、結合部位特異性の抗体の存在を指示するものである。こうして、希望 する抗体を生産するマウスを確認することがＥＬ　Ｉ　ＳＡによって可能となる 。

■、杭受容体モノクローナル抗体の生成ＬＨＲＨ受容体のＬＨＲＨ結合部位に関 して特異的な抗体を生産しｔ；ことがＥＬ　Ｉ　ＳＡによって示されたマウスは 、つぎに、抗ＬＨＲＨ受容体モノクローナル抗体を生成するように考案された細 胞融合において、牌臓細胞提供者として利用される。マウスは、０．２社の生理 食塩水とエピネフリン（生理食塩水中で１　：　５０００に希釈されｔ；もの、 ０　、１　ｖａｆｌ）に含ませた５−２５１１９の精製ウシ下垂体ＬＨＲＨ受容 体の腹腔内注射によって強化される。３日後に、Ｃｅ１ｌｕｌｉｒ　Ｉｍｍｎｎ ｏｌＢｙ、　Ｗ、Ｈ，ＦｒｅＣｍｓ＋＋　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ ｃｉｓｅ。

（１９８０）］に従って細胞融合が行なわれる。培養培地は、１０％ウシ胎仔血 清および５０Ｉ＋９／ｆｆｌαのゲンタマイシンで補力されたＲＰＭｌｌ　６４ ０　（Ｇｉｂｅｏ　ＬｘｂｏｒａｔｏｒｉＣｓ）からなるものである。ＬＨＲＨ 受容体で免疫化されたマウスから得た牌臓細胞を、ポリエチレングリフールを用 いてＰ３腫瘍細胞と融合することにより、モノクローナル抗ＬＨＲＨ受容体抗体 を生産するハイブリドーマを創出する。ノ１イボキサンチン−アミノプテリン− チミジンで補力された培地上に供給し、さらに特定の抗体を先に定義されたＥＬ ＩＳＡの方式を用いて選別することによって、雑種体を選択する。クローニング の効率が１００％に達したときに、細胞系列が確立したものと考える。

確立された細胞系列の試料は、液体窒素中で凍結保存する。

上記Ｍｉｓｈｅｌｌの方法に従い、マウス腹腔内の腹水腫として作業量のモノク ローナル抗体を生成させ、腹水を集める。ＣＡＦ、マウスに対し、０．５ｒｎＱ のプリスタンを腹腔内注射する。３日後に０．５倍生理食塩水中に懸濁した雑種 細胞２Ｘ１０’個をマウスに対して腹腔内注射する。マウスの腹腔から腹水を集 めｔ；のち、その液を遠心分離（４００Ｘｇ、１０分間）にかけて細胞を除く。

つぎに、下記のようにして、マウス中で抗ＬＨＲＨ抗体を放出する受容体特異性 のモノクローナル抗体の能力を評価する。

受容体特異性のモノクローナルを、スカシガイ血清素（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と組合わせ ることにより、マウスに対して免疫原性とする。どのことにより、モノクローナ ルに対する抗体反応を発生させるために、さまざまな種を用いる必要がなくなる 。

血リンパの硫酸アンモニウム沈殿物として購入されたＫＬＨにつき、その沈殿懸 濁物を０．５ＭＮａＣ１に対して透析し、ついで５６ｐｂａｃｒｙｌ　４００の カラム（５０Ｘ１．５ｃｍ、１５社／時、ＬＭＮａＣＩ）でゲル濾過することに よってＫＬＨを分離する。ＫＬＨ含有分画物を集め、標準の分光光度測定技術を 用い、Ｇｉｌ（ｏｒｄＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　２６０　（Ａｚａ ｏ測定）でたん白質濃度を決定する。ついでその合体された材料を、Ａｍ１ｅｏ ｎｆＥ縮器にかけて５．Ｏｒａｇ／ｍＱに濃縮する。

モノクローナル抗体を精製するため、各腹水試料を硫酸アンモニウム（４０％） で沈殿させ、沈殿物を４°Ｃで生理食塩水に対して透析し、ついで分光光度測定 によりたん白質濃度を決定する。複合体を調製するｔ：　メ＋：：、凍結乾燥し ｔ；抗体各１０．０ｍｇを、ＫＬＨ５，０１＋９を含有する０、５Ｍ　ＮａＣＩ 　２．５ｍＱ中に溶解する。混合物を遠心分離（２０００Ｘ　ｇで１０分間）に かけて少量の不純物を除去した後、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ ピル）カルボジイミド塩酸塩５０１１Ｉｇを、かきまぜながら各混合物に添加す る。室温で１６時間反応を進行させ、ついで、混合物を４℃で０．５ＭＮａＣ１ に対して透析する。透析された混合物は一２０℃で凍結して貯蔵され、使用の直 前に融解される。

７０インドの完全補助剤Ｈ３７Ｒｓ　（Ｄｉｆｃｏ）中で１＝１に乳化したｌｏ Ｏａｇの抗受容体モノクローナルーＫＬＨ複合物１００ｍｇでマウスを免疫化す る。それぞれのマウスに、単一種のモノクローナル抗受容体抗体を含有する複合 物を注射する。これを行なうのには、各マウスに対し、エマルジョン０　、１　 ｍＱを腹腔内に注射する。動物は、２１日の間隔で３回、ミョウバン中で処理さ れた抗原各１０゜ｕ９の追加層腔内注射を受ける。第４回の注射の１４日後に、 尾部静脈からの採血により、血清試料を得る。

抗ＬＨＲＨ反応を誘起するモノクローナル抗体を確認するため、つぎに、免疫前 および免疫後の血清を、ＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、ＬＨＲＨに対する抗体の有無を 検定する。ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、標的抗原としてジ７テリャ毒素（Ｄ　Ｔ）で複合 化したＬＨＲＨを用いる点を除いては、ＬＨＲＨ受容体に関して記載されたとこ ろと同一である。

抗原を調製するのには、４ｍｌの生理食塩水に加えられた１５．０ＩＩＩｇのジ ７テリャ毒素（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して３． ０ｍｇの［ｇｌｎ’］　−ＬＨＲＨ（Ｖｅ（ｘ　Ｂｉｏｃｈ！ｍ１ｃａｌｓ）を 添加する。０．ＩＭＮａＯＨを用いてｐ）（を７．５に調節する。つぎに、ＰＨ を７．５に保持したまま、１９．２１＋＋９の１−エチル−３−（３−ジメチル アミノプロピル）−力ルポジイミド（Ｐｉｅｒｃｓ　Ｃｈａｍｉｅｘｌ）を添加 する。

混合物を室温で８時間かきまぜ、ついで４℃において生理食塩水に対して透析す る。ＬＨＲＨ−ＤＴ複合物は一２０℃で貯蔵する。

免疫化されたマウスのそれぞれから得た血清の段階的希釈液を、Ｍｉｃｒａｔｌ ｉｓｉプレートのっぽ穴に塗抹したＬＨＲＨ−ＤＴと反応させる。各試料は遊離 のＬＨＲＨの存在下および不存在下の両方で反応させる。ＬＨＲＨ特異性の抗体 を含有する血清は、抗体結合の遊離Ｌ　ＨＲＨによる特異的な阻止によって識別 可能である。このことは、免疫原としてＬＨＲＨ特異性の抗体を放出するために 用いられたモノクローナル抗ＬＨＲＨ受容体抗体の識別を考慮に入れたものだと いうことにもなる。この効果を媒介する抗受容体抗体は、したがって、ＬＨＲＨ に対する抗体反応を引き起すように設定されたワクチン中に取り入れられてもよ い。

この発明のいくつかの実施態様を以上に示したが、基本的構成は、この発明の過 程および組成物を利用する他の実施態様を提供するｔ；めに変更を加えてもよい ことは明らかである。それ故に、この発明の範囲が、実施例としてこれより前に 示された特定の実施態様によるのではなく、ここに付属の請求の範囲によって定 義されるべきであるということが認識できるであろう。

国際調査報告 １ｍ＋＋Ｔ〜ｗＭｌ　ａｐｓｔｇ“＋１””　ＰＣＴ／１ｌｓ８７１０１７６８

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．関与する作用物質の結合に関して特異的な細胞受容体分子に対する抗体を放 出する段階および該作用物質の受容体特異性結合部位の免疫化学的な模擬態であ る抗体を選択する段階を包含する、免疫原組成物の作成方法。
2. ２．作用物質が病原体である、請求の範囲第１項の方法。
3. ３．作用物質がホルモンである、請求の範囲第１項の方法。
4. ４．作用物質が酵素である、請求の範囲第１項の方法。
5. ５．作用物質が毒素である、請求の範囲第１項の方法。
6. ６．該作用物質の受容体特異性結合部位の免疫化学的な模擬態である抗体がモノ クローナル抗体である、請求の範囲第１項の方法。
7. ７．免疫原組成物が多価である、請求の範囲第１項の方法。
8. ８．作用物質の受容体特異性結合部位に対する抗体を放出する能力を有し、作用 物質の受容体特異性結合部位の内部写像を包含する免疫原組成物。
9. ９．作用物質が病原体である、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
10. １０．作用物質がホルモンである、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
11. １１．作用物質が酵素である、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
12. １２．作用物質が毒素である、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
13. １３．モノクローナル抗体を包含する、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
14. １４．多価であり、かつ、２以上の作用物質の受容体特異性結合部位の内部写像 を包含する、請求の範囲第８項の免疫原組成物。
15. １５．作用物質の受容体結合部位に免疫化学的に類似する抗体を包含し、該抗体 が、作用物質の細胞受容体部位との結合を阻止する抗体の形成を誘発する能力を 有するものである、免疫原組成物を投与することからなる、免疫化の方法。