JPH01503675A - 中空ウイルスキヤプシドのワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３４、不ズミ３Ｔ３細胞、不ズミＣ１２７細胞またはイヌＡ７２細胞である、請 求の範囲第３３項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３５、ｐＡｂＴ２４１、ｐＡｂＴ２４３およびｐＡｂＴ２４５から成る群より選 択されるプラスミドでトランスフェクションされた真核生物の細胞。

３６、ネズミ３Ｔ３細胞、不ズミＣ１２７細胞またはイヌＡ７２細胞である、請 求の範囲第３５項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３７、遺伝子工学の技術によって産生された中空ウィルスキャプシドの、体液中 の抗ウイルス抗体の検出または定量のための使用。

３８、工程： ａ）ウィルスの中空ウィルスキャプシドが結合した固相からなる免疫吸着剤を、 試験すべき生物学的流体の試料と、前記試料中の抗ウイルス抗体が前記免疫吸着 剤に結合できる条件下に、インキュベーションし、ｂ）前記免疫吸着剤を前記試 料から分離し、そしてＣ）前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを 、前記試料中の抗ウイルス抗体の指示として決定する、からなる、生物学的流体 中のウィルスに対する抗体を検出する方法。

３９、前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを決定する工程は、生 物学的流体を誘導する種の抗体に対する標識した抗体とともに、前記免疫吸着剤 をインキュベーションし：インキュベーション期間後、前記標識した抗体から前 記免疫吸着剤を分離し；そして前記免疫吸着剤に関連する標識を検出することか らなる、請求の範囲第３７項記載の方法。

４０、宿主の動物または細胞を免疫原性の中空ウィルスキャプシドで免疫化する ことによって産生された抗ウイルス抗体。

４１、前記中空ウィルスキャプシドはイヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシおよびヒ トのパルヴオウィルスから成る群より選択される、請求の範囲第４０項記載の抗 ウイルス抗体。

４２、生物学的流体中の抗ウイルス抗体を検出するだめの請求の範囲第４０項記 載の抗体の使用。

４３、ウィルスの抗原的に関連する種に対して交差保護的免疫性を提供する免疫 原性の中空ウィルスキャプシド。

４４、パルヴオウイルスキャプシドである請求の範囲第４３項記載のキャプシド 。

明細書 中空ウィルスキャプシドのワクチン １章 イヌのパルヴオウイルス、ミンクの腸炎ウィルス、ネコの汎白血球減少症のウィ ルス、および他のブタ、ウシ、薩歯類、およびヒトのバルヴオウイルスを包含す る、自律的に複製するパルヴオウイルスは、最小の既知のＤＮＡウィルスの中に 入る。感染性ヴイリオンは、球形の、エンヴエロープをもたない、直径２０　２ ５ｎｍの粒子であり、３種の構造ポリペプチド、ＶＰＩ、ＶＰ２’およびＶＦ６ を含有し、重複するアミノ酸配列を有する。これらのウィルスのゲノムは、１． ３５−１．７０Ｘ１０′の分子量をもつ一本鎖の線状ＤＮＡ分子（はぼ５０００ ヌクレオチドの長さ）から主として成る。このＤＮＡは、ゲノムの３′　（左側 ）の部分における非キャプシド部分（ＮＣＶＰ　１）　、ならびにゲノムの５′ （右側）の部分におけるウィルスのＤＮＡの重複する領域によってエンコードさ れる、主要なキャプシドタンパク質をエンコードする。

イヌのパルヴオウイルス（ｃ　ｐ　ｖ）は、最初に、１９７８年にイヌにおける １系列の病気の症候群の原因である、病因学的因子として認識された。１９７８ 年以前において、その時より前のウィルスの存在を示す血清学的証拠は存在しな い。その時付近において、単一の源からＣＰＶは発生すると信じれていた。この ウィルスは急速に流行的比率に広がった。ＣＰＶは、ネコの汎白血球減少症（Ｆ ＰＶ）、ミンクの腸炎ウィルス（ＭＥＶ）および動物における病気を引き起こす 他のパルヴオウイルスに、遺伝学的かつ抗原的に関係付けられる。ＣＰＶはこれ らのウィルスの１つ、最もありうることにはＦＰＶ、の宿主範囲の変異型である と信じられる。なぜなら、ＦＰＶの変性生ワクチンは過去において使用されかつ 現在広く使用されているからである。

現在使用されているパルヴオウイルスのワクチンには２つのタイプが存在する： 変性生ワクチンおよび殺した全ウィルスワクチン。これらのワクチン調製物は有 効であるが、いくつかの欠点を有する。変性生ワクチンは、ビルレントな形態の 復帰する潜在性を有する。さらに、これらの生ウイルスワクチンを連続的に使用 すると、ウィルスは突然変異して広い宿主範囲を発生させるという危険をもたら す。さらに、変性生ウイルスワクチンの保護を誘導する能力は、母の抗体によっ て阻害されることがあり、前記母の抗体は、病気に対して最大の感受性をもつ、 新しく生まれた動物における変性されたウィルスの複製をしばしば防止する。

殺したウィルスワクチンは、ビルレントな形態に復帰せず、そして母の抗体の存 在下に免疫性を刺激することができる。しかしながら、殺したウィルスの調製物 は、一般に、生ウイルス調製物よりも、免疫原性に劣り、そして低い抗体力価を 引き出す。この１つの理由は、ウィルスを不活性化する手順がウィルスタンパク 質を変性させることにある。さらに、殺したウィルスはワクチン接種した動物に おいて複製しない。この免疫原性の欠如を補うために、高い投与量の殺したウィ ルスを与えなくては成らない。しかし、高い投与量のタンパク質の投与は、合併 症、例えば、アナフィラキシ−ショックを起こすことがある：さらに、大量の不 活性化ウィルス調製物を製造することは経費を要することがある。

ＣＰＶ、ＦＰＬＶおよびＭＥＶは、遺伝学的および血清学的に、非常に密接に関 連する。自然からのＣＰＶ分離物は、イヌにおいて、およびネコまたはイヌの単 一層細胞培養物中において効率よく複製する。ＦＰＶ分離物はネコにおいて、お よびネコの単一層細胞培養物中において増殖するが、イヌの単一層細胞培養物中 において増殖しない。両者のウィルスは、交互の動物宿主において制限された程 度に複製する。これらのパルヴオウイルスは類似した抗原構造をもつ結果、これ らのウィルスのいずれか１つによるワクチン接種も、種交差保護的免疫性を生成 することがある；こうして、両者の変性生および殺したＦＰＶワクチンはイヌを イヌのパルヴオウイルスに対して保護するために使用されてきており、そして変 性生または殺したＣＰｖワクチンはミンクをミンクの腸炎から保護するために使 用されてきており、そして同様によ＜ＦＰＬＶに対する保護的免疫性を誘発すべ きである。

従来、不ズミのパルヴオウイルスの中空キャプシド、マウスの小さいウィルス（ ＭＶＭ）　、は組み換えＤＮＡ技術によって産生されうろことが、立証された［ ビンチル（Ｐｉｎｔｅｌ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２． ３２０　（１９８４）］　、それらの実験において、両者のウシ乳頭腫ウィルス Ｉ型およびＭＶＭのゲノムを含有する組み換え体プラスミドは、マウスＣ１２７ 細胞、ＭＶＭ感染のための自然の計容性宿主、を形質転換するために使用された 。しかしながら、これらのプラスミドを収容する細胞は、それらの形質転換され た形態によってのみ選択できた。ＢＰＶ誘導プラスミドを収容する細胞のための 選択的マーカーとしてこの形態学的変化の依存性は、これらのプラスミドを使用 するための宿主の範囲を、マウスの細胞系Ｃｌ２７および３Ｔ３を包含する、形 質転換された表現をを表す細胞に限定する。

前の節に記載した実験の目的は、ＭＶＭ遺伝子の発現の研究のための道具として 、ＭＶＭ遺伝子を構成的に発現する、重感染可能な宿主細胞系を発生させること であった。ＭＶＭ／ＢＰＶ形質転換細胞系の分析の過程の間、ウィルスタンパク 質ＶＰＩおよびｖＰ２°は中空ヴイリオン粒子に類似することが認められた。

発明の要約 本発明は、免疫原性の中空ウィルスキャプシド、すなわち、ウィルスの遺伝物質 を含有しない完全なウィルスキャプシド：免疫原性の中空ウィルスキャプシドを 調製する方法；および前記キャプシドを使用するワクチン接種する方法に関する 。本発明は、イヌのパルヴオウイルス（ＣＰＶ）の免疫原性中空キャプシドは遺 伝学的に形質転換した真核生物の細胞によって産生され、そしてそのように産生 されたキャプシドはバルヴオウイルスおよび抗原的に関連するバルヴオウイルス に対して保護的免疫応答を誘発するという発見に基づく。

イヌのパルヴオウイルスの中空キャブノドを産生ずる本発明の方法は、ネコ、ミ ンク、ブタ、ウシ、およびヒトのバルヴオウイルスを包含する、他のタイプのバ ルヴオウイルスの中空キャブンドを産生ずるために使用できる。さらに、これら の技術は、真核生物の宿主中においてセルファセンブリ−することのできる、比 較的簡単なキャプシド構造をを有する、他のクラスのＤＮＡウィルス、例えば、 ポリオウィルスに適用できる。

本発明の方法に従い、免疫原性の中空ウィルスキャプシドは、キャプンドのタン パク質構成成分を発現できる発現ベクターで真核生物の宿主細胞を形質転換する ことによって、前記細胞中で発現される。本質的には、真核生物のプロモーター の制御下に問題のキャプシドタンパク質をエンコードする構造遺伝子、真核生物 の宿主中の複製のための遺伝子要素、および前記ベクターでトランスフェクショ ンした真核生物の細胞の選択を可能とするｌまたは２以上の遺伝子からなる。好 ましい形態において、ベクターは、バクテリア宿主のための複製起源（バクテリ アのクローニング系中におけるベクターの増幅を可能とする）および真核生物の 宿主中のエピソームの複製を提供する遺伝子要素（前記宿主中のキャプシドの発 現の増幅を可能とする）からなる。本発明の発現ベクターで形質転換された真核 生物の細胞は、免疫原性の中空ウィルスキャプシドにセルファセンブリ−するキ ャプシドタンパク質を発現する。

ＣＰＶの中空キャプシドは、次の組み換えＤＮＡ技術によって産生された。ＣＰ Ｖキャプシドタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２’　をエンコードする構造遺伝子を 含をする、ＣＰＶゲノムの領域は、ウィルスＲＦ（複製形Ｑ）ＤＮＡからクロー ニングした。次いで、内因性ＣＰＶ転写プロモーターをもつかあるいはもたない ＤＮＡ断片を、抗体の選択可能なマーカーｎｅｏ−Ｒ（不オマイシンホスホトラ ンスフニラーゼ）、これは真核生物の細胞中の抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性 を与える、を含有するラン乳頭腫ウィルスベクター中の異なる部位に挿入し、そ してこれらのキメラベクターを使用して、マウス３Ｔ３およびＣ１２７細胞およ びＡ７２と表示するイヌ細胞系をトランスフェクションした。前記ベクターを含 有する細胞系は、Ｇ４１８抵抗性によって選択し、そしてｃＰＶタンパク質の発 現についてアッセイした。赤血球を凝集する能力によって、および種々の化学的 および物理学的パラメーターによって決定して、中空キャプシドにセルファセン ブリ−するＶＰＩおよびｖｐ２’　タンパク質を発現する、ある数の真核生物の 細胞系を発生させｌ：。

中空ＣＰＶキャプシドは、１組のモノクローナル抗体で決定して、完全な野生型 ＣＰＶと同一の抗原性エピトープを示した。中空キャプシドをイヌにおいて抗原 潜在性について試験し、そしてそれらはＲＢＣ凝集を阻止できる（赤血球凝集の 阻止）ｃｐｖ特異的抗体を誘発できた。引き統〈イヌにおける対抗実験は、中空 キャプシドがＣＰＶ誘導病気に対してイヌを保護できることを立証した。

中空ウィルスキャプシドに基づくワクチンは、生変性および殺したウィルスワク チンを越えた利点を提供する。中空キャプシドはウィルスの遺伝子物質を欠くの で、ビルレントに復帰する危険は排除される。さらに、中空キャプシドは自然の 形態のタンパク質から構成されており、こうしてキャプシドは殺したウィルスよ りも抗原性であろう。

中空ウィルスキャプシドは、また、診断的に使用できる。例えば、中空ウィルス キャプシドは、試料の体液中における抗ウイルス抗体の検出のだめの抗原として 使用できる。キャプシドは、また、体液試料中のウィルスの存在を検出とき使用 するウィルスに対して抗体をレイズ（ｒａｉｓｅ）するために使用できる。

図面の簡単な説明 第１図は、原核生物のベクターｐＥＭＢＬＩｇ＋中のＣＰＶ　ＤＮＡ配列のクロ ーニングにおいて含まれる工程を示す。

第２図は、挿入されたＣＰＶ　ＤＮＡ配列をもつ組み換え体レトロウィルスのベ クターＤＯＬ　（ｐＡｂＴ２１０）を示す。

第３図は、プラスミドベクター、ｐｄＭＭＴ立見旦１（ｐＡｂＴ２３０）の誘導 を示す。このプラスミドは、すべてが真核生物の宿主中でセル７アセンブリー性 イヌのバルヴオウイルスキャプシドを発現できるＤＮＡベクターである、プラス ミドｐＡｂＴ２４１．ｐＡｂＴ２４３８よびｐＡｂＴ２４５の産生のための前駆 体として働いた。

第４図は、Ｍｌ　ミ１％　エ体ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　ＶプラスミドｐＡｂＴ２４１ の構成を示す。

笑５図は、組み換え体ＣＰＶ／ＢＰＶプラスミドｐＡｂＴ２４３の構成を示す。

第６図は、組み換え体ＣＰＶ／ＢＰＶプラスミドｐＡｂＴ２４５の構中空ウィル スキャプシドの発現するおよび前記キャプシドを含有するワクチン組成物の調製 を、下に詳述する。１つの関係について特に言及し、ここで本発明の好ましい実 施態様は、用途、すなわち、イヌのバルヴオウイルスの中空キャプシドの発現お よびイヌのパルヴオウィルスおよび抗原的に関連するパルヴオウィルスに対する ワクチン接種のためのこのようなキャプシドの使用を見いだす。前述のように、 記載する技術は、ネコ、ミンク、ブタ、ラン、およびヒトのパルヴオウィルスを 包含する、パルヴオウイルスの族の他の構成員の中空キャブンドに適用できる。

そのうえ、これらの技術は両者のＤＮＡおよびＲＮＡウィルスを包含するウィル スに適用でき、これらのウィルスは、ウィルスの核酸および非構造タンパク質を 含有するキャプシドにアセンブリングされる１つまたはわずかの構造タンパク質 を含有する、比較的簡単なヴイリオンによって特徴づけられる。このようなウィ ルスの倒は、タバコモザイク病ウィルス（１つの構造タンパク質）、ポリオウィ ルス（４つの構造タンパク質）、レオウィルス（３つの構造タンパク質）８よび パルヴオウィルス（２〜３つの構造タンパク質）を包含し、ここに記載する組み 換えＤＮＡ技術を使用して、適当な宿主細胞中で真核生物または原核生物の発現 ベクターから成る、適当に設計された発現系においてウィルスの構造タンパク質 のすべてを発現することが可能であろう。イヌのパルヴオウイルスの場合におけ るように、宿主細胞系の遺伝子形質転換によって発現されたウィルスの構造タン パク質は、ウィルスの核酸および非構造タンパク質を欠く中空キャプシドの粒子 に自発的にアセンブリングできる。これらの非感染性粒子は、真性ヴイリオンに 密接に類似することがあり、次いで、それらを誘導した感染性ウィルスと同一ま たはそれに類似する、免疫原の応答を刺激するであろう。このような中空キャプ シドは、抗ウイルスワクチンの配合において有用であろう；それらは、また、診 断試薬の開発のための基準として使用できるであろう。

中空キャプンドの産生方法を、５つの別の節において説明する。第１節において 、セルファセンブリ−性形態のウィルスキャプシドタンパク質をエンコードする 遺伝子を得るための方法を言及する。第２節は、中空キャプシドの発現のための 発現ベクターの構成を取り扱う。第３節において、キャブノドの発現のために適 当な真核生物の宿主および発現ベクターで前記細胞を形質転換する手順を説明す る。第４節において、キャブンドを含有するワクチン組成物の調製およびワクチ ン接種のだめのこれらの組成物の使用を論する。第５節は、中空ウィルスキャプ シドの診断的使用に向ける。

ｌ、ウィルスキャプシドのタンパク質をエンコードする遺伝子の調製セルファセ ンブリ−性形態のイヌのパルヴオウィルスをエンコードする遺伝子は、中空キャ プシドを調製するウィルスのゲノムＤＮＡがら得ることができる。ウィルスＤＮ Ａは、所望のウィルスからウィルスＤＮＡを分離する標準の技術によって分離す ることができる。例えば、ＣＰＶ　ＤＮＡの分離のためにとくに好ましい技術は 、マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　ｌｏ ｇｙ）、３８．３１７（１９８１）に記載されており、その技術を引用によって ここに加える。

セルファセンブリ−性形態のキャプシドをエンコードするウィルス遺伝子は、分 離したゲノムまたはサブゲノムのＤＮＡを、所望の遺伝子を含有する断片に切断 することによって得ることができる。この目的は、究極的な真核生物の形質転換 体内でキャプシドにセルファセンブリ−する形態のキャプシドタンパク質をエン コードする、１まＩ；は２以上の遺伝子を含有するゲノムの１または２以上の断 片を得ることである。一般に、断片は、細胞内のセルファセンブリ−に必要なキ ャプシド構成成分の各々をエンコードする構造遺伝子全体を含有するであろう。

さらに、発現ベクターの設計に依存して（下に詳述する）、ウィルスのゲノムＤ ＮＡの断片は、キャプシドタンパク質をエンコードする遺伝子のためのウィルス の転写プロモーターを含むようにつくることができる。

ウィルスのゲノムのＤＮＡ断片は、制限エンドヌクレアーゼを使用する酵素的切 断によって得ることができる。ウィルスのゲノムＤＮＡの制限酵素地図が利用で きる場合、適当な酵素を選択して、前託地図を参照することによってキャプシド を含有する所望の断片を生成することができる。他の場合において、消化の適当 な酵素および条件は実験的に決定できる。

例えば、ＣＰＶＤＮＡの切断のための好ましい制限エンドヌクレアーゼはＨａｅ 　Ｉ　Ｉ　１である。この制限エンドヌクレアーゼによるＣＰＶＤＮＡの部分的 消化は、ＣＰＶ　ＤＮＡのいくつかの断片を生成し、これらの少なくとも１つは これらの遺伝子のための内因性ＣＰＶプロモーターをもつＶＰＩおよびＶＰ２’ 遺伝子を含有する。他の制限エンドヌクレアーゼを使用して、ＣＰＶプロモータ ーをもつかあるいはもたない、セルファセンブリ−性ＣＰＶキャプシドタンパク 質をエンコードする遺伝子を含有する、適当なＣＰＶ　ＤＮＡ断片を得ることが できる。

キャプシドタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、断片をバクテリア宿主中 にクローニングすることによって増幅することができる。この目的で、種々のク ローニングベクターを使用することができる。例はｐＢＲ３２２およびｐＥＭＢ Ｌである。

次いで、キャプシドタンパク質をエンコードする遺伝子を使用して、次の節に記 載する方法に従い、ウィルスキャプシドのための発現ベクターを構成することが できる。

ＣＰＶキャプンドタンパク質ＶＰＩおよびＶＰ２″をエンコードする遺伝子を得 るために使用する特定の手順は、第１図に描かれている。ＣＰＶ　ＤＮＡを制限 エンドヌクレアーゼＨａｅｌｌＩで部分的に消化する。

部分的消化によって生成した断片を、プラスミドｐＥＭＢＬ１８＋、Ｅ。

ｃｏｌｉクローニングベクター、中にこのプラスミドの単一のＳｍａ　ｒ部位に 挿入した。Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を組み換え体プラスミドによって形質転換し、そし て形質転換した細胞を交雑技術によって所望のＣＰＶＤＮＡ断片を含有するプラ スミドの存在について選択した。ｐＡｂＴ２００およびｐＡｂＴ２０１と表示す る２つの組み換え体を選択した。ｐＡｂＴ２００は、ＣＰＶゲノムのほぼ６４％ を含有し、ＶＰＩおよびＶＰ２’遺伝子のだめの構造遺伝子をそれらの転写プロ モーターと一緒に含有する。ｐＡｂＴ２０１は、ＣＰＶゲノムのほぼ９５％を含 有し、ＶＰｉおよびＶＰ２’のだめの構造遺伝子およびそれらの内因性プロモー ターを含む。

第２図に概略的に描かれているように、ｐＡｂＴ２００によって収容される断片 をＤＯＬベクター中にクローニングして、それらの内因性プロモーターが存在し ないＶＰＩおよびＶＰ２°を含有し、モしてＢａｎＨ１制限部位によって両端が フランキングした（ｆ　１ａｎｋｅｄ）ＣＰＶ断片を生成した。得られるプラス ミドｐＡｂＴ２１０は、このＣＰＶ断片の便利な源として役立ち、その７ランキ ングＢａｍＨｒ制限部位のおかげで、容易に切除しかつ適合する制限部位中にク ローニングすることができるであろう。独特Ｂａｍ８１部位を収容するＤＯＬ以 外のプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２またはｐＥＭＢＬｌａ＋は、この形態の 、すなわち、７ランキングＢａｍＨＩ末端をもつ、ＣＰＶ断片を得るために使用 できたであろう。

２、中空ウィルスキャプシドの発現のための発現ベクターの構成キャプシドタン パク質をエンコードする遺伝子の複製および発現を可能とする発現ベクターは、 真核生物の宿主中で複製することができかつベクターで形質転換されＩ；宿主細 胞の選択を可能とする選択可能なマーカーを有する真核生物の宿主中において、 複製することができるベクター中で、真核生物のプロモーターと一緒にキャプシ ド遺伝子をアセンブリングすることによって構成することができる。こうして、 一般に、キャプシドの発現のためのキメラ発現ベクターは、内因性または外因性 の真核生物のプロモーターの指令下に問題のキャプシド遺伝子、真核生物の宿主 中の複製のために必要な遺伝子材料および宿主細胞に選択可能な表現型を与える １または２以上の遺伝子を含有するであろう。

バクテリア宿主中で複製することができ、ならびに真核生物の宿主中で複製およ び機能することができる発現ベクターを構成することは、とくに有利である。こ のような二重の能力をもって、キメラ発現ベクターは、便利なバクテリアクロー ニング系において増幅して、真核生物の宿主のトランスフェクションのために十 分な量の発現ベクターを構成することができる。したがって、真核生物の宿主細 胞中の免疫原性の中空ウィルスキャブンドの発現のための好ましい発現ベクター は、次の要素を含有するであろう： ａ、　複製の原核生物誘導起源（これはバクテリア宿主細胞中のベクターの複製 を可能とする）； ｂ、　真核生物の宿主中の複製を可能とする真核生物の遺伝子要素；Ｃ１真核生 物のプロモーター（これは真核生物の宿主細胞中のキャブ・／トタンバク質をエ ンコードする遺伝子の発現を指令する）；および ｄ、　キャブンドタンパク質をエンコードする遺伝子（真核生物のプロモーター の指令下に）。

複製のバクテリアの起源は、バクテリアのプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、 ｐＵｃ、ｐＥＭＢＬ型のプラスミドまたは他の原核生物の起源から得ることがで きる。複製のｌ；めの真核生物の要素は、誘導されたＢＰＶ、ＳＶ４０または他 の源であることができる。真核生物のプロモーターは、不ズミのメタロチオンニ ンのプロモーター、ＳＶ４０の早期のプロモーター、熱衝撃遺伝子プロモーター または他の外因性真核生物プロモーターであるか、あるいは、論するように、キ ャプシドをエンコードする遺伝子のための内因性ウィルスのプロモーターである ことができる。

前述のように、発現ベクターは前記ベクターで形質転換した真核生物宿主細胞の 選択のためのマーカーを含むべきである。さらに、ベクターは原核生物の形質転 換体の選択のためのマーカーを含有すべきである。

原核生物細胞中の選択のために、伝統的マーカー、例えば、抗生物質抵抗性を与 える遺伝子を、これの遺伝子のために必要な調節要素と一緒にベクター中に組み 込むことができる。これらは、アンピシリン、カナマイシンまたはテトラサイク リンの抵抗性を包含する。

真核生物中の選択のため、いくつかの異なるタイプのマーカーを使用することが できる。１つのこのようなマーカーは、ウシ乳頭腫ウィルスのゲノムまたは少な くとも形質転換性部分である。ＢＰＶのゲノムは、ＢＰＶ　ＤＮＡの形質転換性 質のおかげで、トランスフェクションした不ズミ細胞の選択を可能とする。ＢＰ Ｖ　ＤＮＡをそれらの核中に取り込んだ細胞は、形質転換されるようになること ができる。形質転換しｔ；表現型の特徴は、接触の阻止を失っており、これは複 製する細胞の中心としてこれらの形質転換された細胞の同定を可能とする。次い で、これらの中心を分離し、そして細胞の均質な集団として増殖させることがで きる。しかしながら、この選択手順はわずかの不ズミ細胞系に限定される。より 一般的な選択手順は、二二旦″′（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）遺 伝子によって提供される。たいていの真核生物の細胞は、タンパク質の合成を阻 害する抗生物質のゲ不チシン（Ｇ４１８）に対しで発現される場合、Ｇ４１８、 真核生物の細胞によって容易に取り上げられるネオマイシンの類似体の存在下に 細胞を優先的に選択することができる［ジミニズ（Ｊｉｍｉｎｉｚ）ら、ネイチ ャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８７．８６９　（１９８０）］。

真核生物のトランスフェクション体の選択のための他の選択可能なマーカーは、 ｇｐ±と表示する、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺 伝子である。ｇｐ±を使用する選択は、プリンヌクレオチド合成のための基質と してキサンチンを使用する、この遺伝子によってエンコードされる酵素の能力に 基づく；類似する内因性酵素はそれが不可能である。キサンチンモノホスフェー トへのイノシンモノホスフニートの転化を遮断する、キサンチンおよびミコフェ ノール酸を含有する培地において、ｇｐ±遺伝子を発現する細胞のびが生存する ことができる。

とくに好ましいベクターは、真核生物宿主細胞内でマルチコピー（ｍｕｌｔｃｏ ｐｙ）の組み込まれない環状プラスミドとして複製することができる。このエビ ソームの複製は、事実、あるタイプの遺伝子の増幅および、結局、遺伝子の発現 の引き続く増幅を提供する。エビソームの複製のためのこの能力は、例えば、Ｂ ＰＶゲノムによって与えられる。

上に論じた線に沿って、ｐＡｂＴ２４１．ｐＡｂＴ２４３およびｐＡｂＴ２４５ と表示するＣＰＶ中空キャプシドの発現のための３つのキメラ発現ベクターを構 成した。発現ベクター（概略的に第４図に示す）は、次の要素を含有する： ａ、複製のｐＢＲ３２２誘導起源； ｂ１真核生物のＭＭＴプロモーター： ｃ、ＣＰＶキャプシドタンパク質ＶＰＩおよびＶＰ２’　をエンコードする構造 遺伝子： ｄ１全ＢＰＶゲノムおよびユ見旦１遺伝子；およびｅ、ＳＶ４０誘導転写調節要 素。

このベクターにおいて、ＭＭＴプロモーターは、遺伝子がこのプロモーターの指 令下にあるように、ＶＰＩおよびＶＰ２’遺伝子のちょうど上流に位置する。ｎ ｅｏ’遺伝子は、それがまたＭＭＴプロモーターの指令下にあるように、ｖＰｌ およびＶＰ２’遺伝子のちょうど下流に位置する。

発現ベクターｐＡｂＴ２４３　（第５図に概略的に示す）は、ｐＡｂＴ２４１と 同一の要素を含有が、配置が異なる。さらに、それはＶＰｌおよびＶＰ２°遺伝 子のための内因性ＣＰＶ転写プロモーターを含有する。

ｃｐｖプロモーターおよびＶＰＩおよびＶＰ２’遺伝子は、ＭＭＴプロモーター より上流に位置する。ＭＭＴプロモーターはｎｅｏ”遺伝子に隣接して位置し、 そしてこの遺伝子の転写を制御する。

発現ベクターｐＡｂＴ２４５は、ＶＰｌおよびＶＰ２’遺伝子およびＢＰＶゲノ ムに隣接するそれらのプロモーターを除外して、ｐＡｂＴ２４３に類似する。

キメラ発現ベクターは、プラスミドｐｄＢＰＶＭＭＴ旦」ゴーからＢＰＶゲノム を除去することによって形成された前駆体プラスミド（ＡｂＴ２３０）中にＣＰ Ｖ　ＤＮＡを挿入することによって構成された（第３図参照）ａ　ｐＡｂＴ２３ ０はＭＭＴプロモーターおよびＨｅｏ’遺伝子を含有する。ｐＡｂＴ２４１を構 成するために、ＣＰＶ　ＤＮＡをＤＯＬベクターからＢａｍＨＩ消化によって切 除し、そしてＭＭＴプロモ−ターのちょうど下流のｐＡｂＴ２３０のＢｇｌ１１ 部位に挿入して、ｐＡｂＴ２４０と表示する中間体を生成した。次いで、ＢＰＶ ゲノムをこの中間体のＢａｍＨ１部位に組み込んでｐＡｂＴ２４１を生成した。

ｐＡｂＴ２４３は、ｐＡｂＴ２０１からＣＰＶ　ＤＮＡを切除し、そして得られ るＣＰＶ断片をｐＡｂＴ２３０のＥｃｏＲ１部位に挿入することによって構成し た。次いで、ＢＰＶゲノムをｐＡｂＴ２４１に８けるように挿入した。

ｐＡｂＴ２４５は、ｐＡｂＴ２０１からＥｃｏＲＩ消化によってＣＰＶ　ＤＮＡ を切除し、そしてＢａｍＨＩリンカ−でｐＡｂＴ２３０のＢａｍＨ１部位にＢａ ｍＨＩ断片を挿入することによって構成した。次いで、ＢＰＶゲノムを２つのＢ ａｍ８１部位の１つに挿入した。

プラスミドｐＡｂＴ２４１、ｐＡｂＴ２４３ｊ；よびｐＡｂＴ２４５は、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　ＤＲｏｃｋ ｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２）に受託され、そして次の受託番号 を付されたニブラスミド　受託番号 ｐＡｂＴ２４１ ｐＡｂＴ２４２ ｐＡｂＴ２４３ ３、宿主細胞およびトランスフェクション手順中空キャプシドを生成するために 、ウィルスの構造タンパク質の発現のためにキメラ発現ベクターを適当な宿主細 胞中に導入ことが必要である。中空ウィルスキャプシドの発現のための真核生物 宿主細胞を、後述するようにある数の因子を基準にして選択した。

Ａ１適当な宿主細胞はトランスフェクション系に適合すべきである真核生物宿主 細胞は、従来のトランスフェクション技術の１つ、例えば、この開示に記載する リン酸カルシウム沈澱法によってトランスフェクション可能でなくてはならない 。他のトランス７ニクシヨン技術は、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレ イション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはプロトプラスト融合の使用 を包含する。

多くの細胞系を、上の技術の１または２以上によってトランスフェクションする ことができる。これらは次のものを包含するが、これらに限定されない：ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、イヌＡ７２細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ Ｖ−１細胞、Ｂ５Ｃ４０細胞、ヒヨコ胚線維芽およびこの分野においてよく知ら れている他のもの。

種々の技術を利用して形質転換細胞を選択可能である。好ましい系は、形質転換 された細胞をＧ４１８に対して抵抗性とする、ｎｅｏ’遺伝子の発現のために選 択するものである。この分野においてよく知られている、種々の他の選択系を、 発現ベクター／宿主細胞系中に組み込むことができる；これらは次のものを包含 する二ＴＫ−宿主細胞におけるチミジンキナーゼ（ＴＫ）の選択；キサンチン− グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）系、これは、前述のよう に、ｇｐｔを欠く宿主細胞を必要とする；およびＢＰＶ細胞系によって与えられ る形質転換された表現型についての選択、これはある数のネズミ細胞系に限定さ れる。中空キャプシドの生成についての選択は、次の手段によって実施すること ができる：赤血球凝集アッセイ、これは発現されｆ：、ｃＰＶ産生物の赤血球を 凝集する能力を測定する、この能力は完全なキャプシドのみが有するが、ここの ウィルスタンパク質はもたない：および電子顕微鏡検査によるキャブンドの直接 の可視化およびＣｓＣｌ勾配遠心による特性付け。

多くの確立された真核生物の細胞系は、培養において連続的に増殖することがで きる。いくつかの例は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｌ細胞、イヌＡ７２細胞、チャイニ ーズハムスター卵巣細胞およびＶｅｒｏ細胞である。種々の種から誘導された一 次細胞は、また、使用することができる。

Ｄ１宿主細胞系は、適当な取り締まり機関によって、ワクチンの製造における使 用において承認されるべきである例として、米国農務省（ＵＳＤＡ）は動物のた めのバルヴオウイルスのワクチンの製造において使用するための、いくつかの細 胞系を承認した。これらはカランダル（ｃａｒａｎｄａｌ）細胞系（ネコ腎臓か ら誘導される）８よびイヌ細胞系、マディンーダービイ（ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂ ｙ）イヌ腎細胞を包含する。他の細胞系は、フェデラル・ドラグ・アトミニスト レイジョン（Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって 、ヒトのワクチンの生産において使用するために承認された。

これらの細胞系を形質転換するために抗生物質の選択系を使用することは重要で ある。なぜなら、それらは選択に普通に使用されている酵素のあるもの、例えば 、ｄＰｔ８よびＴＫを欠かないからである。

４、ワクチンの調製 中空キャプシドを誘導するウィルスワクチン接種するだめのワクチン組成物は、 一般に、製薬学的に許容されうる賦形剤中に免疫化量の中空ウィルスキャプシド を含んでなる。例えば、このようなワクチンは、注射可能なワクチン、例えば、 液状溶液または懸濁液として調製することができる。注射前に溶液または懸濁液 中に溶解するだめの固体の形態は、また、調製することができる。必要に応じて 、調製物は、また、乳化することができる。活性成分のキャプシドは、製薬学的 に許容されうる、活性キャプシドと適合性の、賦形剤と混合することができる。

適当な賦形剤の例は、水、生理的塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エ タノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワク チンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはア ジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、これはワクチンのを動性を増大する 、を含有することができる。ワクチンは、便利には、非経口的に、注射によって 、例えば、皮下にまたは筋肉内に。

投与することができる。

ワクチンは、投与の配合物適合する方法で、かつ治療学的にかつ免疫原的に有効 であるような量で投与される。投与すべき量は、処置すべき患者、抗生物質を合 成する患者の免疫系の能力、および所望する保護の程度に依存する。投与すべき 活性成分の正確な量は、実施者の判断に依存し、そして患者に特有である。しか しながら、適当な範囲は、個体につきほぼ数百マイクログラム程度である。初期 の投与およびブースターのショット（ｓｈｏｔ）のために適当な養生法は、また 、変化することの注射または他の投与である。

中空ウィルスキャプシドは、全細胞リゼイトの形態で産生性形質転換細胞から得 ることができるか、あるいは示差的遠心、限外濾過またはタンパク質精製のため の他の普通の技術によって精製することができる。

パルヴオウイルスのワクチンの好ましい形態は、全細胞リゼイトである：これら の調製物は凍結乾燥し、そして再構成することができる。

中空キャプシドの免疫化投与量は、パルヴオウイルスキャプシドの種の各々につ いておよび中空キャプシドの個々の調製のために、実験的に決定することができ る。これは次のようにして実施することができる。

赤血球凝集（ＨＡ）単位で測定して、中空キャプシドの投与量を滴定し、引き続 いて種の各々における赤血球凝集阻止力価（Ｈｌ）および血清中和（ＳＮ）力価 によってアッセイして、ウィルスキャプシドに対する免疫学的応答を測定する。

試験動物を引き続いてピルレントバルヴオつ歪ルスで対抗させて、上で測定した 免疫応答を病気に対する保護に関係付けることができる。

５、中空ウィルスキャプシドの診断的使用免疫原性の中空ウィルスキャプシドを 使用して、ウィルスの感染を診断することができる。キャプシドを使用して、ヴ イリオンタンパク質上の種々のエピトープを認識する、モノクローナル抗体およ びポリクローナル抗血清のパネルをレイズすることができる。これらのモノクロ ーナル抗体および／またはポリクローナル抗血清は、ＲＩＡまたはＥＩＡのフォ ーマットにおけるイムノアッセイのための捕捉抗体として、個々にあるいは一緒 に使用して、尿、血液、または便中のウィルスの存在を検出することができる。

あるいは、キャプシドそれら自体を、イムノアッセイにおける抗原として使用し て、尿、血液、または便中の抗体の存在を検出することができる。とくに好まし いイムノアッセイは、固相の免疫測定アッセイ（酵素測定、放射線測定）である 、このようなアッセイにおいて、キャプシドを固相上に固定化して、免疫吸着剤 を生成する。次いで、免疫吸着剤を、試験すべき体液試料とともに、抗体をキャ プシドと反応させて固定化しないキャプシドと複合化するために十分な条件下に 、インキュベーションする。免疫吸着剤を試料から分離し、そして免疫吸着剤と 関連する抗キャプシド抗体を、試料中の抗ウイルス抗体の指示として決定する。

免疫吸着剤に結合した抗体は、一般に、試料を誘導する種の抗体に対する標識し た（同位元素であるいは酵素的に）抗体とともに免疫吸着剤をインキュベーショ ンし、そして免疫吸着剤と関連する標識を検出することによって、決定する。

本発明を次の実施例によってさらに説明する。

酵素は二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ）またはベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅ　ｒ−Ｍａｎｎ ｈｅ　ｉｍ）から入手した。消化は記載されるようにして実施した［マニアチス （Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、、フリトシュ（Ｆｒｉｓｃｈ）、Ｅ、Ｆ、およびサ ンプルツク（Ｓａｎｂｒｏｏｋ）、Ｊ。

、１９８２、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ　ａ　ｌ　、 ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ。

Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプ リング・ハーバ−、ニューヨーク、ｐｐ、１０４−１０５］　；使用した緩衝液 組成物は、次の通りである：低塩緩衝液＝１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７，５，１０３９モルのＭｇＣ＋２、ｌミリモルのジチオスレイトール、１００ μｇ／ｍＱのウシ血清アルブミン；中程度の塩の緩衝液＝５０ミリモルのＮａＣ ｌ、ｌ　Ｏミリモルのトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５，１０３９モルのＭｇＣ＋、 、ｌミリモルのジチオスレイトール、１００μｇ／ｍＱのウシ血清アルブミン； 高置緩衝液−１００ミリモルのＮａＣ１，５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７゜５．１０３９モルのＭｇＣ＋　２．１ミリモルのジチオスレイトール、■０ ０μｇ　／　ｍ　Ｑのウシ血清アルブミン；　Ｓｍａ　Ｉ緩衝液−２０ミリモル のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ミリモルのＭｇＣ＋２、ｌミリモルのジチ オスレイトール、１００μｇ／ｍＱのウシ血清アルブミン。消化は、特記しない 限り、３７℃において１時間実施した。

仔つン腸ホスファターゼによるＤＮＡの処理ＤＮＡは、５０ミリモルのトリス− ＨＣｌ、ｐＨ９，０，１，０ミリモルのＭｇＣＬおよび１ミリモルのスパーミジ ン中においてｌμＱので３７℃において３０分間脱リン酸化し、時々引き続いて 他の１μＱの酵素とともに第２回の３０分のインキュベーションを実施した。

ＤＮＡポリメラーゼ、大量の断片（クレノー）によるＤＮＡの処理クレノー酵素 は、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓ）から入手し、そして記載するようにして使用した［マニアチス（Ｍａｎ ｉａｔｉｓ）、Ｔ、、７リトシユ（Ｆｒ　ｉ　５ｃｈ）　、Ｅ、Ｆ、およびサン プルツク（Ｓ　ａ　ｎ　ｂ　ｒ　ｏ　ｏ　ｋ）、Ｊ。

、１９８２、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、）、コ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプ リング・ハーバ−、ニューヨーク、ｐｐ、１１２−１１３］。

制限断片のゲル精製 ＤＮＡを低融点のアガロース（０，７％〜３％の範囲）ゲル上で大きさにより分 画し、４０ミリモルのトリス−アセテートｐＨ８，０，２ミリモルのＥＤＴＡ中 で展開した。問題のＤＮＡ断片をゲルから切除し、７０°Ｃにおいて液化し、そ して２００ミリモルのＮａＣ５５０ミリモルのトリス、ｐＨ７，５，１ミリモル のＥＤＴＡ中で希釈した。ＤＮＡを７エノールで抽出し、次いでフェノール：ク ロロホルム（１：　１）で抽出し、そしてエタノール沈澱させた。

ＤＮＡ断片の結合 Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼをベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍ ａｎｎｈｅｉｍ）から入手した。結合は、特記しない限り、５０ミリモルのトリ ス、ｐＨ７，４、ｌＯミリモＬ　（７）　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｘ、１０ミリモルのジ チオスレイトール、１ミリモルのスパーミジン中で１５℃において３０分〜３日 間実蔦した。

リンカ−のリン酸化およびＤＮＡへの結合リンカ−をＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼは、二ニー・イングランド。

バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した。リン カ−は、記載されるようにリン酸化および結合した［マニアチス（Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）、Ｔ、、７リトシユ（Ｆｒｉｓｃｈ）、Ｅ、Ｆ。

およびサンプルツク（Ｓ　ａ　ｎ　ｂ　ｒ　ｏ　ｏ　ｋ）、Ｊｏ、１９８２、モ レキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室の マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、）、コールド・スプリ ング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、ｐｐ、３ ９６−３６７］。

Ｅ、ｃｏｌｉの形質転換 Ｅ、ｃｏｌｉ細胞は、記載されるように、能力的にし、そしてＤＮＡで形質転換 した［マニアチス（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ）、Ｔ、、フリトシュ（Ｆｒｉｓｃｈ） 、Ｅ、Ｆ、およびサンプルツク（Ｓ　ａ　ｎ　ｂ　ｒ　ｏ　ｏ　ｋ）、Ｊ、、１ ９８２、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ　ｌ　ｅｃｕ　ｌ　ａ　ｒＣｌｏｎ ｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、）、 コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュ ーヨーク、ｐｐ、２５０−２５１］。

プラスミドＤＮＡの分離および精製 プラスミドＤＮＡの調製および塩化セシウム−臭化エチジウム勾配の遠心による 精製は、記載されるように実施した［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、、 フリトシュ（Ｆｒ　ｉ　５ｃｈ）、Ｅ、Ｆ、およびサンプルツク（Ｓａｎｂｒｏ ｏｋ）、Ｊｌ、１９８２、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａ＋、）、：ｌ−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング＋ハーバ−、ニューヨーク 、ｐｐ、９０．９■、９３．９４］。

第１図は、ＣＰＶ　ＲＦ　ＤＮＡ配列の原核生物ベクターｐＥＭＢＬ１８＋中へ の分子クローニングにおいて含まれる工程を要約する［デンテ（Ｄｅｎｔｅ）ら 、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）、１上、１６４ ５（１９８３）］、ＣＰＶ　ＲＦ　ＤＮＡ［コリ７−パリンシ（Ｃｏｌｉｎ　Ｐ ａｒｒｉｓｈ）、コーネル大学、ニューヨーク、イタ力、から提供された］を、 制限ヌクレアーゼＨａｅＩＩＩによる部分的消化によって切断した。ＣＰＶ　Ｒ Ｆ　ＤＮＡ中には５つのＨａｅｌ１１部位が存在する［マクマスター（ＭｃＭａ 　ｓ　ｔ　ｅｒ）ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ）、３８．３６ ８　（１９８１）１ので、１４の可能な部分的消化の生成物が存在する；この実 施例におけるわれわれの目標は、大きい部分的消化生成物を有するバクテリアの クローン、すなわち、ＣＰＶ　ＤＮＡ配列のほとんどまたはすべてを有するクロ ーンを分離することであった。

消化したＣＰＶ　ＤＮＡは、フェノール−クロロホルム抽出によって精製し、そ してエタノール沈澱によって濃縮した。次いで、それをプラスミドベクターｐＥ ＭＢＬ１８＋のＳｍａ　１部位中に結合した［デンテ（Ｄｅｎｔｅ）ら、核酸の 研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）、↓Ｌ　１６４５　（１ ９８３）］　、Ｓｍａ　Ｉによるベクターの直線化に加えて、直線化したベクタ ーＤＮＡを仔つシ腸ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）で処理して、末端５′のホスフ ェートを除去した、その再環化を防止する処理。結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ 菌株ＪＭＩＯＩ中に形質転換し［スプリング（Ｍｅ　ｓ　ｉ　ｎ　ｇ）ら、核酸 の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）、９．３０９　（１９ ８１）　］そして形質転換体をラクトーノスのマソクコンケイ（ＭａｃＣｏｎｋ ｅｙ）寒天上に広げた［マツクコンケイ（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）ら、Ｊ、ＨＶｇ 、５．３３０　（１９０５）］。組み換え体プラスミドを含有する形質転換体を 、コロニーの交雑によって同定した［グルンスティン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）お よびホブ不ス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）、　ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・ アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ）、ＵＳＡ、７２．３９６１　（１９７１） ］；使用した交雑グローブは、ニック翻訳によって３２ｐで標識した、ＣＰＶ　 ＲＦ　ＤＮＡの１．４ｋｂおよび１．ｌｋｂのＨａｅｌＩＩ断片であった。ｐＡ ｂＴ２００およびｐＡｂＴ２０１と表示した、同定された２つの組み換え体クロ ーンを、引き続くクローニング実験において使用しに。

ｐＡｂＴ２００はＣＰＶゲノムのほぼ６４％を含有し、ＶＰＩおよびＶＰ２’　 をエンコードする遺伝子をそれらの内因性プロモーターと一緒に含む。ｐＡｂＴ ２０１はＣＰＶゲノムのほぼ９５％を含有する；それはウィルスの極端の５゛末 端配列のみを欠き、そして全体のＶＰｌおよびＶＰ２’解読配列およびそれらの 内因性プロモーターを含有する。

クローンｐＡｂＴ２００からのＣＰＶ　ＤＮＡ配列を、第２図中に要約するよう に、レトロウィルスのベクターＤＯＬ中にサブクローニングした［Ｂ、ロバーツ （Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｐｅ　ｒ　ｓ、Ｃｏｍｍ、］　ａ　ＤＯＬ　ＤＮＡＪバー バード・メディカル・スクール（ＨａｒｂｅｒｄＭｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ ）のＢ、ｏパーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）博士から入手した］を、ＢａｍＨＩで直線 化した。消化後、消化したＤＮＡのくぼんだ３′末端を、４つのデオキシヌクレ オチドトリホスフェートの存在下にＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片（クレノ ー断片）を使用して充填した。最後に、末端５′ホスフエートをベクターＤＮＡ がらＣＩＰによって除去した。ＣＰＶ　ＤＮＡをクローンｐＡｂＴ２００がらＴ ａｑｌによる消化によって調製するした。Ｔａｑｌは、ｃＰｖ配列において、Ｖ ＰＩ解読配列から２４塩基上流において１回切断し、そして挿入されたＣＰＶ　 ＤＮＡをちょうど越えた部位に含まれる、プラスミドベクターにおいである回数 切断して、２．７３ｋｂの断片を解放した。この２．７３ｋｂの断片は、全体の ＶＰＩ−ＶＰ２’解読配列、この配列から上流にさらに２４塩基上流およびｐＥ ＭＢＬ１８＋ベクターから誘導された数個の塩基を含有し、普通の方法で精製し 、そしてこの断片のくぼんだ３′末端をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を 使用して修復した。この断片をＤＯＬベクターに結合し、そして結合したＤＮＡ を使用してＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩを形質転換した［ボイエル（Ｂｉｙｅｒ ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオｏ　シー　（Ｊ、ＭＯｌ、Ｂ１ １ｏ、）、ｌ１．４５９　（１９６９）］。形質転換した細胞を、５０μｇ　／ 　ｍ　Ｑのカナマイシンを含有するＬｂ寒天上に広げた。ｐＡｂＴ２１０と表示 する、所望の組み換え体は、ＤＯＬのＢａｍＨ１部位挿入された２、７３ｋｂの ＣＰＶ　ＤＮＡ断片を含有した。

この断片は、ＤＯＬおよびＣＰＶ　ＤＮＡの修飾されに末端の結合にょって発生 したＢａｍＨｒ部位によってフランキングされている。

実施例ＩＩＩ プラスミドベクターｐ　ｄ　ＭＭＴ　ｎ　ｅ　ｏ　”の構成（ｐＡｂＴ２３０） プラスミドベクターｐｄＭＭＴ旦ｅ　ｏ”　（ｐＡｂＴ２３０）を、第３図に概 略的に示すように、ｐ　ｂ　Ｂ　Ｐ　ＶＭＭＴユ見旦１［ラウ（Ｌａｗ）ら、モ レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１、Ｂｉｏｌ、 ）、ユ、２１１０　（１９８３）］から誘導した。プラスミドｐｂＢＰＶＭＭＴ ｎｅｏ”を有するＥ−ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩは、アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ ｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣＮｏ。

３７２２４）から入手した。調製的量のこのプラスミドを普通の技術によって調 製し、そしてＤＮＡをＢａｍＨＩによって消化した。この消化は２つの断片を生 成した：独特Ｂａｍ８１部位で直線化した、全体のゲノムから成る７、９５ｋｂ の断片；および複製のｐＢＲ３２２起源およびＢ−ラクタマーゼ遺伝子を有する 。ｐＭＬｄ２　ＤＮＡから成る６゜６５ｋｂの断片（ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）お よびボッチャン（Ｂｏｔｃｈａｎ）５．ｉイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９３． ７９（１９８１）］：不ズミのメタロチオンニンＩプロモーター；Ｔｎ５からの ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ”）；および小さい（抗 原きり継ぎシグナルおよびＳＶ４０の３′転写九理シグナル。これらの消化生成 物をお互いから分離し、そして普通の技術によって精製した。ＢＰＶ断片を引き 続くクローニング実験において使用するため保存した（参照、実施例ＩＶ）；６ ．ａ５ｋｂの断片を自己結合させ、そしてＥ、ｃｏ１ｉ菌株ＨＢｌＯ１を形質転 換するために使用した。形質転換したバクテリアを４０μｇ　／　ｍ　Ｑのアン ビンリンを含有するＬＢ寒天上に配置した。所望の形質転換体、ｐＡｂＴ２３０ と表示するプラスミドベクター、を調製し、そして引き続くクローニング実験の ために使用した。

ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ組み換え体プラスミドの構成は、第４図〜第６図に概略的 に示されている。一般に、構成の各々は２つの工程から成っていた（１）適当す ＣＰ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（７）ｐＡｂＴ２３０中の挿入；　（２）　ＢＰＶゲ ノムのｐＡｂＴ２３０　：ＣＰＶ組み換え体中の挿入。３つの異なるクローニン グの構成を使用した；これらは３つの異なるＣＰＶ／ＢＰＶ構成体を生成した。

Ａ％ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ組み換え体ｐＡｂＴ２４１の構成ＣＰＶ／ＢＰＶ組み 換え体ｐＡｂＴ２４１の構成における第１工程は、ベクターｐＡｂＴ２３０にお けるネズミのメタロチオンニン（ＭＭＴ）のプロモーターに隣接してキャプシド タンパク質ＶＰＩおよびＶＰ２’のための構造遺伝子を含有するＣＰＶ　ＤＮＡ の挿入であった。この構成は、真核生物の細胞中におけるＣＰＶ構造遺伝子の発 現をＭＭＴグロモーターが指令できるように設計した。ｐＡｂＴ２３０をＢｇｌ ｌｌで消化した。このＢｇｌｌｌは、プラスミドをＭＭＴプロモーターζ１見ｏ １遺伝子との間で１回切断する（参照、第４図）−次いで、末端５°ホスフエー トを直線化したベクターＤＮＡからＣＩＰで除去した。

ＶＰＩおよびＶＰ２’構造遺伝子をエンコードするＤＮＡを、これらの遺伝子を 有する２、７３ｋｂのＣＰＶ　ＤＮＡ断片を遊離する、ＢａｍＨＩ消化によって プラスミドｐＡｂＴ２００かも分離した。この断片をＢｇｌｌｌ消化し、ホスフ ァターゼ処理したｐＡｂＴ２３０プラスミドに結合した。この結合は可能である 。なぜなら、酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌｌは同一の突起する５′付着末端を 生成した。結合した。結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転 換し、そして形質転換体を４０μｇ　／　ｍ　Ｑのアンピシリンを含有するＬＢ 寒天上で増殖させた。

この結合は、ＭＭＴプロモーターに関してＣＰＶ　ＤＮＡの特定の向きによって 異なる、２つのクラスの組み換え体プラスミドを生成した。

これらの２つのクラスを区別するために、ならびに組み換え体と非組み換え体を 区別するために、プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩｆで消化した。

この二重消化の生成物はＣＰＶ　ＤＮＡ断片の向きについて特徴的である：ＣＰ Ｖ構造遺伝子の５′がＭＭＴプロモーターに隣接する、所望の組み換え体におい て、二重消化は５．７４８よび３゜８４ｋｂの断片を生成する；反対の向きにお いて、二重消化は６．１５および３．４３ｋｂの断片は生成する。挿入したＣＰ Ｖ　ＤＮＡをもｔユないｐＡｂＴ２３０を有する形質転換体は、３．８４および ５．７４ｋｂの断片を与えた。

所望の組み換え体をそのＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ　Ｔ　Ｔ制限パターンによって同定 し、そしてｐＡｂＴ２４０と表示した。ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体の構成の第２ 工程において、ＢＰＶゲノムをｐＡｂＴ２４０の独特ＢａｍＨ１部位中に挿入し た。ｐＡｂＴ２４０をＢａｍＨＩで消化し、そして線状の消化生成物の末端をＣ ＩＰで処理して、末端５°ホスフエートを除去した。独特Ｂａｍ８１部位におい て直線化した、ＢＰＶゲノムのＤＮＡを、実施例ＩＩＩに記載するように調製し 、そしてｐＡｂＴ２４０プラスミドに結合した。結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ 菌株ＨＢＩＯ１中に形質転換し、そして形質転換体を４０μｇ／ｍＱのアンピシ リン上で増殖させた。

グラスミドＤＮＡを形質転換した細胞から分離し、そしてＢａｍＨＩ消化によっ てＢＰＶ配列の存在について分析した二組み換え体は、９゜５８ｋｂのｐＡｂＴ ２４０に加えて、７．９３ｋｂのＢＰＶ　ＤＮＡ断片を含有した。

再び、この結合は、ＣＰＶ　ＤＮＡ配列に関してＢＰＶ配列の向きにおいて異な る、組み換え体プラスミドの２つのクラスを生成した。これらの２つのクラスの 組み換え体はＥｃｏＲＩによる組み換え体の消化によって区別することができた 。ＣＰＶおよびＢＰＶ転写単位が同一方向に整列したクローン（参照、第４図） は、１２．５ｋｂおよび５．０ｋｂのＥｃｏＲＩ制限断片を与えｌ：。これらの クローンの１つ、ｐＡｂＴ２４１と表示する、を引き続ぐ実験のために選択した 。

ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ組み換え体ｐＡｂＴ２４＋は、次の特徴を存した：（１） 　それは原核生物および真核生物の宿主細胞の間で往復することができる。なぜ なら、それは必要なｐＢＲ３２２誘導配列ならびに全体のＢＰＶゲノムの両者を 含有する；（２）　それはＣＰＶの構造遺伝子からちょうど上流に真核生物のＭ ＭＴプロモーターを有し、これは真核生物の細胞中でＭＭＴの指令下にこれらの 遺伝子の発現を可能とする：（３）　それは、ＣＰＶ構造選云子からちょうど下 流にＳＶ４　Ｑ転写シグナルと一緒に、不オマインンホスボトランスフエラーゼ 遺伝子を有する：この遺伝子は、また、真核生物の細胞中でＭＭＴプロモーター の指令下に発現される。

Ｂ、ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体ｐＡｂＴ２４３の構成ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ組み 換え体ｐＡｂＴ２４３の構成における第１工程は、キャプシドタンパク質ＶＰ１ ８よびＶＰ２’のだめの構造遺伝子をそれらのプロモーターと一緒に含有するＣ ＰＶ　ＤＮＡの挿入であった。

ｐＡｂＴ２３０をＥｃｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲＩは、このプラスミドをｐＭ Ｌ２とＭＭＴプロモーター配列の間で１回切断する（参照、第５図）；次いで、 末端の５′ホスフエートを直線化したベクターＤＮＡからＣＩＰで除去した。

ＶＰＩおよびＶＰ２’構造遺伝子およびそれらのプロモーターをエンコードする ＤＮＡを、これらの遺伝子を有する４、１４ｋｇのＣＰＶＤＮＡ断片を遊離する ＥｃｏＲＩ消化によって、プラスミドｐＡｂＴ２０Ｉから分離した。この断片を ＥｃｏＲＩ消化した、ホスファターゼ処理したｐＡｂＴ２３０プラスミドに結合 した。結合したＤＮＡをＥ−ｃｏ１ｉ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質転換し、そして形 質転換体を４０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で増殖させた。

これは２つのクラスの組み換え体プラスミドを生成し、これらのクラスはベクタ ーＤＮＡ配列に関してＣＰＶ　ＤＮＡの特定の向きによって異なる。組み換え体 のこれらのクラスを区別するために、ならびに組み換え体と非組み換え体プラス ミドとを区別するために、プラスミドＤＮＡＢｇｌ１１で消化した。この消化の 生成物は、ＣＰＶ　ＤＮＡ断片の存在および向きについて特徴的である：　ｐＡ ｂＴ２３０の非組み換え体のＢｇｌｌｌ消化は、９．５８ｋｂの線状分子を生成 する；ＣＰＶおよびＭＭＴｎｅｏ”転写単位が同一方向に整列した組み換え体は 、２つの断片、７．１６および３．９５ｋｇを生成する：そして反対の向きにお いて、８ｇｌ１１消化生成物は６．５８および４．１７ｋｂである。

ＣＰＶおよびＭＭＴｎｅｏＲ転写単位が同一方向に整列した組み換え体は、ｐＡ ｂＴ２４２と表示し、そしてこのＣＰＶ−ＢＰＶ組み換え体の構成の第２工程に おいて使用した。この工程において、ＢＰＶゲノムをｐＡｂＴ２４２の独特Ｂａ ｍＨ１部位中に挿入した。ｐＡｂＴ２４２をＢａｍＨｒで消化し、そして線状消 化生成物の末端をＣＩＰで処理して、末端の５″ホスフエートを除去した。独特 Ｂａｍ８１部位において直線化したＢＰＶゲノムＤＮＡを、実施例ＩＩＩに記載 するように調製し、そしてｐＡｂＴ２４２プラスミドに結合した。結合したＤＮ ＡをＥ。

ｃｏｌｉ菌株ＨＢ　Ｉ　Ｏｌ中に形質転換し、そして形質転換体を４０μｇ／ｍ Ｑのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で増殖させた。

プラスミドＤＮＡを形質転換した細胞から分離し、そしてＢａｍＨＩ消化によっ てＢＰＶ配列の存在について分析しに二組み換え体は、１０゜７５ｋｂのｐＡｂ Ｔ２４２断片に加えて、７．９３ｋｂのＢＰＶ　ＤＮＡ断片を含有した。

再び、この結合は２つのクラスの組み換え体プラスミドを生成した。

これらはＣＰＶ　ＤＮＡ配列に関してＢＰＶ配列の向きにおいて異なった。これ らの２つのクラスの組み換え体は、組み換え体をＥｃｏＲＩおよび５ａｌｒで消 化することによって区別することができた。ＣＰＶおよびＢＰＶ転写単位を同一 方向において整列したクローン（参照、第５図）は、ＥｃｏＲｒおよび５ａｌｔ で消化したとき、４つの制限断片を与えた：これらの断片の大きさは、９．９． ３．８，２．６８よび２゜３ｋｂであった。これらのクローンの１つ、ｐＡｂＴ ２４３と表示する、を引き続く実験のために選択した。

ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体ｐＡｂＴ２４３は、次の特徴を有した＝１、　それは 原核生物および真核生物の宿主細胞の間で往復することができる。なぜなら、必 要なｐＢＲ３２２誘導配列ならびに全体のＢＰＶゲノムの両者を含有する： ２、　それはＭＭＴプロモーター、不オマイシンホスポトランス７エラーゼ遺伝 子、およびＳＶ４０の早い領域転写処理シグナルから構成された転写カセットを 有し、これは形質転換した真核生物の細胞の抗生物質の選択を可能とする； ３、　それは、キャプシドタンパク質ＶＰＩおよびＶＰ２’　をエンコードする 遺伝子を、それらの関連するｃＰｖプロモーターと一緒に有し、前記プロモータ ーはこのプラスミドによって形質転換された細胞系におけるそれらの発現を指令 することができる。

Ｃ，ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体ｐＡｂＴ２４５の構成ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体 ｐＡｂＴ２４５の構成における第１工程は、キャプシドタンパク質ＶＰＩおよび ｖｐ２’のための構造遺伝子をそれらのプロモーターと一緒に、ベクターｐＡｂ Ｔ２：３０中に挿入することであった。ｐＡｂＴ２３０をＢａｍＨＩで消化した 。ＢａｍＨＩは、プラスミドをｐＭＬ２およびＭＭＴプロモーター配列の間で１ 回切断する（参照、第６図）：次いで、末端の５′ホスフエートを直線化したベ クターＤＮＡからＣＥＰで除去した。

ＶＰＩおよびＶＰ２’構造遺伝子およびそれらのプロモーターをエンコードする ＤＮＡを、プラスミドｐＡｂＴ２０１から、ＥｃｏＲＩ消化によって分離した。

ＥｃｏＲＩはこれらの遺伝子を有する４、１４ｋｂのＣＰＶ　ＤＮＡ断片を遊離 する。この断片のくぼんだ３′末端を、４つのデオキシヌクレオチドトリホスフ ェートの存在下にＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を使用して、充填した。

次いで、リン酸化したＢａｍＨＩリンカ−をこのＤＮＡ断片の末端に結合し、そ して結合した断片をＢａｍＨＩで消化し、そして精製した。

この修飾した断片を、ＢａｍＨＩ消化し、ホスファターゼ処理したｐＡｂＴ２３ ０プラスミドに結合した。結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩ中に形 質転換し、そして形質転換体を４０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含有するＬＢ寒 天上で増殖させた。

この結合は２つのクラスの組み換え体プラスミドを生成した。これらはベクター ＤＮＡ配列に関してＣＰＶ　ＤＮＡの特定の向きによって異なる。これらのクラ スの組み換え体を区別するために、ならびに組み換え体および非組み換え体のプ ラスミドを区別するために、プラスミドＤＮＡをＢｇｌｌｌで消化した。この消 化の生成物は、ＣＰＶ　ＤＮＡ断片の存在および向きについて特徴的である。非 組み換え体ｐＡｂＴ２３０のＢｇｌｌｌ消化は、９．５８ｋｂの線状分子を生成 する。ＣＰＶおよびＭＭＴ　ｎ　ｅ　ｏ　’転写単位が同一方向に整列した組み 換え体は、２つの断片、６．２４および４．５１ｋｂを生成する；そして、反対 の向きにおいて、ＢｇｌＩＩ消化生成物は６，８２および３．９３ｋｂである。

ＣＰＶおよびＭＭＴ　ｎ　ｅ　ｏ　”が同一方向に整列した組み換え体を、ｐＡ ｂＴ２４４と表示し、そしてこのＣＰＶ−ＢＰＶ組み換え体の構成の次の工程に おいて使用した。この工程に８いて、ＢＰＶゲノムをｐＡｂＴ２４４の２つのＢ ａｍＨ［部位の１つ中に挿入した。ｐＡｂＴ２４４をＢａｍＨＩで部分的に消化 し、そして得られる線状分子をＣＩＰで処理も１次いで中性のアガロースゲルで 精製した。

独特ＢａｍＨ１部位において直線化しｆ：、ＢＰＶゲノムのＤＮＡを、実施例Ｉ １１に記載するように、調製し、そしてｐＡｂＴ２４０プラスミドに結合した。

結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ菌株ＨＢＩＯＩ中に形質　・転換し、そして形質 転換体を４０μｇ　／　ｍ　Ｑのアンピシリンを含有するＬＢ寒天上で増殖させ た。

プラスミドＤＮＡを形質転換した細胞から分離し、そして次について分析した： １ＸＢＰＶ　ＤＮＡ配列の存在； ２、ＢＰＶ　ＤＮＡが挿入されたＢａｍＨ１部位：３、ＣＰ■配列に関するＢＰ Ｖ配列の向き。

この分析はプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することによって実施し、Ｅｃ ｏＲＩはＣＰＶおよびＢＰＶの４つの可能な配列の向きの各々について独特の制 限バタン−を与えた。２つのクローンｐＡｂＴ２４５およびｐＡｂＴ２４６は、 同一方向で整列したＣＰＶおよびＢＰＶ転写単位を有するが、ＢＰＶ　ＤＮＡの 挿入の部位において異なる。クローンｐＡｂＴ２４５はそれ以上の分析のために 選択した。

前述＋７）ＣＰＶ／ＢＰＶ組み換え体ｐＡｂＴ２４３（７）、Ｊ：うに、ｐ　Ａ 　ｂ　Ｔ２４５は原核生物および真核生物の宿主細胞の間を往復することができ 、そして形質転換した真核生物の宿主細胞をそれらの抗生物質抵抗性によって選 択することができる。最後に、ｐＡｂＴ２４５は、また、ＣＰＶキャプンドタン パク質ＶＰＩおよびＶＰ２″　をエンコードする遺伝子を、それらの関連するＣ ＰＶプロモーターと一緒に有し、このプロモーターはこのプラスミドによって形 質転換された真核生物の細胞中の指令することができる。

イヌのバルヴオウイルスＶＰＩおよびＶＰ２’　を発現する細胞系の発生Ａ１細 胞および培地 ＮＩＨ３Ｔ３細胞はプリアン・ロバーツ（Ｂｒｙａｎ　Ｒｏｂｅｒｔｓ）（バー バード・メディカル・スクール、マサチュセッッ州ボストン）から入手した。細 胞をＤＭＥ　１０％の仔ウシ血清（Ｃ５）およびピリビン酸ナトリウム（ギブコ 、Ｎｏ、４３０−２１００）中で維持した。Ａ−７２イヌ腫瘍細胞（ＡＴＣＣＮ ｏ、ＣＲＬ　１５４２）をＬ−１５（レイポビッッ培地、ギブコ、Ｎｏ、４３０ −１３００）および変性したマクコイス（ＭａｃＣｏｙｓ）５Ａ培地［１０％の 胎児仔つシ血ｆｒ（Ｆｅ２）を含有する］のｌ：１混合物中で維持した。仔ウシ 血清および胎児仔ウシ血清は、ハイクローン・ラボラトリーズ・インコーホレー テッド（ＨｙＣｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）から購入した ；ゲ不チシン（Ｇ４１８）はギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から購入した。Ｇ４１８の各 々のロフトはＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡ７２細胞の両者への細胞障害性について 力価決定した。

Ｂ、　キメラＣＰＶ／ＢＰＶプラスミドｐＡｂＴ２４１．ｐＡｂＴ２４３および ｐＡｂＴ２４５を使用する細胞のトランスフェクションキメラＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ 　Ｖプラスミドのすべては、実施例■Ｖにおいて記載するいくつかの共通の特徴 を有するニブラスミド中のＢＰＶゲノムおよびｎｅｏ”遺伝子の存在は２つの機 構を提供し、そしてこれらによってトランスフェクション後ズラスミドを取り上 げた細胞を選択することができる。培養において増殖した広い種類の真核生物の 細胞は、標準のトランス７エクンヨン手順に従い外因的に添加されたＤＮＡを取 り上げるようにすることができる［セプコ（Ｃｅｐｋｏ）ら、ネイチャー（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３７−１１０５３　（１９８４）　］　。

１、ｐＡｂＴ２４１　（形質転換Ｎｏ、ＶＩ　＋）およびｐＡｂＴ２４３（形質 転換Ｎｏ、ＶＩ　Ｉ　りによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション ＮＩＨ３Ｔ３細胞を５Ｘ１０’細胞／　Ｉ　Ｏｃ　ｍ平板で、トランスフェクシ ョンの１日前に、接種した。細胞はトランスフェクションのほぼ４時間前に供給 し、このときほぼ４０％の全面成長であった。細胞を１０μｇのプラスミドの各 々でリン酸カルシウム沈澱としてトランス７エクンヨンした。詳しくは、ｌＯμ ｇのｐＡｂＴ２４１　（２９μＱの原料）またはｐＡｂＴ２４３　（８，６８μ Ｑの原料）を、それぞれ、４２１μＱまたは４４２ｐＱのＨＥＰＥＳ緩衝液！　 （１３７ミ’Ｊモル（７）ＮａＣ１゜５０ミリモルのＫＣＩ、０．７ミリモルの Ｎａ２ＨＰＯい　６ミリモルのデキストロース、２１ミリモルのＨＥＰＥＳ、ｐ Ｈ７，１）と混合した。

３２μＱの２モルのＣａＣｌ２を混合しながらゆっくり添加した。

沈澱を室温において４０分間沈降させ、次いで沈澱を２．０ｍＱのＤＭＥ＋ｌＯ ％ＣＳ中のＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。ＣＯ，のインキュベーター内において ３７°Ｃで２０分間後、追加の３，０μＱのＤＭＥ　十ｌＯ％Ｃ８を添加した。

ＤＮＡの添加後４時間に、細胞を２ＸＤＭＥで洗浄し、そして０．３モルのＨＥ ＰＥＳ緩衝化生理的塩類溶液中の１５％のグリセロールの３．０ｍＱとともに室 温においてインキュベーションすることによってグリセロール衝撃し、４ＸＤＭ Ｅで洗浄し、次いで５．０ｍＱのＤＭＥ＋ｌＯ％ＣＳ中で３８°Ｃにおいてイン キュベー’／ヨンた。１８時間後、細胞をＤＭＥ＋ｌＯ％ＣＳ中でｌ：５／１０ ｃｍ平板に分割した。４８時間後、細胞を洗浄し、そして８００μｇ／ｍＱのＧ ４１８を含有するＤＭＥ＋　ｌ　０％Ｃ５中でインキュベーションだ。Ｇ４１８ を含有する培地を３日毎に交換した。

単一のＧ４１８”コロニーをトランスフニクション後１８日に無菌のコロニーリ ングで取り上げ、そしてＤＭＥ＋ｌ　０％Ｃ５中で２４ウエル（ｗｅｌｌ）のマ ルチプレート（ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅｓ）Ｊ［７フルコン（Ｆａｌｃｏｎ）］中 で全面成長に増殖させた。次いで、抵抗性細胞を３．５ｃｍの平板に増幅のため に移し、そして最後に２つの１０ｃｍの平板に移した。分離したフォーカス（ｆ 　ｏｃ　ｉ）の各々の一方の１０ｃｍの平板を２本のアンプル［凍結培地、ＤＭ Ｅ＋２０％Ｃ３；１２．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）］中で凍結し 、そして液体窒素中で貯蔵した。フォーカスの各々の第２平板を原料平板として 使用した。　トランスフェクションの各々は多数のＧ４１８抵抗性フオーカスを 生成した。いくつかのフォーカスをＣＰＶ特異的ＲＮＡ転写体について、ＲＮＡ トンドブロットアッセイによって、放射線漂識したＣＰＶ　ＤＮＡを交雑プロー ブとして使用し、標準のプロトコルを使用してアッセイした（参照、実施例ＶＩ ）。ＣＰＶ特異的転写体を生成すると決定された個々の７オーカスを、さらに分 析のために選択した。

２、ｐＡｂＴ２４５（形質転換Ｎｏ、Ｘ）によりＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフ ェクション ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２．５ＸＩＯ’／６ｃｍ平板で、トラン７、７　エクション の２日前に接種した。細胞をトランスフェクションの４時間前に再び供給し、そ のとき細胞はほぼ８０％の全面成長であった。細胞をリン酸カルシウム沈澱とし て５μｇのｐＡｂＴ２４５でトランスフェクションした。詳しくは、５μｇのＤ ＮＡ　（６，４μＱの原料）を４４２μＱのＨＥＰＥＳ緩衝液■中の仔ウシ胸腺 担体ＤＮＡ　［ベーリンガーーマンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）］のｉｏμｇ（２μＱの原料）と混合し、次いで５０ｐＱの１．２５モル のＣａＣｌ溶液をゆっくりかきまぜながら添加した。沈澱を室温において３０分 間沈降させた。次いで、全体のＤＮＡ沈澱を５．Ｑｍｆ２のＤＭＥ＋ＩＯ％ＣＳ 中の細胞にを滴々添加し、平板をおだやかにロキングし、次いで３７℃において ４時間インキュベーションだ。インキュベーション期間の終わりに、培地を吸引 し、そして２０％のＤＭＳＯを含有する０、７ｍＱのＤＭＥ＋１０％Ｃ８を添加 して細胞を衝撃した。細胞を室温において１分間インキュベーションし、次いで リン酸塩緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で２回洗浄した。次いで、５．０ｍ１２　（７） ＤＭＥ＋］　０％Ｃ５を添加し、そして細胞を１４時間３７°Ｃにおいてインキ ュベーションだ。次いで、トランスフェクションした細胞を６ｃｍの平板中に１ ＝３に分割した。２日後、細胞を８００μｇ／ｍＱでＧ４１８を含有するＤＭＥ ＋ＩＯ％ＣＳを再び供給した。培地および新鮮なＧ４＋８を３日毎に添加した。

１４〜２１日後、よく分離されたフォーカスを取り上げ、そして前述のように増 幅したが、ただし細胞はＧ４１８（２００μｇ／ｍ０．）の存在下に維持しｔこ 。

３、　ｐＡｂＴ２４５　（形質転換ＮＯ，ＸＩＩ）およびｐＡｂＴ２４１（形質 転換ＮＯ，Ｘ　ｒ　［＋）によるＡ−７２細胞のトランスフェクション トランスフェクションは、シヒ（Ｓｈｉｈ）ら［プロシーデインダス・オブ・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃ　ｉ）　、　ＵＳＡ、　７６．５７１４　（１９７９）］が記載する ように実施した。詳しくは、Ａ−７２細胞を５Ｘ１０５細胞／１０ｃｍ平板でト ランスフェクションの１日前に接種した。トランスフェクションの４時間後、そ れらに新鮮な培地（Ｌ−１５＋Ｍｃｃｏｙｓｌ：１％　ｌＯ％ＦＳＣ）を再び供 給した。平板の各々をｌｏｐｇのプラスミドで次のようにトランスフェクション した。ＩＯμｇのプラスミドを３０μｇのサケ精子ＤＮＡ　［シグマ（Ｓ　ｉ　 ｇｍａ）］　と混合し、そして水を４４０μＱに添加し、次いで６０μαの２モ ルのＣａ　ＣＩ　２を添加した。これを、ｌＯμａの１００Ｘリン酸塩緩衝液（ ７０ミリモルのＮａＰｏ、７０ミリモルのＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ、）と混合した４ ４０　の２ＨＥＰＥＳ緩衝化生理的塩類溶液（ＨＥＰＥＳ　ｌＯｇ／Ｑ、ＮａＣ ｌ　１６ｇ／Ｑ　ｐＨ７，ＩＱ）の溶液に、この溶液に空気を通入しながら、を 滴々添加した。ＤＮＡを室温において３０分間インキュベーションし、次いで全 体の１．Ｑｍｉ２を１０ｍｆ＋の培地中のＡ−７２細胞に添加した。

細胞をおだやかにロッキングし、そして３７℃においてＣＯ２のインキュベータ ー内で４〜６時間インキュベーションだ。次いで、細胞に新鮮な培地を供給した 。３日後、トランスフェクションした細胞を１２００μｇ／ｍＱでＧ４１８を含 有する新鮮な培地中に１：４に分割した。新鮮な培地中Ｇ４１８を３日毎に添加 した。１４〜１８日後、単一のウェルの分離したフォーカスを、全体の平板を０ ．０５６％のトリプシンで１分間おだやかに処理した後、パスツールピペットで 取り上げた。分離したフォーカスを増幅し、そして前述のように貯蔵したが、Ｇ ４１８（２００μｇ／ｍＱ）中で維持した。

実施例ｖｒ ｃｐｖＨ異的ＲＮＡについてのＲＮＡドツトプロントアッセイ２つの異なるプロ トコルをＲＮＡドツトプロットアッセイのために使用した。第１の方法において 、形質転換＃ＶＩＩ（４７オーカス）、＃Ｖ１１１（１７７オーカス）および＃ Ｘ（１２））からの個々のフォーカスを、実施例５に記載するように２４ウエル のマルチプレイド（ファルコン）中で全面成長に増殖させた。細胞をＰＢＳ中で ２×洗浄し、次いでＧＴＣ（４モルのグアニジンチオシアネート、２５ミリモル のクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，５％のラウリルサルコシン）およびＤＭＳ Ｏの１＝１溶液の２００μＱで３７°Ｃにおいて３０分間溶菌した。９０ｐＱの リゼイトを２０ＸＳＳＣ（３モルのＮａＣ１，０，３モルのクエン酸ナトリウム 、ｐＨ７，０）中で前もつ湿潤したニトロセルロースでＳ＆Ｓマニホールド装置 において濾過した。試料を２ＸＳＳＣで２回洗浄した。標準の条件下に３２ｐ標 識したＣＰＶ　ＤＮＡを使用して交雑した後、フィルターをオートラジオグラフ ィーにかけた。結果を表１に示す。

ｐＡｂＴ２４１　（形質転換＃ＶＩＩ）、ｐＡｂＴ２４３　（形質転換＃ＶＩ　 Ｉ　［）およびｐＡｂｒ２４５　（形質転換＃Ｘ）で形質転換した３Ｔ３細胞中 のＣＰＶ構造遺伝子の発現ニ スクリーニングした　ＣＰＶ　ＲＮＡを発現する形質転換＃Ｘ［１（１５７オー カス）および＃ＸＩＩＩ（１１フオーカス）からの個々のフォーカスを、次の方 法で、ＣＰＶ交雑性ＲＮＡについてスクリーニングした：細胞を、前述のように 、５ｃｍ平板中で全面成長に増殖させた。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで１ｍ ＱのＰＢＳ中に引っ掻いて入れ、遠心によって収攬し、１ｍＱのＰＢＳ中で１回 洗浄し、次いで４５μＱの１０３９モルのトリス　Ｃ１，１ミリモルのＥＤＴＡ 中に再び懸濁させた。５μＱのＮＰ４０を各試料に添加し、そして試料を氷上で ５分間インキュベーションだ。次いで、さらに５μＱのＮＰ４０を添加し、そし て氷上のインキュベーンコンをさらに５分間続け、その後核をマイクロフーグ（ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で２゜５分間遠心により沈澱させた。次いで、５０ｐＱ の上澄み液を３０μＱの２０ｘｓｓｃおよび２０μＱの３７％（Ｗ／ｖ）のホル ムアルデヒドの混合物に添加した。混合物を６０°Ｃにおいて１５分間インキュ ベーションし、試料をニトロセルロース上にスポツティングし、そして前節にに 記載するように処理した。形質転換＃ＸＩ＋からの１４フオーカスのすべては多 少のレベルのＣＰＶ交維性ＤＮＡを含有した；形質転換＃１３からのｌｌフォー カスの６は、また、ｃｐｖ特異的ＲＮＡを示した（表２）、。

表２ ｐＡｂＴ２４５（形質転換体＃ＸＩ＋）およびｐＡｂＴ２４３　（形質転換体＃ ＸＩＩＩ）で形質転換したＡ−７２細胞中のＣＰＶ構造遺伝子の発現 形質転換体　ＲＮＡ　ＨＡ単位 Ｘ１ｌｌ　１　３２０ ２　Ｎ　／　Ｄ ｌ　４　＋／−６４Ｏ Ｎ、Ｄ、：決定せず。

これらの実験においてＣＰＶ交雑性ＲＮＡを示した、ある個々の形質転換体は、 それ以上の分析について選択した。形質転換体Ｖｌｌ−１、Ｖｌｌ＋−２、Ｘ− １％Ｘ−２８よびＸ−５と表示した。さらに、形質ングしたパルヴオウイルスキ ャプシドの産生について、下の実施例Ｘに記載するように赤血球凝集アッセイし た。によってアッセイした（表２）実施例ＶＺ ｃｐｖキャプシドの調製 ＣＰｖ感染したＡ−７２細胞からの赤血球凝集活性の調製（すなわち、完全なキ ャプシド）は、典型的には次の方法で実施した。すべての作業は、特記しない限 り、４°Ｃにおいてまたは氷上で実施した。感染した細胞からのほぼ３００〜ｌ ｏｏｏｍＱの培地を限外濾過（アミコン撹拌した細胞、ＹＭＩＯ膜）によって濃 縮し、次いで１４．５００ｇ　［１０゜ＱＯＯｒｐｍ、ンーバル（Ｓｏ　ｒｖａ 　ｌ　１）ＳＡ６００ローター］において１５分間遠心により細胞の破片を清浄 にしｔ；。試料（上澄み液）を５８．０００ｇ　［２５，ＯＯＯｒｐｍ、ベック マン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＳＷ５０．１０−ター１で４時間回転し、その後得られ るウィルスの沈澱を１ｍＣの５０ミリモルのトリス、ｐＨ８，０１０，５ミリモ ルのＥＤＴＡで再懸濁した。さらに細胞の破片をクロロホルムの抽出によって除 去し、ここで試料を１ｍ＋２のクロロホルムと混合し、次いで１４，５００ｇ　 （１０，ＯＯＯｒｐｍ、ソーパル５Ａ６００ローター）で回転した。次いで、水 性相を直線のスクロース勾配、ｌＯ〜４０％’ＪＪ　Ｚ　Ｗ　ｓ上に層状にし、 そして８３，０００ｇ　（２５，０００’ｒｐｍ、ベックマン５Ｗ２８０−ター ）で５．５時間回転した。ウィルスの帯を集め、５０ミリモルのトリス、ｐＨ８ ，０１０，５ミリモルのＥ’　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液に対して透析してスクロースを 除去し、次いでＣｓＣＩで１．３８　ｇ／ｍＱの密度に調製し、そして超遠心機 で９９．０００ｇ　（３８，ＯＯＯｒｐｍ、ベックマン　７０．ＩＴｉローター ）において３６時間回転した。

分画を密度勾配から集め、そして下の実施例Ｘに記載するように赤血球凝集活性 についてアッセイした。分画の各々の屈折率を測定して、その溶液密度を決定し た。精製したＣＰＶを、まＩ；、下の実施例！Ｘに記載するように５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによって分析した。

ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ形質転換した細胞の赤血球凝集の活性の調製は、ウィルス 感染した細胞について上に概説したのと同一の手順の変更に従った。

１．４ＸＩＯ”の形質転換した細胞から調製した沈澱を１ｍＱのトリス、ｐＨ８ ，０１０，５ミリモルのＥＤＴＡで懸濁させ、そして超音波によって溶菌した。

試料を１４．０００ｇの低い回転の遠心にかけ、次いで前述のようにクロロホル ムで抽出した。スクロースの勾配を省略し、そしてトリス／ＥＤＴＡ中の試料を ＣｓＣ］密度勾配に直接適用した。

実施例Ｖｒｌｌ 普通の抗血清の製造 ＣＰＶに対するウサギポリクローナル抗血清を、抗原として不活性化し、精製し たＣＰＶを使用してレイズした。塩化セ／ウムで帯にしたウィルスを２５４ｎｍ において３７°Ｃで照射した（ＵＶ源のランプＵＶｃ　ｒ−−２５型ミ不ラライ ト；試料から１．５ｃｍ）。得られる試料は、組織の培養において試験すること によって、感染性ウィルスを合釘しないことが決定された。試料からほぼ１００ μｇのタンパク質を、雌のニューシーラント白ウサギに、完全７０インドアジユ バントと皮膚内および筋肉内注射液の混合物によって接種した。１００−１５０ ｇｇのタンパク質から成る免疫化ブーストを、１月の間隔で、皮下注射によって 、不完全ツウインドアジュバントで１回、引き続いてアジュバントなしで与えた 。注射後７〜１９日に動物から採血した。血清を５６°Ｃに３０分間補体を不活 性化し、１２，０００ｇで１０分間回転して凝血を除去し、そして−２０℃で貯 蔵した。

ＣＰＶのエピトープに対するマウスモノクローナル抗体は、一般に、コソン・パ リソン（Ｃｏｌｉｎ　Ｐａｒｒｉｓｈ）博士から入手し、そしてパリソン（Ｐａ ｒｒｉｓｈ）ら、アーチープス・才ブ・ピロロジー（Ａｒｃｈ、Ｖｉ　ｒｏ　１ ．）　、７２．２６７　（１９８２）に記載されてし＼る。

実施例ＩＸ 形質転換した細胞中で産生されたＣＰＶタンパク質の免疫沈澱による分析 １〕代謝の標識つけ： ＣＰ　Ｖ／Ｂ　Ｐ　Ｖ形質転換した３Ｔ３細胞を、ＤＭＥ　（メチオニン不合） 、１０％の仔タシ血清、担体のメチオニンＣＯ−３ｍｇ／ｌ　ＯＯｒ＋１　）、 ２．０ミリモルのグルタミンおよび１００μＣｉの［３ＳｓＪ　メチオニン［二 ニー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ ）］から成る培地中で２４時間標識した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして１ ｍ＋＋の免疫沈澱綴衝液（ＩＰＢ）（１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ５　ｐＨ７ ，２，６５０ミリモルのＮａＣｌ、１％のｈ！ＪドアＸ−１００，１％のＳＤＳ 、５ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオライド 、０．１ｍｇ／ｍＱのトリプンン阻害剤およびＩミリモルのＡＴＰかも成る）中 に引っ掻いて入れｌ；。リゼイトを８０℃で貯蔵した。

２）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の調製： 殺しかつホルマリン固定した球菌ブドウ球菌（ＩｇＳｏｒｂ）は、酵素センター （Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）（マサチュセッッ州マルデン）から１０％（Ｗ ／Ｖ）懸濁液として得た。細胞をＩＰＢで２回洗浄し、そしてマイクロフーグ（ エノペンドルフ）内で５分間回転することによって沈澱させた。細胞をＩＰＢ中 に１０％または２０％（ｗ／ｖ）の最終濃度に再懸濁した。

黄色ブドウ球菌およびＩｇＧの予備形成した複合体を、５体積の１０％（Ｗ／Ｖ ）の黄色ブドウ球菌を１体積の正常な血清とともＩ：０℃でＩＯ分間インキユベ ーンヨコンることによって調製した。複合体を沈澱させ、２回洗浄し、そしてＩ ＰＢ中で２０％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度に再懸濁しｊ二。

３）免疫沈澱： 免疫沈澱は、０．３ｍＱのＩＰＢ中に５μＣｉを各々が含有する細胞の試料につ いて実施した。黄色ブドウ球菌の抗体のすべてのインキュベーションは、４℃で ロッキングしながら実施した。試料の各々は、５０μαの予備形成した免疫複合 体（黄色ブドウ球菌−ＴｇＧ、２０％［Ｗ／ｖ１）とともに１時間インキュベー ションし、そしてマイクロフーグ内で５分間遠心することによって清浄にして予 ＠清浄化した。上澄み液を新しい試験管に移し、そして予備清浄化を反復した。

次いで、得られる上澄み液を５０μＱの２０％（ｗ／ｖ）の黄色ブドウ球菌でさ らに３０分間処理した。を後に、上澄み液を新しい試験管に移し、そして−次抗 体とともに適当な希釈ｌ二おいてインキュベーションだ。次の日、５０μＱの１ ０％の黄色ブドウ球菌を試料に添加し、そしてインキュベーションを３０分間続 けた。黄色ブドウ球菌複合体を遠心によって沈澱させ、そして２００　ｔｔＱの ＩＰＢで洗浄した。この懸濁液を示差的スクロース勾配［４００ｐＱの１０％（ Ｗ／Ｖ）スクロース１０，５モルのＮａＣ１／ＩＰＢ］上に層状にし、そしてマ イクロフーグ内で１０分間回転した。得られる沈澱を２００μＱのＩＰＢで洗浄 し、そして２０μＱのゲル試料綴衝液で再懸濁させた。試料を５分間１００℃に 加熱し、遠心して沈澱を除去し、そしてＳＤＳゲル上に適用するため注射器で外 に取り出した。

４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびオートラジオグラフィー：５ＤＳ−ポリアクリ アミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、０．７５ｍｍのスラブゲル上で 、還元性条件下に実施した［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔ ｕｒｅ）、２２７．６８０（＋９７０）］。分離ゲルは８％のアクリルアミドで あり、そして３７５ミリモルノドリス、ｐＨ８，８、Ｏ，１％のＳＤＳ、０．３ ３％のＴＥＭＥＤｌおよび０．０２％の過硫酸アンモニウムを含有した；積み重 ねたゲルは３％のアクリルアミドゲルであり、そして１２５ミリモルのトリス、 ｐＨ６，８，０，１％１７）ＳＤＳ、Ｏ，１％（７）ＴＥＭＥＤ、Ｓよび０．１ ％の過硫酸アンモニウムを含有した。試料を等体積の２×試料緩衝液（１２５ミ リモルのトリス、ｐＨ６，８，４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の （ｖ／ｖｊＢ−メルカグトエタノール、および微量のブロモフェノールブルー） と混合し、１００℃に加熱し、短い遠心によって清浄にし、そしてゲルに適用し た。電気泳動を２５ミリモルのトリス、ｐＨ８，３，１９２ミリモルのグリノン 、Ｏ，１％のｓＤｓ中で約３０ｍＡにおいて、粘性の色素がゲルから出るまで、 実施した。ゲル上のタンパク質の相対的移動を、１組の１４（の放射性分子量標 準（Ｂ　ＲＬ）と比較した。ゲルを３０％のメタノール／１０％の酢酸／６０％ のＨ，０中で固定し、そしてＥｎ３Ｈａｎｃｅ　Ｉニュー・イングランド・ニュ ークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）］中で１時間インキュ ベーションし、次いで水中で１時間インキュさ一ンコンすることによってオート ラジオグラフィーのために準備した。

ゲルを６０°Ｃで真空乾燥し、次いでコダックＸ−ｏｍａｔ　ＡＲ−５フィルム に一８０℃にお（１て露出した。

５）結果： ＣＰＶ／ＢＰＶ形質転換したＶｒ　Ｉ−１，Ｖｒ　Ｉ　Ｉ−Ｌ　Ｘ−Ｌ　Ｘ−２ 、およびＸ−５を、ＶＰ２’　およびＶＰＩの発現について、それらの［＋５５ ］　メチオニン標識タンパク質の免疫沈澱分析によって検査した。

試験は最初に培養上澄み液およびクローンから誘導した細胞リゼイトの両者につ いて実施した；しカルながら、培養上澄み液の分析は、それらの低いタンパク質 濃度が明確なシグナルを提供しなかったので、中断した。標的タンパク質は細胞 リゼイトから容易に免疫沈澱し、それゆえＣＰＶタンパク質を発現するクローン の陽性の同定はその源からなされた。

免疫沈澱の分析によって、５つの形質転換体は明瞭にＣＰＶタンパク質ＶＰ２’ およびＶＰＩの産生を示した。首尾よい免疫反応は、われわれのウサギおよびマ ウス−ＣＰ■抗血１ｆｒ（１：１００希釈）といくつかのマウス−ＣＰ■モノク ローナル抗体（１：　１０００希釈：コリン・）（リツン博士）との両者を用い て、沈澱試薬として黄色ブドウ球菌を使用して、再び発生した。同様に、われわ れはＡ−７２細胞から生成したクローンからＣＰＶタンパク質を免疫沈澱するこ とかでさた。試験した９つのクローンのうちで、５つは非常に強い陽性のシグナ ルを示した（２つは形質転換Ｘｌ＋から；３つは形質転換Ｘｌｌ＋からであった ）。

実施例Ｘ 赤血球凝集（ＨＡ）試験 赤血球凝集のアッセイを使用して、試料中のＣＰＶキャブンドの存在を評価した ［パ パリソ／（Ｐａｒｒｉｓｈ）ら、アーチーブス・オプ・ビロロジ＝（Ａｒｃｈ、 Ｖｉｒｏｌ、）、２ヱ、２６７１゜アッセイの緩衝液、パルビタールー緩衝化生 理的塩類溶液（Ｂ　Ｂ　Ｓ）は、３２ミリモルのバルビタール、２８．６ミリモ ルの酢酸ナトリウム、２．５ミリモルのＭｇＣＬ　６Ｈ２０，０，７５ミリモル のＣａ　Ｃｌ　２−２Ｈ２０，１１６，８ミリモルのＮａＣｌ、および０．１％ のウシ血清アルブミン、ＩＮ　ＨＣＩでｐＨ６，２に調節した、から成っていた 。

１００％の全面成長で形質転換体細胞から得られた細胞の沈澱を、２５０μＱの ＢＢＳ中に懸濁させ、そして超音波処理によって溶菌した［多数のバースト、５ ０％の能力のサイクル、ソニケイター・ウルトラソニック・プロセッサー　ｗ− ２２５を（ヒート・システムス・ウルトラソニック・インコーホレーテッド（Ｈ ｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ、））］。試試験材の 各々の２５μａの部分各々をＶ−ウェルのマイクロタイタープレートの第１ウエ ル中で２５μａのＢＢＳと混合し、次いで２倍の希釈で血清的に交差希釈した。

次いで、レスス（ｒｈｅｓｕｓ）サルの赤血球（ＢＢＳ中で２回洗浄した）の０ ゜５％の溶液の５０μＱを細胞の各々に添加し、そしてインキュベーションを４ ℃において２〜１６時間実施した。ＨＡ力価を、完全な赤血球凝集を与えた最後 の希釈の逆数（ｒｅｖｅｒｓｅ）として読んだ。

赤血球凝集のアッセイは、選択したＣＰＶ／ＢＰＶ形質転換体について実施して 、アセンブリングしたパルヴオウイルスキャブシドを産生ずるクローンが存在す るかどうかを決定した。試験したクローンのすべて（Ｖｌｌ−１、Ｖｌ　ｒ　Ｉ −１、Ｘｉ、Ｘ−２、およびＸ−５）は、強い赤血球凝集力価を示した（表３） 、最も強い陽性のクローン（Ｘ−５）は、それ以上の特性付けのために選択した 。このクローンからＨＡ単位の収率は、１０’〜ｌＯ″／細胞のキャプシド粒子 が生成したことを示した（ＩＨＡ単位は、ロウリイ（ｌｏｗｒｙ）のタンノくり 質決定に基づし）て２ＸＩＯ”キャプシド粒子および４Ｘ１０’ダルトンの中空 キャプシドの分子量と相関関係をもつ）。比較により、ＣＰＶ感染したＡ−７２ 細胞の培養物は典型的にはｌＯ′／細胞の粒子を生成する。赤血球凝集の滴定は 、また、Ｂ　Ｐ　Ｖ／ＣＰ　Ｖ形質転換したＡ−７２細胞から得た。

（参照、表２）ａ ＣＰＶ／ＢＰＶ形質転換３Ｔ３細胞からの赤血球凝集力価の発現ｘ−５０４１０ ００ 形質転換した細胞を１０ｃｍの平板にほぼ２Ｘ１０’細胞の密度で接種した。全 面成長に到達した後、細胞を収穫し、そして超音波処理により溶菌した。ＨＡア ッセイは実施例Ｘに記載するように実施した。

実施例ＸＩ Ｃ５Ｃ１勾配遠心によるＣＰＶキャプシドの特性付けＸ−５の赤血球凝集活性は 、細胞リゼイトの分画においてのみならず、かつまた培地の上澄み液において検 出された。われわれは、ＨＡ活性の精製を実施して、それがバルヴオウイルスの 中空キャプシドの粒子として挙動するかどうかを確証した。リゼイトは１．３５ Ｘ１０”細胞の形質転換した糸状から調製した。細胞の破片を遠心により１４． ５００ｇにおいて除去し、そして得られる上澄み液を５８．０００ｇで高速回転 して沈澱を生成した。沈澱をさらにクロロホルムの抽出によって精製した。試料 を１ｍＱのクロロホルムと混合したｉｍ（２の緩衝液（５０ミリモルのトリス、 ｐＨ８−０１０，５ミリモルのＥＤＴＡ）で再懸濁させ、そして１４．５００ｇ で遠心した。この工程は破片を相間中に抽出した。

緩衝液の相をＣｓＣｌ勾配（１、３８ｇ／ｍＱ　）に適用し、そして９９゜００ ０ｇ、４℃において３６時間遠心した。次いで、分画を勾配の試料の底から集め 、モしてＨＡ単位についてアッセイした。ＨＡ活性は移動し、ピークは１　、３ ３　ｇ／ｍＱの密度において中心をなしく屈折率＝１゜３６６）、これは中空キ ャプシドについて報告されている値と一致する［バチマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ） ら、インターピロロジー（Ｉｎｔｅｒｖｌｒｏｌｏｇｙ）、ｌｌ−１２４８（１ ９７９）］　、この活性な分画け、ＳＤＳゲルの分析により、不均質であり、Ｖ ＰＩおよびＶＰ２″に加えて、多くの他のタンパク質の帯を含有することが示さ れた。

Ｘ−５の粗製の細胞リゼイトのＨＡ活性は、それらが−８０°Ｃにおいて貯蔵す るとき、安定であり、そしてなおさらに凍結乾燥または凍結−融解によって影響 を受けない。しかしながら、４℃において、キャプシド粒子の凝集がゆっくり起 こり、これは数日にわたってＨＡ活性は実質的に失われる。凝集の速度は、緩衝 および希釈の作用に従う。損失した活性は超音波処理によって部分的に再生され る。比較により、ＣＰＶ感染した粗製の細胞リゼイトはそれらの赤血球凝集活性 に関して安定である。ざらにＸ−５キャプシド粒子の安定性を研究すると、リゼ イト自体の成分によって不安定性が明らかに促進することが立証された。スクロ ース勾配（ｔｏ−３０％　ｗ　／　ｖ　）でさらに精製した試料は、４°Ｃで３ か月間貯蔵した後でさえ、完全に活性にとどまった。

われわれはＸ−５の培養上澄み液中の赤血球凝集活性を検出することができなか ったが、いくつかの細胞外分画の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、これらはそれ にもかかわらずＣＰＶポリペプチドＶＰ２’　およびＶＰＩ（はぼ４州で）含有 したことを示した。これらの細胞外リゼイト分画において、ならびに細胞内リゼ イト分画において、ＶＰ２’対ＶＰＩの比は精製したＣＰＶ中のこれらのタンパ ク質の比に同一である。

実施例Ｘ１１ Ｘ−５から調製した中空キャプシドを使用する免疫化細胞リゼイトを１０枚の１ ５ｃｍの全面成長したＸ−５細胞の平板から、収穫した細胞の沈澱を］ｍ１２の ＰＢＳ中Ｉこ懸濁させ、細胞懸濁液を３回凍結−融解することによって調製した 。細胞リゼイト中のＨＡ力価は、はぼ２ＸＩＯ’ＨＡ単位／　ｍ　Ｑであった。

赤血球凝集単位は、実施例Ｘに記載するように決定した。

第１ＥＮｍ、２匹の子犬（血清陰性の雌）を隔離して配置し、血清試料を集め、 イヌの各々をＰＢＳ中の細胞リゼイトの０．３μＱ　（イヌ＃２１５）で、ある いは１０％の水酸化アンモニウム（イヌ＃２１４）で筋肉内接種した。追加の血 清陰性イヌを第１９日に接触の対照として添加した（イヌ＃　１８４）。第４日 に、２匹の前厄てワクチン接種したイヌを前のように再び免疫化した。すべての イヌは、第８３日にオロナサル（ｏｒｏｎａｓａｌ）ｍ種により、イヌのパルヴ オウイルスのビルレント１９８０年後（ｐｏｓｔ−１９８０）の菌株のほぼ２Ｘ １０’プラ一ク形成単位（Ｐ　Ｆ　Ｕ）で対抗した（ＣＰＶ−１５、Ｃ，Ｐａｒ ｒｉｓｈ。

Ｊａｍｅｓ　Ａ、Ｂａｋｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｔ　Ｈ ｅａｌｔｈ、Ｃｏｒｎｅｌｌ）ａこの系統（ま、構造タンノくり質遺転子をクロ ーニングしたウィルスと抗厚的に異なる。対抗ウィルスの１９８０月後の菌株は 、３つの理由で選択した＝　（ｉ）それは１９８０年前の菌株よりビルレントで あり、したがってより容易に監視することができ、（１１）それは現在性質が普 通にイヌを感染するウィルスであり、そして（商１）それはイヌのパルヴオウイ ルス１９８０年後の菌株に対する保護におけるワクチンの効能の決定を可能とす る。

実験の過程の開極々の間隔でイヌから採血し、そして血清試料をパリ７シ（Ｐａ ｒｒｉｓｈ）ら［アーチーブス・オブ・ピロロジー（Ａｒｃｈ。

Ｖｉｒｏｌ、）、ヱ２，２６７　（１９ｇ２）］が記載するように赤血球凝集阻 止（Ｈｌ）についてアッセイした。力価は、レススサルの赤血球のウィルスの赤 血球凝集を完全に阻止した最高の希釈度の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）して表 し、そして血清中の抗ＣＰＶ抗体のレベルの測度である。これらの結果を表４に 示す。これらの結果が明瞭に示すように、抗体はＸ−５抗原に対して応答し、な らびにウィルスによる対抗後、高いレベルの抗ＣＰｖ抗体が存在する。これらの 血清は、また、ＰＦＵ還元アッセイにおいて中和性抗ＣＰＶ抗体の存在について 試験した。血清中和力価（ＳＮＴ）は、次のように決定した：血清を５６°Ｃで ３０分間不活性化し、次いで系統的に希釈した。等体積の血清およびウィルス（ はぼ４ＱＰＦＵのＣＰＶ菌株ＣＰＶ−９５；Ｃ，Ｐａｒｒｉｓｈ、Ｊａｍｅｓ　 Ａ、Ｂａｋｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ） を混合し、そして室温において１時間インキュベーションし、そのとき混合物の 各々を単層のＡ−７２細胞（Ｐ１６５−１７３；Ｊａｍｅｓ　Ａ、Ｂａｋｅｒ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ）に添加した。平板 を３７°Ｃにおいて１時間震盪しながらインキュベーションし、次いで０．９％ のアガロースを含有する成長培地をオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙ）した。５日 後、平板を固定し、着色し、そしてプラークを計数した。対照実験において、ウ ィルスを血清の不存在下に力価決定した：比較のため、ウィルスは、また、対照 （超免疫）血清とともにインキュベーションだ。これらの結果を表４に表す。こ れらの結果が示すように、免疫レベル前よりもワタチン接種したイヌのＳＮＴは 増加し、ならびに対抗後１日における対照イヌ＃１８４に比較してイヌ２１４の ＳＮＴは増加する（この時におけるイヌ＃２１５のＳＮＴは決定しなかった）、 。

表４ 対抗前および後の血清赤血球凝集および血清中和力価：血清中和力価 血清の希釈 日　イヌ＃　Ｈｌ　５　２５　１２５　６２５　３＋２５　１５６２５０　２１ ４　＜１０　４４　２８　３０　−４０　１８４　＜１０　２４　２７　３４　 −（ブースター）２１４　く１０　０　５　２７　−７６　１８４　〈１０ ８３　１８４　３６３７３３　−　−、　−（対抗後　２１４　＞２０４８０ １０日）　２１５　＞２０４８０ （ＳＮＴ滴定、アッセイ前にｌ：ｌｏＯに希釈した）対照の血清 （赤血球凝集）１０２４０　０　０　０　４　９　２７血清を含まないウィルス の対照の滴定は３７／４２／４４　ＰＦＵの力価を与えた。

追加の実験において、ウィルスで対抗したイヌの血清および便中のＣＰＶの存在 を検査した（表５）。プラークのアッセイによって測定して、対抗後４日までワ クチン接種した動物の血漿中でＰＦＵは本質的に検出サレナったが、対抗後３日 に有意のレベルのウィルスが対照動物の血清中に検出された。さらに、対照イヌ はワクチン接種したイヌのいずれよりも便中に非常に高いウィルスＨＡ力価を放 出した。

表５ 便の赤血球凝集力価および血清ウィルス力価：イヌの番号 対抗後の　１８４　２１４　２１５ 日数　ＨＡ　ＰＦＵ　ＨＡ　ＰＦＵ　ＨＡ　ＰＦＵ３　２６ＸＩＯ’２　０　２ 　１ ６　試料なし＊　２−４　２ ７　２５６−５１２＊＊　２　２ ＊　イヌは食べなかった一便は集めなかった。

＊＊　この日イヌ＃１８４は下痢をした。すべての他の試料を正常である。

さらに、対照イヌは下痢を発生したが、ワクチン接種したイヌは発生しなかった 。明らかにワクチン接種したイヌは病気に対して保護された；しかしながら、よ り高い対抗後血清Ｈ１力価および便中に放出され多少のウィルス粒子によって示 されるように、ワクチン接種したイヌにおけるウィルスの複製のレベルが制限さ れた。この免疫応答は、商業的に入手可能な殺したＣＰＶワクチンによるワクチ ン接種後に見られる応答に匹敵する。

同等の実施態様 当業者は認識するように、あるいは日常の実験を越えないで確認できるように、 ここに記載した本発明の特定の実施態様にに対して多くの同等の実施態様が存在 する。このような同等の実施態様は、次の請求の範囲に包含されることを意図す る。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年３月８日 ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２２０４ ２、発明の名称 中空ウィルスキャプシドのワクチン ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチュセツツ州０２１４２ケンブリッジ・ロジャーズ ストリート８０名　称　アプライド・バイオテクノロジー・インコーホレーテッ ド４、代理人　〒１０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正書の提出年月日 １９８８年ｌＯ月３日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通請求の範囲 １、ウィルス中和性免疫応答を引き出すことができる、ネズミ以外の免疫原性の 中空ウィルスキャプシド。

２、ウィルスはパルヴオウイルスである請求の範囲第１項記載のウィルスキャプ シド。

３、バルヴオウイルス（ま、イヌ、ネコ、ミンク、）゛り、ウシまｔこはヒトの パルヴオウイルスである請求の範囲第２項記載のパルヴオウイルス。

４、免疫原性の中空イヌのバルヴオウイルスキャプシド。

５、セルファセンブリ−性の形態の不ズミ以外のウィルスキャプシドのタンパク 質をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で含有するＤＮＡベクターによっ て、形質転換された真核生物の細胞によって発現された、ウィルス中和性免疫応 答を引き出すことができる、セルファセンブリ−した免疫原性の中空ウィルスキ ャプシド。

６、ウィルスはバルヴオウイルスである請求の範囲第５項記載のウィルスキャプ シド。

７、パルヴオウイルスはイヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシまたはヒトのパルヴオ ウイルスである請求の範囲第６項記載のウィルスキャプシド。

８、キャプシドタンパク質をエンコードする遺伝子は、パルヴオウイルスのキャ プシドのタンパク質ＶＰＩおよびＶＰ２′をエンコードする、請求の範囲第６項 記載のウィルスキャプシド。

９、真核生物の細胞はネズミまたはイヌの細胞である請求の範囲第６項記載のウ ィルスキャプシド。

ｌＯ、セルファセンブリ−性の形態のイヌのパルヴオウイルスのキャプシドのタ ンパク質ＶＰｌおよびＶＰ２’　をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で 含有するＤＮＡベクターによって形質転換された、イヌまたはマウスの細胞によ って発現された、セルファセンブリ−した中空イヌのバルヴオウイルスキャプシ ド。

ｌ１１成分： ａ１免疫化量の、ウィルス中和性免疫応答を引き出すことができる、免疫原性の 中空ウィルスキャプシド、およびｂ１製薬学的に許容されうる注射用賦形剤、か らなる、ネズミ以外のウィルスおよび前記ウィルスの抗原的に関連する種に対し てワクチン接種するためのワクチン組成物。

１２、成分： ａ１免疫化量の、ウィルス中和性免疫応答を引き出すことができる、免疫原性の 中空動物のバルヴオウイルスキャプシド、およびｂ、製薬学的に許容されうる注 射用賦形剤、からなる、不ズミいパルヴオウイルスおよび前記バルヴオウイルス の抗原的に関連する種に対してワクチン接種するだめのワクチン組成物。

１３、バルヴオウイルスキャプシドはイヌのバルヴオウイルスキャプ／ドである 、イヌ、ネコまたはミンクのワクチン接種のだめの、請求の範囲第１２項記載の ワクチン組成物。

１４、成分： ａ、ウィルス中和性免疫応答を引き出すことができる、セルファセンブリ−した 免疫化量の免疫原性の中空不ズミ以外のパルヴオウイルスキャブシド、前記キャ プシドは、セル７アセンブリー性の形態のパルヴオウイルスキャプンドのタンパ ク質をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で含有するＤＮＡベクターによ って、形質転換された真核生物の細胞によって発現されており、および す、製薬学的に許容されうる注射用賦形剤、からなる、ネズミ以外のバルヴオウ イルス対してワクチン接種するためのワクチン組成物。

１５、動物のパルヴオウイルスはイヌのパルヴオウイルスである請求の範囲第１ ４項記載のワクチン組成物。

１６、動物に免疫化量の不ズミ以外のウィルスの免疫原を投与することからなる 、ウィルスに対して動物をワクチン接種する方法において、前記ウィルスの免疫 原はウィルス中和性免疫応答を引き出すことができる免疫原性の中空ウィルスキ ャプシドである改良。

１７、ウィルスはパルヴオウイルスであり、そしてウィルスキャプシドは動物の パルヴオウイルスのキャプシドである、請求の範囲第１６項記載の改良。

１８、前記中空ウィルスキャプシドは、セルファセンブリ−性の形態のウィルス キャプシドのタンパク質をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態でをするＤ ＮＡ発現ベクターによって、形質転換された真核生物の細胞によって発現された 、セルファセンブリ−した免疫原性の中空ウィルスキャプシドである、請求の範 囲第１６項記載の改良。

１９、ウィルスは動物のパルヴオウイルスであり、そしてウィルスキャプシドは 動物のバルヴオウイルスのキャプシドである、請求の範囲第１８項記載の改良。

２０、動物はイヌ、ネコまたはミンクであり、そしてウィルスはイヌのバルヴオ ウイルスである、請求の範囲第１８項記載の改良。

２１、不ズミ以外の免疫原性の中空ウィルスキャプシドであり、ウィルス中和性 免疫応答を引き出すことができるキャプシドを発現できるＤＮＡ発現ベクター。

２２、ウィルスキャプシドはバルヴオウイルスキャプシドである、請求の範囲第 ２１項記載のＤＮＡ発現ベクター。

２３、パルヴオウイルスキャブシドは、イヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシまたは ヒトのパルヴオウイルスである請求の範囲第２２項記載のＤＮＡ発現ベクター。

２４、成分： ａ１真核生物の宿主から誘導された複製起源、ｂ１真核生物の宿主のための複製 起源を有する、実質的に全体のウシ乳頭腫ウィルスのゲノム、 ｃ１真核生物のプロモーター、 ｄ、セルファセンブリ−性の形態のバルヴオウイルスのＶＰＩおよびＶＰ２’　 のキャプシドタンパク質をエンコードする構造遺伝子を少なくとも含有するバル ヴオウイルスのゲノムの部分、前記部分は真核生物のプロモーターの指令の下に あり、不安定性の原因であるバルヴオウイルスのゲノムの５′領域を排除する、 およびｅ、Ｒ核生物の宿主および真核生物の宿主に選択可能な表現型の特性を与 える遺伝子、 からなる、原核生物の宿主および真核生物の宿主中において複製することができ かつ真核生物の宿主中においてネズミ以外の中空パルヴオウイルスキャプシドを 発現することができるプラスミド。

２５、複製起源はプラスミドｐＢＲ３２２から誘導され、真核生物のプロモータ ーは不ズミのメタロチオンニンのプロモーターであり、そして真核生物の宿主の ために選択可能な特性を与える遺伝子はＮｅｏ”遺伝子である請求の範囲第２４ 項記載のプラスミド。

２６、前記凡ｅｏＲ遺伝子はＶＰＩおよびＶＰ２’の構造遺伝子より下流にかつ それらに隣接して位置し、これによって前記遺伝子は不ズミのメタロチオンニン のプロモーターの指令の下にある請求の範囲第２５項記載のプラスミド。

２９、真核生物のプロモーターは、ｖＰｌおよびＶＰ２’　タンパク質をエンコ ードする、内因性パルヴオウィルスのプロモーターである、請求の範囲第２４項 記載のプラスミド。

３０、第４図、第５図および第６図に実質的に示すキメラのプラスミドｐＡｂＴ ２４１．ｐＡｂＴ２４３、ｐＡｂＴ２４５゜３１、ウィルス中和性免疫応答を引 き出すことができる、セルファセンブリ−した、免疫原性の、中空キャプシドを 産生でさるトランスフェクションした真核生物の細胞。

３２、ウィルスキャプシドはネズミ以外のバルヴオウイルスキャプシドである、 請求の範囲第３１項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３３、パルヴオウィルスキャブシド（まイヌのバルヴオウィルスキャブシドであ る、請求の範囲第３２項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３４、ネズミ３Ｔ３細胞、不ズミＣｌ２７細胞またはイヌＡ７２細胞である、請 求の範囲第３３項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３５、それぞれ、第４図、第５図および第６図に実質的に示すｐＡｂＴ２４１． ｐＡｂＴ２４３８よびｐＡｂＴ２４５から成る群より選択されるプラスミドでト ランスフェクションされた真核生物の細胞。

３６、ネズミ３Ｔ３細胞、ネズミＣ１２７細胞またはイヌＡ？２細胞である、請 求の範囲第３５項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。

３７、体液をネズミ以外のウィルスの中空ウィルスキャプシドと接触させ、前記 キャプシドは抗ウイルス抗体と結合することができ、そして前記中空ウィルスキ ャプシドへの前記抗体を決定することからなる、体液中の抗ウイルス抗体を検出 または定量する方法。

３８、工程： ａ１ウィルスの中空ウィルスキャプシドが結合した固相からなる免疫吸着剤を、 試験すべき生物学的流体の試料と、前記試料中の抗ウイルス抗体が前記免疫吸着 剤に結合できる条件下に、インキユベーンコンし、ｂ１前記免疫吸着剤を前記試 料から分離し、そしてＣ１前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを 、前記試料中の抗ウイルス抗体の指示として決定する、からなる、生物学的流体 中のウィルスに対する抗体を検出する方法。

３９、前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを決定する工程は、生 物学的流体を誘導する種の抗体に対する標識した抗体とともに、前記免疫吸着剤 をインキュベーンコンし：インキュベーション期間後、前記標識した抗体から前 記免疫吸着剤を分離し：そして前記免疫吸着剤に関連する標識を検出することか らなる、請求の範囲第３７項記載の方法。

４０、宿主の動物または細胞を免疫原性の中空ウィルスキャプシドで免疫化する ことによって産生された抗ウイルス抗体。

４１、前記中空ウィルスキャプシドはイヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシおよびヒ トのバルヴオウイルスから成る群より選択される、請求の範囲第４０項記載の抗 ウイルス抗体。

４２、請求の範囲第４０項記載の抗体を体液と接触させ、そして前記抗体の存在 または不存在を検出する、ことからなる、体液中のウィルス粒子を検出する方法 。

４３、ウィルスの抗原的に関連する種に対して交差保護的免疫性を提供する免疫 原性の中空ウィルスキャプシド。

４４、パルヴオウイルスキャプシドである請求の範囲第４３項記載のキャプシド 。

それ以上の進歩はある数の有用な宿主細胞の発現において教示される。

出願人は、ビンチル（Ｐｉｎｔｅｌ）らが使用したＣｌ２７系統以外の不ズミ細 胞、およびまたイヌ細胞において、高いレベルの発現を示した。

ビンチルＣＰｉｎｔｅｌ）らの教示および出願人の開示の組み合わせから、当業 者にとって、ＢＰＶに基づく発現系におけるキャプシドタンパク質の発現は真性 のキャプシドに類似するキャプシドのアセンブリーが生ずることが避けられない ように思われる。しかしながら、１９８６年９月、ミラー（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｅ　 ｒ）ら。

ビンチル（Ｐｉｎｔｅｌ）らは、３２２ページ欄ｌにおいて、クローニングした キャプシド遺伝子でトランスフェクションした細胞が典型的なＭＶＭ感染におい て見られるものと比較したとき、免疫蛍光の異常なパターンを示したことを報告 している。著者らは、細胞におけるこの異常なキャプシドペプチドの分布を説明 することができなかった。しかしながら、このような異常性は、野生型キャプシ ドタンパク質とビンチル（Ｐｉｎｔｅｌ）らが操作した組み換え体タンパク質と の間の生物学的に有意な差を明瞭に示唆している。

当業者は、ビンチル（Ｐｉｒ＋ｔｅｌ）もの教示に基づいて、組み換え体ウィル スキャプシドタンパク質が制限された構造的統合性のみを示すことを結論するこ とができるであろう。それらは免疫沈澱可能であるが、これは制限された数の野 生型抗原決定基のみの保存の機能であろう。この背景が与えられると、あるキャ プシドが野生型ウィルスに対して有効ｙ中和性免疫応答を引き出すであろうこと はまったく明らかでなかったであろう。

匡際調査報告 ＋ｍ＋＋ｖ＋゛ｏ＋＋＋□　ＡＩ＊ｌｌｅ°”””　ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０２ ２０４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫原性の中空ウイルスキャプシド。 ２、ウイルスはパルヴォウイルスである請求の範囲第１項記載のウイルスキャプ シド。 ３、パルヴォウイルスは、イヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシまたはヒトのパルヴ ォウイルスである請求の範囲第２項記載のパルヴォウイルス。 ４、免疫原性の中空イヌのパルヴォウイルスキャプシド。 ５、セルフアセンブリー性の形態のウイルスキャプシドのタンパク質をエンコー ドする遺伝子を、発現可能な形態で含有するＤＮＡベクターによって、形質転換 された真核生物の細胞によって発現された、セルフアセンブリーした免疫原性の 中空ウイルスキャプシド。 ６、ウイルスはパルヴォウイルスである請求の範囲第５項記載のウイルスキャプ シド。 ７、パルヴォウイルスはイヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシまたはヒトのパルヴォ ウイルスである請求の範囲第６項記載のウイルスキャプシド。 ８、キャプシドタンパク質をエンコードする遺伝子は、パルヴォウイルスのキャ プシドのタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２′をエンコードする、請求の範囲第６項 記載のウイルスキャプシド。 ９、真核生物の細胞はネズミまたはイヌの細胞である請求の範囲第６項記載のウ イルスキャプシド。 １０、セルフアセンブリー性の形態のイヌのパルヴォウイルスのキャプシドのタ ンパク質ＶＰ１およびＶＰ２′をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で含 有するＤＮＡベクターによって形質転換された、イヌまたはマウスの細胞によっ て発現された、セルフアセンブリーした中空イヌのパルヴォウイルスキャプシド 。 １１、成分： ａ、免疫化量の免疫原性の中空ウイルスキャプシド、およびｂ、製薬学的に許容 されうる注射用賦形剤、からなる、ウイルスおよび前記ウイルスの抗原的に関連 する種に対してワクチン接種するためのワクチン組成物。 １２、成分： ａ、免疫化量の免疫原性の中空動物のパルヴォウイルスキャプシド、および ｂ、製薬学的に許容されうる注射用賦形剤、からなる、動物のパルヴォウイルス および前記パルヴォウイルスの抗原的に関連する種に対してワクチン接種するた めのワクチン組成物。 １３、パルヴォウイルスキャプシドはイヌのパルヴォウイルスキャプシドである 、イヌ、ネコまたはミンクのワクチン接種のための、請求の範囲第１２項記載の ワクチン組成物。 １４、成分： ａ、セルファセンブリーした免疫化量の免疫原性の中空動物のパルヴォウイルス キャプシド、前記キャプシドは、セルフアセンブリー性の形態のパルヴォウイル スキャプシドのタンパク質をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で含有す るＤＮＡベクターによって、形質転換された真核生物の細胞によって発現されて おり、およびｂ、製薬学的に許容されうる注射用賦形剤、からなる、動物のパル ヴォウイルス対してワクチン接種するためのワクチン組成物。 １５、動物のパルヴォウイルスはイヌのパルヴォウイルスである請求の範囲第１ ４項記載のワクチン組成物。 １６、動物に免疫化量のウイルスの免疫原を投与することからなる、ウイルスに 対して動物をワクチン接種する方法において、前記ウイルスの免疫原は免疫原性 の中空ウイルスキャプシドである改良。 １７、ウイルスはパルヴォウイルスであり、そしてウイルスキャプシドは動物の パルヴォウイルスのキャプシドである、請求の範囲第１６項記載の改良。 １８、前記中空ウイルスキャプシドは、セルフアセンブリー性の形態のウイルス キャプシドのタンパク質をエンコードする遺伝子を、発現可能な形態で有するＤ ＮＡ発現ベクターによって、形質転換された真核生物の細胞によって発現された 、セルフアセンブリーした免疫原性の中空ウイルスキャプシドである、請求の範 囲第１６項記載の改良。 １９、ウイルスは動物のパルヴォウイルスであり、そしてウイルスキャプシドは 動物のパルヴォウイルスのキャプシドである、請求の範囲第１８項記載の改良。 ２０、動物はイヌ、ネコまたはミンクであり、そしてウイルスはイヌのパルヴォ ウイルスである、請求の範囲第１８項記載の改良。 ２１、免疫原性の中空ウイルスキャプシドを発現できるＤＮＡ発現ベクター。 ２２、ウイルスキャプシドはパルヴォウイルスキャプシドである、請求の範囲第 ２１項記載のＤＮＡ発現ベクター。 ２３、パルヴォウイルスキャプシドけ、イヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシまたは ヒトのパルヴォウイルスである請求の範囲第２２項記載のＤＮＡ発現ベクター。 ２４、成分： ａ）バクテリアのプラスミドから誘導された複製起源、ｂ）真核生物の宿主のた めの複製起源、ｃ）真核生物のプロモーター、 ｄ）セルフアセンブリー性の形態のパルヴォウイルスのＶＰ１およびＶＰ２′の キャプシドタンパク質をエンコードする構造遺伝子、前記遺伝子は真核生物のプ ロモーターの指令の下にある、およびｅ）原核生物の宿主および真核生物の宿主 に選択可能な表現型の特性を与える遺伝子、 からなる、原核生物の宿主および真核生物の宿主中において複製することができ かつ真核生物の宿主中において中空パルヴォウイルスキャプシドを発現すること ができるプラスミド。 ２５、複製起源はプラスミドｐＢＲ３２２から誘導され、真核生物のプロモータ ーはネズミのメタロチオンニンのプロモーターであり、そして真核生物の宿主の ために選択可能な特性を与える遺伝子はＮｅｏＲ遺伝子である請求の範囲第２４ 項記載のプラスミド。 ２６、前記ＮｅｏＲ遺伝子はＶＰ１およびＶＰ２′の構造遺伝子より下流にかつ それらに隣接して位置し、これによって前記遺伝子はネズミのメタロチオンニン のプロモーターの指令の下にある請求の範囲第２５項記載のプラスミド。 ２７、真核生物の宿主中においてベクターのエピソームの複製を提供する遺伝子 の要素をさらに含む、請求の範囲第２４項記載のプラスミド。 ２８、エピソームの複製を提供する遺伝子の要素は、ウシ乳頭腫ウイルスから誘 導される、請求の範囲第２４項記載のプラスミド。 ２９、真核生物のプロモーターは、ＶＰ１およびＶＰ２′タンパク質をエンコー ドする、内因性パルヴォウイルスのプロモーターである、請求の範囲第２４項記 載のプラスミド。 ３０、キメラのプラスミドｐＡｂＴ２４１、ｐＡｂＴ２４３、ｐＡｂＴ２４５、 およびそれらの実質的に同等なプラスミド。 ３１、セルフアセンブリーした、免疫原性の、中空キャプシドを産生できるトラ ンスフェクションした真核生物の細胞。 ３２、ウイルスキャプシドはパルヴォウイルスキャプシドである、請求の範囲第 ３１項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。 ３３、パルヴォウイルスキャプシドはイヌのパルヴォウイルスキャプシドである 、請求の範囲第３２項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。 ３４、ネズミ３Ｔ３細胞、ネズミＣ１２７細胞またはイヌＡ７２細胞である、請 求の範囲第３３項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。 ３５、ｐＡｂＴ２４１、ｐＡｂＴ２４３およびｐＡｂＴ２４５から成る群より選 択されるプラスミドでトランスフェクションされた真核生物の細胞。 ３６、ネズミ３Ｔ３細胞、ネズミＣ１２７細胞またはイヌＡ７２細胞である、請 求の範囲第３５項記載のトランスフェクションした真核生物の細胞。 ３７、遺伝子工学の技術によって産生された中空ウイルスキャプシドの、体液中 の抗ウイルス抗体の検出または定量のための使用。 ３８、工程： ａ）ウイルスの中空ウイルスキャプシドが結合した固相からなる免疫吸着剤を、 試験すべき生物学的流体の試料と、前記試料中の抗ウイルス抗体が前記免疫吸着 剤に結合できる条件下に、インキュベーションし、ｂ）前記免疫吸着剤を前記試 料から分離し、そしてｃ）前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを 、前記試料中の抗ウイルス抗体の指示として決定する、からなる、生物学的流体 中のウイルスに対する抗体を検出する方法。 ３９、前記抗体が前記免疫吸着剤に結合しているかどうかを決定する工程は、生 物学的流体を誘導する種の抗体に対する標識した抗体とともに、前記免疫吸着剤 をインキュベーションし；インキュベーション期間後、前記標識した抗体から前 記免疫吸着剤を分離し；そして前記免疫吸着剤に関連する標識を検出することか らなる、請求の範囲第３７項記載の方法。 ４０、宿主の動物または細胞を免疫原性の中空ウイルスキャプシドで免疫化する ことによって産生された抗ウイルス抗体。 ４１、前記中空ウイルスキャプシドはイヌ、ネコ、ミンク、ブタ、ウシおよびヒ トのパルヴォウイルスから成る群より選択される、請求の範囲第４０項記載の抗 ウイルス抗体。 ４２、生物学的流体中の抗ウイルス抗体を検出するための請求の範囲第４０項記 載の抗体の使用。 ４３、ウイルスの抗原的に関連する種に対して交差保護的免疫性を提供する免疫 原性の中空ウイルスキャプシド。 ４４、パルヴォウイルスキャプシドである請求の範囲第４３項記載のキャプシド 。