JPH10506782A - 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中のXhoI部位を具備した挿入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、サイトカインをコードした前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。本発明は、シチメンチヨウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。最後に、本発明は、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させるための相同性ベクタ、宿主細胞、ワクチン、及び免疫方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え型シチメンチョウヘルペスウイルス、及びその使用 本願は、１９９４年８月９日に出願のU.S．シリアル番号０８／２８８，０６ ５の一部継続出願である、１９９４年１２月２２日出願の継続出願であり、その 内容を本願で参照することにより本願に組み込む。 本願全体を通じて、種々の文献は括弧中のアラビア数字で引用する。参考文献 の詳しい内容は、請求項のすぐ後にアルファベット順で記載してある。これらの 参考文献を、本願で参照することにより本願に組み込み、本願発明が属する技術 分野での最新技術について詳細に記載する。 発明の背景 ＤＮＡを単離して、その単離されたＤＮＡを細菌プラスミドへクローニングす ることが可能であることから、ウイルスワクチン調製の手法が発展した。本願発 明で使用した方法では、動物の種々のウイルス性病原体からクローン化したＤＮ Ａ配列を、挿入、欠失、１またはそれ以上の塩基の変異、により修飾し、それに 続いて、この修飾済み配列をウイルスゲノムへ挿入することを行った。外来性配 列を付加することの一つの有用性は、外来性配列が、動物のウイルス感染時に発 現される外来性タンパク質をコードする時に成し遂げられる。得られる生ウイル スを次いでワクチンに使用して、宿主動物での免疫反応を惹起して、該動物を疾 患より保護する。このような特徴を有するウイルスはウイルスベクタと呼ばれる が、それは外来性タンパク質を運び、宿主動物内で外来性タンパク質を発現する からである。実際、それは外来性タンパク質の運搬用の精巧な系となる。 より特異的には本発明は、疾患に対してトリをワクチン接種するためのウイル スベクタとしてのシチメンチョウヘルペスウイルスを使用することに関する。ヘ ルペスウイルス群は、以下の数多くの標的種に感染して疫病を引き起こす病原体 からなる：ブタ、ウシ、ニワトリ、ウマ、イヌ、ネコ等。それぞれのヘルペスウ イルスはそれぞれの宿主に特異的であるが、そのゲノム構造、複製様式 に関してはすべて関連していて、宿主動物内での病原性、及びウイルス感染に対 する宿主免疫反応の機序に関しては、ある程度関連している。 組み換えＤＮＡ技術を動物ウイルスへ適用することは、比較的歴史が浅い。改 変されたウイルスの最初の例は、ゲノムが最も小さいウイルスであった。パポバ ウイルスの場合は、これらのウイルスが小さく、余分なＤＮＡを保持できないた めに、遺伝子工学的に使用すると、複製に関して欠損していた。これらのウイル スを利用して、外来性遺伝子の発現を行うには、野生型のヘルパーウイルスが必 要であり、細胞培養系に限定されている。アデノウイルスの場合は、外来性ＤＮ Ａで置換することが可能な、必須でないＤＮＡの量は小さい。アデノウイルスで 発現されたと思われる唯一の外来性ＤＮＡは、パポバウイルスのT抗原遺伝子群 （Mansour et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985;Thummel et al.，Cell ，1983; Scolnick，et al.，Cell，1981; Thummel et al.，Cell，1981）、及び 単純ヘルペスウイルス（HSV）のチミジンキナーゼ遺伝子（Haj-Amed and Graham ，J．of Virology，1986）がある。これらの文献では、外来性ＤＮＡが挿入され ている可能性のある、HVTの非必須領域を同定しておらず、またHVT内で如何に外 来性遺伝子を発現させるかについて、すなわちどのようなプロモータや終結配列 を使用するかも教示していない。 改変された別のウイルス群はポックスウイルスである。この群の一つの構成員 であるワクシニアは、外来性遺伝子発現に関しての多くの研究主題である。ポッ クスウイルスは、感染細胞の細胞質内で複製する、大型のＤＮＡ含有ウイルスで ある。このウイルスは、正二十面体やら旋の対称性に基づくカプシドを有さない という点において、ユニークな構造を有する。ポックスウイルスは、機能の喪失 と縮退により、細菌様の微生物から進化した可能性が高い。一部、このユニーク さのため、ポックスウイルスの遺伝子工学でなされた進歩は、他のウイルス系（ ヘルペスウイルスやHVTを含む）へ直接適用することができない。ワクシニアウ イルスの組換え体構築物は、数多くの研究室で作成されており、以下のような外 来性の挿入遺伝子が発現されている：HSVチミジンキナーゼ（Mackett，et al.， Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1982; Panicali and Paoletti，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA,1982）、B型肝炎表面抗原（Paoletti et al.，Proc． Natl．Acad．Sci．USA,1984; Smith et al.，Nature，1983）、HSV糖タンパク質 D遺伝子、インフルエンザ血球凝集素遺伝子（Panicali et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，1983; Smith et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1983）、マ ラリア抗原遺伝子（Smith，et al.，Science，1984，and）、水痘性口内炎ウイ ルス糖タンパク質G遺伝子（Macket，et al.，Scinece，1986）。ワクシニアの組 み換えＤＮＡ技術の全体の一般的特徴は、全てのウイルスで使用するものと同様 であり、特に参考文献（Maniatis et al.，Molecular Cloning，1982）に関して はそうである。しかしながら詳細には、ワクシニアでの技術はヘルペスウイルス やHVTには適用できない。ワクチンベクタとしてのワクシニアの利用性には疑問 がもたれているが、それはワクシニアがヒトの天然痘ウイルスに近縁であって、 またヒトに対して病原性があることが知られているためである。故に、宿主特異 的なヘルペスウイルスHVTを使用することは、家禽のワクチン接種に対する、よ りよい解決策である。 霊長類のヘルペスウイルスの中では、ヒトのHSVのみが外来性ＤＮＡ配列を含 有するように改変されていて、また、限られてはいるが、リスザルヘルペスウイ ルスも外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されている。組み換えＤＮＡを使 用してHSVを操作した最初の例は、HSVのL-SジャンクションのＤＮＡ断片を、HSV のＤＮＡの長領域（long region）、特にチミジンキナーゼ遺伝子へクローニン グしていたものである（Mocarski et al.，Cell，1980）。この挿入物は外来性 ＤＮＡ断片ではなくて、ゲノムの他の部位で増幅された、天然のヘルペスウイル スＤＮＡ断片である。このＤＮＡ断片は、タンパク質を発現するために特別に改 変したものではなく、よってこの実験にはヘルペスウイルスでのタンパク質発現 は行っていない。HSVの次の操作は、組み換えＤＮＡ技術とチミジンキナーゼ選 択との組み合わせにより、ウイルスゲノム中の欠失を作りだすことである。この 方法を使用して、HSVアルファ-22遺伝子が欠失されていて（Post，et al.，Cell ，1981）、また15,000塩基対のＤＮＡ配列がHSVの内部繰り返しより欠失されて いる（Poffenberger，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1981）。 以下の場合では、タンパク質をコードする遺伝子の、ヘルペスウイルスへの、 次のような挿入が行なわれている：HSVの糖タンパク質Cを、HSVのこの遺伝子に 関して天然に起こる欠失変異体への挿入(Gibson and Spear，J．of Virology，1 983)；２型HSVの糖タンパク質Dの、１型HSVへの挿入(Lee et al.，Proc．Natl． Acad．Sci．USA，1982)（この遺伝子は外来性でないのでプロモータ配列の操作 は必要ない）；B型肝炎の表面抗原を、HSVのICP4プロモータ制御下におくHSVへ の挿入（Shih et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1984）；SV40プロモータ を伴ったウシ成長ホルモンの、リスザルヘルペスウイルスへの挿入（このプロモ ータは、この系では機能しないが、内在性の上流プロモータがこの遺伝子の転写 を行う）（Desrosiers et al.，1984）。二つの付加的外来遺伝子（ニワトリ・ オバルブミン遺伝子と、エプスタイン・バールウイルスの核抗原）がHSVに挿入 されていて（Arsenakis and Roizman，1984）、また仮性狂犬病ウイルスの糖タ ンパク質Xも、HSVへ挿入されている（Post et al.，1985）。 遺伝子の欠損、または挿入をヘルペスウイルスへ導入した、以上の例は、組み 換えＤＮＡ技術によりヘルペスウイルスを遺伝的に改変することが可能であるこ とを証明している。遺伝子を挿入するのに用いたこの方法では、プラスミドにク ローニングされたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞へ形質移入された、精製済み ウイルスＤＮＡとの間で相同性組み換えを行わせる。しかしながら、欠損を行わ せる位置と、外来性遺伝子の挿入を行わせる部位に関してどの程度一般化できる かは、先行技術からは分からない。 本発明の一つの目標は、マレック病に対するワクチンである。マレック病ウイ ルス（MDV）は、家禽の麻痺やニワトリの通常のリンパ球増殖性病が含まれるマ レック病の病原体である。この疾患は生後２から５ケ月の若いニワトリで最も頻 繁に起こる。顕著な臨床的症状は、一つ以上の四肢の進行性麻痺、脚の麻痺によ る不釣り合い、翼の関与による肢のしおれ、及び首の筋肉の関与により、頭の位 置が低くなることがあげられる。急性の場合、重度の抑圧が起きる。腫瘍性がこ とに高い株の場合は、特徴的な、ブルサ及び胸腺の萎縮がおきる。更に、生殖腺 、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺に影響するリンパ腫がある（Mohanty and Dutta ，1981）。多くのニワトリは、生涯MDVに対しての保護を与えるワクチン接種を 、生後１日で受ける。本発明がなされるよりも前は、MDVに対するワ クチン接種方法の原理は、シチメンチョウヘルペスウイルス（HVT）の天然株を 使用するものであった。この、生後１日目のワクチンに、他の抗原を取り込ませ ることは有益であるが、通常のワクチンを組み合わせることの効果は、現在まで のところ十分には証明されておらず、これは病原体間での競合と、免疫抑制によ るためである。本発明で作成された、多価のHVTベースのワクチンは、数多くの 病原体に対して、同時にワクチン接種する新規の方法となる。HVTのゲノムの非 必須領域に挿入された外来性遺伝子を有する、組み換えHVTが始めて開示さてい る。 これらのヘルペスウイルスに対して行なわれた遺伝子工学のタイプには、細菌 プラスミドへのウイルスＤＮＡの一部のクローニング、クローン化した状態で前 記ウイルスＤＮＡを再構築して該ＤＮＡが、ある配列を欠損するようにすること 、そして外来性ＤＮＡ配列を、上記の欠損部分と置き換えるか、または欠損によ り取り除かれた部位へ加えること、がある。 HVTのゲノムに挿入する標的の外来性遺伝子は興味ある如何なる病原体から得 てもよい。典型的には、興味ある遺伝子とは家禽で疾患を引き起こす病原体で、 家禽産業に経済的インパクトのあるものである。この遺伝子はすでにワクチンが 存在している生物体から得てもよく、誘導（vectoring）技術の新規の利点のた め、HVT由来ワクチンはより優れているであろう。さらに、興味ある遺伝子は、 現在ワクチンが存在していないが、その疾患を制御する必要性のある病原体から 由来するものでもよい。典型的には、興味ある遺伝子は病原体の免疫原性ポリペ プチドをコードしていて、表面タンパク質、分泌型タンパク質、及び構造タンパ ク質であってもよい。 HVTの誘導の標的である、トリの関連した病原体は、伝染性喉頭気管炎ウイル ス（ILTV）である。ILTVはヘルペスウイルス科の構成員であり、この病原体は、 呼吸抑制、息切れ、及び血の滲出した痰で特徴付けられる、ニワトリの急性疾患 を引き起こす。ウイルスの複製は、呼吸路の細胞に限られ、ここでは気管での感 染が、組織の侵食と、出血を引き起こす。ニワトリでは病変の形成の程度を減少 させるか、または臨床的症状を減少させる効果的な薬剤はない。細胞の 継代、及び/または煩雑な投与方法で由来した、ILTの種々の修飾体でトリをワク チン接種すると、感受性のニワトリに、許容できる保護が生じる。現在のILTワ クチンの中和の度合いのために、正しいレベルのウイルスを維持するための注意 が必要である。すなわち保護与えるのには十分であるが、群れの中で疾患を引き 起こすのには不十分な程度である。 HVT誘導方の付加的標的としては、ニューカッスル病ウイルスによって引き起 こされる、感染性であって伝染性の高い、衰弱性のニューカッスル病がある。ND Vは、パラミクソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。NDVの種々の病原型 （ヴェロ原性株、亜病原性株、レント原性株）は、疾患の重症度、特異性、及び 症状におうじて異なるが、多くの型は呼吸器系、及び神経系に感染するようであ る。NDVは主に、ニワトリ、シチメンチョウ、及びその他のトリの種に感染する 。歴史的には、ワクチン接種が疾患予防のために使われてきたが、母性の抗体干 渉、当該トリの寿命、及び投与経路のため、生産者は免疫プロトコールを適応さ せて特異的な要求にフィットさせる必要がある。 本発明のウイルスベクタで運ばれる治療薬は、ブタポックスウイルス複製の副 産物である生物学的分子でなくてはならない。これは、第一分析の治療薬を、Ｄ ＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質の何れかに限定する。このようなクラスの化合物 で、次のような形態の治療薬の例がある：アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲ ＮＡ（S.Joshi，et al.，J．of Virology，1991）、リボザイム(M.Wachsman，et al.，J．of General Virology，1989)、サプレッサーtRNA（R.A.Bhat，et al. ，Nucleic Acids Research，1989）、インターフェロン誘導性二本鎖ＲＮＡ、及 びインシュリンのようなホルモンから、インターフェロンやインターロイキンの ようなリンホカイン、天然のアヘン剤までの種々のタンパク性治療薬の例。これ ら治療薬が発見され、またそれらの構造と機能が解明されたが、ウイルスベクタ によるデリバリーシステムでそのような治療薬を使用する能力については明らか ではない。 発明の要約 本発明は、サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシ チメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中のXhoI部位を具備 した挿入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって 、サイトカインをコードした前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘル ペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型 シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 最後に、本発明は、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させる ための相同性ベクタ、宿主細胞、ワクチン、及び免疫方法を提供する。 図の簡単な説明 図１A−１C：HVT構築とマップデータの詳細。 図１Aは、HVTゲノムのBamHI消化断片のマップを示す図である。断片は、大き い順番に番号が付けられていて、文字は、比較上の大きさが決定されていない小 断片を示す。 図１Bは、HVTゲノムの、BamHIの＃１６断片を示し、これはS-HVT-001中のベー タガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。 図１Cは、HVTゲノムの、BamHIの＃１９断片を示し、これはベータガラクトシ ダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。 凡例：B=BamHI、X=XhoI、H=HindIII、P=PstI、S=SalI、N=NdeI、R=EcoRI。 図２A−２D：プラスミド191-47中への挿入。 図２Aはプラスミド191-47中へ組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す図である 。 図２A−2Dは、プラスミド191-47中のＤＮＡ断片の間のそれぞれの結合部に位 置する配列を示す（配列認識番号：20、21、22、23、24、25、26、及び27）。 図３A-３B：S-HVT-003の構築の詳細。 図３Aは、HVT ＤＮＡの、BamHI＃１６断片の領域での制限酵素地図を示す。こ の断片は、HindIII大断片内に含まれる。図３Aは更に、リンカと標準的なクロー ニング手法によりEcoRI（R）部位へまず変換された、XhoI部位を示している。図 ３Aは更に、相同性組み換えのためにBamHI断片に組み込まれたベータgal遺伝子 、及びIBVD遺伝子の構築の詳細を示している。両方の遺伝子はともに、PRV gX遺 伝子プロモータ（gX）の制御下にある。 図３Bは、S-HVT-003ゲノムを示し、これには二つの挿入外来遺伝子、ベータga l及びIBVDの位置が含まれている。 図３において：H=HindIII、B=BamHI、X=XhoI、R=EcoRI、Xb=XbaI、Hp=HpaI、S =SmaI、UL=ユニークな長領域（unique long region）、IR=内部繰り返し領域、T R=末端繰り返し領域。 図４： 変性済みIBDVウイルス粒子に向けられた過免疫のラット抗血清を使って行った 、ブロットのプロービングにより、S-HVT-003に感染した細胞（３２kDが存在す る）、及びS-HVT-001に感染した細胞（３２kDが存在しない）の細胞抽出液中のI BVDの３２kDaの抗原の差動的発現を示すウェスターンブロット。この血清は、主 として免疫優勢な３２kDの抗原（IBDV VP3）に反応する。ブロット中の各レーン は次のとおりである：１）タンパク分子量標準；２）非感染CEF細胞；３）S-HVT -001感染細胞；４、５、及び６）IBDVウイルス粒子のポリペプチド。 図５： S-HVT-003に感染した細胞（４２kDが存在する）、及びS-HVT-001に感染し た細胞（４２kDが存在しない）の細胞抽出液中のIBVDの４２kDaの（VP2）抗原の 差動的発現を示すウェスターンブロット。VP2特異的ウサギ抗ペプチド抗血清を 使って、IBDV特異的ポリペプチドが同定された。各レーンは次のとおりである： １）タンパク分子量標準；２）野生型HVTに感染したCEF細胞；３）S-HVT-001に 感染した細胞；４）S-HVT-003に感染したCEF細胞、５）S-HVT-003に感染したCEF 細胞、６）IBDVウイルス粒子のポリペプチド。 図６A-6C：S-HVT-004構築物の詳細 図６AはBamHI＃１６領域に関しての、HVT DNAの制限酵素地図である。この断 片は、Hind III大断片内に含まれている。また、XhoI部位（Ｘ）も示されている が、これは挿入が行なわれた部位である。挿入前に、リンカと標準的なクローニ ング方法により、XhoIをまずEcoRI（R）に変換した。 図６Bは相同組み換えで使用する、BamHI＃１６断片に挿入されたβ−gal遺伝 子及びMDV gA遺伝子の構築の詳細を提供している。β−galは、PRV gX遺伝子プ ロモータ（gX）の制御下におかれ、一方MDV gA遺伝子は自身のプロモータの制御 下におかれている。 図６Cは、S-HVT-004ゲノムを示し、二つの挿入外来遺伝子（β−gal、及びMDV gA）の位置を示している。 図６において：Ｈ：HindIII、Ｂ＝BamHI、Ｘ＝XhoI、Ｒ＝EcoRI、Ｘｂ＝XbaI 、UL：ユニークな長領域、US:ユニークな短領域、IR:内部繰り返し領域、TR:末 端繰り返し領域。 図７A-7B：相同性ベクタ４６７−２２.A12内へのβ−ガラクトシダーゼ（lacZ ）標識遺伝子の挿入に関しての詳細な記載。図７Aは、標識遺伝子内に組み込ま れたＤＮＡ断片の向きを示す図である。それぞれの断片の起源は、実験材料と実 験方法の項に記載されている。図７Aと図７Bは、ＤＮＡ断片と標識遺伝子（配列 認識番号28,29,30,31,32,及び33）の末端との間の結合部分に 位置するＤＮＡ配列を示す。図７A及び図７Bは更に、適切な結合部におけるそれ ぞれのＤＮＡ断片を創製するのに使用した制限酵素部認識部位、及びlacZ遺伝子 のコード領域の位置を示す。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内 の制限部位は、構築過程で破壊された部位の残遺物を示す。以下の略語を使用し た:仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ラクトースオペロンZ遺伝子(lacZ)、大腸菌（E.c oli）、ポリアデニル化シグナル（pA）、及び糖タンパク質X（gpX）。 図８： HVTゲノムのBamHI、及びNotI制限酵素地図。ユニークな長領域（UL）、及びユ ニークな短領域（US）を示している。長及び短領域の繰り返しは四角でかこって 示している。BamHI断片はサイズの大きい順に番号を付しているプローブP1-P4の 位置を示してある。それぞれのプローブの起源は以下のとおりである:P1-BamHI ＃６、P2-BamHI＃２、P3-BamHI＃１３、P4-HVTゲノムのXbaI断片＃５（８.０kb ）の、Bgl IIからStuIまでの4.0ｋｂのサブ断片。 図９：プラスミドpSY229の構築手順を示す図。 図１０A-１０B： 相同性ベクタ456-18.18及び456-17.22内の、MDV遺伝子カセット挿入物の詳細 な記載。図１０A及び１０Bは、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向き、並 びにMDVgA、及びgB遺伝子の位置を示す概略図である。それぞれの断片の起源は 、実験材料及び実験方法の項に記載されている。それぞれの断片の間の結合部、 及び標識遺伝子の末端に位置する配列は、図１０A及び１０Bに示されていて、こ れにはジャンクションA（配列認識番号３４）、ジャンクションB（配列認識番号 ３５）、及びジャンクションC（配列認識番号３６）が含まれる。それぞれの断 片を創製するのに使用した制限酵素認識部位は、適切な結合部（ジャンクション ）に示されている。括弧（）内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限酵 素認識部位は、構築過程中に破壊された部位の残遺物を示す。 図１１A-１１B： 相同性ベクタ556.-41.5内のHind III断片挿入物の詳細な記載。図１１A及 び１１Bの該略図は、カセット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す。それ ぞれの断片の起源は、実験材料と実験方法の項に記載されている。図１１Aと１ １Bは更に、プラスミドのそれぞれのＤＮＡ断片の間の結合部、及び標識遺伝子 の末端に位置するＤＮＡ配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配 列認識番号３７）、ジャンクションB（配列認識番号３８）、及びジャンクショ ンC（配列認識番号３９）が含まれる。それぞれの断片を創製するのに使用した 制限酵素部位は、適切な結合部（ジャンクション）に記載されている。MDV gD及 びgI遺伝子の一部の位置もまた、示されている。括弧（）内の番号はアミノ酸を 意味し、括弧[]内の制限酵素部位は、構築過程で破壊された部位の残遺物を示す 。 図１２A-１２C： 相同性ベクタ255-18.Ｂ16内のSalI断片挿入物の詳細な記載。図１２Aは、カセ ット内に組み込まれたＤＮＡ断片の向きを示す該略図を示す。それぞれの断片の 起源は実験材料と実験方法の項に記載されている。図１２Aから１２Cまでは更に 、それぞれの配列の間での結合部（ジャンクション）、及び標識遺伝子の末端に 位置する配列を示していて、これらには、ジャンクションA（配列認識番号４０ ）、ジャンクションＢ(配列認識番号４１)、ジャンクションC(配列認識番号４２ )、ジャンクションD（配列認識番号４３）、ジャンクションE（配列認識番号４ ４）、ジャンクションF(配列認識番号４５)、ジャンクションＧ（配列認識番号 ４６）、及びジャンクションH（配列認識番号４７）が含まれる。それぞれの断 片を創製するのに使用した制限酵素部位は、適切なジャンクションに示されてい る。NDV F及び1acZ-NDV HNハイブリッド遺伝子の位置が示されている。括弧（） 内の番号は、アミノ酸を意味し、括弧[]内の制限酵素部位は、構築過程で破壊さ れた残遺物を示す。 図１３A-１３B： HVTゲノムのBamHI＃１０断片の、ユニークなXhoI部位が、XhoI部位（ヌクレオ チド＃1333-1338；配列認識番号４８）への合成ＤＮＡの挿入によってどのよう にPacI部位、及びNotI部位へ変換されたかを示している。図１３Aは、プラスミ ド654-45.1(配列認識番号55)を創製するためにPacI部位へ変換された XhoI部位を示し、また図１３Bはプラスミド686-63.A1（配列認識番号５６）を創 製するためにNotIに変換されたXhoI部位を示す。 図１４： HVTの長いユニーク部分（配列認識番号４８）内の挿入部位を取り囲む配列の 制限酵素地図とタンパク質読み取り枠。この地図は、外来性遺伝子の挿入に使用 された、XhoI制限部位（配列認識番号４８；ヌクレオチド1333-1338）を示す。 また、この配列内の４つのタンパク質読み取り枠も示されている。ORF Aは、Xho I部位へのＤＮＡの挿入により分断されている。このORF Aのアミノ酸配列（配列 認識番号５０；ヌクレオチド1402-602；267アミノ酸）は、タンパク質データベ ースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。UL54（配 列認識番号４９；ヌクレオチド146-481；112アミノ酸）、及びUL55（配列認識番 号51；ヌクレオチド1599-2135；179アミノ酸）は、それぞれ、単純ヘルペスウイ ルス１型のUL54及びUL55タンパク質に顕著な配列相同性を示している。ORF B（ 配列認識番号52；ヌクレオチド2634-2308；109アミノ酸）は、タンパク質データ ベースの既知の如何なるアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。ブラス ト・ソフトウェア（Blast software）を使用してNCBIデータベースのサーチを行 った。 図１５： コスミド407-32.1Ｃ1、672-01.A40、672-07.Ｃ40、及び654-45.1の制限酵素地 図。HVTゲノムＤＮＡ断片であるEcoRI＃９とBamHI＃１０との重なり合う部分を 示している。EcoRI＃９とBamHI＃１０断片内のユニークなXhoI部位は、プラスミ ド654-45.1内ではPacI部位に変換され、またプラスミド686-63．A1内ではNotI部 位に変換された。 発明の詳細な説明 本発明は、HVTゲノムの非必須部位へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を具備した 、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。該外来性ＤＮＡ配列 は、組み換えHVTに感染した宿主細胞内で発現することが可能であり、その発 現は、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある。 本願では、「HVTゲノムの非必須部位」とは、HVTウイルスゲノム中の領域であ ってウイルス感染、または複製に必要のないものを意味すると定義する。 本願では、「ウイルスゲノム」、または「ゲノムＤＮＡ」とは、天然のシチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスが含む、ＤＮＡ全体を意味すると定義する。本願で は、「外来性ＤＮＡ配列」、または「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに対して外来 性である如何なるＤＮＡ、または遺伝子を意味すると定義する。 本願では、「タンパク質読み取り枠」とは、ＤＮＡの分節であって、終止コド ンを含まないアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡに転写されるコドンを含むものを 意味すると定義する。 本発明は更に、本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築す るのに有益な、HVTゲノム内の、複数の適切な挿入部位を提供する。挿入部位に は、HVTゲノムのEcoRI＃９断片とBamHI＃１０断片とが含まれ、この両方の断片 中の好ましい挿入部位はXhoI制限エンドヌクレアーゼ部位である。 このような部位のもう一つは、HVTゲノムのBamHI＃１６断片である。このBamH I＃１６断片中の好ましい挿入部位は、UL43タンパク質をコードするタンパク質 読み取り枠内にあり、このタンパク質読み取り枠内の好ましい挿入部位は、XhoI 制限エンドヌクレアーゼ部位である。 更に別の挿入部位としては、HVT US2遺伝子があり、この中の好ましい挿入部 位はStuI制限エンドヌクレアーゼ部位である。 本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、該シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された 外来性ＤＮＡ配列を含むシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを 具備し、上記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス に感染した宿主細胞内で発現することが可能な、上記のシチメンチョウ・ヘルペ スウイルスを提供する。 一つの態様において、上記の外来性ＤＮＡ配列は、EcoRI＃９断片のタンパク 質読み取り枠(ORF)A内に挿入されている。外来性ＤＮＡ配列をEcoRI＃９断片のX hoI部位へ挿入してORF Aを分断することは、ORF A領域全体が、組換え体の複製 にとって非必須であることを意味する。 本発明の目的に適した「組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス」は、当 業者らによく知られている技術（例えばDNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECO MBINANT HERPESVIRUSの実験材料と実験方法の項に記載されている方法）によっ て創製された、生のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、このウイルス は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質が欠失されてい ないものである。シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを精製すると、EcoRI＃９ 断片、またはBamHI#１０断片に外来性のＤＮＡ配列、または遺伝子が安定に挿入 されたものが得られる。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、上記 の外来性ＤＮＡが、該組み換え型ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性 であるポリペプチドをコードする、上記のウイルスを提供する。 一つの態様において、該ポリペプチドは検出可能な標識である。本発明の目的 に適した「検出可能な標識であるポリペプチド」は、該ポリペプチドの二量体、 三量体、及び四量体である。大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼは４つの ポリペプチド、または単量体サブユニットからなる４量体である。一つの態様に おいて、前記のポリペプチドは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼである。好ましく は、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-001、S-HVT-014、 またはS-HVT-012と命名されている。 S-HVT-012は1992年10月15日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、A TCC受入れ番号、VR.2382の下に寄託された。 S-HVT-014は１９９３年12月７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATC C),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号 、VR.2440の下に寄託された。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様 においては、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワ トリインターフェロン（cIFN）である。好ましい態様において、組換え型のシチ メンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-144と、命名されている。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、その ウイルスゲノムが、マレック病ウイルス（MDV）、ニューカッスル病ウイルス（N DV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、 または伝染性粘液嚢病ウイルス（IBDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードして いる外来性ＤＮＡを有する、上記のヘルペスウイルスを提供する。 本発明は、EcoRI＃９断片に外来性ＤＮＡ配列が挿入された、組換え型のシチ メンチョウ・ヘルペスウイルスであって、マレック病ウイルス、ニューカッスル 病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、または伝染 性粘液嚢病ウイルスからなる群から選択した抗原性のポリペプチドをコードする 外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを 提供する。 一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、 マレック病ウイルス由来であって、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、 またはgDをコードしていている。別の態様において、マレック病ウイルスの糖タ ンパク質gA、gB、又はgDをコードした外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルスのUS2遺伝子のコード領域のユニークなStuI部位へ挿入され ている。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、その ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードしている外 来性ＤＮＡを有する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好 ましくは、抗原性ポリペプチドはマレック病ウイルスの糖タンパク質gB、gA、ま たはgDである。 一つの態様において、外来性のＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTは、IBDV VP 2、MDV gA、及びMDV gBをコードする。好ましくは、このような組換え型ウイル スは、S-HVT-137、及びS-HVT−143と命名されているものである。 本発明は更に、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲ ノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードする外来性ＤＮＡ を有するものであり、更に検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来 性ＤＮＡを具備する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好 ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-004と 命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gBをコー ドする外来性ＤＮＡを有している、組換え型のはシチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス は、S-HVT-045と命名されているものである。 MDVのgBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの、一つの態様も 提供され、また、この組換え型HVTは、S-HVT-045と命名されている。S-HVT-045 は、199 ２年１０月１５日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.23 83の下に寄託された。 本発明は更に、MDV抗原をコードする一つより多い数の外来性ＤＮＡ配列を含 むように改変された組換え型のHVTを提供する。例えば、MDVのgA、及びgBをコー ドする外来性ＤＮＡ配列はともにHVTゲノム内に運ばれることが可能である。更 に組換え型のHVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を含む ように構築することが可能である。 S-HVT-046、及びS-HVT-04 ７と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA及びgB をコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供し、S-HVT-04 ８、及びS-HVT-０６２と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA、gB、及びgDを コードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供する。 S-HVT-０６２は、１９９３年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際 的承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection (ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入 れ番号、VR.2401の下に寄託された。 本発明は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）由来の抗原性ポリペプチドをコ ードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTを提供する。このような場合 、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）、 ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはニ ューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合させた 大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを具備した組換え型のタンパク質であることが好 ましい。このようなウイルスの一つの例は、S-HVT-007と命名されているもので ある。 本発明は更に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性 ＤＮＡ配列と同様に、NDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外 来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型HVTを提供する。好ましくは、M DVの抗原性ポリペプチドは、MDVのgB、gD、またはgAであり、またNDVでは、Ｆま たはHNである。 本発明の一つの態様においては、組換え型の HVTは、MDVのgB、MDVのgA、及 びNDVのＦをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HV T-048と命名されているものである。 本発明の一つの態様においては、組換え型のHVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びN DVのHNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-0 49と命名されているものである。 例えば、MDV gA及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともに、HVTゲノム内 へ運ばれる。更に、組換え型HVTは、MDV gA、gB、及びgDをコードする外来性Ｄ ＮＡ配列を有するように構築することができる。 更に、別の態様においては、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配 列は、ニューカッスル病ウイルス由来であって、ニューカッスル病ウイルスの融 合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードするものである。 別の態様においては、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球 凝集素・ノイラミニダーゼをコードする上記の外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチ ョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長領域のEcoRI＃９のXhoI部位へ挿入され る。好ましい態様においては、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは S-HVT-136と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチ ドをコードしている、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、 ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ を更に具備したものを提供する。 本発明は更に、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイル スの糖タンパク質gD由来の抗原性ポリペプチドをコードした外来性ＤＮＡ配列を 有する組換え型のHVTであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F ）をコードした外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の組換え型HVT を提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS- HVT-048と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及び マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え 型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの 血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備し た、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは 、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-049と命名されて いるものである。 本発明は、ゲノムＤＮＡが、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパ ク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを 有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル 病ウイルスの融合タンパク質（F）、及び血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘル ペスウイルスは、S-HVT-０５０と命名されているものである。 S-HVT-050は、1993年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC) ,12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号 、VR.2400の下に寄託された。 本発明の更に別の態様においては、上記の組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，M DV gD，NDV F，及びNDV HNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは 、このような組換え型HVTは、S-HVT-106、またはS-HVT-128と命名されているも のである。 本発明は更に、組換え型のヘルペスウイルスを提供する。更に、一つの態様に おいては、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって伝 染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gBをコードするもの、伝染性喉頭気管炎 ウイルスの糖タンパク質gIをコードするもの、または伝染性喉頭気管炎ウイルス の糖タンパク質gDをコードする。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、以下のものよりなる群より由来した か、または由来することが可能な抗原性ポリペプチドをコードする：MDV gA，MD V gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBVD VP2，IBDV VP3，IBDV VP4,ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパ ラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス 、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス 、ニワトリ貧血ウイルス（agent）、サルモネラ.spp、大腸菌（E.coli）、パス テウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Ei meria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas） spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。 本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードする 外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ILTVの糖タンパク質gB、及びILTV gD、またはILTV gIである。 ILTV抗原をコードする、一より多い外来性ＤＮＡ配列を有するように改変され た組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスもまた、提供される。例えば、 ILTV gB、及びgDは、一緒にHVTゲノム内へ運ばれることが可能であり、ILTV gD とgI、並びにILTV gB、gD、及びgIも同様である。S-HVT-051、S-HVT-052、S-HVT -138と命名されている組換え型HVTは、このような組換え型のウイルスの態様で ある。 本発明はまた、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来 性ＤＮＡ配列と同様に、ILTV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多 い外来性ＤＮＡ配列を有する、改変済み組換え型HVTを提供する。好ましく は、MDVの抗原性ポリペプチドはMDV gB，gD，またはgAであり、ILTVの抗原性ポ リペプチドは、ILTV gB，gD，またはgIである。 本発明の一つの態様において、組換え型のHVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，I LTV gD，及びILTV gBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している。好ましくは 、この組換え型HVTは、S-HVT-123と命名されているものである。 本発明の別の態様においては、組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILT V gI,及びILTV gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、この組 換え型HVTは、S-HVT-139、またはS-HVT-140と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB，マレ ック病ウイルス糖タンパク質gA、及びマレック病ウイルス糖タンパク質gDをコー ドする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD，伝染性喉頭気管炎 ウイルスの糖タンパク質gB，及び大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼをコ ードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウ イルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスは、S-HVT-104と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク 質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードする外来 性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供す る。 本発明は更に、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来の抗原性ポリペプチドを コードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のHVTを提供する。好ましくは 、抗原性ポリペプチドは、IBVのスパイクタンパク質、またはIBVのマトリックス タンパク質である。 本発明はまた、IBV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来 性ＤＮＡ配列と同様に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多 い外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型HVTを提供する。好ましくは、IBV抗原性 ポリペプチドは、IBVスパイクタンパク質、またはIBVマトリックスタンパク質で あり、またMDV抗原性ポリペプチドは、MDV gB，gD，又はgAである。このような 組換え型のウイルスの一つの態様は、S-HVT-066と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性粘液嚢病ウイルス由来の抗原性ポリペ プチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルスであって、検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来 性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供 する。 更に、一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配 列は、伝染性粘液嚢病ウイルス由来である。別の態様において、外来性ＤＮＡ配 列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2遺伝子をコードする。別の態様においては 外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3遺伝子をコードする。別の 態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP４遺伝子をコ ードする。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S- HVT-003、またはS-HVT-096と命名されているものである。 S-HVT-003、及びS-HVT-096と命名されている組換え型HVTはそれぞれ、IBDV由 来の抗原性ポリペプチド、及び検出可能な標識をコードした外来性ＤＮＡ配列を 具備した組換え型HVTの態様である。S-HVT-003は、1987年７月21日に、特許手続 き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American T issue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20 852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2178の下に寄託された。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス 由来であり、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、または伝染性喉頭気 管炎ウイルスの糖タンパク質gDをコードすることを特徴とする、上記のシチメン チョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であ って、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、または喉頭気管炎ウイルス の糖タンパク質gIをコードする。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列がニューカッスル病ウイルス由来で あり、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ、またはニューカッスル病ウイルスのＦ をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性粘液嚢病ウイルス由来であ り、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、ＶＰ３、またはVP4をコードすることを特徴 とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性気管支炎ウイルス由来であ り、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードすることを特徴 とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は以下のものよりなる群から由来したか 、または由来することが可能な、抗原性ポリペプチドをコードしている：MDV gA ，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBDV VP2， IBDV VPD3，IBDV VP4，ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワ トリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウ イルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウ イルス、ニワトリ貧血ウイルス(agent)、サルモネラ.spp、大腸菌(E.coli)、パ ステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（ Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas ）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。好ましい 態様においては、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-136と 命名されているものである。 このような抗原性ポリペプチドは、以下のものより由来するか、または由来す ることが可能であるものであってもよい：ネコの病原体、イヌの病原体、ウマの 病原体、ウシの病原体、ニワトリの病原体、ブタの病原体、またはヒトの病原体 。 別の態様においてヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイル ス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロ ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、水痘-帯状ヘルペスウイルスヒトヘ ルペスウイルス６型、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス由来である。更に、ヒ ト病原体の抗原性ポリペプチドは、以下のものからなる群から由来する、マラリ ア、または悪性腫瘍に関連していてもよい：プラスモジウム・ファルシパラム（ Plasmodium falciparum）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertusis）、 及び悪性腫瘍。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質 （F）をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘル ペスウイルスであって、大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼがニューカッス ル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（HN）に融合している、組み換え 型のタンパク質を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲ ノム領域と、マレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメン チョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する 。一つの態様において、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病 ウイルスとの組換え体キメラは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルス ゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を有し、この外来性Ｄ ＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現さ れうる。 一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリ ペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え 体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となりえる。 別の態様において、ポリペプチドは大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼで ある。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコードする。別 の態様において、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、または ニワトリインターフェロン（cINF）である。 本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え体ヘルペスウイルスが導入さ れた動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え体シチメンチョウ ・ヘルペスウイルスを提供する。 更に、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものからなる群 より選択した抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備している ：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス 、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルス。 本発明は前記の外来性ＤＮＡ配列が内在性の上流のヘルペスウイルスプロモー タの制御下にあることを特徴とする組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイル スを提供する。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は異種の上流プロモータ の制御下にある。別の態様においては、がプロモータは以下のものより選択され る：PRV gX，HSV-1アルファ４，HCMV極初期，MDV gA，MDV gB，MDV gD， ILT gB，BHV-1.1 VP8，及びILT gD。 本発明は、以下のものを必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメン チョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に、外来性ＤＮＡを挿入すること により、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させる相同性ベク タを提供する：(a)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内には 通常存在しない、二本鎖の外来性ＤＮＡ；(b)前記外来性ＤＮＡの一方の末端に ある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、 シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位の一方の 末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの；(c)前記外来性Ｄ ＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡ であって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域である EcoRI＃９部位のもう一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的で あるもの。この相同性ベクタの例は、751-87.A８、及び761-7.A1と命名されてい るものである。 一つの態様において、ポリペプチドとは、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、抗原 性ポリペプチドとは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウ イルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来の抗原 性ポリペプチドである。好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドとは、以 下のものである：ニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリインタ ーフェロン（cIFN）、伝染性粘液嚢病ウイルスポリタンパク質、伝染性粘液嚢病 ウイルスのVP2タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、マレック病 ウイルスの糖タンパク質gD、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニュ ーカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイ ルスの糖タンパク質gB、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、伝染性気 管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリ ックスタンパク質。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配 列は、ウマの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードしている。ウマの病原体 の抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルス、またはウマヘルペスウ イルスから由来することが可能である。このような抗原性ポリペプチドは、この ような抗原性ポリペプチドの例には、次のようなものがある：ウマインフルエン ザウイルスA/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/プラ ハ56ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/マイアミ63ノイラミニダ ーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘ ルペスウイルス１型糖タンパク質B、及びウマヘルペスウイルス１型糖タンパク 質D。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列 は、ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザウイルスから由来した抗原 性ポリペプチドをコードする。ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザ ウイルスから由来する抗原性ポリペプチドには次のものがある：ウシＲＳウイル ス吸着タンパク質（BRSV G）、ウシRSウイルス融合タンパク質（BRSV Ｆ）、ウ シRSウイルスヌクレオカプシドタンパク質（BRSV N）、ウシパラインフルエンザ ウイルス３型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイルス３型血球凝 集素・ノイラミニダーゼ。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡは、 ヒトの免疫反応を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サ イトカインはインターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12 、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、及びインター ロイキン受容体であることが可能であるが、これらには限定されない。 本発明の一つの態様においては、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖 ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのBamHI＃１６断片内に存 在するＤＮＡ配列に対して相同性である。好ましくは、シチメンチョウ・ヘルペ スウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUL43 タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内に存在するＤＮＡ配列に相同性 である。好ましくは、この相同性ベクタは172-29.31と命名されてい るものである。 本発明の目的に適した「相同性ベクタ」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイル スのゲノムの特異的部位へ外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミド である。 本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖Ｄ ＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に存 在するＤＮＡ配列に相同発明の詳細な説明 本発明は、HVTゲノムの非必須部位へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を具備した 、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。外来性ＤＮＡ配列は 、組み換えHVTに感染した宿主細胞内で発現することが可能であり、その発現は 、該外来性ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモータの制御下にある。 本願では、「HVTゲノムの非必須部位」とは、HVTウイルスゲノム中の領域であ ってウイルス感染、または複製に必要のないものを意味すると定義する。 本願では、「ウイルスゲノム」、または「ゲノムＤＮＡ」とは、天然のシチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスが含む、ＤＮＡ全体を意味すると定義する。本願で は、「外来性ＤＮＡ配列」、または「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡに対して外来 性である如何なるＤＮＡ、または遺伝子を意味すると定義する。 本願では、「タンパク質読み取り枠」とは、ＤＮＡの分節であって、終止コド ンを含まないアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡに転写されるコドンを含むものを 意味すると定義する。 本発明は更に、本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築す るのに有益な、HVTゲノム内の、複数の適切な挿入部位を提供する。挿入部位に は、HVTゲノムのEcoRI＃９断片とBamHI＃１０断片とが含まれ、この両方の断片 中の好ましい挿入部位はXhoI制限酵素部位である。 このような部位のもう一つは、HVTゲノムのBamHI＃１６断片である。このBamH I＃１６断片中の好ましい挿入部位は、UL43タンパク質をコードするタンパク質 読み取り枠内にあり、このタンパク質読み取り枠内の好ましい挿入部位は、XhoI 部位である。 更に別の挿入部位としては、HVT US2遺伝子があり、この中の好ましい挿入部 位はStuIエンドヌクレアーゼ部位である。 本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、該シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に挿入された 外来性ＤＮＡ配列を含むシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムを 具備し、上記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染 した宿主細胞内で発現することが可能な、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスを提供する。 一つの態様において、上記の外来性ＤＮＡ配列は、EcoRI＃９断片のタンパク 質読み取り枠(ORF)A内に挿入されている。外来性ＤＮＡ配列をEcoRI＃９断片のX hoI部位へ挿入してORF Aを分断することは、ORF A領域全体が、組換え体の複製 にとって非必須であることを意味する。 本発明の目的に適した「組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス」は、当 業者らによく知られている技術（例えばDNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECO MBINANT HERPESVIRUSの実験材料と実験方法の項に記載されている方法）によっ て創製された、生のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、このウイルス は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質が欠失されてい ないものである。シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを精製すると、EcoRI＃９ 断片、またはBamHI#１０断片に外来性のＤＮＡ配列、または遺伝子が安定に挿入 されたものが得られる。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、上 記の外来性ＤＮＡが、該組み換え型ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原 性であるポリペプチドをコードする、上記のウイルスを提供する。 一つの態様において、該ポリペプチドは検出可能な標識である。本発明の目的 に適した「検出可能な標識であるポリペプチド」は、該ポリペプチドの二量体、 三量体、及び四量体である。大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼは４つの ポリペプチド、または単量体サブユニットからなる４量体である。一つの態様に おいて、前記のポリペプチドは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼである。好ましく は、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-001、S-HVT-014、 またはS-HVT-012と命名されている。 S-HVT-012は1992年10月15日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),1 2301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR. 2382の下に寄託された。 S-HVT-01 ４は199 ３年12月７日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATC C),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852U.S.A.に、ATCC受入れ番号 、VR.2440の下に寄託された。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様 においては、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワ トリインターフェロン（cIFN）である。好ましい態様において、組換え型のシチ メンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-144と、命名されている。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、その ウイルスゲノムが、マレック病ウイルス（MDV）、ニューカッスル病ウイルス（N DV）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）、 または伝染性粘液嚢病ウイルス（IBDV）由来の抗原性ポリペプチドをコードして いる外来性ＤＮＡを有する、上記のヘルペスウイルスを提供する。 本発明は、EcoRI＃９断片に外来性ＤＮＡ配列が挿入された、組換え型のシチ メンチョウ・ヘルペスウイルスであって、マレック病ウイルス、ニューカッスル 病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、または伝染 性粘液嚢病ウイルスからなる群から選択した抗原性のポリペプチドをコードする 外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを 提供する。 一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列は、 マレック病ウイルス由来であって、マレック病ウイルスの糖タンパク質gA、gB、 またはgDをコードしていている。別の態様において、マレック病ウイルスの糖タ ンパク質gA、gB、又はgDをコードした外来性ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルスのUS2遺伝子のコード領域のユニークなStuI部位へ挿入されてい る。 本発明は更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、その ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードしている外 来性ＤＮＡを有する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好 ましくは、抗原性ポリペプチドはマレック病ウイルスの糖タンパク質gB、gA、ま たはgDである。 一つの態様において、外来性のＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTは、IBDV VP 2、MDV gA、及びMDV gBをコードする。好ましくは、このような組換え型ウイル スは、S-HVT-137、及びS-HVT-143と命名されている。 本発明は更に、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、そのゲ ノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードする外来性ＤＮＡ を有するものであり、更に検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外来 性ＤＮＡを具備する、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好 ましくは、この組み換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-004と 命名されている。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gBをコー ドする外来性ＤＮＡを有している、組換え型のはシチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス は、S-HVT-045と命名されている。 MDVのgBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの、一つの態様も 提供され、また、この組換え型HVTは、S-HVT-045と命名されている。S-HVT-045 は、199 ２年１０月１５日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関す るブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.23 83の下に寄託された。 本発明は更に、MDV抗原をコードする一つよりお多い数の外来性ＤＮＡ配列を 含むように改変された組換え型のHVTを提供する。例えば、MDVのgA、及びgBをコ ードする外来性ＤＮＡ配列はともにHVTゲノム内に運ばれることが可能である。 更に組換え型のHVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードする外来性ＤＮＡ配列を含 むように構築することが可能である。 S-HVT-046、及びS-HVT-04 ７と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA及びgB をコードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供し、S-HVT-04 ８、及びS-HVT-０６２と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA、gB、及びgDを コードした外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型HVTの態様を提供する。 S-HVT-０６２は、199 ３年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的 承認に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(A TCC),12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ 番号、VR.2401の下に寄託された。 本発明は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）由来の抗原性ポリペプチドをコ ードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のHVTを提供する。このような場合 、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F）、 ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、またはニ ューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）に融合させた 大腸菌のβ−ガラクトシダーゼを具備した組換え型のタンパク質であることが好 ましい。このようなウイルスの一つの例は、S-HVT-007と命名されているもので ある。 本発明は更に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外来性 ＤＮＡ配列と同様に、NDV由来の抗原性ポリペプチドをコードする一つ以上の外 来性ＤＮＡ配列を含むように改変された組換え型HVTを提供する。好ましくは、M DVの抗原性ポリペプチドは、MDVのgB、gD、またはgAであり、またNDVでは、Fま たはHNである。 本発明の一つの態様においては、組換え型の HVTは、MDVのgB、MDVのgA、及 びNDVのＦをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HV T-048と命名されているものである。 本発明の一つの態様においては、組換え型のHVTは、MDVのgB、MDVのgA、及びN DVのHNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、このHVTはS-HVT-0 49と命名されているものである。 例えば、MDV gA及びgBをコードする外来性ＤＮＡ配列はともに、HVTゲノム内 へ運ばれる。更に、組換え型HVTは、MDV gA、gB、及びgDをコードする外来性Ｄ ＮＡ配列を有するように構築することができる。 更に、別の態様においては、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配 列は、ニューカッスル病ウイルス由来であって、ニューカッスル病ウイルスの融 合タンパク質、または血球凝集素・ノイラミニダーゼをコードするものである。 別の態様においては、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、または血球 凝集素・ノイラミニダーゼをコードする上記の外来性ＤＮＡ配列は、 シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長領域のEcoRI＃９のXhoI部位 へ挿入される。好ましい態様においては、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスはS-HVT-136と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチ ドをコードしている、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、 ニューカッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ を更に具備したものを提供する。 本発明は更に、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及びマレック病ウイル スの糖タンパク質gD由来の抗原性ポリペプチドをコードした外来性ＤＮＡ配列を 有する組換え型のHVTであって、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質（F ）をコードした外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記の組換え型HVTを提供す る。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスはS-HVT-048 と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、及び マレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを有する組換え 型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル病ウイルスの 血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備し た、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは 、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-049と命名されて いるものである。 本発明は、ゲノムＤＮＡが、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパ ク質gB、及びマレック病ウイルスの糖タンパク質gAをコードした外来性ＤＮＡを 有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、ニューカッスル 病ウイルスの融合タンパク質（F）、及び血球凝集素・ノイラミニダーゼ（ＨＮ ）をコードした外来性ＤＮＡを更に具備した、上記の組換え型シチメンチョウ・ ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘル ペスウイルスは、S-HVT-０５０と命名されているものである。 S-HVT-050は、1993年２月23日に、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブタペスト条約に準じて、American Tissue Cluture Collection(ATCC) ,12301 Parklawn Drive,Rockville，Maryland20852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号 、VR.2400の下に寄託された。 本発明の更に別の態様においては、上記の組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，M DV gD，NDV F，及びNDV HNをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは 、このような組換え型HVTは、S-HVT-106、またはS-HVT-128と命名されているも のである。 本発明は更に、組換え型のヘルペスウイルスを提供する。更に、一つの態様に おいては、外来性ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であって伝染性 喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gBをコードするもの、伝染性喉頭気管炎ウイ ルスの糖タンパク質gIをコードするもの、または伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖 タンパク質gDをコードする。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、以下埜も尾よりなる群より由来した か、または由来することが可能な抗原性ポリペプチドをコードする：MDV gA，MD V gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBVD VP2，IBDV VP3，IBDV VP4,ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワトリパ ラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウイルス 、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウイルス 、ニワトリ貧血ウイルス（agent）、サルモネラ.spp、大腸菌（E.coli）、パス テウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（Ei meria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas） spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。 本発明は更に、伝染性喉頭気管炎ウイルスの抗原性ポリペプチドをコードする 外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルス を提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、ILTVの糖タンパク質gB、及び ILTV gD、またはILTV gIである。 ILTV抗原をコードする、一よりお追い外来性ＤＮＡ配列を有するように改変さ れた組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスもまた、提供される。例えば 、ILTV gB、及びgDは、一緒にHVTゲノム内へ運ばれることが可能であり、ILTV g DとgI、並びにILTV gB、gD、及びgIも同様である。S-HVT-051、S-HVT-052、S-HV T-138と命名されている組換え型HVTは、このような組換え型のウイルスの態様で ある。 本発明はまた、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来 性ＤＮＡ配列と同様に、比TV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多 い外来性ＤＮＡ配列を有する、改変済み組換え型HVTを提供する。好ましくは、M DVの抗原性ポリペプチドはMDV gB，gD，またはgAであり、ILTVの抗原性ポリペプ チドは、ILTV gB，gD，またはgIである。 本発明の一つの態様において、組換え型のHVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，I LTV gD，及びILTV gBをコードする外来性ＤＮＡ配列を有している。好ましくは 、この組換え型HVTは、S-HVT-123と命名されているものである。 本発明の別の態様においては、組換え型HVTは、MDV gB，MDV gA，MDV gD，ILT V gI,及びILTV gDをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。好ましくは、この組 換え型HVTは、S-HVT-139、またはS-HVT-140と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB，マレ ック病ウイルス糖タンパク質gA、及びマレック病ウイルス糖タンパク質gDをコー ドする外来性ＤＮＡ配列を有している組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスであって、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD，伝染性喉頭気管炎 ウイルスの糖タンパク質gB，及び大腸菌（E.coli）のβ−ガラクトシダーゼをコ ードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウ イルスを提供する。好ましくは、この組み換え型シチメンチョ ウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-104と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク 質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードする外来 性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供す る。 本発明は更に、伝染性気管支炎ウイルス（IBV）由来の抗原性ポリペプチドを コードする外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型のHVTを提供する。好ましくは 、抗原性ポリペプチドは、IBVのスパイクタンパク質、またはIBVのマトリックス タンパク質である。 本発明はまた、IBV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多い外来 性ＤＮＡ配列と同様に、MDV由来の抗原性ポリペプチドをコードした一つより多 い外来性ＤＮＡ配列を有する、組換え型HVTを提供する。好ましくは、IBV抗原性 ポリペプチドは、IBVスパイクタンパク質、またはIBVマトリックスタンパク質で あり、またMDV抗原性ポリペプチドは、MDV gB，gD，又はgAである。このような 組換え型のウイルスの一つの態様は、S-HVT-066と命名されているものである。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、伝染性粘液嚢病ウイルス由来の抗原性ポリペ プチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有すしている組換え型シチメンチョウ・ ヘルペスウイルスであって、検出可能な標識であるポリペプチドをコードする外 来性ＤＮＡ配列を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。 更に、一つの態様において、抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配 列は、伝染性粘液嚢病ウイルス由来である。別の態様において、外来性ＤＮＡ配 列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2遺伝子をコードする。別の態様においては 外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3遺伝子をコードする。別の 態様においては外来性ＤＮＡ配列は、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP ４ 遺伝子をコードする。好ましくは、この組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスは、S-HVT-003、またはS-HVT-096と命名されているものである。 S-HVT-003、及びS-HVT-096と命名されている組換え型HVTはそれぞれ、IBDV由 来の抗原性ポリペプチド、及び検出可能な標識をコードした外来性ＤＮＡ配列を 具備した組換え型HVTの態様である。S-HVT-003は、1987年７月21日に、特許手続 き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に準じて、American T issue Cluture Collection(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland20 852 U.S.A.に、ATCC受入れ番号、VR.2178の下に寄託された。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性喉頭気管炎ウイルス由来で あり、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gB、または伝染性喉頭気管炎ウ イルスの糖タンパク質gDをコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ ・ヘルペスウイルスを提供する。 一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であ って、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、または喉頭気管炎ウイルス の糖タンパク質gIをコードする。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列がニューカッスル病ウイルス由来で あり、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ、またはニューカッスル病ウイルスのＦ をコードすることを特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性粘液嚢病ウイルス由 来であり、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、ＶＰ３、またはVP4をコードすること を特徴とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのEcoRI#9断 片へ挿入された外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスであって、前記の外来性ＤＮＡ配列が伝染性気管支炎ウイルス由来であ り、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードすることを特徴 とする、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は以下のものよりなる群から由来したか 、または由来することが可能な、抗原性ポリペプチドをコードしている：MDV gA ，MDV gB，MDV gD，NDV HN，NDV F，ILT gB，ILT gI，ILT gD，IBV，IBDV VP2， IBDV VPD3，IBDV VP4，ニワトリ脳髄炎ウイルス、ニワトリレオウイルス、ニワ トリパラミクソウイルス、ニワトリインフルエンザウイルス、ニワトリアデノウ イルス、ニワトリポックスウイルス、ニワトリコロナウイルス、ニワトリロタウ イルス、ニワトリ貧血ウイルス(agent)、サルモネラ.spp、大腸菌(E.coli)、パ ステウレラ（Pasteurella）.spp.、ボルデテラ(Bordetella)spp.、エイメリア（ Eimeria）.spp.、ヒストモナス（Histomonas）spp.、トリコモナス（Trochomoas ）spp.、家禽線虫、条虫、吸虫類、家禽のダニ/シラミ、家禽の原虫。好ましい 態様においては、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、S-HVT-136と 命名されているものである。 このような抗原性ポリペプチドは、以下のものより由来するか、または由来す ることが可能であるものであってもよい：ネコの病原体、イヌの病原体、ウマの 病原体、ウシの病原体、ニワトリの病原体、ブタの病原体、またはヒトの病原体 。 別の態様においてヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイル ス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロ ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、水痘-帯状ヘルペスウイルスヒトヘ ルペスウイルス６型、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス由来である。更 に、ヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、以下のものからなる群から由来する、 マラリア、または悪性腫瘍に関連していてもよい：プラスモジウム・ファルシパ ラム（Plasmodium falciparum）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertus is）、及び悪性腫瘍。 本発明は更に、ゲノムＤＮＡが、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質 （F）をコードする外来性ＤＮＡ配列を有する組換え型のシチメンチョウ・ヘル ペスウイルスであって、大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼがニューカッス ル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ（HN）に融合している、組み換え 型のタンパク質を更に具備した、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提 供する。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノ ム領域と、マレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチ ョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。 一つの態様において、上記のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウ イルスとの組換え体キメラは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲ ノムのEcoRI＃９断片内に挿入された外来性ＤＮＡ配列を有し、この外来性ＤＮ Ａ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現され うる。 一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリ ペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え 体ヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となりえる。 別の態様において、ポリペプチドは大腸菌（E.coli）のβガラクトシダーゼで ある。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコードする。別 の態様において、サイトカインはニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、または ニワトリインターフェロン（cINF）である。 本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え体ヘルペスウイルスが導入 された動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え体シチメンチョ ウ・ヘルペスウイルスを提供する。 更に、組換え体シチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものからなる群 より選択した抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備している ：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス 、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルス。 本発明は前記の外来性ＤＮＡ配列が内在性の上流のヘルペスウイルスプロモー タの制御下にあることを特徴とする組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイル スを提供する。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は異種の上流プロモータ の制御下にある。別の態様においては、がプロモータは以下のものより選択され る：PRV gX，HSV-1アルファ４，HCMV極初期，MDV gA，MDV gB,MDV gD，ILT gB， BHV-1.1 VP8，及びILT gD。 本発明は、以下のものを必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメン チョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に、外来性ＤＮＡを挿入すること により、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させる相同性ベク タを提供する：(a)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内には 通常存在しない、二本鎖の外来性ＤＮＡ；(b)前記外来性ＤＮＡの一方の末端に ある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、 シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域であるEcoRI＃９部位の一方の 末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの；(c)前記外来性Ｄ ＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡ であって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのコード領域である EcoRI＃９部位のもう一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的で あるもの。この相同性ベクタの例は、751-87.A８、及び761-7.A1と命名されてい るものである。 一つの態様において、ポリペプチドとは、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、 抗原性ポリペプチドとは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル 病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来の 抗原性ポリペプチドである。好ましい態様においては、抗原性ポリペプチドとは 、以下のものである：ニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニワトリイ ンターフェロン（cIFN）、伝染性粘液嚢病ウイルスポリタンパク質、伝染性粘液 嚢病ウイルスのVP2タンパク質、マレック病ウイルスの糖タンパク質gB、マレッ ク病ウイルスの糖タンパク質gD、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、 ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎 ウイルスの糖タンパク質gB、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質gD、伝染 性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマ トリックスタンパク質。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列 は、ウマの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードしている。ウマの病原体の 抗原性ポリペプチドは、ウマインフルエンザウイルス、またはウマヘルペスウイ ルスから由来することが可能である。このような抗原性ポリペプチドは、このよ うな抗原性ポリペプチドの例には、次のようなものがある：ウマインフルエンザ ウイルスA/アラスカ91ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/プラハ 56ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスA/マイアミ63ノイラミニダー ゼ、ウマインフルエンザウイルスA/ケンタッキー81ノイラミニダーゼ、ウマヘル ペスウイルス１型糖タンパク質B、及びウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質D 。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡ配列 は、ウシRSウイルス、またはウシパラインフルエンザウイルスから由来した抗原 性ポリペプチドをコードする。この抗原性ポリペプチド￥￥￥￥￥ ウシＲＳウイルス吸着タンパク質（BRSV G）、ウシRSウイルス融合タンパク質 （BRSV F）、ウシRSウイルスヌクレオカプシドタンパク質（BRSV N）、ウシパラ インフルエンザウイルス３型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイ ルス３型血球凝集素・ノイラミニダーゼ。 別の態様においては、上記の相同性ベクタ内の上記の二本鎖外来性ＤＮＡは、 ヒトの免疫反応を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サ イトカインはインターロイキン-2、インターロイキン-6、インターロイキン-12 、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、及びインター ロイキン受容体であることが可能であるが、これらには限定されない。 本発明の一つの態様においては、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖 ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのBajnHI＃１６断片内に存 在するＤＮＡ配列に対して相同性である。好ましくは、シチメンチョウ・ヘルペ スウイルスの二本鎖ＤＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUL43 タンパク質をコードするタンパク質読み取り枠内に存在するＤＮＡ配列に相同性 である。好ましくは、この相同性ベクタは172-29.31と命名されているものであ る。 本発明の目的に適した「相同性ベクタ」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイル スのゲノムの特異的部位へ外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミド である。 本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖Ｄ ＮＡ配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI＃９断片内に存 在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクタは172-63.1と 命名されているものである。 本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖Ｄ ＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのUS2遺伝子コード領域内に 存在するＤＮＡ配列に相同性である。好ましくは、この相同性ベクタは、435-47 .1と命名されているものである。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、スクリーニング可能な標識をコード するＤＮＡ配列である。スクリーニング可能な標識の例には大腸菌（E.coli）の βガラクトシダーゼ、または大腸菌（E.coli）のβ−グルクロニダーゼが含 まれるが、これらには限定されない。 本発明は更に、本発明の有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウ イルス、及び適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、マレック病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチンで あって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切 な担体を具備したものを提供する。 本発明は、ニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワク チンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及 び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、伝染性喉頭気管炎病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワ クチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、 及び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、伝染性気管支炎病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワク チンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及 び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、伝染性粘液嚢病ウイルスに対してトリを免疫するのに有益なワクチ ンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び 適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、マレック病ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスに対してトリ を免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリ を免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シ チメンチョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを 免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメン チョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は、マレック病ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルスに対してトリを 免疫するのに有益な多価のワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメン チョウ・ヘルペスウイルス、及び適切な担体を具備したものを提供する。 本発明は更に、家禽を免疫する方法を提供する。本発明の目的に適したこの方 法には、以下のものに対して家禽を免疫することが含まれる：伝染性粘液嚢病ウ イルス、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウ イルス、または伝染性気管支炎ウイルス。この方法は、家禽に対して、本発明の ワクチンを、免疫的に有効な量で投与することを具備している。このワクチンは 、当業者によく知られる方法の如何なるものを使用して投与されてもよく、例と しては、筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内接種がある。あるいは、ワクチン は、鼻腔内的、または経口的に投与することが可能である。 本発明は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞を提供する 。一つの態様において、宿主細胞はトリの細胞である。 本発明の目的に適した「宿主細胞」は、ベクタとその挿入物を増殖させるのに 使用される細胞である。細胞感染は当業者らによく知られたもので行なわれたが 、例としては、実験材料と実験方法の項の「組み換えヘルペスウイルスを作成す るためのＤＮＡ形質移入」に記載されているものがある。組換え型のシチメンチ ョウ・ヘルペスウイルスを構築し、選択し、精製する方法は以下に詳しく記載さ れている。 本発明は、上記のワクチンを投与されたニワトリ、またはその他の家禽を、天 然のマレック病ウイルスに感染したものより識別する方法であって、ニワト リ、またはその他の家禽から得た体液を分析して、天然のマレック病ウイルスに 感染したニワトリ、若しくはその他の家禽で通常は発現している少なくとも一つ の抗原と、糖タンパク質gGとの存在を調べることを具備した方法であり、感染し たニワトリでは通常発現しているこのような抗原が存在するが糖タンパク質gGが 存在しないことは上記のワクチン接種を受けたことを示し、天然おマレック病ウ イルスに感染したのではないことを示す、上記の方法を提供する。 本発明は、以下のものを含むがこれらには限定されない、トリ、または哺乳類 種においてワクチンとして有益な、外来性ＤＮＡを発現する組換え型のシチメン チョウ・ヘルペスウイルスを提供する：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ネ コ、イヌ、ウシ、ウマ、及びヒトを含む霊長類。 本ワクチンは、不活化、または生の組換え型ウイルスの何れかであってもよい 。 本発明の目的に適した、本発明の「免疫的に効果的な量」の組換え型ネコヘル ペスウイルスは、10³から10⁹PFU/投与量の範囲にある。好ましい態様においては 、免疫量は10⁶PFU/投与量である。 本方法は、動物に対して本発明のワクチンを免疫的に有効な量で投与すること を具備している。ワクチンは当業者によく知られた如何なる方法で投与されても よく、例としては筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内注射がある。あるいは、 ワクチンは鼻腔内的、または経口的に投与されてもよい。 組換え型ウイルスのための適切な担体は、当業者にはよく知られており、タン パク質、糖等が含まれるが、これらには限定されない。このような適切な担体の 一つの例は、生理学的に均衡のとれた培養液であって、加水分解済タンパク質や ラクトース等の一つ以上の安定化剤を有するものがある。好ましくは、生のワク チンは組織培養液を採取して、安定化性のある加水分解済タンパク質を加えるこ とで作成される。好ましくは、不活化ワクチンはウイルスの不活化後すぐに組織 培養液を使用する。 本発明は更に、以下に続く実験の詳細な記載部で例示されている。この部分は 発明を理解する補助として書かれているが、その後に書かれている発明を、如何 なるようにしても限定することを意図しているものではなく、またそのように解 釈すべきものでもない。 実験の詳細 材料と方法 シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料の調製 ２mMグルタミン、１００単位/mlペニシリン、１００単位/mlストレプトマイ シンを含有するダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（これらの成分は、 Irvine Scientificまたは同等の会社から得られ、以後完全ＤＭＥ培地と呼ぶ） に１％ウシ胎児血清を加えた培地中、０．０１PFU/細胞の感染多重度で組織培養 細胞を感染させて、シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料を調製した 。細胞変性作用が完了後、培地と細胞を採取し、細胞を臨床用遠心分離機中で３ ０００rpmで５分遠心分離してペレットにした。感染した細胞を２０％ウシ胎児 血清、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地中に再懸濁し、−７０℃で保存した。 シチメンチョウのヘルペスウイルスＤＮＡの調製 シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）のすべての操作は、ＦＣ−１ ２６株（ＡＴＣＣ＃５８４−Ｃ）を用いて行なった。感染細胞の細胞質からのＨ ＶＴウイルスＤＮＡの調製のために、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の増殖 が始まる前に広範な細胞変性作用を引き起こすのに充分な感染多重度で感染させ た。インキュベートはすべて、空気中に５％炭酸ガスを有する加湿インキュベー ター中で行なった。最大に感染したが不完全な細胞溶解を示した単層（典型的に は５−７日目）を採取することにより最大のＤＮＡ収率が得られた。細胞掻き取 り器（Costarブランド）を用いて、培地中に感染した細胞を採取した。細胞懸濁 液をＧＳ−３ロータ(Sorvall Instruments)中で３０００rpmで５℃で１０分遠心 分離した。得られたペレットを冷ＰＢＳ（２０ml/ローラービン（Roller Bottle ））に再懸濁し、冷却してさらに３０００rpmで１０分遠心分離した。ＰＢＳを デカント後、細胞ペレットを４ml/ローラービンのＲＳＢ 緩衝液（１０mMトリス（pＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ、および１．５TmM ＭｇＣ ｌ₂）に再懸濁した。ＮＰ−４０（ノニデットＰ−４０（登録商標）、Sigma）を 、０．５％になるように時々攪拌して試料に加えた。試料を３０００rpmで１０ 分冷却遠心分離して、核をペレットにし、細胞破片を除去した。上清液を注意深 く、１５mlのCorex遠心分離管に移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）と ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、ストック２０％）を、それぞれ最終濃度５mM と１％になるように試料へ加えた。試料４mlに対して１００μｌのプロテイナー ゼ−Ｋ（１０mg/ml、Boehringer-Mannheim）を加え、混合し、４５℃で１〜２時 間インキュベートした。インキュベート後、等量の水飽和フェノールを試料に加 え、手で静かに混合した。臨床用遠心分離機で試料を３０００rpmで５分遠心分 離した。酢酸ナトリウムを最終濃度０．３Ｍ（ストック溶液３Ｍ、ｐＨ５．２） になるように水層に加え、２．５容量の冷無水エタノールを添加後−７０℃で３ ０分核酸を沈殿させた。ＨＢ−４ロータ中で５℃で８０００rpmで２０分遠心分 離して試料中のＤＮＡをペレットにした。上清を注意深く除去し、ＤＮＡペレッ トを２５mlの８０％エタノールで洗浄した。真空下で短時間（２〜３分）乾燥し 、ＴＥ緩衝液（１０mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ）の５０μｌ/ロー ラービンの感染細胞に再懸濁した。典型的にはウイルスＤＮＡの収率は、５〜１ ０μｌ/ローラービンの感染細胞の範囲であった。すべてのウイルスＤＮＡを約 １０℃で保存した。 ポリメラーゼ埋め込み（fill-in）反応 ５０mMトリス（pＨ７．４）、５０mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂、および４種 類のデオキシヌクレオチドを各４００μMを含有する緩衝液中にＤＮＡを再懸濁 した。１０単位のクレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を加え、室温で１５分 反応を進行させた。次にＤＮＡをフェノールで抽出し、前述のようにエタノール で沈殿させた。 ＤＮＡ配列決定 ＵＳＢシーケナーゼキット（Sequenase Kit）と³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ） を用いて、配列決定を行なった。ｄＧＴＰ混合物とｄＩＴＰ混合物の両方を用い て、圧縮のある領域を解明した。あるいは、圧縮のある領域をホルムアミド ゲルで分離した。鋳型は２本鎖プラスミドサブクローンまたは１本鎖Ｍ１３サブ クローンであり、プライマーは、配列決定される挿入体のすぐ外でベクターに、 またはあらかじめ得られた配列に作成した。得られた配列を集合させ、Dnastar ソフトウェアを用いて比較した。得られた配列の操作と比較は、Coral Software のSuperclone and Superseeプログラムを用いて行なった。 分子生物学的方法 制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽 出、連結、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処理、細菌培養物の 増殖、ＤＮＡによる細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法を含む、細菌 やＤＮＡの操作方法は、マニアティス（Maniatis）ら（1982）およびサンブルッ ク（Sambrook）ら（1989）により記載されている。種々のＤＮＡの操作に便利な 制限部位を導入するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。使用 した方法は、インニス（Innis）ら（1990）により記載されたものである。一般 に増幅された断片のサイズは５００塩基対未満であり、増幅断片の決定的に重要 な領域は、ＤＮＡ配列決定により確認された。特に明記していない限りこれらの 方法に若干変更を加えて使用した。 ＤＮＡのサザンブロッティング サザンブロッティングの一般的な方法は、マニアティス（Maniatis）ら(198 2)の方法を使用した。ＤＮＡを２０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣ ｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中でニトロセルロースフィ ルター（Ｓ＆Ｓ ＢＡ８５）にブロットし、３０％ホルムアミド、１×デンハル ツ溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）、０．０２％フィコール）、６×ＳＳＣ、５０mM ＮａＨ₂ＰＯ₄ 、ｐＨ６．８、２００μg/mlサケ精子ＤＮＡよりなるハイブリダイゼーション 溶液中で、５５℃で４〜２４時間プレハイブリダイゼーションを行なった。Beth esda Research Laboratories（ＢＲＬ）のキットと１つの³²ｐ−標識ヌクレオチ ドを用いてニックトランスレーションにより標識した標識プローブＤＮＡを加え た。ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）またはセファデックスＧ５０カラム（Pharmacia ）により、取り込まれなかったＤＮＡからプローブＤＮＡを 分離した。５５℃で一晩ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で２×Ｓ ＳＣで１回洗浄し、次に０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）で５５℃で３０分の洗浄を２回行なった。フィルターを乾燥しオートラジ オグラフィーを行なった。 ｃＤＮＡクローニング操作 ｃＤＮＡクローニングとは、現状の技術を用いてＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に 変換するために使用する方法を意味する。本出願人の方法は、グブラーとホフマ ン（Gubler and Hoffman 1983）、に記載されている。Bethesda Research Labor atories（Gaithersburg、メリーランド州）は、本出願人の方法にきわめて類似 したｃＤＮＡクローニングキットを考案し、これは我々と同じような結果を得る ために使用できる試薬のセットと方法を含む。 ウイルスｍＲＮＡをクローニングするために、ウイルスによる感染に感受性 のの＝宿主細胞株を５〜１０プラーク形成単位／細胞で感染させた。細胞変性作 用が明らかになったが、完全に破壊される前に、培地を除去し、１０mlの溶解緩 衝液（４Ｍグアニジンチオシアネート、０．１％消泡剤Ａ、２５mMクエン酸ナト リウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍベーターメ ルカプトエタノール）中で細胞を溶解させた。細胞溶解液を、滅菌したダウンス ホモジナイザー中に注ぎ、溶液が均一になるまで氷の上で８〜１０回ホモジネー トした。ＲＮＡ精製のために、８mlの細胞溶解液をBeckman ＳＷ４１遠心分離管 中の３．５mlのＣｓＣｌ溶液（５．７ＭＣｓＣｌ、２５mMクエン酸ナトリウム（ ｐＨ７．０））に静かに重層した。試料をBeckman ＳＷ４１ロータ中で２０℃で ３６０００rpmで１８時間遠心分離した。遠心分離管を氷の上に置き、遠心分離 管の上清を注意深く除去してＲＮＡペレットを乱さないように残した。ペレット を４００μｌのガラスで蒸留した水に再懸濁し、２．６mlのグアニジン溶液（７ ．５Ｍグアニジン−塩酸、２５mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、５mMジチ オスレイトール）を加えた。０．３７容量の１Ｍ酢酸を加え、次に０．７５容量 の冷エタノールを加え、試料を−２０℃で１８時間置いてＲＮＡを沈殿させた。 ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００rpmで１０分間遠心分離して沈殿物を集め た。ペレットを１．０mlの蒸留水に溶解し、１３０００rpmで再度遠心分離し、 上清を採取した。ペレットからさらに ２回上述のように０．５mlの蒸留水でＲＮＡを抽出し、上清をプールした。０． １容量の２Ｍ酢酸カリウム溶液を試料に加え、次に冷エタノールを２容量加えて 、試料を−２０℃に１８時間置いた。沈殿したＲＮＡを、ＳＳ３４ロータ中で４ ℃で１００００rpmで１０分遠心分離して集めた。ペレットを１mlの蒸留水に溶 解し、Ａ２６０／２８０の吸光度から濃度を求めた。ＲＮＡを−７０℃に保存し た。 オリゴ−ｄＴセルロース（Pharmacia #27 5543-0）を用いて、ポリアデニル 酸テイル（ポリＡ）を含有するｍＲＮＡを選択した。３mgの全ＲＮＡをボイルし 、冷却して、結合緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＬｉＣｌ 、５mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸リチウム）中で１００m gのオリゴ-ｄＴセルロースカラムにかけた。保持されたポリＡ ＲＮＡを、溶出 緩衝液（５mMトリス（ｐＨ７．５）、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム）でカラムから溶出した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中 で再びオリゴーｄＴセルロースカラムにのせ、溶出緩衝液で再度溶出した。試料 を２００mMの酢酸ナトリウムで沈殿させ、２容量の冷エタノールを加えて、−２ ０℃で１８時間置いた。ＲＮＡを５０μｌの蒸留水に再懸濁した。 １０μｇのポリＡＲＮＡを２０mMの水酸化メチル水銀中で２２℃で６分間変 性させた。β−メルカプトエタノールを７５mMになるように加え、試料を２２℃ で５分インキュベートした。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための反応混合物は０． ２５ml中に、１μｇオリゴ−ｄＴプライマー（P-L Bio-chemiclas）または１μ ｇ合成プライマー、２８単位の胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（Bethesda R esearch Laboratories#5518SA）、１００mMトリス（ｐＨ８．３）、１４０mM Ｋ Ｃｌ、１０mM ＭｇＣｌ₂、０．８mM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ ＴＰ（Pahrmacia）、１００μＣｉの³²ｐ−標識ｄＣＴＰ(New England Nuclear #NEG-013H)、および１８０単位のＡＭＶ逆転写酵素(Molecular Genetics Resour ces #MG 101)を含有した。反応物を４２℃で９０分インキュベートし、次に２０ mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止させた。試料を等量のフェノール／ク ロロホルム（１：１）で抽出し、２mMの酢酸アンモニウムと２容量の冷エタノー ルで−２０℃で３時間沈殿させた。沈殿と遠心分離後、ペレットを１００μｌの 蒸留水に溶解した。試料を緩衝液(１００mMトリス(ｐ Ｈ７．５）、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００mM ＮａＣｌ）中で１５mlの Ｇ−１００セファデックスカラム（Pahrmacia）にかけた。溶出するＤＮＡ画分 の先端をプールし、容量が約１００μｌになるまでＤＮＡを凍結乾燥して濃縮し 、次に酢酸アンモニウムとエタノールで前記したように沈殿させた。 第１の鎖の全試料を第２の鎖の反応に使用した。第２の鎖の反応は、全量５ ０μｌ中の５０μｇ/ml ｄＮＴＰ、５．４単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（Boehri nger-Mannheim #642-711）、および１００単位/mlの大腸菌（E.coli）ＤＮＡリ ガーゼ（New England Biolabs #205）を用いた以外は、グブラーとホフマン（Gu bler and Hoffman（1983））の方法に従った。第２の鎖の合成後、ｃＤＮＡをフ ェノール／クロロホルムで抽出し沈殿させた。このＤＮＡを１０μｌの蒸留水に 再懸濁し、１μｇのＲＮアーゼＡで２２℃で１０分処理し、４０mMトリス−酢酸 （ｐＨ６．８５）中１％アガロースゲル（SigmaII型アガロース）で電気泳動し た。ゲルを臭化エチジウムで染色し、予想される範囲のサイズのＤＮＡをゲルか ら切り出し、８mMトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）で電気泳動した。電気泳動した ＤＮＡを凍結乾燥して約１００μｌにし、前記したように酢酸アンモニウムとエ タノールで沈殿させた。ＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁した。 クローニングを促進するためにＤＮＡにオリゴ−ｄＴを加えた。反応物は、 ５０μｌ中にＤＮＡ、１００mMカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、０．２mMジ チオスレイトール、２mM ＣａＣｌ₂、８０μモルｄＣＴＰ、および２５単位のタ ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Molecular Genetics Reso urces #1001)を含有した。３７℃で３０分後、１０mM ＥＤＴＡで反応を停止さ せ、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、前記したように沈殿させた。 ｄＣテイルのあるＤＮＡ試料を、２００μｌの０．０１Ｍトリス（ｐＨ７． ５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の、オリゴ−ｄＧテ イル（Bethesda Research Laboratories #5355 SA/SB）を含有する２００ngのプ ラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２分、次に５７℃で２時間アニーリ ングさせた。新鮮なコンピタント大腸菌（E．coli）ＤＨ−１細胞を調製し、ハ ナハン（Hanahan（1983））が記載したように、２００μｌの一定分割量の細胞 ２０個中のアニーリングしたｃＤＮＡ試料の半分を用いて形質転換した。 形質転換した細胞を１０μｇ/mlテトラサイクリン含有するＬ−ブロス寒天プレ ートに広げた。Ampscreen（Bethesda Research Laboratories #5537 UA）を用い て、アンピシリン遺伝子中の挿入体の存在についてコロニーをスクリーニングし 、陽性のクローンを取り上げて解析した。 組換えヘルペスウイルス作製のためのＤＮＡ形質移入 本方法は、カワイとニシザワ（Kawai and Nishizawa(1984)）のポリブレン −ＤＭＳＯ法に以下の変更を加えて行なった。組換えＨＶＴウイルスの作製は、 ＨＶＴウイルスＤＮＡと、適当なヘルペスウイルスクローン化配列が隣接する目 的の外来性ＤＮＡを含有するプラスミド相同性ベクターとの相同的組換えに依存 する。形質移入は、６cmのプレート（Corning plastic）の５０％コンフルエン スの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞中で行なった。細胞を前日に、４μg/ mlのポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４mg/ml）を含有するＣＥＦ増殖培地 （１×Ｆ１０／１９９、５％ウシ胎児血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ 酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）中に広げた。ＣＥＦ細胞への 共形質移入（コ・トランスフェクション）のために、５μｇの完全なＨＶＴＤＮ Ａを、３０μｇ/mlポリブレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４mg/ml）を含有するＣ ＥＦ培地１ml中に懸濁した。次にＤＮＡ−ポリブレン懸濁液（１ml）を６cmプレ ートのＣＥＦ細胞に加え、ここから培地を吸引し、３９℃で３０分インキュベー トした。接種物を再分散させるために、この間プレートを定期的に揺らせた。こ の時間の後、４mlのＣＥＦ増殖培地を洗浄プレートに直接加え、３９℃でさらに ２．５時間インキュベートした。この時各プレートから培地を除去し、１×ＨＢ ＳＳ中の３０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、J.T．Baker Chemical Co.） ２mlで室温で４分間細胞にショックを与えた。３０％ＤＭＳＯを注意深く除去し 、単層を室温で１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次に５mlのＣＥＦ増殖培地を添加 後、細胞を３９℃でインキュベートした。翌日、残存するＤＭＳＯを除去し細胞 増殖を刺激するために、培地を交換した。６日以内にウイルスの細胞変性作用が 明らかになる。この日から通常１週間以内に、より高力価（８０％−９０％ＣＰ Ｅ）の作成が可能になる。感染細胞を、２０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを 含有するＣＥＦ増殖培地中に再懸濁してＨＶＴストック試料を調製し、−７０℃ に保存した。 サブゲノムＤＮＡ断片からの組換えヘルペスウイルスの作製方法 クローン化した重複サブゲノムＤＮＡ断片の共形質移入（コ・トランスフェ クション）によるヘルペスウイルスを作製する能力は、仮性狂犬病ウイルス（Zi j1ら、1988）について証明されている。欠失および／または挿入は、共形質移入 （コ・トランスフェクション）の前に直接サブゲノム断片に行われるなら、この 方法によりゲノム変更を含有する高頻度のウイルスが得られ、組換えウイルスの 精製に必要なスクリーニングの量を大幅に低下させる。この方法は組換えＨＶＴ の作製に使用される。 重複するＨＶＴサブゲノム断片を含有するサブクローンのライブラリーを、 以下のように作製した。ＨＶＴＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ョン(ＦＣ−１２６(″Calnek″))から得た。これを剪断し、vanZijlら(1988)が 記載したように、４０〜５０kbの断片を挿入体集団として選択して、グリセロー ル勾配によりサイズ選択した。プールした画分をＴＥで２倍希釈し、１／１０容 量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量のエタノールを加え、ＤＮＡをBeckman S Ｗ４１ロータ中で３００００rpmで１時間沈殿させた。３’オーバーハングの除 去を促進するために低濃度のＤＮＴＰを用いて、まずＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ により剪断した断片を処理し、次にへこんだ３’末端をクレノウポリメラーゼで 充填して平滑末端にした。次にこれらの挿入体断片を、ＢａｍＨＩで消化しウシ 小腸ホスファターゼで処理しクレノウポリメラーゼで平滑末端としたｐＷＥ１５ （Stratagene）コスミドベクターに連結した。連結した混合物を次に、Gigapack XLパッケージ抽出物（Stratagene）を用いてパッケージングした。連結とパッ ケージングは、製造業者の薦めるように行なった。 酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、およびＸｈｏＩの公表された制限酵素地図の ため、サブクローニングした断片を特異的プローブとして使用して、ゲノムをま たぐサブクローニングのコスミドライブラリーをスクリーニングすることができ た。サブクローニングした制限断片からプローブを作製した。次に非放射性シス テム（Genius，Boehringer-Mannheim）を用いて、断片を標識した。コロニーを 取り上げて培地に入れ次に一晩増殖させてスクリーニングを促進した。５個のフ ィルターとマスタープレートのセットを、マイクロタイタープレートからスタン プして、再び一晩増殖させた。グリセロールを１５％になるように ウェルに入れ、プレートを−２０℃で凍結して、各コロニーのストック培養物を 得た。フイルターは、BioRad Colony Lift Membranesであり、製造業者の薦める ように処理しハイブリダイズさせ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６5℃ で洗浄した。非放射性プローブとハイブリダイズしたコロニーを、Geniusキット の説明書に従って検出した。 ２つまたはそれ以上の特異的プローブへのハイブリダイゼーションに基づき 、さらに解析してコロニーを選択した。次にこれらをＢａｍＨＩで消化し、ＨＶ Ｔの公表されている地図（Buckmasterら、1988）と比較した。こうして３つのコ スミド（４０７−３２．２Ｃ３、４０７−３２．ＩＧ７、４０７−３２．５Ｇ６ ）を得た。各クローンの詳細な説明は後述する。これらのコロニーから妥当な収 率のＤＮＡを得るには、クロラムフェニコール増幅（Maniatisら、1982）が必要 であることが見いだされた。さらに、１つのコスミドクローン（４０７−３２． ５Ｇ６）は不安定であり、満足できるＤＮＡ調製物を得るには、本来の凍結スト ックから増殖する必要があった。 ｐＷＥ１５ベクターは、挿入体をＮｏｔＩで切断することを可能にする。し かし、ＨＶＴゲノムには４つのＮｏｔＩ部位があり、これらの部位にまたがって いる挿入体はＮｏｔＩで切断できない。ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片にはＮｏｔ Ｉ部位の２つがあり、この断片は直接ｐＳＰ６４中でクローン化された。他の２ つの部位は、ＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークな短い領域中に存在した。この断 片は直接ｐＷＥ１５ベクター中でクローン化された。３つの剪断したコスミドと ２つのＢａｍＨＩ断片は、ＨＶＴゲノムの末端のすべてのしかし小さな部分をカ バーする。これらの領域はゲノムの内部で繰り返されていらため、ゲノム情報の すべてが利用できる。 ＨＶＴＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は、「組換えヘルペスウイルスを作製 するための相同的組換え法」（実施例６）を用いて、外来性ＤＮＡ挿入のための 有用な部位として確立されている。ＨＶＴＵＳ２遺伝子は、５つのｓｔｕＩ部位 を含有するＢａｍＨＩ＃１断片内に位置する。外来性ＤＮＡの挿入にこの部位の 使用を促進するために、ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位をユニークなＨｉｎｄII I部位に変換した。このために、ＢａｍＨＩ＃１サブクローンをＳｔｕＩ部位で 部分的に消化し、次にＨｉｎｄIIIリンカーを用いてこの部位内にカノマイシン 耐性（Neo^R）を与える１０kbの断片を挿入した。カノマイシン 耐性遺伝子により、組換えクローンの陽性の選択が可能になった。このNeo^R断片 はＨｉｎｄIIIで消化して除去し、次に再連結してクローン４３０−８４．２１ ５を作製した。 ＨＶＴ挿入部分の外または隣接するサブクローンを切断する酵素で制限消化 して、再作製実験のためにＤＮＡを調製した。ある場合には、再作製中の１つの コスミドを消化しないで使用した。消化したＤＮＡをフェノールで１回抽出し、 エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．５〜１μｇ/mlの濃度で再懸濁した。形 質移入を仲介するためにウイルス再作製実験をリポフェクチン（ＢＲＬ）を用い て行なった。各サブクローン２〜３μｇを、１％非必須アミノ酸と２％ペニシリ ン／ストレプトマイシンを補足したＭＥＭ培地（アール塩溶液）（ＭＥＭ＋）０ ．５mlに加えた。対照は、ＤＮＡを含ないＭＥＭ＋であり、数μｇのＨＶＴＤＮ Ａを含むかまたは５つのサブクローンのうち４つを含むものである。別に、３０ μｌのリポフェクチンを０．５mlのＭＥＭ＋に加えた。これらの２つの混合物を 次に一緒にし、室温で１５分間インキュベートした。 ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞を形質移入のために、以下のように作成し た。ＣＥＦ（Spafas）を６つの６ウェルプレート中で、１％非必須アミノ酸、２ ％ペニシリン／ストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を含有するＦ１０ ／Ｍ１９９（１：１）培地（ＣＥＦ＋）中で３９℃で増殖させた。細胞を９０〜 ９５％のコンフルエンスで形質移入した。形質移入のために、ウェルを吸引し、 ＭＥＭ＋で３回洗浄し、次に前記の１mlリポフェクチン／ＤＮＡ混合物とともに ３９℃で４時間インキュベートした。次にさらに１mlのＣＥＦ＋をウェルに加え 、細胞を一晩インキュベートし、ＣＥＦ＋を与えた。次にプラークの出現につい て毎日プレートを試験した。 対照ＨＶＴ ＤＮＡを有するリポフェクチンでは、５日以内にプラークが出 現した。５クローンのうち４つのみを使用すると、プラークは得られなかった。 ＨＶＴの５つの重複するゲノムの断片を使用してウイルスを再作製すると、最初 のリポフェクション後５〜１９日のどこかでプラークが出現した。遅く出現する プラークの場合は、感染した単層に最初プラークは見えず、単層を継代して大き な表面に再度広げるとプラークが現れた。継代後、一般に３日以内にプラークが 現れた。組換えウイルスを約３回プラーク精製し、外来性ＤＮＡの挿入について 解析した。 組換えヘルペスウイルスのBluogalスクリーニング 外来性ＤＮＡが酵素β−ガラクトシダーゼをコードする時、その遺伝子を含 有するプラークはより容易に目で見えた。プラーク測定の間化学物質Bluogal（ 登録商標）（Bethesda Research Laboratories）は２００〜３００μｇ/mlのレ ベルでアガロース重層中に取り込まれ、活性なβ−ガラクトシダーゼを発現する プラークは青くなった。次に青いプラークを取り上げ、さらに青いプラークを単 離して精製した。他の外来性ＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換する ように相同的組換えにより挿入した。この場合組換えウイルスの精製のために青 くないプラークを取り上げた。 黒いプラーク測定法を用いる組換えＨＶＴでの外来遺伝子発現のスクリーニン グ 組換えＨＶＴウイルスにより発現される外来性抗原の発現を解析するために 、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＨＶＴで感染させて、栄養アガロース培地を重層し 、３９℃で４〜５日間インキュベートした。プラーク出現後、アガロース重層を プレートから除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄し、１００％メタノールで室温で １０分間固定し、細胞を空気乾燥した。ＰＢＳでプレートを再び水和した後、一 次抗体をＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、室温で２時間から一晩細胞単層ととも にインキュベートした。次に室温でＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった抗体 を細胞から除去した。アルカリ性ホスファターゼ結合２次抗体をＰＢＳで希釈し 、細胞とともに室温で２時間インキュベートした。次に室温で細胞をＰＢＳで３ 回洗浄して、結合しなかった２次抗体を除去した。次に、発色緩衝液（1００mM トリス（ｐＨ９．５）／１００mM ＮａＣｌ／５mM ＭｇＣｌ₂）で単層を洗浄し 、次に新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中０．３mg/mlニトロブルーテトラ ゾリウム＋０．１５mg/ml ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェー ト）で室温で１０分〜一晩インキュベートした。最後に、基質溶液をＴＥ（１０ mMトリス（ｐＨ７．５）／１mM ＥＤＴＡ）で置換して反応を停止させた。正し い抗原を発現するプラークは黒く染色される。 組換えＨＶＴストックの純度を評価するためのプラークハイブリダイゼーシ ョン法 組換えＨＶＴウイルス中の特定の抗原の存在を検出するための適当な免疫学 的試薬が存在しない場合、ストックの純度を評価するためにプラークハイブリダ イゼーション法が使用される。まずＣＥＦ細胞単層を種々の希釈率のウイルスス トックで感染させて、約５０〜１００プラーク／１０cmプレートを得て、栄養ア ガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベートする。いったんプラ ークが出現したら、各プラークの位置をプレートの底にマークする。次にアガロ ース重層を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、残存するＣＥＦ単層をＰＢＳで あらかじめ浸潤させたＮＣ膜またはBioRadナイロン膜に形質移入する（プレート に対して膜の位置を記録しておく）。次に膜を１．５mlの１．５Ｍ ＮａＣｌお よび０．５Ｍ ＮａＯＨに５分間入れて、ＮＣ膜上の細胞を溶解する。膜を１． ５mlの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中に５分間入れて中和する。次に溶解 した細胞からのＤＮＡを８０℃で１時間ベークしてＮＣ膜に結合させる。この時 間の後、膜を、６×ＳＳＣ、３％スキムミルク、０．５％ＳＤＳ、（±）サケ精 子ＤＮＡ（５０μｇ/ml）を含有する溶液中で６５℃で１時間プレハイブリダイ ゼーションする。次に、放射標識プローブＤＮＡ（アルファ³²Ｐ−ｄＣＴＰ）を 加え、膜を６５℃で一晩（約１２時間）インキュベートした。ハイブリダイゼー ション後ＮＣ膜を６５℃で２×ＳＳＣで２回洗浄（各３０分）し、次に６５℃で ０．５×ＳＳＣでさらに２回洗浄する。次にＮＣ膜を乾燥し、−７０℃で１２時 間Ｘ線フィルム（Kodak XOOMT，AR）に露光させる。陽性のシグナルをプレート 上のプラークの位置と合わせて、ストックの純度を、全体に対する陽性プラーク のパーセントとして記録する。 ＨＶＴＵＳ２遺伝子へのベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入のための相同ベ クターの作製 ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃７断 片中のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。マーカー遺伝子はＵＳ２遺伝子と同 じ配向である。マーカー遺伝子の詳細な説明は、図７Ａと７Ｂに記載されている 。これは標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）を 用いて、以下の供給源からの制限断片を図７Ａと７Ｂに記載の合成ＤＮＡ配列と 結合させて作製する。断片１は、ＰＲＶＢａｍＨＩ制限断片１０ である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら、1985）の約３０１０ 塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨ 制限サブ断片である。 コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ SPAFAS,Incの３週令のヒヨコからニワトリ脾臓を切開し、洗浄し、そしてシ リンジ／針で破壊し細胞を放出させた。間質と破片を沈降させた後、細胞をペレ ットにし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して赤 血球を溶解し、脾臓細胞を回収しＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を、５％ＦＢ Ｓおよび５μｇ/mlコンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩ中に５×１０⁶細胞／ml で再懸濁し、３９℃で４８時間インキュベートした。グアニジンイソシアネート 溶解試薬とPromega ＲＮＡ単離キット（Promega Corporation、マジソン、ウィ スコンシン州）の試薬を用いて、細胞から全ＲＮＡを単離した。適当なアンチセ ンスプライマーとＡＭＶ逆転写酵素（Promega Corporation、マジソン、ウィス コンシン州）を含有する各第１の鎖反応物に、４μｇの全ＲＮＡを使用した。ｃ ＤＮＡ合成は、逆転写酵素反応後の同じ試験管中で適当なセンスプライマーとVe tnt(登録商標)ＤＮＡポリメラーゼ(Life Technologies，Inc.、ベセスダ、メリ ーランド州）を用いて行なった。 サブゲノムクローン１７２−０７．ＢＡ２ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド１７２−０７．ＢＡ２を作製した 。これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約２５，０００塩基対領域を含有する。これは、 組換えＨＶＴ作製のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用する ことができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982お よびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合する ことにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２ ９９９塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ （Buckmasterら、1988）の約２５，０００塩基対のＢａｍ ＨＩ＃２断片である。 相同ベクター１７２−２９．３１ 外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド１７２−２９．３１を作 製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有 する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トラ ンスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って、ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含 有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。 このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら 、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製 することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対の ＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ（Buckmasterら 、1988）の約３３００塩基対のＢａｍＨＩ＃１６断片である。ＢａｍＨＩ＃１６ の完全な配列は配列認識番号３に記載される。この断片は、ＵＬ４３ ＯＲＦが ｐＳＰ６４β−ラクタマーゼ遺伝子とは反対の転写配向になるようにクローン化 されたことに注意すべきである。 相同ベクター１７２−６３．１ 外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド１７２−６３．１を作製 した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有す る。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ・トラン スフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って、ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ挿入体を含有 するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。こ のプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、 1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合することにより作製す ることができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９９塩基対のＥ ｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴの約５５００塩基 対のＢａｍＨＩ＃９断片である。ＥｃｏＲＩ断片は、ユニークなＸｈｏＩ部位が ｐＳＰ６４ベクター中でユニークなＨｉｎｄIII部位に 最も近くなるようにクローン化されたことに注意すべきである。 相同ベクター２５５−１８．Ｂ１６ ＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子をＨＶＴに挿入するために２５５−１８．Ｂ１６を 作製した。ＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子は、ＸｈｏＩ制限部位で相同ベクター１７２ 標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以 下の供給源からの制限断片を、図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃに記載の合成ＤＮ Ａ配列と結合することにより作製することができる。断片１は、ＰＲＶ Ｂ ａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ferrariら 、1985）の約３００９塩基対のＢａｍＨＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片３ は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡの約１２００塩基対のＡｖａII〜ＥｃｏＲＩ制限 断片である。断片４は、プラスミドｐＳＰ６４（Promega）の約１７９塩基対の ＥｃｏＲＩ〜Ｐｖｕ II制限断片である。断片５は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限 断片Ｎの約３５７塩基対のＳｍａＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片６ 〜ＳｃａＩ制限断片である。 サブゲノムクローン３７８−５０．ＢＡ１ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド３７８−５０．ＢＡ１を作製した。 これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約２９，５００塩基対領域を含有する。これは、 組換えヘルペスウイルス作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えへル ペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンととも に使用することができる。このコスミドは、以下の供給源からの２つの制限断片 を結合することにより作製することができる。第１の断片はｐＷＥ１５（Strata gene）の約８１６４塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断 片は、ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約２９，５００塩基対のＢａ ｍＨＩ＃１断片である。 サブゲノムクローン４０７−３２．１Ｃ１ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．１Ｃ１を作製した。 これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約３８，８５０塩基対領域を含有する（図８参照 ）。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、断片１３の約 １２５０塩基対、および断片１の約６，７００塩基対を含有する。これは、組換 えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを 作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用すること ができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。 これは、プローブＰ１とＰ４（図８に記載）によりスクリーニングして、剪断し たＤＮＡライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手 続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年３月３日に アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークロー ン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物 保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２８で寄託されている。 サブゲノムクローン４０７−３２．２Ｃ３ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．２Ｃ３を作製した。 これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約４０，１７０塩基対領域を含有する（図８参照） 。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０、１４、１９、１７、５、および断片２の約 ２，１００塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴ作成のための「重複するサ ブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他 のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複 するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従っ て、前記したように作製することができる。これは、プローブＰ１とＰ２（図８ に記載）によりスクリーニングして、剪断したＤＮＡライブラリーから単離した 。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関する ブダペスト条約に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィ ル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番 号７５４３０で寄託されている。 サブゲノムクローン４０７−３２．５Ｇ６ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４０７−３２．５Ｇ６を作製した。 これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約４０，０００塩基対領域を含有する（図８参照 ）。この領域は、ＢａｍＨＩ断片９、３、２０、１２、１６、１３、断片２の約 １，６５０塩基対、および断片１１の約４，０００塩基対を含有する。これは、 組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用する ことができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペス ウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができ る。これは、プローブＰ２とＰ３（図８に記載）によりスクリーニングして、剪 断したＤＮＡライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特 許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年３月３ 日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パーク ローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培 養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２７で寄託されている。 相同ベクター４３５−４７．１ 外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド４３５−４７．１を作製 した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＨｉｎｄIII制限酵素部位 を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（コ ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペ スウイルスを作成するための方法」に従って、ＨｉｎｄIII部位に外来性ＤＮＡ 挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが 得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982および Sambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合すること により作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９９ ９塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片である。第 ２の断片は、ＨＶＴの約７３００塩基対のＥｃｏＲＩ＃７断片である。ｐＳＰ６ ４ベクターのＨｉｎｄIII部位は、サブクローンをＨｉｎｄIIIで消化し、次にク レノウ充填反応と再連結により除去したことに注意すべきである。次に、合成Ｈ ｉｎｄIIIリンカー（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）を、ＥｃｏＲＩ＃７断片のユニークな ＳｔｕＩ部位に挿入した。 サブゲノムクローン４３７−２６．２４ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド４３７−２６．２４を作製した。 これはゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１３，６００塩基対領域を含有する。これは、 組換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用する ことができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982お よびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合する ことにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２ ９７０塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶ ＴのＢａｍＨＩ＃２断片の約１３，６００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断 片である（Buckmasterら、1988）。ＢａｍＨＩ＃２断片は５つのＳｔｕＩ部位を 含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重複するサブゲノム断片 から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記載のようにＨｉｎｄII I部位に変換したことに注意すべきである。 サブゲノムクローン４３７−２６．２６ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド４３７−２６．２６を作製した。 これはゲノムＨＶＴＤＮＡの約１５，３００塩基対領域を含有する。これは、組 換えＨＶＴ作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルス を作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用するこ とができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およ びSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合するこ とにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４（Promega）の約２９ ７０塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、ＨＶＴ のＢａｍＨＩ＃２断片の約１５，３００塩基対のＢａｍ ＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である（Buckmasterら、1988）。ＢａｍＨＩ＃２断片は ５つのＳｔｕＩ部位を含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重 複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記 載のようにＨｉｎｄIII部位に変換したことに注意すべきである。 相同ベクター４５６−１８．１８および４５６−１７．２２ ＨＶＴにＭＤＶｇＡおよびｇＢ遺伝子を挿入するためにプラスミド４５６− １８．１８および４５６−１７．２２を作製した。ＭＤＶ遺伝子は、ユニークな ＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にカセットとして挿 ＥｃｏＲＩ断片として挿入した（図１０Ａと１０Ｂを参照）。ＨｉｎｄIIIと ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応により平滑化した。ＭＤＶカセットは両方の配向で 挿入されたことに注意すべきである。プラスミド４５６−１８．１８は、親相同 ベクター中のＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入されたＭＤＶ遺伝子を含有す る。プラスミド４５６−１７．２２は、親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ 転写配向で挿入されたＭＤＶ遺伝子を含有する。ＭＤＶカセットの詳細な説明は 、図１０Ａと１０Ｂに記載される。これは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら 、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を図１０ Ａと１０Ｂに記載の合成ＤＮＡ配列と結合することにより作製することができる 。断片１は、ＭＤＶ ＥｃｏＲＩの６．９KBゲノム制限断片の約２１７８塩基対 のＰｖｕII〜ＥｃｏＲＶ制限サブ断片である（Iharaら、 片である（Rossら、1989）。 相同ベクター５２８−０３．３７ ＨＶＴに伝染性咽頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＤ遺伝子を挿入するために プラスミド５２８−０３．３７を作製した。ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナ ルが後に続くｇＤ遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５ −４７．１にカセットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法 （Maniatisら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源 からの制限断片を結合することにより作製することができる。第１の断片は、Ｉ ＬＴ ＫｐｎＩゲノム制限断片＃８の約２０６０塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ 制限サブ断片である（１０．６KB）。第２の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制 （Lomnicziら、1984）。これらの断片はＢｃｌＩとＮｄｅＩが隣接するように配 置されていることに注意すべきである。 相同ベクター５２８−１１．４３ ＨＶＴに伝染性咽頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＢ遺伝子（A.M．Grifin、1 991）を挿入するためにプラスミド５２８−１１．４３を作製した。ｇＢ遺伝子 は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４３５−４７．１にＥｃｏＲＩ 断片として挿入した。ｇＢ遺伝子は、平滑末端ＨｉｎｄIII部位で平滑末端Ｅｃ ｏＲＩ断片として挿入した。ＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ部位は、クレノウ充填反 応により平滑化した。ｇＢ遺伝子は、親相同ベクター中にＵＳ２遺伝子と同じ転 写配向で挿入された。ＥｃｏＲＩ断片は、３．０KBのＩＬＴウイルスゲノム断片 として得られる。 相同ベクター５２８−４６．Ｂ３ 外来性ＤＮＡをＨＶＴに挿入するためにプラスミド５２８−４６．Ｂ３を作 製した。これは、外来性ＤＮＡが挿入されるユニークなＨｉｎｄIII制限酵素部 位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ共形質移入（ コ・トランスフェクション）」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘル ペスウイルスを作成するための方法」に従って、ＨｉｎｄIII部位に外来性ＤＮ Ａ挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性ＤＮＡを含有するウイルス が得られる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およ びSambrookら、1989）により、以下の供給源からの３つの制限断片を結合するこ とにより作製することができる。第１の断片はｐＳＰ６４ 断片である。第３の断片は、プラスミド４３７−４７．１の約３４００塩基対の ＸｈｏＩ〜ＸｈｏＩ断片である。 相同ベクター５３５−７０．３ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を挿入するために プラスミド５３５−７０．３を作製した。Ｆ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝 子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベク ター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初 期プロモーターの制御下にあり、後ろにＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナ ルが続く。Ｆ遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入し た。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrook ら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することに 断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約 Ｖ−１ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩基対のＳｍａＩ 〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 相同ベクター５４９−２４．１５ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を挿入する ためにプラスミド５４９−２４．１５を作製した。ＨＮとＦ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ遺伝子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII 部位で相同ベクター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。ＨＮとＦ遺 伝子は、それぞれＰＲＶ ｇｐＸおよびＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下に ある。ＨＮとＦ遺伝子は、後ろにそれぞれＰＲＶ ｇＸポリおよびＨＳＶ−１ Ｔ Ｋアデニル化シグナルが続く。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniat isら、1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結 合することにより作製することができる。第１の断片は、ＰＲＶ ａｍＨＩ制限サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクロー ン（Ｂ１株）の約１８１１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。第３の 断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基 ｖａII制限サブ断片である。第５の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７８４塩 基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 相同ベクター５４９−６２．１０ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮを挿入するためにプラ スミド５４９−６２．１０を作製した。ＨＮ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ遺伝 子（Junction Ｂ、図１０Ａを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベク ター４５６−１７．２２にカセットとして挿入した。ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇ ｐＸプロモーターの制御下にあり、後ろにＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナル が続く。ＨＮ遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入し た。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrook ら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製する ことができる。第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０ である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）の約１８ １１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。最後の断片は、ＰＲＶ Ｂａ ｍＨＩ断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅＩ〜Ｓａｌ サブゲノムクローン５５０−６０．６ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド５５０−６０．６を作製した。こ れは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１２，３００塩基対領域を含有する。これは、 組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウ イルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用 することができる。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、19 82およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの２つの制限断片を結合 することにより作製することができる。第１の断片は、ｐＢＲ３２２ の約４１７６塩基対のＥｃｏＲＶ〜ＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片は、 ＨＶＴ（Buckmasterら、1988）の約１２，３００塩基対のＢａｍＨＩ＃２断片で ある。この断片は、以下の方法で作成した。プラスミド４３７−２６．２６をＨ ｉｎｄIIIで線状化し、次にExoIII Mung Bean Deletion Kit（Stratagene）で切 除した。３および４分反応の試料を一緒にし、ＢａｍＨＩで消化して目的の１２ ，３００塩基対サブ断片を含有する断片の集団を得た。この集団をｐＢＲ３２２ 断片にクローン化し、得られるクローンを適当なサイズと制限地図についてスク リーニングした。偶然にもクローン５５０−６０．６を作成した切除されたサブ 断片は、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ部位（ＡＴＣＣ）に連結する時第２のＢａｍ ＨＩを生成するヌクレオチドＧＧで終わった。このプラスミドを含有する細菌株 は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年 ３月３日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の 特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号７５４２９で寄託されている。 相同ベクター５６６−４１．５ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢおよびｇＤ遺伝子を挿入するためにプラスミド ５６６−４１．５を作製した。ＭＤＶ ｇＤ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡとｇＢ（図１ ０Ａと１０Ｂを参照）の間に位置するＨｉｎｄIII部位で相同ベクター４５６− １７．２２にＨｉｎｄIII断片として挿入した。ＭＤＶ遺伝子は親相同ベクター 中のｇＡおよびｇＢと同じ転写配向で挿入した。ＭＤＶ ｇＤ遺伝子を含有する ＨｉｎｄIII断片の詳細な説明は、図１１Ａおよび１１Ｂに記載される。ヘルペ スウイルスポリアデニル化シグナルは、ｇＤ遺伝子カセットに加えた。この挿入 ＨｉｎｄIII断片は、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およびSambrook ら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を図１１Ａと１１Ｂに記載の合 成ＤＮＡ配列に結合することにより作製することができる。第１の断片は、ＨＳ Ｖ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、１９８８）の約７ ニル化配列（ＡＡＴＡＡＡ）が結合部Ｂに最も近く位置するように配向している ことに注意すべきである。断片２は、ＭＤＶ ＢｇｌII４．２KBのゲノム制 ある。 相同ベクター５６７−７２．ＩＤ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子および伝染性気管支炎ウイル ス（ＩＢＶ）マトリックスおよびスパイク遺伝子を挿入するためにプラスミド５ ６７−７２．ＩＤを作製した。ＩＢＶ遺伝子は、ＭＤＶ ｇＤ遺伝子(JunctionＣ 、図１１Ｂを参照)の上流に位置するユニークなＮｏｔＩ部位で相同ベクター５ ６６−４１．５にカセットとして挿入した。ＩＢＶスパイクおよびマトリックス 遺伝子は、それぞれＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＰＲＶ ｇｐＸプロモー ターの制御下にある。ＩＢＶスパイクおよびマトリックス遺伝子の後ろに、それ ぞれＨＳＶ−１ ＴＫおよびＰＶＲ ｇＸポリアデニル化シグナルが続く。ＩＢＶ 遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセ ットは、標準的組換えＤＮＡ法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)によ り、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。 第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０（Omnicziら、 断片は、ＩＢＶマトリックス遺伝子のアミノ酸１〜２２３を含有する。コード領 域は、ＩＢＶのArkansas株のｃＤＮＡクローンから得られた。第３の断片は、Ｐ ＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Omnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄ サブ断片である。第５の断片は、ＩＢＶスパイク遺伝子のアミノ酸４〜１１６２ を含有する。コード領域は、ＩＢＶのArkansas株のｃＤＮＡクローンから得られ た。最後の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約 ７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 相同ベクター６０３−５７．Ｆ１ ＨＶＴにＩＢＤＶＶＰ２遺伝子を挿入するためにプラスミド６０３−５７． Ｆ１を作製した。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ユニークなＨｉｎｄIII部位で相同 ベクター４３５−４７．１にカセットとして挿入した。ＶＰ２遺伝子は、 ＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にあり、後ろにＨＳＶ−１ ＴＫポリアデ ニル化シグナルが続く。ＶＰ２遺伝子は親相同ベクター中のＵＳ２と同じ転写配 向で挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、1982およ びSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合することによ り作製することができる。第１の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断 ブ断片である。第２の断片は、全長ＩＢＤＶ ｃＤＮＡクローン（配列認識番号 １を参照）の約１０８１塩基対のＢｃｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。Ｂ ｃｌＩ部位は、配列ＣＧＣＡＧＣをＴＧＡＴＣＡに変換することにより、ＶＰ２ 開始メチオニンのすぐ上流でｃＤＮＡクローンに導入されることに注意すべきで ある。第１と第２の断片は、ＡｖａII部位とＢｃｌＩ部位が隣接するように配置 される。第３の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985） の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 相同ベクター６３３−１３．２７ ＨＶＴにＭＤＶ ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮとｆ遺伝子 を挿入するためにプラスミド６３３−１３．２７を作製した。ＨＮ遺伝子とＦ遺 伝子は、それぞれＰＲＶ ｇｐＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターの制御下にある 。ＨＮ遺伝子とＦ遺伝子の後ろに、それぞれＰＲＶ ｇＸポリおよびＨＳＶ−１ ＴＫアデニル化シグナルが続く。５つのすべての遺伝子は親相同ベクター中のＵ Ｓ２遺伝子と同じ転写配向で挿入した。遺伝子は、ＭＤＶ ｇＡ、ＮＤＶＨＮ、 ＮＤＶ Ｆ、ＭＤＶ ｇＤおよびＭＤＶ ｇＢの順序で挿入した。 相同ベクター６３４−２９．１６ ＨＶＴにＩＬＴウイルスｇＢとｇＤ遺伝子を挿入するためにプラスミド６３ ４−２９．１６を作製した。ＩＬＴ ｇＢとｇＤ遺伝子が後に続くｌａｃＺマー カー遺伝子は、ユニークなＸｈｏＩ部位で相同ベクター１７２−２９．３１にカ セットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えＤＮＡ法（Maniatisら、 1982およびSambrookら、1989）により、以下の供給源からの制限断片を結合する ことにより作製することができる。第１の断片は、前記のおよび図７Ａと７Ｂに 記載のｌａｃＺマーカー遺伝子から得られる約４２２９塩基対のＳａ ＃８（1０．６KB）の約２０６０塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ制限サブ断片で ある。第３の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984） 片は、ＢｃｌＩとＮｄｅＩ部位が隣接するように配置されることに注意すべきで ある。第４の断片は、ｇＢ遺伝子を含有する３．０KBのＩＬＴウイルスゲノムＥ ｃｏＲＩ断片である。３つのすべての遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向 である。 サブゲノムクローン４１５−０９．ＢＡ１ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド４１５−０９．ＢＡ１を作製した。 これは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約２９，５００塩基対のＢａｍＨＩ＃１断片を 含有する。これは、組換えＨＶＴを作成するための「重複するサブゲノム断片か ら組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムク ローンとともに使用した。このコスミドは、以下の供給源からの２つの制限断片 （Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、ｐＨＣ ７９（Bethesda Research Laboratories，Inc.）とｐＷＥ１５（Stratagene）か ら得られるｐＳＹ１００５の約４４３０塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限断 片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノム（Buckmasterら、1988）の約２９，５０ ０塩基対のＢａｍＨＩ＃１断片である。 サブゲノムクローン６７２−０１．Ａ４０ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド６７２−０１．Ａ４０を作製した。 これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のサブクローンと して単離した。コスミド６７２−０１．Ａ４０は、コスミド４０７−３２．１Ｃ １の約１４，０００塩基対のＮｏｔＩ〜ＡｓｃＩサブ断片と約１３００塩基対の ＡｓｃＩ〜ＢａｍＨＩサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供給源から の制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。このベクター は、ＳｍａＩ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（Ne w England Biolabs，Inc.）から作製した約２７００塩基対のＮｏｔＩ〜Ｂａｍ ＨＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１５，３０ ０塩基対領域である。この領域はＢａｍＨＩ断片１１と７、および断片１３の約 １２５０塩基対を含有する。これは、組換えＨＶＴを作成するための「重複する サブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、 他のサブゲノムクローンとともに使用した。 サブゲノムクローン６５４−４５．１ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド６５４−４５．１を作製した。こ れは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のＡｓｃＩサブクロ ーンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambrook ら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウＤＮＡポ リメラーゼで平滑末端にしＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（New En gland Biolabs，Inc.）の２０００塩基対のＡａｔII〜ＰｖｕII断片から作製し た約２０００塩基対のＡｓｃＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの 約８，６００塩基対のＡｓｃＩ〜ＡｓｃＩ断片である。この領域はＢａｍＨＩ断 片１０と２１、および断片６の約１１００塩基対、および断片７の約１３００塩 基対を含有する。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９−１３４４；配列認識 番号４８）は、合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＰａｃＩ部位に変換され た。ＰａｃＩ部位は、ＨＶＴ中のの外来性ＤＮＡの挿入と発現に使用した。（図 １３Ａを参照）。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複するサブゲノム 断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲ ノムクローンとともに使用した。 サブゲノムクローン６８６−６３．Ａ１ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド６８６−６３．Ａ１を作製した。 これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８、１５を参照）のＡｓｃＩサブク ローンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片（Sambro okら、1989）を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウＤＮＡ ポリメラーゼで平滑末端にしＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（New England Biolabs，Inc.）の２０００塩基対のＡａｔII〜ＰｖｕII断片から作製 した約２０００塩基対のＡｓｃＩ断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡ の約８，６００塩基対のＡｓｃＩ〜ＡｓｃＩ断片である。この領 域はＢａｍＨＩ断片１０と２１、および断片６の約１１００塩基対、および断片 ７の約１３００塩基対を含有する。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９−１ ３４４；配列認識番号４８）は、合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＮｏｔ Ｉ部位に変換された。ＮｏｔＩ部位は、ＨＶＴ中の外来性ＤＮＡの挿入と発現に 使用した。（図１３Ｂを参照）。これは、組換えＨＶＴを作製するための「重複 するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従っ て、他のサブゲノムクローンとともに使用した。 サブゲノムクローン６７２−０７．Ｃ４０ 組換えＨＶＴを作成するためにコスミド６７２−０７．Ｃ４０を作製した。 これは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１（図８と１５を参照）のサブクローンと して単離した。コスミド６７２−０７．Ｃ４０は、は、コスミド４０７−３２． １Ｃ１の約１１００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＡｓｃＩサブ断片および約１３，００ ０塩基対のＡｓｃＩ〜ＮｏｔＩサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供 給源からの制限断片（Sambrookら、1989）を結合することにより作製した。この ベクターは、ＳｍａＩ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカー含有するｐＮＥＢ１９ ３（New England Biolabs，Inc.）の約２７００塩基対のＮｏｔＩ〜ＢａｍＨＩ 断片である。断片１は、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡの約１４，０００塩基対領域であ る。この領域は、ＢａｍＨＩ断片６と１８、およびＢａｍＨＩ断片＃１内の約２ ６００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＮｏｔＩを含有する。これは、組換えＨＶＴを作製 するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するた めの方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。 サブゲノムクローン７０６−５７．Ａ３ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７０６−５７．Ａ３を作製した。 プラスミド７０６−５７．Ａ３は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位 に挿入されたＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、Ｉ ＢＲＶ ＶＰ８プロモーターとＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニル化シグナルを使用す る。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）により作製し た。第１の断片は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーター（Carpenterら、1991） をコードする２０８塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片 は、ＩＢＲＶ標準的感染（challenge）株（ＵＳＤＡ）ゲノムＲＮＡ（Kibengeら 、1990）の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（Sambrookら、1989）により得ら れるＩＢＲＶ ＶＰ２遺伝子をコードする約１６２６塩基対断片である。逆転写 とＰＣＲに使用したアンチセンスプライマーは、５’−ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣ ＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列認識 番号５３）である。ＰＣＲに使用したセンスプライマーは、５’−ＣＴＧＧＴＴ ＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣ−３’ （配列認識番号５４）である。ＰＣＲにより作成したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ−Ｄ ｉｒｅｃｔ（登録商標）ベクター（Clontech Laboratories，Inc.、パロアルト （Palo Alto）、カリホルニア州）内にクローン化した。次にＩＢＲＶ ＶＰ２断 片を、ＰＣＲプライマーにより作成したＢｃｌＩ部位を用いて、ＶＰ８プロモー ターにサブクローニングした。この結合部のＤＮＡ配列は、ＶＰ２活性開始メチ オニンの前にアミノ酸メチオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が添加さ れている。このＤＮＡ断片は、ＶＰ２タンパク質の全コード配列を含有するＩＢ ＤＶポリタンパク質（配列認識番号２）のアミノ酸１〜アミノ酸５３６のコード 配列を含有する。第３の断片は、ＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニル化シグナルをコ ードする約４９４塩基対断片である。 サブゲノムクローン７１１−９２．１Ａ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７１１−９２．１Ａを作製した。 プラスミド７１１−９２．１Ａは、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位 に挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＩ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ ｇＤおよび ｇＩ遺伝子は、それぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターと１つの共通の内因性ポ リアデニル化シグナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（ Sambrookら、1989）により作製した。第１の断片は、ＩＬＴＶ Ａｓｐ ｎｄIII制限断片である。 サブゲノムクローン７１７−３８．１２ 組換えＨＶＴを作成するためにプラスミド７１７−３８．１２を作製した。 プラスミド７１７−３８．１２は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位 に挿入されたＮＤＶ ＨＮ遺伝子とＦ遺伝子を含有する。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、 ＰＲＶ ｇＸプロモーターとＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルを使用する。Ｎ ＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターとＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シ グナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、19 89）を用いて作製した。第１の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ断 サブ断片である。第２の断片は、全長ＮＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株） の約１８１１塩基対のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限断片である。第３の断片は、ＰＲ Ｖ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の約７５４塩基対のＮｄｅ サブ断片である。第５の断片は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株： る。第６の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約 ７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 サブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊ ＨＶＴのユニークなショートにＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を挿 入するため、および組換えＨＶＴを作成するために、コスミド７２１−３８．１ Ｊを作製した。コスミド７２１−３８．１Ｊは、ＨＶＴのユニークな短い領域の ＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄIIIに変換したＨＶＴ ＵＳ２遺伝子 内のＳｔｕＩ部位に挿入したＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子を含有する。 ＭＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域は、Ｓ−ＨＶＴ −０６２から得られた。コスミド７２１−３８．１Ｊは、Ｓ−ＨＶＴ−０６２ ＤＮＡのＢａｍＨＩによる部分制限消化および約３９，３００塩基対断片の単離 により作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989） を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベ クターは、コスミドベクターｐＷＥ１５からの約８２００塩基対のＢａｍＨＩ断 片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノムの繰り返し領域からの約９００塩基対の ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ ＃１の約１５，５００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である。第３の断 片は、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子（図１０と１１を参照）を含有する 約８４００塩基対カセットである。第４の断片は、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１の約 １４，５００塩基対のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩサブ断片である。 サブゲノムクローン７２２−６０．Ｅ２ ＨＶＴのユニークな短い領域にＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、ｇＢ遺伝子ならびにＮ ＤＶ ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を挿入するため、ならびに組換えＨＶＴを作成 するために、コスミド７２２−６０．Ｅ２を作製した。コスミド７２２−６０． Ｅ２は、ＨＶＴのユニークな短い領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉ ｎｄIIIに変換したＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位に挿入したＭＤＶ ｇ Ａ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を含有する 。すべての５つの遺伝子を、ＨＶＴＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で導入した。Ｍ ＤＶとＮＤＶ遺伝子を含有するＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域は、Ｓ− ＨＶＴ−１０６から得られた。コスミド７２２−６０．Ｅ２は、Ｓ−ＨＶＴ−１ ０６のＢａｍＨＩによる部分制限消化および約４６，３００塩基対断片の単離に より作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、1989）を 用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベク ターは、ｐＨＣ７９（Bethesda Research Laboratories，Inc.）およびｐＷＥ１ ５（Stratagene，Inc.）から得られたコスミドベクターｐＳＹ１６２６からの約 ６１００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第１の断片は、ＨＶＴゲノムの繰り返 し領域からの約９００塩基対のＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は、ＨＶＴの ＢａｍＨＩ＃１の約１５，５００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブ断片である 。第３の断片は、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子（図１０Ａ１０ｂ、配列認識番号８を参照 ）、ＰＲＶ ｇＸプロモーター（Lomnicziら、1984）、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子(配列 認識番号１０)、ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化部位(Lomnicziら、1984)、ＨＣＭＶ 極初期プロモーター(D.R．Thomsenら、1981)、ＮＤＶ Ｆ遺伝子（配列認識番号 １２）、ＨＣＶ ＴＫポリアデニル化部位（McGeochら、1985）、ＭＤＶ ｇＤ遺 伝子（図１１Ａおよび１１Ｂ）、約４５０塩基対のＩＬＴＶ ＵＳ３ポリアデニ ル化部位、およびＭＤＶ ｇＢ遺伝子（図１０Ａと１０Ｂ）を含有する約１５， ４００塩基対カセットである。第４の断片は、ＨＶＴ のＢａｍＨＩ＃１の約１４，５００塩基対のＳｔｕＩ〜ＢａｍＨＩサブ断片であ る。 サブゲノムクローン７２９−３７．１ 組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７２９−３７．１を作製した。 プラスミド７２９−３７．１は、プラスミド６８６−６３．ＡのＮｏｔＩ部位に 挿入されたＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＡ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇ Ｂ遺伝子は、それぞれの内因性ＩＬＴＶプロモーターを使用し、ＩＬＴＶ ｇＤ およびｇＢ遺伝子は、それぞれＰＲＶ ｇＸポリアデニル化シグナルが後に続く 。ＩＬＴＶ ｇＤおよびｇＢ遺伝子は、標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら、198 9）を用いて作製した。第１の断片は、ＩＬＴＶ Ａｓｐ７１８１ゲノム断片 ある。第２の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、1984）の は、ＩＬＴＶゲノムＤＮＡの約３０５９塩基対のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断 片である。第４の断片は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Lomnicziら、 サブゲノムクローン７３９−２７．１６ ユニークな長い領域のＨＶＴ遺伝子とユニークな短い領域のＭＤＶ １型遺 伝子を含有する非キメラＨＶＴ／ＭＤＶウイルスを作製するために、コスミド７ ３９−２７．１６を作製した。コスミド７３９−２７．１６は、ＭＤＶ １型の 完全なユニークな短い領域を含有する。この領域は、全ＳｍａＩ Ｂ断片と２つ のＳｍａＩ Ｋ断片を含有する。コスミド７３９−２７．１６は、ＭＤＶ ＤＮＡ のＳｍａＩによる部分的制限消化と約２９，０００〜３３，０００塩基対断片の 単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えＤＮＡ法(Sambrookら、198 9)を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。この ベクターは、コスミドベクターｐＷＥ１５からの約８２００塩基対のＢａｍＨＩ 断片（クレノウＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端にされた）である。第１の断 片は、ＭＤＶゲノムの短い内部繰り返し領域からの約４０５０塩基対のＳｍａＩ Ｋ断片である。第２の断片は、ＭＤＶの約２１，０００塩基 対断片ＳｍａＩである。第３の断片は、ＭＤＶゲノム（Fukuchiら、1984、1985 ）の短い末端繰り返し領域からの約３，６５０塩基対のＳｍａＩ Ｋ断片である 。 サブゲノムクローン７５１−８７．Ａ８ 組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７５１−８７．Ａ８を作製した 。プラスミド７５１−８７．Ａ８は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部 位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有する。ｃ ＭＧＦ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＨＩＶ−１ ＴＫポリアデ ニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えＤＮＡ法（Sambrookら 、1989）を用いて作製した。以下の断片を、ＨＶＴサブゲノムクローン６５４− ４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。第１の断片は、ＨＣＭＶ したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）（Sambrookら、1989）により得られたｃＭＧＦ遺伝子（５８）をコー ドする、約６４０塩基対の断片である。逆転写とＰＣＲに使用したアンチセンス プライマーは、５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧ ＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’（配列認識番号５７）である。ＰＣＲに使用したセンス プライマーは、５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡ ＧＡＧＣＴＧ−３’（配列認識番号５８）である。ｃＭＧＦ断片は、ＰＣＲプラ イマーにより作成したＢａｍＨＩ部位を用いて、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの 隣でサブクローニングした。このＤＮＡ断片は、成熟ｃＭＧＦタンパク質のアミ ノ末端の２３個のアミノ酸のリーダー配列と１７８アミノ酸を含有するｃＭＧＦ タンパク質（５８）の、アミノ酸１からアミノ酸２０１のコード配列を含有する 。第３の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985）の約７ ８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 サブゲノムクローン７６１−０７．Ａ１ 組換えＨＶＴを作成するために、プラスミド７６１−０７．Ａ１を作製した 。プラスミド７６１−０７．Ａ１は、プラスミド６５４−４５．１のＰａｃ Ｉ部位に挿入されたニワトリインターフェロン遺伝子を含有する。ニワトリイン ターフェロン遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターおよびＨＩＶ−１ ＴＫポ リアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えＤＮＡ法（Samb rookら、1989）を用いて作製した。以下の断片を、ＨＶＴサブゲノムクローン６ ５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入した。第１の断片は、ＨＣＭＶ したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）（Sambrookら、1989）により得られたニワトリインターフェロン遺伝 子（５８）をコードする、約５７７塩基対の断片である。逆転写とＰＣＲに使用 したアンチセンスプライマーは、５’−ＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＡＧ ＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧ−３’（配列認識番号５９）である。ＰＣＲに 使用したセンスプライマーは、５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧ ＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列認識番号６０）である。ニワトリイ ンターフェロン遺伝子断片は、ＰＣＲプライマーにより作成したＢｇｌII部位を 用いて、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの隣でサブクローニングした。このＤＮＡ 断片は、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質のアミノ末端の ３１個のアミノ酸のシグナル配列と１６２アミノ酸を含有するニワトリインター フェロンタンパク質（５９）の、アミノ酸１からアミノ酸１９３のコード配列を 含有する。第３の断片は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（McGeochら、1985 ）の約７８４塩基対のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブ断片である。 実施例１ Ｓ−ＨＶＴ−００１ Ｓ−ＨＶＴ−００１は、ＨＶＴゲノムのユニークな長い領域内に挿入された 大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するシチメンチョウのヘ ルペスウイルス（ＨＶＴ）である。ＨＶＴの制限酵素地図は公表されている（T ．Igarashiら、1985）。この情報は、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するための出 発点として使用した。ＨＶＴのＢａｍＨＩ制限酵素地図は、図１Ａに示す。この データから、外来遺伝子が挿入されるＨＶＴＤＮＡのいくつかの異なる領 域がターゲティングされる。挿入のために選択された外来遺伝子は、ＰＲＶで使 用した大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子である。プ ロモーターはＰＲＶｇｐＸプロモーターである。ｌａｃＺ遺伝子をＨＶＴのユニ ークな長い領域内、特にＢａｍＨＩ＃１６（３３２９塩基対）断片のＸｈｏＩ部 位内に挿入し、基質Bluogal（登録商標）（Bethesda Research Laboratories） を用いると青いプラークを形成してＨＶＴ組換え体中で発現されることが証明さ れた。同様に、ｌａｃＺ遺伝子は、ＢａｍＨＩ＃１９（９０ これらの実験は、ヘルペスウイルスでの外来遺伝子の挿入と発現のための本 出願で記載した方法がＨＶＴに応用できることを示している。特に、外来性ＤＮ Ａの挿入のための２つの部位が同定されている（図１Ｂと１Ｃ）。 実施例２ Ｓ−ＨＶＴ−００３ Ｓ−ＨＶＴ−００３は、ＨＶＴゲノムのユニークな長い領域内に挿入された 大腸菌（E．coli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子と伝染性粘液嚢病 ウイルス（ＩＢＤＶ）Ｓ４０７４７のＲＮＡの大きい断片（ｃＤＮＡコピーとし て）（配列認識番号１）を含有するシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ ）である。このＩＢＤＶ ＤＮＡは、３つのタンパク質をコードする１つの読み とり枠（５’ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３ ３’）（配列認識番号２）を含有する（ このうち２つは、ニワトリのＩＢＤＶ感染を防御する抗原である）。β−ガラク トシダーゼとＩＢＤＶポリタンパク質は、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸ 遺伝子プロモーターに支配されている。Ｓ−ＨＶＴ−００３は相同的組換えによ り作成した。Ｓ−ＨＶＴ−００３は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関する ブダペスト条約に従って、1987年７月21日にアメリカンタイプカルチャーコレク ション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリ ーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２１７ ８で寄託されている。 ＩＢＤＶ遺伝子は、ｃＤＮＡ「クローン化法」によりクローン化した。ＩＢ ＤＶのゲノムであるクローンは、真のＩＢＤＶ ＲＮＡを含有するブロットに対 して、「ＤＮＡのサザンブロッティング法」によりスクリーニングした。次 に、陽性のクローンを群を同定するための制限マッピング法により性状解析した 。このようなクローンの２つを同定し、この２つが一緒になってＩＢＤＶの大き な断片のＲＮＡ（３．３kbのdsＲＮＡ）の全コード領域となることを見いだした 。１つのｃＤＮＡクローン（２〜８４）は、ＩＢＤＶ遺伝子の前半である約２５ ００塩基対の断片を含有した。第２のクローン（２〜４０）は、ＩＢＤＶ遺伝子 の後半である約２０００塩基対の断片を含有した。全ＩＢＤＶ遺伝子であるプラ スミド２−８４／２−４０は、重複配列中に存在するユニークなＰｖｕII部位で クローン２−８４と２−４０を結合させて作製した。ＩＢＤＶゲノムは、約３４ ００塩基対のＳｍａＩ〜ＨｐａＩ断片としてプラスミド２−８４／２−４０から 得ることができる。ＩＢＤＶ遺伝子によりコードされるタンパク質の性質は、ク ローン（２−８４／２−４０）を大腸菌（E．coli）中で発現し、精製したＩＢ ＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清を用いるウェスタンブロット上 で検出して確認した。ＩＢＤＶ抗原をコードするＲＮＡのＩＢＤＶの大きな断片 のｃＤＮＡは、以後ＩＢＤＶ遺伝子と呼ぶ１つの読みとり枠を示す。オーストラ リアンＩＢＤＶ株の配列は、出願人の配列に密接な相同性を有するとして公表さ れている（Hudsonら、1986）。２つのウイルスのアミノ酸の差を比較して、１０ １２アミノ酸コード領域内に２９のアミノ酸の変化があることが明らかになった 。ＶＰ４については３つのみのアミノ酸の差が、ＶＰ３については８つのみのア ミノ酸の差があった。これに対して、ＶＰ２は１８のアミノ酸の変化があり、そ のうち１４はアミノ酸１３９〜３３２の間にかたまっていた。 ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＩＢＤＶ遺伝子のコード領域をＰＲＶ ｇｐＸプロモーターとＨＳＶ ＴＫポリＡシグナル配列の間でクローン化して、 プラスミド１９１−２３を作成した。ＩＢＤＶ遺伝子を含有する相同的組換えで 作成したＨＶＴ組み換え体の同定を助けるため、プラスミド１０１−２３からの ｇｐＸでプロモートしたＩＢＤＶ断片を、ｇｐＸプロモーターにより制御される ｌａｃＺ遺伝子の後ろに（縦列で）挿入した。得られたプラスミド（１９１−４ ７）は、各ＰＲＶｇｐＸプロモーターの制御下で大腸菌（E．coli）ｌａｃＺ遺 伝子とＩＢＤＶ遺伝子を含有する。プラスミド１９１−４７の作製において、種 々のＤＮＡ断片を、天然に存在する制限部位または合成リンカーＤＮＡを用いて 組換えＤＮＡ法により結合させた。プラスミド１９１−４７中 に含有されるこれらの遺伝子の作製の詳細は、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄに 記載する。 ＤＮＡの第１のセグメント（セグメント１、図２Ａ）は、ｇｐＸ遺伝子の最 初の７つのアミノ酸をコードする残基を含むｇｐＸプロモーターを含有し、 １０のサブクローンから得られた。ＤＮＡの第２のセグメント（セグメント２、 図２Ａ）は、アミノ酸１０〜アミノ酸１０２４の大腸菌（E．coli）β−ガラク トシダーゼコード領域を含有し、後に約４０塩基対のＡｖａＩ〜ＳｍａＩ断片が 続く、約３３００塩基対のＢａｍＨＩ〜ＢａｌＩ断片として、プラスミドｐＪＦ ７５１（Jim Hoch，Scripps Clinic and Research Foundationから得た）から得 られた。ＤＮＡの第３のセグメント（セグメント３、図２Ａ）は、ｇｐＸポリＡ シグナル配列を含有し、約７００塩基対のＮｄｅＩ〜ＳｔｕＩ断片としてＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃７断片のサブクローンから得られた。「ポリメラーゼ充填反応」 に従って充填したＮｄｅＩをＳｍａＩ部位に連結して、セグメント３をセグメン ト２に結合させた。ＤＮＡの第４のセグメント（セグメント４、図２Ａ）はｇｐ Ｘプロモーター（ＴＡＴＡボックスとｃａｐ部位）を含有し、約３３０塩基対の ＮａｅＩ〜ＡｌｕＩ断片としてＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃１０断片のサブクローンか ら得られた。さらに、セグメント４は、合成ＤＮＡリンカ 非翻訳リーダー配列を含有する。ＤＮＡセグメント４〜６は、ｇｐＸポリＡシ トとして挿入した。ＤＮＡの第５セグメント（セグメント５、図２Ａ）は、ＩＢ ＤＶの大きな断片のＲＮＡの全コード領域（ｃＤＮＡクローン）を約３４００塩 基対のＳｍａＩ〜ＨｐａＩ断片として含有する。セグメント５のＳｍａＩ部位は 、「ポリメラーゼ充填反応」に従って充填したセグメント４のＢｇｌII部位に融 合した。ＩＢＤＶ遺伝子（５’ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３ ３’）は、ｇｐＸプロ モーター（セグメント４）の制御下にあるが、その自然の開始コドンと停止コド ンを利用する。ＤＮＡの第６のセグメント（セグメント６、図２Ａ）は、ＨＳＶ ＴＫポリＡシグナル配列を約８００塩基対のＳｍａＩ断片（シカゴ大学のBerna rd Roizmenから得た）として含有する。セグメント５のＨｐａＩ 部位は、合成ＤＮＡリンカーを使用してセグメント６のＳｍａＩ部に融合させた 。 要約すると、Ｓ−ＨＶＴ−００３（プラスミド１９１９−４７）を作製する ために使用する構築物は、（５’から３’へ）ＰＲＶプロモーター、ｇｐＸＴＡ ＴＡボックス、ｇｐＸキャップ部位、ｇｐＸの最初の７アミノ酸、大腸菌（E．c oli）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ＰＲＶポリＡシグナル配列、 ＰＲＶ ｇｐＸプロモーター、ｇｐＸＴＡＴＡボックス、ｇｐＸキャップ部位、 ｇｐＸ非翻訳５’リーダー内のＩＢＤＶ遺伝子への融合、ＩＢＤＶ開始コドン、 ＩＢＤＶ非翻訳３’末端内のＨＳＶ ＴＫ非翻訳３’末端への融合、およびＴＫ ポリＡシグナル配列を含有する。これらの遺伝子を含有するカセットは、２つの ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接されるように作成した。その結果 、ｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子の両方を含有する約９１００塩基対断片が、 ＥｃｏＲＩによる消化により得られる。以後、９１６１塩基対ＥｃｏＲＩ断片を 、ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットと呼ぶ。以下の方法を用いて、相同的組換えによ りＳ−ＨＶＴ−００３を作成した。ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットを、ＨＶＴ Ｂ ａｍＨＩ＃１６断片のサブクローン内に存在するユニークなＸｈｏＩ部位に挿入 した。これをおこなうために、まずＥｃｏＲＩリンカーを用いてＸｈｏＩ部位を ＥｃｏＲＩ部位に変換した。この部位は、あらかじめｌａｃＺ（Ｓ−ＨＶＴ−０ ０１）の挿入によりＨＶＴには必須ではないことが証明されている。また、Ｂａ ｍＨＩ＃１６断片中の隣接する相同性領域は、相同的組換えに効率的であること が証明されている。図３Ａと３Ｂには、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＢａｍ ＨＩ＃１６断片地図のゲノムの位置を示す。ＢａｍＨＩ＃１６断片の長さは、約 ３３２９塩基対である（配列認識番号３、４、５、６、および７）。ＨＶＴ Ｄ ＮＡは、「ヘルペスウイルスＤＮＡの調製」法に従って調製した。ＨＶＴ ＤＮ ＡとプラスミドＤＮＡの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞への共形質移入（ コ・トランスフェクション）は、「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤ ＮＡ形質移入」に従って行なった。共形質移入（コ・トランスフェクション）ス トックから生ずる組換えウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスク リーニング」法を用いて、３回連続してプラーク精製を行って精製した。１００ ％のプラークが青くなった時、「ＤＮＡのサザンブロッティング」法によりＩＢ ＤＶ遺伝子の存在についてＤＮＡを 解析した。ＥｃｏＲＩ消化したＳ−ＨＶＴ−００３ＤＮＡをＩＢＤＶに特異的な ニックトランスレーションしたプローブ（プラスミド２−８４／２−４０）とプ ローブ結合させるサザンブロットにより、９１００塩基対のＥｃｏＲＩ断片の存 在が確認された。この結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３がそのゲノム内にｌａｃＺ遺 伝子とＩＢＤＶ遺伝子を取り込んで含有していることを確認している。ＢａｍＨ Ｉ＃１６に特異的なプローブを用いるさらなるサザンブロットにより、ＢａｍＨ Ｉ＃１６中の適当な位置で配列が起きること、および欠失は発生しないことが確 認された。野生型ウイルス（Ｓ−ＨＶＴ−０００）に比較してＳ−ＨＶＴ−００ ３の増殖には、インビトロで差が観察されなかった。 Ｓ−ＨＶＴ−００３からのＩＢＤＶ特異的タンパク質の発現は、「ウェスタ ンブロッティング法」を用いてインビトロで測定した。細胞溶解物は、「ヘルペ スウイルス細胞溶解物の調製」に記載したように調製した。簡単に説明すると、 Ｓ−ＨＶＴ−００３の細胞溶解物中に含有されるタンパク質を、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、そして変性させた精 製ＩＢＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清、またはＩＢＤＶ４０kd （ＶＰ２）カプシドタンパク質の予測される免疫優性領域に対応する合成ペプチ ドに対して作成した抗血清のいずれかとプローブ結合させた。フィルターを洗浄 し、［¹²⁵Ｉ］プロテインＡで処理して、結合抗体の位置を検出した。図４は、 変性させた精製ＩＢＤＶカプシドタンパク質に対して作成した抗血清を用いて得 られた結果を示し、これは本出願人により主にＶＰ３（３２kdタンパク質）と反 応することが証明されている。図から明らかなように、Ｓ−ＨＶＴ−００３は、 完全なＩＢＤＶウイルス粒子の真正のＶＰ３タンパク質とは免疫学的に区別でき ないタンパク質を産生する。さらに、ポリタンパク質は正しく処理されて、真正 のＶＰ３タンパク質と同時に移動するＶＰ３種を産生するようである。オースト ラリアンＩＢＤＶ株を用いた最近の証拠は、成熟したＶＰ２およびＶＰ３タンパ ク質種への前駆体ポリタンパク質の処理にＶＰ４が関与していることを示唆して いる（Jagadishら、1988）。図５は、ＩＢＤＶ ＶＰ２（４０kd）カプシドタン パク質の１４アミノ酸領域と相同である合成ペプチドに対して作成したウサギ抗 血清を用いて得られた結果を示す。図から明らかなように、Ｓ−ＨＶＴ−００３ は、真正のウイルスＶＰ２タンパク質とは免疫学的に区別できないタンパク質を 産生する。さらに、Ｓ−ＨＶＴ−０ ０３から産生されるＶＰ２タンパク質は、完全なＩＢＤＶウイルス粒子から単離 されたＶＰ２の４０kd種と同時に移動する。この分子種は、感染性（完全）ウイ ルス粒子の主要な成分である。 要約すると、Ｓ−ＨＶＴ−００３からのＩＢＤＶ特異的タンパク質の発現の 解析は、ポリタンパク質はＣＥＦ細胞培養物中で処理され、ウェスタンブロット 上のＶＰ２またはＶＰ３タンパク質のいずれかに特異的な免疫学的試薬と反応す る適当なサイズのタンパク質を産生することを証明した。 以下のセットの実験は、血清転換（seroconversion）データ、血清中和結果 、およびＩＢＤＶ抗原刺激からの防御により測定した、Ｓ−ＨＶＴ−００３内に 含有されるＩＢＤＶ遺伝子のインビボの発現を解析するために、ニワトリ中で行 なった。 第１の実験は、Ｓ−ＨＶＴ−００３でワクチン化するとニワトリのＩＢＤＶ への血清転換が起きることを証明するように計画した。ＨＶＴとＩＢＤＶに対し て血清陰性の１１羽の１１週令のニワトリを、SPAFAS Inc.から得た。６羽のニ ワトリを、Ｓ−ＨＶＴ−００３（４０，０００PFU/ml）を含有するＣＥＦ細胞の 細胞懸濁液０．５mlを腹部に皮下投与してワクチン化した。この実験ですべての ニワトリから、７日毎に８週間血清試料を採取した。２８日目（第４週）に、こ れらのニワトリの３羽にＳ−ＨＶＴ−００３を追加免疫し、他の３羽には不活性 化ＩＢＤＶワクチン０．５mlを首の皮下に接種した。さらに３羽のニワトリには 、２８日目に不活性化ワクチンのみを投与した。２羽のニワトリは接触対照とし て、ワクチン接種をしなかった。５６日目にすべてのニワトリを屠殺し剖検を行 なった。表１は、ＩＢＤＶに対する血清中和測定法の結果を示す。Ｓ−ＨＶＴ− ００３のみを投与したニワトリには、ＳＮ活性は検出されなかった。さらに、不 活性化ワクチンのみを投与された３羽のニワトリのうちの１羽のみが、低いが検 出可能なＳＮ活性を示した。Ｓ−ＨＶＴ−００３を投与された後不活性化ＩＢＤ Ｖワクチンの追加免疫をされた３羽のニワトリのうちの１羽でも、ＳＮ力価が検 出された。これらの力価は、不活性化ＩＢＤＶワクチンのみの場合よりはるかに 高レベルであった。これらの結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３は、ＩＢＤＶに対する ２次的応答についてニワトリをプライミングすることを示唆している。「ウェス タンブロッティング」による血清試料のインビトロ解析は、２８日目に投与した 追加免疫の前でも後でも、Ｓ−ＨＶＴ −００３によるワクチン接種によりＩＢＤＶに対してニワトリが血清転換された ことを確認している。 第２の実験で、２５羽の１週令のＳＰＦヒヨコをＳ−ＨＶＴ−００３（２０ 羽は０．２mlを皮下に、５羽は両目に点眼）でワクチン接種した。２０羽のヒヨ コを対照とした。感染後４日目と７日目に、５羽のワクチン接種ヒヨコと２羽の 対照ヒヨコを出血させ、屠殺し、脾臓を取り出してウイルスを単離した。脾臓細 胞懸濁液を標準的方法で作成し、３mlのニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞増殖培 地中の約１×１０⁶細胞を、直接２次細胞に接種した。培養物を６〜７ 日間インキュベートし、次に細胞の形態を観察して測定して細胞変性作用（ＣＰ Ｅ）を採点した。培養物を再度継代し、ＣＰＥについて再度採点した。ワクチン 接種していないすべての対照ヒヨコは、４日目と７日目の脾臓細胞単離物につい てＨＶＴは陰性であった。Ｓ−ＨＶＴ−００３をワクチン接種した５羽のヒヨコ のうち４羽は、第１と第２の継代について４日目にＨＶＴは陽性であった。１羽 はウイルスを産生せず、これはワクチン化が成功しなかったせいかも知れない。 ５羽のヒヨコのうち５羽は継代１と２の両方でＨＶＴは陽性であった。全体的に 、ベクター回収実験はＳ−ＨＶＴ−００３がインビボで野生型ＨＶＴウイルスと 同様に複製し、ＢａｍＨＩ＃１６のＸｈｏＩ部位へのＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセッ トの挿入は、ウイルスの検出可能な弱毒化を引き起こさないことを示している。 「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて回収されたウ イルスを調べる以後の実験は、１００％のウイルスでβ−ガラクトシダーゼ発現 を証明することにより、Ｓ−ＨＶＴ−００３のインビボの安定性を確認した。 感染後０、４、７、１４、２１、および２７日目に、残りのニワトリから血 液試料を得て、ＩＢＤＶおよびＨＶＴ抗原に対する血清ＥＬＩＳＡ力価測定、お よびＩＢＤＶに対するウイルス中和試験を行なった。さらに、感染後２１日目に 、５羽の対照と１４羽のワクチン接種ヒヨコに両目の点眼により病原性ＩＢＤＶ で抗原刺激した（１０３−８ＥＩＤ５０）。すべてのヒヨコを抗原投与６日後に 屠殺し、体重に対する嚢の重量比を計算した。結果の要約をそれぞれ 表３と４に示す。表３に示すように、ワクチン接種後２１〜２７日目より前では 、ＥＬＩＳＡによりＨＶＴ抗原に対する抗体は検出されなかった。ヒヨコでは、 軒化後最初の２週間は免疫応答は未成熟で抑制されており、従ってこれらの結果 は全く予想外ではない。これに対して、ＩＢＤＶのＥＬＩＳＡではワクチン接種 後２１日目まで陰性であり、２７日目に抗原刺激後にわずかに検出されたのみで あった。ワクチン接種後２７日目に見られるＥＬＩＳＡレベルは、ＩＢＤＶに対 する一次応答を示している。抗原刺激した対照とワクチン接種／抗原刺激した群 についての嚢対体重比を比較する表４は、有意差を示していない。これらの条件 下でのＳ−ＨＶＴ−００３のワクチン接種は、抗原刺激後４羽のワクチン接種し たヒヨコが死亡したことから明らかなように、ＩＢＤＶ抗原刺激によるワクチン 接種ヒヨコの感染を防止しなかった。 ＥＬＩＳＡ力価はＧＭＴであり、０〜９の範囲である。 値は平均値である。抗原刺激したヒヨコはあまり餌を食べなかったため、体 重は対照群で異なる。４羽の抗原刺激−処理ヒヨコは死亡した。 第３の実験は、免疫応答性ヒヨコ（３週令）を用いて、実験２を繰り返した 。６羽の３週令のＳＰＦレッグホーンニワトリに、０．２mlのＳ−ＨＶＴ−００ ３を腹腔内投与して種々のワクチン接種した（各目に１滴）。血清試料を７日毎 に６週間得て、ワクチン接種後４３日目にニワトリを病原性ＵＳＤＡ標準的抗原 刺激ＩＢＤＶウイルスで刺激した。抗原刺激後６日目に、対照、ワクチン接種− 抗原刺激、および抗原刺激群を屠殺し、嚢を取り出して抗−ＩＢＤＶモノクロー ナル抗体（ＭＡＢ）（Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Med icineのDavid Snyder博士から提供された）でプローブ結合させた。嚢ホモジネ ートを１mlの０．５％ＮＰ４０と混合して調製した。次に嚢を摩砕し、短時間超 音波処理した。ホモジネートの上清を、プロテインＡ結合を介して９６ウェルＥ ＬＩＳＡプレートに結合したＲ６３ＭＡＢと反応させた。インキュベート後、Ｒ ６３ＭＡＢのビオチン標識調製物を加えた。洗浄後、アビジン−ホースラディッ シュペルオキシダーゼ結合体を加えてインキュベートした。試験体をトリス−マ ルケート（Tris-malcate）緩衝液（ＴＭＢ）＋Ｈ₂Ｏ₂基質で発色させた。試験結 果を表５に示す。データは、ワクチン接種−抗原刺激群と抗原刺激群のすべての 嚢で高レベルのＩＢＤＶ抗原が存在することを 示している。対照群にはＩＢＤＶ抗原は検出されなかった。ＩＢＤＶ特異的抗原 は、１／１０００を越える希釈率でも検出され、ワクチン接種と非ワクチン接種 抗原刺激群の間に差はないようである。ＥＬＩＳＡで測定したＨＶＴ力価は、ワ クチン接種した６羽のうち４羽で７日目に検出可能になった。１４日目までに、 ワクチン接種した６羽のうち６羽でＨＶＴ力価が証明された。６羽のニワトリは すべての、実験の間中ＨＶＴ力価を示し続けた。抗原刺激の前にはＩＢＤＶ Ｓ Ｎ力価は見られなかった。これに対して、これらの同じ血清試料のウェスタンブ ロットによる解析は、ウイルスの刺激の投与前にＳ−ＨＶＴ−００３によるＩＢ ＤＶへの血清転換を示した。しかし抗原刺激で追加免疫をしない場合は応答のレ ベルは小さい。ワクチン接種／抗原刺激群と刺激のみの群の比較では、ウェスタ ンブロットによる反応性のレベルは、ワクチン接種／抗原刺激群ではるかに高か った。これらの結果は、Ｓ−ＨＶＴ−００３はワクチン接種したニワトリをＩＢ ＤＶに血清転換しており、ＩＢＤＶ特異的発現のレベルは、ニワトリで中和応答 を誘発するのに充分なほど高くはないことを示唆する。 Ｓ−ＨＶＴ−００３は、本出願人が発明したワクチン接種アプローチの利点 を示す。ＨＶＴは、これらのタンパク質に対する免疫応答により宿主中で認識さ れる外来性抗原（β−ガラクトシダーゼとＩＢＤＶ抗原）を同時に発現するよう に作成された。 実施例３ Ｓ−ＨＶＴ−００４ Ｓ−ＨＶＴ−００４は、ユニークな長い領域内に挿入されたマレック病ウイ ルス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ａ（ｇＡ）遺伝子と、ユニークな長い領域内に挿入 されたβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組 換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等抗原より正 しい抗原応答を誘発し易い。 ＭＤＶ ｇＡ（配列認識番号８と９）遺伝子は、標準的ＤＮＡクローニング ｇＡ法によりクローン化された。ＥｃｏＲＩ制限断片は、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子（I sfortら、1984）を含有することは報告されており、この断片はＤＮＡクローン 中でサイズにより同定された。ｇＡ遺伝子を含有すると報告されたＤＮＡの領域 は本出願人により配列決定され、予想されるように糖タンパク質遺伝子を含有す ることが見いだされた。この遺伝子からのＤＮＡを用いて、「ＤＮＡのサザンブ ロッティング」法によりＨＶＴ中で対応する遺伝子を見いだし、非常によく似た 配列を含有するＨＶＴ中の遺伝子が同定された。この遺伝子は従来ｇＡと呼ばれ ていたものと同じ遺伝子である（Isfortら、1984）。 ＭＤＶ ｇＡ遺伝子はすでに良好なヘルペスウイルスシグナル配列を有する であろうから、ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＭＤＶ ｇＡ遺伝子をそのま ま用いた。ｌａｃＺ遺伝子をＢａｍＨＩ断片＃１６中のＸｈｏＩ部位断片内に挿 入し、ＭＤＶ ｇＡ遣伝子を、図６Ａと６ｂに示すようにｌａｃＺの後ろに挿入 した。ＢａｍＨＩ＃１６中の隣接領域を、相同的組換えのために使用した。ＨＶ Ｔ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡを、「組換えヘルペスウイルスを作成するための ＤＮＡ形質移入」法に従って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に共形質 移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックからのウイルスを、 「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて連続的プラー ク精製により精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった時 、ＤＮＡをＭＤＶ ｇＡ遺伝子の存在について解析した。Ｓ−ＨＶＴ−００４は 、β−ガラクトシダーゼ遺伝子とＭＤＶ ｇＡ遺伝子の両方をゲノム内に取り込 んだ組換えウイルスである。 図６Ｃは、Ｓ−ＨＶＴ−００４の構造を示す。 実施例４ ニューキャッスル病ウイルス ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、全体の構造がＰＩ−３に密接に 関連している。ＰＩ−３の血球凝集（ＨＮ）遺伝子と融合（Ｆ）遺伝子を、ＩＢ Ｒ（ｒｅｆ）中で発現するために作成した。同様に血球凝集（ＨＮ）遺伝子と融 合（Ｆ）遺伝子を、ヘルペスウイルスデリバリーシステム（シチメンチ ョウのヘルペスウイルス、ＨＶＴ）で使用するためにＮＤＶからクローン化した 。 発現のためのヘルペスウイルス制御配列の作製に使用した方法をＮＤＶに応 用した。 伝染性気管支炎ウイルス 伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、全体の構造がＴＧＥに密接に関連し たニワトリのウイルスである。ＴＧＥの主要な中和抗原を、ＰＲＶ（ｒｅｆ）中 で発現するために作成した。同様に主要な中和抗原を、ＩＢＶの３つの株（Mass achusetts（配列認識番号１４と１５）、Connecticut（配列認識番号１８と１９ ）、およびArkansas-99（配列認識番号１６と１７））から、ヘルペスウイルス デリバリーシステム（シチメンチョウのヘルペスウイルス、ＨＶＴ）で使用する ためにクローン化した。 発現のためのヘルペスウイルス制御配列の作製に使用した方法をＩＢＶに応 用した。 実施例５ Ｓ−ＨＶＴ−０４５ Ｓ−ＨＶＴ−０４５は、ユニークな短い領域内に挿入されたマレック病ウイ ルス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換 えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。このＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原 より正しい抗原応答を誘発し易い。Ｓ−ＨＶＴ−０４５は、特許手続き上の微生 物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年１０月１５日にアメリカ ンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パークローン・ドラ イブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許培養物保管局に 、ＡＴＣＣ受託番号２３８３で寄託されている。 ＭＤＶ ｇＢ遺伝子は、ｃＤＮＡクローン化法によりクローン化した。ＭＤ Ｖ ｇＢ遺伝子は、既知のヘルペスウイルスｇＢ遺伝子の間で保存されているこ とがわかっている領域中のＨＳＶ ｇＢ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプ （Rossら、1989）。 ｇＢ遺伝子はすでに良好なヘルペスウイルスシグナル配列を有するであろう から、ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、ＭＤＶ ｇＢ遺伝子をそのまま用いた 。ＭＤＶ ｇＢ遺伝子を、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片から得られたクローン化し た１７．１５kbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片内に挿入した。挿入に使用した部 位は、Ｓ−ＨＶＴ−０１２の作製にすでに使用したＨＶＴ ＵＳ２内のＳｔｕＩ 部位である。この部位は最初ユニークなＨｉｎｄIIIリンカーの挿入により改変 し、標準的ＤＮＡクローニング法によりＭＤＶ ｇＢ遺伝子を挿入した。１７． １５kbのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片中の隣接領域を、「重複するサブゲノム断 片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、残りのクロー ン化ＨＶＴ断片とともに使用した。形質移入ストックから得られたウイルスをプ ラーク精製し、ＤＮＡをＭＤＶ ｇＢ遺伝子の存在について解析した。Ｓ−ＨＶ Ｔ−０４５は、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＳｔｕＩ部位でゲノム内に挿入されたＭ ＤＶ ｇＢ遺伝子を含有する組換えウイルスである。 組換えＳ−ＨＶＴ−０４５の試験 病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対するこれらの組換えＨＶＴ／ ＭＤＶウイルスの有効性を証明するために、２つに実験を行なった。実験Ａでは 、１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０４５ま たはＳ−ＨＶＴ−０４６をワクチン接種した。ワクチン接種７日後、ワクチン接 種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、マレック病ウ イルスの病原性の強いＭＤ−５株で抗原刺激した。刺激後６週間マレック病に典 型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断が できる病変を調べた。表６に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワクチ ン接種対照ヒヨコの９０％でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全な 防御を与えたことを示している。 第２の実験で１日令のヒヨコを、Ｓ−ＨＶＴ−０４５またはＳ−ＨＶＴ−０ ４７のいずれかをワクチン接種した。第３の群のヒヨコを、ＨＶＴとＳＢ−１よ りなるＵＳＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチン接種５日後に 、ワクチン接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原性のマレック病 ウイルスＲＢ１Ｂ株で抗原刺激した。８週間マレック病に典型的な臨床症状を観 察してから、剖検し、マレック病の病変を調べた。実験は、ＨＶＴ −０４５とＨＶＴ−０４７の抗原刺激に対する完全な防御を与えたことを示した 。市販のワクチンは９６％の防御を与え、非ワクチン接種ヒヨコの７９％はマレ ック病を発病した。 実施例６ Ｓ−ＨＶＴ−０１２ Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、ユニークな短い領域中に大腸菌（E．coli）β−ガ ラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換え型ヘルペ スウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（”Calnek ”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。Ｓ−ＨＶＴ−０１２ は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年 １０７月１５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２ ３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米 国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２３８２で寄託されている。 ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨＶＴ のクローン化したＥｃｏＲＩ断片＃７（すなわち、ＨＶＴのＵＳ２遺伝子内 にＳｔｕＩ部位を含有する断片）のユニークなＳｔｕＩ部位に導入した（方法と 材料中に記載されている）。ＥｃｏＲＩ断片＃７の隣接領域を、相同的組換えの ために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、初代ニワトリ胚線維芽 細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従 って共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入ストックから得ら れた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法 を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、１００ ％のプラークが青くなった時、ｌａｃＺ遺伝子の有無についてＤＮＡを解析した 。Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、ＨＶＴのＵＳ２遺伝子内にＳｔｕＩ部位でゲノムに導 入されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである。 Ｓ−ＨＶＴ−０１２は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方す ることができる。ヒヨコに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイル スに対して防御を与える。 実施例７ ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入部位 適当な挿入部位を規定するために、ＨＶＴ ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限断 片のライブラリーを作成した。これらの制限断片のいくつか（ＢａｍＨＩ断片＃ １６と＃１３、ＥｃｏＲＩ断片＃６、＃７、および＃９（図１を参照））に対し て、制限マッピング解析を行なった。各断片で１つのユニークな制限部位を、挿 入部位候補として同定した。これらの部位は、ＢａｍＨＩ断片＃１３と＃１６と ＥｃｏＲＩ断片＃９中のＸｈｏＩ部位、およびＥｃｏＲＩ断片＃６中 位のそれぞれにβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を挿入した。 このような外来性ＤＮＡ挿入体を含有するプラスミドを、外来性ＤＮＡを含有す るＨＶＴを「作製」するための「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮ Ａ共形質移入（コ・トランスフェクション）」に従って使用した。この方法が成 功するためには、挿入部位が、ＨＶＴの複製にとって必須ではなく、その部位は 、ウイルスとプラスミドＤＮＡの間の相同的組換えを仲介するのに適したＨＶＴ ＤＮＡが隣接していることが重要である。ｌａｃＺマーカー遺伝子を含有する プラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作成するためのＤＮＡ 共形質移入（コ・トランスフェクション）」に従って使用した。組換えウイルス の作成は、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」により測定し た。５つの部位のうちの３つは、組換えウイルスを作成するのに使用して成功し た。各場合で、得られたウイルスは容易に１００％に精製でき、外来性ＤＮＡの 挿入のために適当な部位であることを明らかに証明している。これらの部位を規 定するために使用した３つの相同ベクターは、後述する。 実施例７Ａ 相同ベクター１７２−２９．３１ 相同ベクター１７２−２９．３１は、ＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１６断片を含有 し、ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド１７２−２９．３ １は、ユニークなＸｈｏＩ部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクローン化され る。相同ベクター１７２−２９．３１中のＸｈｏＩ部位は、少なくとも３つの組 換えＨＶＴ（実施例１〜３を参照）を作製して、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入す るのに使用することができる。 相同ベクター１７２−２９．３１を、ＤＮＡ配列解析によりさらに性状解析 した。ＢａｍＨＩ＃１６断片の完全な配列を決定した。隣接ＢａｍＨＩ＃１３断 片の約２０９２塩基対の配列も決定した（配列認識番号３を参照）。この配列は 、ＨＶＴ糖タンパク質Ａ（ｇＡ）をコードする読みとり枠は、ＢａｍＨＩ＃１６ 〜ＢａｍＨＩ＃１３結合部にまたがることを示す。ＨＶＴ ｇＡ遺伝子は、ＨＳ Ｖ−１糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）に相同である。ＸｈｏＩ部位は、ＨＶＴ ｇＡ遺 伝子のすぐ上流にあるＯＲＦを妨害する。このＯＲＦは、ＰＲＶ ｐ４３とＶＺ Ｖ遺伝子１５に対してアミノ酸配列の相同性を示す。ＰＲＶとＶＺＶ遺伝子は、 ＨＳＶ−１ ＵＬ４３の同族体である。従って、このＯＲＦをＨＶＴ ＵＬ４３と 名付けた(配列認識番号５を参照)。ＨＶＴ ＵＬ４３はＨＶＴ ｇＣ同族体の上流 に位置するが、ＨＶＴ ｇＡと同じＤＮＡ鎖上にコードされ、ＨＶＴ−１ ＵＬ４ ３はＨＳＶ−１ ｇＣに対して反対の鎖の上にある。ＸｈｏＩ部位は大体アミノ 酸６でＵＬ４３を妨害し、ＵＬ４３遺伝子はＨＶＴ複製に必須ではないことを示 唆している。 実施例７Ｂ 相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７ 相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７は、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃７断片を含有 し、ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド４３５−４７．Ｒ １７は、ユニークなＨｉｎｄIII制限部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクロ ーン化される。プラスミド中のＨｉｎｄIII部位は、ＥｃｏＲＩ断片＃７の天然 に存在するＳｔｕＩ部位にＨｉｎｄIIIリンカーを挿入することにより得られる 。相同ベクター４３５−４７．Ｒ１７中のＨｉｎｄIII部位は、少なくとも２５ の組換えＨＶＴの作製により、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するために使用する ことができる。 ＳｔｕＩでのＤＮＡ配列解析は、この断片が、ＵＳ１０、ＵＳ２、およびＵ Ｓ３をコードする読みとり枠を含有することを示した。ＳｔｕＩ部位は大体アミ ノ酸１２４でＵＳ２を妨害し、ＵＳ２遺伝子はＨＶＴ複製に必須ではないことを 示唆している。 実施例７Ｃ 相同ベクター１７２．６３．１ 相同ベクター１７２．６３．１は、ＨＶＴ ＥｃｏＲＩ＃９断片を含有し、 ＨＶＴへの外来性ＤＮＡの挿入に有用である。プラスミド１７２．６３．１は、 ユニークなＸｈｏＩ制限部位を含有し、ここに外来性ＤＮＡがクローン化される 。相同ベクター１７２．６３．１中のＸｈｏＩ部位は、Ｓ−ＨＶＴ−０１４の作 製により、ＨＶＴに外来性ＤＮＡを挿入するために使用することができる（実施 例８を参照）。 実施例８ Ｓ−ＨＶＴ−０１４ Ｓ−ＨＶＴ−０１４は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．col i）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換 えヘルペスウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（ ”Calnek”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。 ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、クロー ン化したＥｃｏＲＩ断片＃９のユニークなＸｈｏＩ部位に導入した（方法と 材料中に記載されている）。ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ断片＃９内のＸｈｏＩ部 位は、実施例１６〜１９に記載のシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスの作 製のために使用したＢａｍＨＩ＃１０断片内のＸｈｏＩ部位と同じである。Ｅｃ ｏＲＩ断片＃９の隣接領域を相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡと プラスミドＤＮＡは、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイル スを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従って共形質移入（コ・トランスフェ クション）した。形質移入ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘル ペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を 行って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった。Ｓ−Ｈ ＶＴ−０１４は、ＨＶＴのＥｃｏＲＩ＃９断片内にＸｈｏＩ部位でゲノムに導入 されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである。 Ｓ−ＨＶＴ−０１４は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方す ることができる。ニワトリに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイ ルスに対して防御を与える。 実施例９ Ｓ−ＨＶＴ−００５ Ｓ−ＨＶＴ−００５は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌（E．col i）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換 えヘルペスウイルスである。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ＡＴＣＣＦ−１２６（ ”Calnek”）］中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。 ＨＶＴのゲノムへの挿入のために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨＶＴ のＸｈｏＩ＃９断片の約１３００塩基対欠失内に導入した。ユニークなＭｌｕＩ 部位とＥｃｏＲＶ部位の間に位置する欠失は、ＨＶＴ ｇＡ遺伝子の完全なコー ド領域を除去している（配列認識番号３を参照）。ＸｈｏＩ断片＃９の隣接領域 を相同的組換えのために使用した。ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、初代 ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中に「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ 形質移入」法に従って共形質移入（コ・トランスフェクション）した。形質移入 ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalス クリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作 の最後に、１００％のプラークが青くなり、ＤＮＡをｌａｃＺ遺伝子 の存在について解析した。Ｓ−ＨＶＴ−００５は、ＨＶＴの欠失したｇＡ遺伝子 の代わりにゲノムに導入されたｌａｃＺ遺伝子を含有する組換えウイルスである 。 Ｓ−ＨＶＴ−００５は、Ｓ−ＨＶＴ−０４５と同様にワクチンとして処方す ることができる。ニワトリに投与すると、このようなワクチンはマレック病ウイ ルスに対して防御を与える。 実施例１０ マレック病ワクチン マレック病ウイルスからの糖タンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレッ ク病のために優れたワクチンとなる。我々は、ＭＤＶ糖タンパク質を発現するい くつかの組換えＨＶＴを作製した：Ｓ−ＨＶＴ−００４（実施例３）、Ｓ−ＨＶ Ｔ−０４５（実施例５）、Ｓ−ＨＶＴ−０４６（実施例１０Ａ）、Ｓ−ＨＶＴ− ０４７（実施例１０Ｂ）、Ｓ−ＨＶＴ−０６２（実施例１０Ｃ）。 実施例１０Ａ Ｓ−ＨＶＴ−０４６ Ｓ−ＨＶＴ−０４６は、短いユニークな領域に挿入されたマレック病ウイル ス（ＭＤＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ａ（ｇＡ）遺伝子を含 有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ遺伝子は、ＵＳ ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より 正しい抗原性応答を誘発し易い。 Ｓ−ＨＶＴ−０４６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．２２。適 当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１０Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０４７ Ｓ−ＨＶＴ−０４７は、短いユニークな領域に挿入されたＭＤＶ ｇＢおよ びｇＡ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤ Ｖ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入される。ＭＤＶ抗原は、ＨＶ Ｔの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。 Ｓ−ＨＶＴ−０４７は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．１８。適 当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１０Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−０６２ Ｓ−ＨＶＴ−０６２は、短いユニークな領域に挿入されたＭＤＶ ｇＢ、糖 タンパク質Ｄ（ｇＤ）およびｇＡ遺伝子を含有するシチメンチヨウの組換えヘル ペスウイルスである。ＭＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入され る。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。Ｓ −ＨＶＴ−０６２は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約 に従って、1993年２月23日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣ Ｃ）（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０ ８５２、米国）の特許培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２４０１で寄託されて いる。 Ｓ−ＨＶＴ−０６２は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６０．６ とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない４５６−１７．２２。適当 なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 ＭＤＶ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験 病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれらの組 換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスの有効性を証明するために、２つに実験を行な った。実験１では、１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ− ＨＶＴ−０４５、Ｓ−ＨＶＴ−０４６、またはＳ−ＨＶＴ−０４７をワクチン接 種した。ワクチン接種５日後、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコであ る非ワクチン接種ヒヨコを、ＭＤＶで抗原刺激した。刺激後６週間マレック病に 典型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断 ができる病変を調べた。表７に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワク チン接種対照ヒヨコの８４％でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全 な防御を与えたことを示している。 第２の実験で１日令のヒヨコを、Ｓ−ＨＶＴ−０６２でワクチン接種した。 さらに２群のヒヨコを、ＨＶＴ、およびＨＶＴとＳＢ−１の組合せよりなるＵＳ ＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチン接種５日後に、ワクチン 接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原性のＭＤＶを抗原刺激した 。８週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、剖検し、マレック病の 病変を調べた。実験は、Ｓ−ＨＶＴ−０６２の、抗原刺激に対する１００％の防 御を与える能力を示した（表７）。市販のワクチンはそれぞれ８１％と９５％の 防御を与え、非ワクチン接種ヒヨコの１００％はマレック病を発病した。 実施例１１ ニューキャッスル病とマレック病に対する２価ワクチン ＮＤＶからタンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病とニューキャ ッスル病の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＮＤＶタンパク質を発 現するいくつかの組換えＨＶＴを作成した：Ｓ−ＨＶＴ−００７（実施例１１Ａ ）、Ｓ−ＨＶＴ−０４８（実施例１１Ｂ）、Ｓ−ＨＶＴ−０４９（実施例１１Ｃ ）、Ｓ−ＨＶＴ−０５０（実施例１１Ｄ）、およびＳ−ＨＶＴ−１０６（実施例 １１Ｅ）。 実施例１１Ａ Ｓ−ＨＶＴ−００７ Ｓ−ＨＶＴ−００７は、ユニークな長い領域に挿入されたＰＲＶ ｇＸプロ モーターに制御される大腸菌（E．coli）ｌａｃＺ ＮＤＶ ＨＮハイブリッドタ ンパク質遺伝子と、ＨＳＶ−１ α４プロモーターに制御されるＮＤＶ Ｆ質遺伝 子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤＶ遺伝子は 、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−００７を作製するために、ＨＶＴ ＤＮＡとプラスミド２５５ −１８．Ｂ１６を、「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質移入」法に従 って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に共形質移入（コ・トランスフェク ション）した。形質移入ストックから得られる青いウイルスを、「組換えヘルペ スウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行 って精製した。この操作の最後に、１００％のプラークが青くなった。 実施例１１Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０４８ Ｓ−ＨＶＴ−０４８は、ユニークな短い領域に挿入されたＨＣＭＶ極初期プ ロモーターに制御されるＭＤＶ ｇＢとｇＡ、およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を含有する シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶとＮＤＶ遺伝子は、Ｕ Ｌ４３遺伝子と同じ転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０４８は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５３５−７０．３。適当 なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１１Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−０４９ Ｓ−ＨＶＴ−０４９は、短いユニークな領域に挿入されたＰＲＶ ｇＸプロ モーターに制御されるＭＤＶ ｇＢとｇＡ、およびＮＤＶ ＨＮ遺伝子を含有する シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＭＤＶとＮＤＶ遺伝子は、Ｕ Ｓ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０４９は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の 以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．Ｂ Ａ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１と ＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６ ．２６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５４９−６２．１０ 。適当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１１Ｄ Ｓ−ＨＶＴ−０５０ Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、ＭＤＶ ｇＢとｇＡ遺伝子、ならびにＮＤＶ ＨＮ遺 伝子（配列認識番号１０と１１）およびF（配列認識番号１２と１３）遺伝子を 含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤＶ遺伝子はそれ ぞれＰＲＶ ｇＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。すべての４つの 遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５４９−２４．１５。適 当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。Ｓ−ＨＶＴ−０５０は、 特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年２月 23日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１パー クローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州２０８５２、米国）の特許 培養物保管局に、ＡＴＣＣ受託番号２４００で寄託されている。 実施例１１Ｅ Ｓ−ＨＶＴ−１０６ Ｓ−ＨＶＴ−１０６は、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、ｇＤ遺伝子、およびＮＤＶ Ｈ ＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＮＤ Ｖ遺伝子はそれぞれＰＲＶ ｇＸとＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。 すべての５つの遺伝子は、ユニークな短い領域内にＵＳ２遺伝子と同じ転写配向 で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−１０６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない６３３−１．２７。 ＮＤＶ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験 病原性ニューキャッスル病ウイルスおよびマレック病ウイルスによる抗原刺 激に対するこれらの組換えＨＶＴ／ＭＤＶ／ＮＤＶウイルスの有効性を証明する ために、２つに実験を行なった。実験１では、１日令の特異的病原体を含まない （ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０４８、Ｓ−ＨＶＴ−０４９、Ｓ−ＨＶＴ− ０５０またはＮＤＶ Ｂ１／Ｂ２ウイルスよりなるＵＳＤＡに認可された従来の ワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種後３週間、ワクチン接種したヒヨコ 、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ＮＤＶで抗原刺激した。次 に疾患に典型的な臨床症状を観察した。表８に示す結果は、これらの組換えウイ ルス（Ｓ−ＨＶＴ−０４８とＳ−ＨＶＴ−０５０）は、非ワクチン接種対照ヒヨ コの１００％でニューキャッスル病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御 を与えたことを示している。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−０４９は、ニューキャ ッスル病に対して部分的な防御を与えた。 第２の実験で１日令のヒヨコを、１日令のヒヨコをＳ−ＨＶＴ−０５０でワ クチン接種した。さらに２群のヒヨコに、ＨＶＴ、およびＨＶＴとＳＢ−１ウイ ルスの組合せよりなるＵＳＤＡで認可された従来のワクチンを接種した。ワクチ ン接種５日後に、ワクチン接種したヒヨコと対照の非ワクチン接種ヒヨコに病原 性のＭＤＶを抗原刺激した。８週間マレック病に典型的な臨床症状についてヒヨ コを観察してから、剖検し、マレック病の病変を調べた。この実験は、市販のマ レック病ワクチンより強い防御を与えるＳ−ＨＶＴ−０５０の能力を示した。 実施例１２ 伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する２価ワクチン ＩＬＴウイルスから糖タンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病と 伝染性咽頭気管炎の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＩＬＴウイル ス糖タンパク質を発現するいくつかの組換えＨＶＴ、Ｓ−ＨＶＴ−０５１（実施 例１２Ａ）、Ｓ−ＨＶＴ−０５２（実施例１２Ｂ）、およびＳ−ＨＶＴ−１０４ （実施例１１Ｃ）を作成した。 実施例１２Ａ Ｓ−ＨＶＴ−０５１ Ｓ−ＨＶＴ−０５１は、ユニークな短い領域に挿入されたＩＬＴウイルスｇ Ｂ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＬＴ遺 伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０５１は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５２８−１１．３４。適 当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１２Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−０５２ Ｓ−ＨＶＴ−０５２は、短いユニークな領域に挿入されたＩＬＴウイルスｇ Ｄ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ＩＬＴ遺 伝子は、ＵＳ２遺伝子と反対の転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０５２は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、４３７−２６．２ ６とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、および切断しない５２８−０３．３７。適 当なＤＮＡの挿入は、サザンブロット解析で確認した。 実施例１２Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−１０４ Ｓ−ＨＶＴ−１０４は、６つの外来遺伝子を含有するシチメンチョウの組換 えヘルペスウイルスである。ＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およびｇＤ遺伝子は、ＵＳ２ 遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。大腸菌（E.coli）ｌ ａｃＺマーカー遺伝子とＩＬＴ ｇＢおよびｇＤ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同 じ転写配向でＢａｍＨＩ＃１６領域に挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−１０４を作製するために、Ｓ−ＨＶＴ−０６２のＤＮＡとプ ラスミド６３４−２９．１６を、「組換えウイルスを作成するためのＤＮＡ形質 移入」法に従って、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）に共形質移入（コ・ト ランスフェクション）した。 ＩＬＴ抗原を発現する組換えＨＶＴの試験 病原性伝染性咽頭気管炎ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれ らの組換えＨＶＴ／ＩＬＴウイルスの有効性を証明するために、以下の実験を行 なった。１日令の特異的病原体を含まない（ＳＰＦ）ヒヨコに、Ｓ−ＨＶＴ−０ ５１、Ｓ−ＨＶＴ−０５２、Ｓ−ＨＶＴ−０５１とＳ−ＨＶＴ−０５２の組合せ 、またはＩＬＴウイルスよりなるＵＳＤＡに認可された従来のワクチンをワクチ ン接種した。ワクチン接種後２〜３週間、ワクチン接種したヒヨコ、および対照 ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ＩＬＴで抗原刺激した。次に疾患の臨床 症状を観察した。表９に示す結果は、これらの組換えウイルス（Ｓ−ＨＶＴ−０ ５１とＳ−ＨＶＴ−０５２）は、ＩＬＴウイルスによる抗原刺激に対して、市販 のＩＬＴワクチンに匹敵する防御を与えたことを示している。 ここに記載したワクチンでワクチン接種したヒヨコは、病原性のＩＬＴに感 染したヒヨコから容易に区別できる。これは、ｇＢまたはｇＤ以外の任意のＩＬ Ｔ抗原に対する抗体について、疑わしいヒヨコを試験することにより行われる。 そのような抗原の例は、ＩＬＴ糖タンパク質Ｃ、Ｅ、およびＧである。ワクチン 接種した感染していないトリは、これらの抗原が陰性であり、感染したトリは陽 性である。 実施例１３ 伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する２価ワクチン ＩＢＤＶからタンパク質を発現する組換えＨＶＴは、マレック病と伝染性粘 液嚢病の両方に対して防御する２価のワクチンとなる。ＩＢＤＶタンパク質を発 現するいくつかの組換えＨＶＴを作製した。これらのウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ− ００３（実施例２）とＳ−ＨＶＴ−０９６である。 Ｓ−ＨＶＴ−０９６は、ユニークな短い領域に挿入された、ＨＣＭＶ極初期 プロモーターに制御されるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの 組換えヘルペスウイルスである。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配 向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０９６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７． ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１ とＮｏｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６ ０．６とＢａｍＨＩ、および切断しない６０２−５７．Ｆ１。適当なＤＮＡの挿 入は、サザンブロット解析で確認した。 Ｓ−ＨＶＴ−０９６を、黒プラークとウェスタンブロット解析によりＶＰ２ の発現について測定した。両方の測定法は、このウイルスが、ＩＢＤＶ中和性モ ノクローナル抗体と特異的に反応する高レベルのタンパク質を発現することを示 した。このウイルスは、伝染性粘液嚢病に対するワクチンとして有用であろう。 実施例１４ 伝染性気管支炎およびマレック病に対する２価ワクチン Ｓ−ＨＶＴ−０６６は、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＤおよびｇＡ遺伝子、ならびにＩ ＢＶスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子を含有するシチメンチョウの組換 えヘルペスウイルスである。ＩＢＶスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子は 、それぞれＨＣＭＶ極初期プロモーターとＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され る。すべての５つの遺伝子は、短いユニークな領域に挿入された。ＭＤＶ遺伝子 とＩＢＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写配向で挿入される。 Ｓ−ＨＶＴ−０６６は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組換えヘルペスウイル スを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７−３２．１Ｃ１とＮｏ ｔＩ、４３７−２６．２４とＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII、５５６−６０．６ とＢａｍＨＩ、および切断しない５６７−７２．１Ｄ。適当なＤＮＡの挿入は、 サザンブロット解析で確認した。 Ｓ−ＨＶＴ−０６６を、黒プラークとウェスタンブロット解析によりＩＢＶ スパイクタンパク質の発現について測定した。両方の測定法は、このウイルスが 、ＩＢＶ中和性モノクローナル抗体と特異的に反応する高レベルのタンパク質を 発現することを示した。このウイルスは、伝染性気管支炎に対するワクチンとし て有用であろう。 実施例１５ 種々の病原体からの抗原を発現するためにＨＶＴを利用するワクチン 以下の病原体からの抗原は、家禽のワクチンを開発するのに利用できるかも 知れないと予想する：ヒヨコ貧血ウイルス（物質）、トリ脳脊髄炎ウイルス、ト リレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリ アデノウイルス、鶏痘ウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、サル モネラ種大腸菌（Salmonella spp E．coli）、パスツレラ（Pasterrella）種、 ヘモフィルス（Haemophilus）種、クラミジア種、マイコプラズマ種、キャンピ ロバクター種、ボルデテラ種、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ／シラミ、家禽 原虫（エイメリア（Eimeria）種、ヒストモナス（Histomonas）種、トリコモナ ス（Trichomonas）種）。 実施例１６ 伝染性咽頭気管炎、マレック病およびニューカッスル病に対する３価のワク チン、および伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する２価のワクチンを記載 する。伝染性咽頭気管炎に対する優れた防御は、Ｓ−ＨＶＴ−１２３（ＩＬＴＶ ｇＢとｇＤを発現する）をＳ−ＨＶＴ−１３８、−１３９、または−１４０（ ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩを発現する）と組合せたワクチンで得られる。 実施例１６Ａ Ｓ−ＨＶＴ−１２３ Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＮｏｔＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇ ＢとｇＤ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図 １３Ｂと１５；配列認識番号４８）。Ｓ−ＨＶＴ−１２３はさらに、ＨＶＴ Ｕ Ｓ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入したＭ ＤＶ ｇＡ、ｇＤとｇＢ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ遺伝子とＭＤＶ遺伝子は、 それぞれのプロモーターを使用する。Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、伝染性咽頭気管炎 およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１２３は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７． ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０ とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７２１−３８．１Ｊ 、７２９−３７．１とＡｓｃＩ。 実施例１６Ｂ Ｓ−ＨＶＴ−１３８ Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴウイルスｇ ＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（図 １３Ｂと１５；配列認識番号４８）。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲ ノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ） と反対の転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。ＩＬＴＶ ｇＤ とｇＩ遺伝子は、内在性ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体として発現さ れ、それら自身の内在性ポリアデニル化シグナルを共有する。 Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽の ワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１３８は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、４ １５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 Ｓ−ＨＶＴ−１３８をワクチン接種したヒヨコの血清は、ウェスタンブロッ トでＩＬＴＶ ｇＩタンパク質と反応し、Ｓ−ＨＶＴ−１３８ワクチンはＩＬＴ Ｖタンパク質を発現し、トリで免疫応答を誘発しないことを示している。Ｓ−Ｈ ＶＴ−１３８をワクチン接種したヒヨコは、病原性の伝染性咽頭気管炎ウイルス による抗原刺激から防御された。 実施例１６Ｃ Ｓ−ＨＶＴ−１３９ Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴ ウイルスｇＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウ イルスである。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９ （ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦＡ）と反対の転写配向である （図１３Ａと１５；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１３９はさらに、 ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に 挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＩＬＴＶ ｇＤと ｇＩ遺伝子は、それら自身の内因性ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体と して発現され、ＭＤＶ遺伝子もまた、それ自身の内因性プロモーターから発現さ れる。Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽 のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１３９は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、切 断しない７２１−３８．１Ｊ。 実施例１６Ｄ Ｓ−ＨＶＴ−１４０ Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＬＴ ウイルスｇＤとｇＩ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス である（図１３Ａと１５）。ＩＬＴＶ ｇＤとｇＩ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥ ｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と反対の 転写配向である（図１４；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１４０はさ らに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ 部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ Ｆおよ びＨＮ遺伝子を含有する。ＩＬＴ ＶｇＤとｇＩ遺伝子は、それら自身の内因性 ＩＬＴＶプロモーターから重複する転写体として発現され、ＭＤＶ遺伝子もまた 、それ自身の内因性プロモーターから発現される。ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭ Ｖ極初期プロモーターから転写され、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモー ターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、伝染性咽頭気管炎、マレック病、 およびニューキャッスル病に対する家禽のワクチンとして有 用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１４０は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１１−９２．１Ａ、切 断しない７２２−６０．Ｅ２。 実施例１７ 伝染性粘液嚢病、マレック病およびニューキャッスル病に対する３価のワク チン、ならびに伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する２価のワクチンが記載 される。 実施例１７Ａ ＨＶＴ−１２６ Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢＤ Ｖ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（ 図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（Ｂａｍ ＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１４ ；配列認識番号４８、５０）。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロ モーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、伝染性粘液嚢病およびマレッ ク病に対する家禽のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１２６は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、４ １５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 実施例１７Ｂ ＨＶＴ−１３７ Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１ ０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢ ＤＶ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである （図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（Ｂａ ｍＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１ ４；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１３７はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭ ＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、Ｉ ＢＲＶ ＶＰ８プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、それら自身の各 内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、伝染性粘液 嚢病およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１３７は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、切 断しない７２１−３８．１Ｊ。 実施例１７Ｃ ＨＶＴ−１４３ Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＩＢＤ Ｖ ＶＰ２遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（ 図１３Ａと１５）。ＩＢＤＶ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（Ｂａｍ ＨＩ＃１０）断片内の読みとり枠（ＯＲＦ Ａ）と同じ転写配向である（図１４ ；配列認識番号４８、５０）。Ｓ−ＨＶＴ−１４３はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺 伝子内のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子、ならびにＮＤＶ ＦおよびＨＮ遺伝子を含有 する。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、ＩＢＲＶ ＶＰ８プロモーターから発現される 。ＭＤＶ遺伝子は、それぞれの内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤ Ｖ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写され、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子 はＰＲＶ ｇＸプロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、伝染性粘 液嚢病、マレック病、およびニューキャッスル病に対する家 禽のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１４３は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７０６−５７．Ａ３、切 断しない７２２−６０．Ｅ２。 実施例１８ ＨＶＴ−１２８ Ｓ−ＨＶＴ−１２８は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０ ）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである（ 図１３Ａと１５）。Ｓ−ＨＶＴ−１２８はさらに、ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＨ ｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇ Ｄ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ ｇＸプロモー ターから発現され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プロモーターから転写 される。ＭＤＶ遺伝子は内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。Ｓ−ＨＶＴ −１２８は、ニューキャッスル病、およびマレック病に対する家禽のワクチンと して有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１２８は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１７−３８．１２。こ れらの６つのコスミドの混合物に、ユニークな短い領域に挿入されたＭＤＶ ｇ Ａ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子（ＨＶＴ−０６２を参照）と、ＨＶＴのユニークな 長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＮｏｔＩ部位に変換 したＸｈｏＩ部位内に挿入したＰＲＶ ｇＸプロモーター−ｌａｃＺ遺伝子を含 有する、組換えＨＶＴウイルスの限界希釈物を加えた。ｌａｃＺ陰性である組換 えウイルスＳ−ＨＶＴ−１２８を選択した。 実施例１８Ｂ ＨＶＴ−１３６ Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ ＢａｍＨＩ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に 挿入されたＮＤＶ ＨＮとＦ遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペス ウイルスである（図１４；配列認識番号４８と５０）。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子は、 ＰＲＶ ｇＸプロモーターから発現され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子は、ＨＣＭＶ極初期プ ロモーターから転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、ニューキャッスル病、およ びマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１３６は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイ ルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の以 下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮ ｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７１７−３８．１２、お よび４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 実施例１９ Ｓ−ＨＶＴ−１４５ ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウイルスワクチン Ｓ−ＨＶＴ−１４５は、マレック病に対して防御するＭＤＶとＨＶＴゲノム 配列を含有する組換えウイルスワクチンであり、病原性の作成した血清型２の関 連する防御性抗原をコードする遺伝子を含有するＭＤＶゲノムＤＮＡのコスミド と、ＨＶＴゲノムＤＮＡのコスミドを、「重複するサブゲノム断片から組換えヘ ルペスウイルスを作成するための方法」に従って組合せて産生される。得られる ウイルスは、病原性のＭＤＶ血清型２に対する防御性免疫応答およびＨＶＴの弱 毒化増殖特性も有するワクチンである。１つの態様において、ユニークな短い領 域のＭＤＶ遺伝子とユニークな長い領域のＨＶＴ遺伝子を含有するキメラウイル スワクチンは、ニワトリのマレック病に対するワクチンとして有用である。ユニ ークな短い領域内のＭＤＶ防御性抗原（ｇＤ、ｇＥおよびｇＩ）はＭＤＶに対す る防御性免疫応答を誘発し、ＭＤＶのユニークな長い領域内に存在する病原性の 成分（５５、５６、５７）は、ＨＶＴの弱毒性のユニークな長い配列により置換 される。その結果、マレック病に対して防御性の弱毒化ウイルスワクチンが得ら れる。マレック病、伝染性咽頭気管炎、伝染性粘液 嚢病、ニューキャッスル病、または他の家禽病原体に対する多価防御性は、ＩＬ ＴＶ ｇＢ、ｇＤ、およびｇＩ遺伝子、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子、ＮＤＶ ＨＮお よびＦ遺伝子、または家禽病原体からの抗原遺伝子を、ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウ イルス（図１３と１５）のユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９（ＢａｍＨＩ ＃１０）断片中のＰａｃＩ部位またはＮｏｔＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿 入することにより得られる。 全てのＭＤＶのユニークな短い領域を含有するコスミドを作製した。ＭＤＶ ゲノムＤＮＡは、ウイルスのユニークな長い領域、および内部と末端繰り返し部 分にいくつかのＳｍａＩ部位を含有するが、ウイルスのユニークな短い領域には ＳｍａＩ部位はない。ＭＤＶの全てのユニークな短い領域は、ＭＤＶゲノムＤＮ ＡをＳｍａＩで部分的制限分解することにより単離された。約２９，０００〜３ ３，０００塩基対のＤＮＡ断片を単離し、コスミドベクターｐＷＥ１５の平滑末 端部位にクローン化した。ＨＶＹ−１４５を作製するために、ＭＤＶのユニーク な短い領域を含有するコスミドであるＨＴＶ／ＭＤＶキメラウイルスを、「重複 するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従っ て、ＨＶＴのユニークな長い領域を含有するコスミドと一緒にした。サブゲノム クローンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、 １７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、４０７ ．３２．１Ｃ１とＮｏｔＩ、および７３９−２７．１６とＮｏｔＩ。 得られるウイルスは、マレック病に対する優れた防御性、またはマレック病 、伝染性咽頭気管炎、伝染性粘液嚢病、ニューキャッスル病、または他の家禽病 原体に対する多価防御性ワクチンとして優れた防御性を与える。ＨＶＴ／ＭＤＶ キメラワクチン中のＭＤＶ遺伝子の発現が安全であり、ＨＶＴとＭＤＶ１型（Ｓ Ｂ−１）またはＨＶＴのみを含有する現在入手可能なワクチンよりマレック病に 対する防御性が優れているため、このワクチンは優れている。第２に、診断と制 御の両方の目的のために、相同性のＨＶＴ遺伝子の非存在下でＭＤＶ糖タンパク 質遺伝子を発現することができる。ＭＤＶ糖タンパク質に対する抗体は相同性の ＨＶＴ糖タンパク質と交差反応するため、これは有用である。最後に、各糖タン パク質遺伝子の単一のコピーを含有する組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルスは、相同 的組換えにより欠失するかも知れないＨＶＴとＭＤＶから の相同性糖タンパク質遺伝子の２つのコピーを含有する組換えウイルスより安定 である。 別の態様において、ユニークな長い／内部繰り返し結合部とユニークな長い ／末端繰り返し結合部のＭＤＶ病原性の遺伝子を有効に避けて、ユニークな長い 領域（ＭＤＶ ｇＢおよびｇＣ）からのＭＤＶ防御性抗原遺伝子を含有するコス ミドと、ユニークな短い領域とユニークな長い領域からのＨＶＴ遺伝子配列を含 有するコスミドを一緒にした（５５、５６、５７）。 ＳＢ−１株は、病原性が弱毒化されたＭＤＶ血清型１である。ＨＶＴとＳＢ −１の生きたウイルスの組合せでワクチン接種をすると、病原性のＭＤＶ抗原刺 激に対して、いずれか単独でワクチン接種するよりも良好な防御性を与える。本 発明の別の態様において、組換えウイルスワクチンは、非病原性のＭＤＶ血清型 １と３の弱毒化遺伝子と組合せた病原性のＭＤＶ血清型２の防御性抗原を含む（ 例えば、ＳＢ−１とＨＶＴ）。ユニークな長い領域に対応するゲノムＤＮＡは、 ＳＢ−１血清型の寄与である。ユニークな短い領域に対応するゲノムＤＮＡは、 ＨＶＴ血清型の寄与である。ＭＤＶ血清型２からの３つの主要な糖タンパク質抗 原（ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ）が、ウイルスのユニークな短い領域に挿入される。 ユニークな短い領域を再作製するためにＨＶＴのサブゲノムクローン６７２ −０１．Ａ４０、６７２−０７．Ｃ４０および７２１−３８．１Ｊを用いて、組 換えウイルスが作製される。サブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊは、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＡ、およびｇＤ遺伝子の挿入を含有する。これらのクローンのモル大 過剰量を、サブ感染性量のＳｂ−１ゲノムＤＮＡと共形質移入（コ・トランスフ ェクション）する。適当なサブ感染性用量を決定するために、ＳＢ−１の形質移 入を、細胞培養物中でウイルスプラークが出なくなる用量まで力価測定をする。 このような用量は、ＨＶＴのユニークな短いサブゲノムクローンと再結合するＳ Ｂ−１のユニークな長い領域をまたぐサブゲノム断片を含有する。従って、ＳＢ −１とＨＶＴサブゲノム断片の重複する相同性領域の間の組換えにより得られる ウイルスは非常に好ましい。あるいは、ユニークな長い領域からのＳＢ−１ゲノ ム断片をコスミドベクターにサブクローニングする。ＭＤＶ ｇＢ、ｇＡ、およ びｇＤ遺伝子とともにＳｂ−１ユニークな長い領域とＨＶＴユニークな短い領域 を含有する組換えウイルスは、「重複するサブゲノム断片 から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って産生した。この方 法はまた、ＨＶＴサブゲノムクローンとともに使用して、伝染性咽頭気管炎ウイ ルス、ニューキャッスル病ウイルスおよび伝染性粘液嚢病ウイルスを含む（ただ し、これらに限定されない）他の鳥類病原体からの抗原遺伝子を挿入した。 実施例２０ ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリインターフェロン （ｃＩＦＮ）を発現する組換えＨＶＴは、マレック病ウイルスに対するワクチン として、および家禽の他の疾患に対する免疫応答を増強するために有用である。 ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物Ｇ−ＣＳＦやインターロイ キン−６タンパク質（５８）と関係があり、ニワトリインターフェロン（ｃＩＦ Ｎ）は哺乳動物１型インターフェロン（５９）と相同性がある。前記実施例で記 載したワクチンと組合せて使用すると、Ｓ−ＨＶＴ−１４４またはｃＩＦＮを発 現するＨＶＴは、鳥に疾患を引き起こすウイルス（例えば、マレック病ウイルス 、ニューキャッスル病ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウ イルス、伝染性粘液嚢病ウイルスがあるが、これらに限定されない）に対する粘 液性、体液性または細胞性免疫を与えるのに有用である。ｃＭＧＦまたはｃＩＦ Ｎを発現する組換えＨＶＴは、実施例１５に記載の鳥類の疾患を引き起こす生物 に対して増強された免疫を与えるのに有用である。 実施例２０Ａ Ｓ−ＨＶＴ−１４４ Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断 片中のＰａｃＩ部位に変換したユニークなＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨 髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペ スウイルスである。ｃＭＧＦ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内の 読みとり枠（ＯＲＦＡ）と反対の転写配向である（図１４；配列認識番号４８と ５０）。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから 転写される。Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、マレック病に対する家禽のワクチンとして 有用である。 Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウ イルスを作成するための方法」に従って作製した。サブゲノムクローンと酵素の 以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．Ｂ Ａ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０と ＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、 および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 実施例２０Ｂ ニワトリインターフェロンを発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えＨＶＴは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏ ＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリイ ンターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイト メガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ｃＩＦＮを発現する組換え ＨＶＴは、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。 ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換え ヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製する。サブゲノムクロー ンと酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２ −０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７ ．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１と ＡｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 鳥類サイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するために鳥 類の疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。ＨＶＴ中で発現され、免 疫刺激作用を有する追加のサイトカインには、トランスフォーミング増殖因子ベ ータ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インス リン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、 インターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、イ ンターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキ ン６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、イン ターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイ キン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激 因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インター フェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレ イオトロフィン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビ ター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体があるが、これら に限定されない。これらのサイトカインは、トリの種またはヒト、ウシ、ウマ、 ネコ、イヌもしくはブタを含む他の動物由来である。 実施例２０Ｃ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェロン遺 伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域 内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入された ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイト メガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性Ｍ ＤＶプロモーターから発現される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、および ｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強した ワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子とｃＩＦＮ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブ ゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作製す る。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮ ｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、 ７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７１７−３８．１Ｊ。 実施例２０Ｄ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝 子およびニワトリインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域 内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入された ニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有す る。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモータ ーから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される 。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子 はＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇ Ｂ、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル 病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「 重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に 従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７ −３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２ ．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０ とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２２−６０． Ｅ２。 実施例２０Ｅ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリ骨髄単球性増殖因子 遺伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域 内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入された ニワトリ骨髄単球性増殖因子(ｃＭＧＦ)遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイト メガロウイルス極初期プロモーターから転写される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性Ｍ ＤＶプロモーターから発現される。ｃＭＧＦおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、および ｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対するに対する家禽の免疫応答が 増強したワクチンとして有用である。 ｃＭＧＦ遺伝子およびＭＤＶ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複する サブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って作 製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２． ２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６ とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔ Ｉ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。 実施例２０Ｆ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝 子、およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域 内のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入された ニワトリ骨髄単球性増殖因子(ｃＧＭＦ)遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子ならびにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有す る。ｃＧＭＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写 される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ 極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮおよびＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、および ｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対する に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＧＭＦ遺伝子を発現する組換えＨＶＴ は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方 法」に従って作製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する： ４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７ −３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１． Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７５１−８７．Ａ８、および切断しない７２２− ６０．Ｅ２。 実施例２１ 疾患を引き起こす微生物からの抗原を発現するシチメンチョウの 組換えヘルペスウイルス シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、鳥類の種とともに 動物からの疾患を引き起こす微生物の抗原を発現するのに有用である。組換えＨ ＶＴは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、およびネコを含む（しかし、これらに 限定されない）動物のワクチンとして有用である。 組換えＨＶＴは、疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中 で発現される時、ウマの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、 ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス−１およびウマヘル ペスウイルス−４があるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾 患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ウシの 疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、ウシヘルペスウイルス− １、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシRSウイルス、ウシパラインフルエンザウ イルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾 患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、ブタの疾患に対す るワクチンとして有用である。これらには、仮性狂犬病ウイルス、ブタ生殖器お よび呼吸器症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）、ブタコレラウイルス、ブタインフル エンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイルスがあるが、これらに限 定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨ ＶＴベクター中で発現される時、ネコまたはイヌの疾患に対するワクチンとして 有用である。これらには、ネコヘルペスウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ免 疫不全症ウイルス、および糸状虫（Dirofilaria imitis）（心糸状虫症）がある が、これらに限定されない。イヌの疾患を引き起こす微生物には、イヌヘルペス ウイルス、イヌジステンパー、イヌアデノウイルス１型（肝炎）、アデノウイル ス２型（呼吸系疾患）、パラインフルエンザウイルス、レプトスピラカニコーラ （Leptospira canicola）、黄痘性出血病、パルボウイルス、コロナウイルス、 ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、イヌヘルペスウイルス 、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、イヌ糸状虫 （Dirofilaria imitis）（心糸状虫症）および狂犬病があるが、これらに限定さ れない。 実施例２２ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスをベクターとして用い るヒトワクチン シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、ヒトの疾患に対す るワクチンとして有用である。例えば、ヒトのインフルエンザウイルスは、中和 性ウイルスエピトープが急速に変化する急速に進化するウイルスである。有用な 組換えＨＶＴワクチンはインフルエンザウイルス中和性エピトープがインフルエ ンザウイルスの新しい株に対して防御するように急速に変化するものである。ヒ トのインフルエンザＨＡとＮＡ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して組換 えＨＶＴにクローン化される。組換えＨＶＴは、以下の疾患また は疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される時、他のヒトの疾 患に対するワクチンとして有用である。これらには、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原 およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウ イルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタ インバーウイルス、水痘−帯状庖疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒト ヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ハンター ンウイルス（hantaan virus）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイル ス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、狂 犬病ウイルス、おたふくかぜウイルス、マラリア（Plasmodium falciparum）、 百日咳菌（Bordetella pertussis）、ジフテリア、リケッチア・プロワゼキイ（ Richetsia prowazekii）、ボレリア・ベルグドルフェリ（Borrelia bergdorferi ）、破傷風毒素、悪性腫瘍抗原があるが、これらに限定されない。 ヒトサイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するためにヒ トの疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。追加のサイトカイン（ヒ トおよび他の動物のトランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミ リー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経 増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ −１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インタ ーロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容 体、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インター ロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキ ン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファ ージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロ ンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白 血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性腫瘍 壊死因子受容体があるが、これらに限定されない）は、ＨＶＴ中で発現され、免 疫刺激作用を有する。 実施例２３ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスワクチンの改良製造法 インターフェロンやインターロイキンのようなサイトカインは、培養細胞 や動物のウイルスの複製を阻害する。細胞性インターフェロンまたはインターロ イキンの産生の阻害は、細胞培養による組換えＨＶＴの増殖を改良する。組換え 豚痘ベクターから発現されるニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）を、ニワト リ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞培養物に加え、β−ガラクトシダーゼを発現するＳ− ＨＶＴ−０１２で感染させた。細胞培養培地に加えたｃＩＦＮは、β−ガラクト シダーゼの発現とＳ−ＨＶＴ−０１２力価の両方を用量依存的に低下させた。こ の結果は、ＨＶＴの増殖は、ニワトリインターフェロンの外因性添加により制限 されることを示す。ＣＥＦ細胞中でニワトリインターフェロン活性を除去または 不活性化することにより、ＣＥＦ細胞中のＨＶＴの増殖を改良するためにいくつ かの方策が利用可能である。 １つの態様において、ニワトリインターフェロン中和性抗体は、ニワトリイ ンターフェロン活性を阻害し、ＣＥＦ細胞培養物中の組換えＨＶＴの増殖を改良 するために、培地に加えられる。抗−ｃＩＦＮ抗体は、ニワトリインターフェロ ンタンパク質を注射したマウスまたはウサギの血清から得られ、好ましくはｃＩ ＦＮは、ニワトリインターフェロンを発現する組換え豚痘ウイルス由来である。 ポックスウイルスは、免疫逃避方法としてサイトカイン阻害性タンパク質を 分泌する。ある型のポックスウイルス免疫逃避機序では、サイトカインを不活性 化しウイルスの複製を可能にするインターロイキン、インターフェロン、または 腫瘍壊死因子のポックスウイルス可溶性受容体が関与する（６０）。本発明の１ つの態様において、鶏痘ウイルスは、ニワトリインターフェロン阻害性タンパク 質および他の免疫逃避タンパク質の供給源として有用である。インターフェロン 活性を阻害しＨＶＴ力価を増加させるために、ＦＰＶ感染ＣＥＦ細胞培養物から の調整培地をＨＶＴ感染ＣＥＦ細胞に加える。さらなる態様において、組換えニ ワトリインターフェロン阻害性タンパク質または他のポックスウイルス免疫逃避 タンパク質は、ＨＶＴ力価を増加させるためにＨＶＴワクチン組成物とともにベ クター中で発現される。 外来遺伝子を発現するために、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞が作成され た（６１）。さらなる態様において、ニワトリインターフェロンのアンチセンス ＲＮＡをコードする遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞株に導入して、イン ターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株を作製する。インターフェロン陰性ＣＥＦ 細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、インターフェロン産生性ＣＥＦ細胞株中 で増殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。さらなる態様 において、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を発現するベクター をＣＥＦ細胞に導入して、ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株を作製する。ｃＭＧＦ陽性 ＣＥＦ細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、ｃＭＧＦ陰性ＣＥＦ細胞株中で増 殖させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。 前記実施例で概説したように、本発明の組換えＨＶＴは、マレック病および 他の疾患に対するワクチンとして有用である。ＣＥＦ細胞での組換えＨＶＴの増 殖効率が上昇すれば、ワクチンの生産に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/17 Ｃ１２Ｎ 7/00 39/245 5/00 Ｂ 39/255 Ａ６１Ｋ 37/66 48/00 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 37/24 7/00 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者 ウイルド、 マーサ・エー アメリカ合衆国、 カリフォルニア州 92104、 サン・ディエゴ、サン・マルコ ス・アベニュー 2414 (72)発明者 シンガー、 フィリップ・エー アメリカ合衆国、 カリフォルニア州 92117、 サン・ディエゴ、ジェニファ ー・ストリート 3616

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サイトカインをコードする外来性ＤＮＡ配列を具備し、該配列がシチメン チョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI＃９断片中のXhoI部位を具備した挿 入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、サイ トカインをコードした前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウ イルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルス。 ２．前記のサイトカインが、ニワトリの骨髄単球性成長因子（cMGF）、ニワト リのインターフェロン（cIFN）、インターロイキン-2、インターロイキン-6、イ ンターロイキン-12、インターフェロン群、顆粒球−マクロファージコロニー刺 激性因子、またはインターロイキン受容体であることを特徴とする、請求項１に 記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 ３．第二の外来性ＤＮＡ配列を更に具備した、請求項１に記載の組換え型シチ メンチョウ・ヘルペスウイルス。 ４．前記の外来性ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードしていることを特徴と する、請求項３に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 ５．前記のポリペプチドが、抗原性であることを特徴とする、請求項４に記載 の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 ６．前記のポリペプチドが大腸菌（E.coli）のベータガラクトシダーゼである ことを特徴とする、請求項４に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイル ス。 ７．S-HVT-144と命名されている、請求項２に記載の組換え型シチメンチョウ ・ヘルペスウイルス。 ８．抗原性ポリペプチドをコードする、前記の外来性ＤＮＡ配列が、US2遺伝 子内のユニークなStuI部位を具備するシチメンチョウ・ヘルペスウイルスの挿入 領域へ挿入されていることを特徴とする、請求項５に記載の組換え型シチメンチ ョウ・ヘルペスウイルス。 ９．前記のＤＮＡ配列が、以下のものよりなる群から選択される抗原性ポリペ プチドを具備することを特徴とする、請求項８に記載の組換え型シチメンチョウ ・ヘルペスウイルス：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性 喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性粘液嚢病ウイルス。 １０．前記の外来性ＤＮＡ配列が、マレック病ウイルスの糖タンパク質A、マ レック病ウイルスの糖タンパク質B、またはマレック病ウイルスの糖タンパク質D をコードすることを特徴とする、請求項９に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルス。 １１．前記の外来性ＤＮＡ配列が、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク 質、またはニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼをコード することを特徴とする、請求項９に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウ イルス。 １２．前記の外来性ＤＮＡ配列が、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質 B、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質I、または伝染性喉頭気管炎ウイル スの糖タンパク質Dをコードすることを特徴とする、請求項９に記載の組換え型 シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 １３．前記の外来性ＤＮＡ配列が、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパ ク質、または伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質をコードするこ とを特徴とする、請求項９に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス 。 １４．前記の外来性ＤＮＡ配列が、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP2、伝染性粘 液嚢病ウイルスのVP３、または伝染性粘液嚢病ウイルスのVP４をコードすること を特徴とする、請求項９に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 １５．前記のサイトカインが、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモータの制 御下にあることを特徴とする、請求項１に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘル ペスウイルス。 １６．前記のサイトカインが、異種の上流プロモータ制御下にあることを特徴 とする、請求項１５に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 １７．前記のプロモータが、PRV gX、HSV-1アルファ４、HCMV極初期、MDV gA 、MDV gB、MDV gD、ILT gB、BHV-1.1 VP8、及びILT gDの中から選択されること を特徴とする、請求項１５に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス 。 １８．以下の(a)〜(c)を必須的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備した、シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムの中に、サイトカインをコードする外来性 ＤＮＡ配列を挿入することによって、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイル スを産生させるための相同性ベクタ： (a)通常はシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノム内には存在しない外来 性の二本鎖ＤＮＡ； (b)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI＃９断 片の一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記外来 性ＤＮＡの一方の末端に存在するシチメンチョウ・ヘルペスウイルス２本鎖ＤＮ Ａ； (c)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI＃９断 片のもう一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記 外来性ＤＮＡのもう一方の末端に存在する、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス ２本鎖ＤＮＡ。 １９．前記のサイトカインが、ニワトリの骨髄単球性成長因子（cMGF）、ニワ トリのインターフェロン（cIFN）、インターロイキン-2、インターロイキン-6、 インターロイキン-12、インターフェロン群、顆粒球・マクロファージコロニー 刺激性因子、またはインターロイキン受容体であることを特徴とする、請求項１ ８に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。 ２０．抗原性ポリペプチドをコードする第二の外来性ＤＮＡ配列を更に具備し た、請求項１８に記載の相同性ベクタ。 ２１．前記の抗原性ポリペプチドが、必須的に以下のものよりなる群から選択 されることを特徴とする、請求項２０に記載の相同性ベクタ：マレック病ウイル ス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウ イルス、伝染性粘液嚢病ウイルス。 ２２．前記の抗原性ポリペプチドが、必須的に以下のものよりなる群から選択 されることを特徴とする、請求項２０に記載の相同性ベクタ：マレック病ウイル スの糖タンパク質A、マレック病ウイルスの糖タンパク質B、マレック病ウイルス の糖タンパク質D、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質、ニュー カッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭気管炎ウイル スの糖タンパク質B、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質I、伝染性喉頭気 管炎ウイルスの糖タンパク質D、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質 、伝染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパク質、伝染性粘液嚢病ウイルス のVP2、伝染性粘液嚢病ウイルスのVP3、及び伝染性粘液嚢病ウイルスのVP4。 ２３．前記の外来性ＤＮＡ配列が、スクリーニング可能な標識をコードするこ とを特徴とする、請求項２０に記載の相同性ベクタ。 ２４．前記のスクリーニング可能な標識が、大腸菌（E.coli）のベータガラク トシダーゼ、または大腸菌（E.coli）のベータグルクロニダーゼであることを特 徴とする、請求項２３に記載の相同性ベクタ。 ２５．７５１−８７.A８と命名されている、請求項１８に記載の相同性ベクタ 。 ２６．７６１−０７.A１と命名されている、請求項１８に記載の相同性ベクタ 。 ２７．トリをマレック病ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチンであ って、請求項１０に記載の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペス ウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。 ２８．トリをニューカッスル病ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチ ンであって、請求項１１に記載の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。 ２９．トリを伝染性喉頭気管炎ウイルスに対して免疫にするのに有益なワクチ ンであって、請求項１２に記載の効果的な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘ ルペスウイルス、及び適切な担体を具備したワクチン。 ３０．トリをマレック病ウイルス、及びニューカッスル病ウイルスに対して免 疫にするのに有益な多価ワクチンであって、請求項１１に記載の効果的な免疫量 の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを具備したワクチン。 ３１．トリをマレック病ウイルスに対して免疫するための方法であって、請求 項２７に記載の、効果的な投薬量のワクチンをトリに投与することを具備した方 法。 ３２．請求項１に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染し た宿主細胞。 ３３．前記の宿主細胞がトリの細胞であることを特徴とする、請求項３２に記 載の宿主細胞。 ３４．シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領 域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。 ３５．前記の外来性ＤＮＡ配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノ ムのEcoRI＃９断片中へ挿入されていて、またシチメンチョウ・ヘルペスウイル スに感染した宿主細胞内で発現することが可能であることを特徴とする、請求項 ３４に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組 換え体キメラ。 ３６．前記の外来性ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードすることを特徴とす る、請求項３５に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイ ルスとの組換え体キメラ。 ３７．前記の外来性ＤＮＡ配列がサイトカインをコードすることを特徴とする 、請求項３６に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイル スとの組換え体キメラ。 ３８．前記のサイトカインがニワトリ骨髄単球性成長因子（cMGF）、またはニ ワトリのインターフェロン（cIFN）であることを特徴とする、請求項３７に記載 の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメ ラ。 ３９．抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを更に具備した、請求項 ３８に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組 換え体キメラであって、該抗原性ポリペプチドが、マレック病ウイルス、ニュー カッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及 び伝染性粘液嚢病ウイルスからなる群より選択される、上記のキメラ。 ４０．S-HVT-145と命名されている、請求項３９に記載の組換え型シチメンチ ョウ・ヘルペスウイルス。