JPH0151782B2 - - Google Patents
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- JPH0151782B2 JPH0151782B2 JP56133441A JP13344181A JPH0151782B2 JP H0151782 B2 JPH0151782 B2 JP H0151782B2 JP 56133441 A JP56133441 A JP 56133441A JP 13344181 A JP13344181 A JP 13344181A JP H0151782 B2 JPH0151782 B2 JP H0151782B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
本発明は、生物試料例えばヒト血清の濁りを効
果的に透明化する方法およびその方法に使う試薬
に関する。さらにくわしく言うと本発明は、界面
活性剤と酵素とからなる試薬および濁り除去剤と
してのその試薬の使用方法に関する。 生成試料の濁りは重大な問題をひきおこす。濁
りのために読み取れなかつたり、読みが不正確に
なつたりし、そのため非常に疑わしい定量結果が
出る。 血清および血しよう試料の濁りは、臨床上の光
学的分析において常に重大な問題であり、誤つた
データを生み、血清成分の光学的定量をしばしば
誤らせる。濁りの主な原因は、全コレステロール
量が増加しているかまたはしていない、高りポタ
ンパク質症（hyperlipoproteinemia）の患者の血
清中のトリグリセリドの増加であると思われる。
血清中のコレステロールの異常な増加は、非常に
危検なアルテロスクレロシス（artherosclerosis）
と互いに関連があることがわかつている。医師が
高リポタンパク質症の患者を診断し、心臓疾患を
予想する際にはコレステロールおよびトリグリセ
リドの正確な値が役立つため、これらの定量は重
要である。他の試験例えばアスパラギン酸アミノ
基転移酵素（GOT）、アラニンアミノ基転移酵素
（GPT）および乳酸化脱水素酵素（LDH）等に
ついての試験においても、濁つた試料を試験する
場合は、前記のようなコレステロールまたはトリ
グリセリドの定量における問題と同じ難点があ
る。 高濃度の界面活性剤例えばポリオキシエチレン
化されたラウリン酸で試料を処理することによ
り、濁つた血清の臨床試験が行なわれている（米
国特許第3853465号および4184848号）。そこでは
界面活性剤だけを使うため、効果的に透明化るに
はかなり高濃度の界面活性剤が必要である。高濃
度の界面活性剤は他の化学物質または酵素の反応
と相互作用し、分析を複雑にする。 本発明で使う界面活性剤は比較的低濃度であ
る。これは透明化用試薬に加える酵素（コレステ
ロール・エステラーゼまたはリパーゼ）の作用に
よる。 本発明による透明化の正確な機構たまだ知られ
ていない。しかし患者が高リポタンパク質症の場
合は、血清試料中の濁りはトリグリセリド含量の
増加が主な原因であることが推測できる。トリグ
リセリドは水不溶性であり、通常はリポタンパク
質複合体の中でコレステロールエステルと一緒に
脂肪核の内部に埋まつている。脂質含有試料の透
明化は、まず界面活性剤例えばラウリン酸ジエタ
ノールアミド（DEA）によつてリポタンパク質
を粉砕し、次に酵素塩基によつてトリグリセリド
を加水分解して行なわれる。界面活性剤は、放出
される脂肪酸を溶解する役目を持つ。酵素がなけ
れば透明にならない。 本発明の目的は、生物試料中の濁りを透明にす
る効果のある試薬およびそれによる透明化の方法
を提供することであり、とりわけ、特定の成分、
例えばコレステロールについて光学的に検定また
は分析する場合の試料を対象とする。 本発明は、式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘおよびｙはそれぞれ１
である） で表わされる界面活性剤、およびコレステロール
エステラーゼまたはリパーゼまたはそれらの混合
物から成る群から選んだ酵素から成る。生物試料
の濁りを透明にする効果のある試薬を要旨とす
る。 水性緩衝液の形の前記試薬は、全試薬組成物に
対して、界面活性剤約0.05〜約2.5ｇ／dlおよび
酵素（コレステロールエステラーゼ）好ましくは
0.1〜約0.5ｇ／dlそして少なくとも約0.025U／ml
から成るのが好ましい。得られる組成物のPH値は
約5.5〜約7.0の範囲である。 組成物が酵素としてリパーゼを含む場合は、得
られる全試薬組成物に対して界面活性剤約0.05〜
約2.5ｇ／dl、好ましくは0.1〜約0.5ｇ／dlおよび
リパーゼ少なくとも約1.0U／mlから成り、組成
物のPH値は約5.5〜約8.0の範囲である。 組成物に含まれる酵素が前記のいずれの場合
も、使える緩衝剤は、マレイン酸のナトリウム塩
またはカリウム塩、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、コハク酸塩、イミダゾール酢酸塩の緩衝
剤、トリス等である。その他でも適当な緩衝剤を
使える。そのような緩衝剤とは、組成物のいずれ
の成分とも相互作用することなく所望の一定のPH
値に保つことができるものである。 マレイン酸塩、例えばカリウムまたはナトリウ
ム塩の緩衝剤を使う場合は、約0.05〜約0.5Mで、
得られる組成物のPH値が約5.0〜約7.0になる量で
加える。 他の緩衝剤についても同様な濃度で使う。 前記の酵素組成物には、前記の成分の他に溶解
促進剤を加えることもできる。そのような溶解促
進剤とは、界面活性剤の可溶化を助ける材料であ
る。例えば胆じゆう酸塩例えばコラン酸ナトリウ
ム、デオキシコラン酸ナトリウム等がとりわけ有
効である。 別の好ましい例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基である前記の式で表わされるもの例え
ばラウリン酸ジエタノールアミドまたはオレイン
酸ジエタノールアミドである。 酵素は動物例えば膵臓または微生物を起源とす
る。 本発明による処理法に適する試料には、ヒト血
清および血しようを含む。 前記の試薬を生物試料と組み合わせると濁りが
効果的に透明になる。試薬は通常水性緩衝溶液の
形である。 式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘとｙとは、それらの合
計が11以下の整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種、および
コレステロールエステラーゼまたはリパーゼまた
はそれらの混合物から選んだ酵素から成り、光学
的に検定または分析する生物試料の濁りを透明に
する効果のある試薬も、本発明の範囲内である。 好ましい試薬は、界面活性剤が前記の式におい
てＲがアルキル基好ましくはラウリル基でありｘ
とｙとの合計が５である化合物であり、酵素がリ
パーゼであるものである。この試薬組成物は、好
ましくはポリエチレングリコール−ｐ−イソオク
チルフエニルエーテルまたは他の適当な界面活性
剤を含む。 PH２〜10で濁つた試料を透明にする効果がある
好ましい試薬としてはさらに、２種の界面活性剤
混合物、すなわちラウリン酸ジエタノールアミド
（ｘ＝ｙ＝１）とエポキシ化されたラウリン酸
（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含むものがある。 前記の酵素組成物は、前記の界面活性剤を使つ
て調製する。 前記の組成物中に含まれる適当な界面活性剤と
しては、ラウリン酸ジエタノールアミド、ミリス
チン酸ジエタノールアミド、カプリン酸ジエタノ
ールアミド、オレイン酸ジエタノールアミドおよ
びココヤシ酸ジエタノールアミドである。 本発明の試薬を生物試料と組み合わせると、試
料の濁りを効果的に透明化することができ、試料
の正確な光学的検定または分析ができる。コレス
テロールについて光学的分析を行なう試料は、こ
のようにして有利に処理される。 本発明はまず第一に、特性の界面活性剤と酵素
を使つて生物試料の濁りを効果的に透明にする方
法、およびそのための試薬を対象とする。ここ
で、界面活性剤は式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘとｙとはそれぞれ１で
ある） で表わされる。好ましくは、Ｒがアルキル基であ
る、例えばラウリン酸ジエタノールアミドであ
る。 酵素成分は、コレステロールエステラーゼまた
はリパーゼまたはそれらの混合物である。 得られる組成物は驚くべきことに、生物試料の
濁りを透明にするのに非常に有効であることがわ
かつた。従つて、濁つた生物試料を透明な試料に
変えるのに非常に役立つ。 界面活性剤と酵素との相互作用と、検定用試薬
の作用との間で、抑制や妨害が起きないならば、
前記の本発明の組成物で処理した試料は、どのよ
うな特定の成分についても、比色検定または分析
を行なえる。 前記試薬を利用して行なうことのできる典型的
な検定の例としては、コレステロール、トリグリ
セリドおよびクレアチンホスフエートキナーゼの
定量である。 酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。 本発明は第二番目に、光学的検定を行なう濁つ
た生物試料を効果的に透明にする方法およびその
ための試薬を対象とする。この試薬は、前記第一
の界面活性剤より広い定義を持つ式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個を持つアルキル基
またはアルケニル基であり、ｘとｙとは、それら
の合計が11以下である整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種と、コレ
ステロールエステラーゼまたはリパーゼまたはそ
れらの混合物から選んだ酵素とを含む。 好ましい具体例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
前記の式で表わされる。例としては、ラウリン酸
ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノール
アミドおよびカプリン酸ジエタノールアミドであ
る。好ましい界面活性剤としてはさらに、Ｒがア
ルケニル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
もの、例えばオレイン酸ジエタノールアミドおよ
びココヤシ酸ジエタノーあアミドも挙げられる。
さらに別の好ましい例としては、Ｒがアルキル基
であり、ｘとｙとの合計が５である界面活性剤も
挙げられる。 酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。 前記の試薬を検定に使う際には、水性緩衝溶液
の形にして生物液体と組み合わせる。濁つていた
試料は透明になり、検定することができる。 効果的に透明化され、検定に供される試料には
ヒト血清および血しようが挙げられる。 本発明による方法と試薬は、少なくとも２つの
点で独特である。濁りによる妨害なしに、透明、
澄明な状態での生物試料中の成分定量を可能にし
たこと、および使用する特性の界面活性剤と酵素
との相互作用によつて、従来のコレステロール定
量で使われていた量より少量の酵素で十分となつ
たことである。 生体液のコレステロールの臨床検査で最も一般
的なのは、遊離のコレステロールとコレステロー
ルエステルとの合わせた全コレステロールの定量
である。コレステロールもそのエステルも、血清
の中でリポタンパク質と呼ばれる低分子複合体中
に他の脂質および種類のタンパク質と一緒になつ
て存在し、全コレステロールのうちではコレステ
ロールエステルが通常は成分（60〜80％）であ
る。コレステロールは一般的に水不溶性であり、
通常は複合体内部に埋まつていて酵素は近づけな
い。全コレステロールの定量を全体として酵素を
使つて行なう場合は、自動化された方法でも手動
による方法でも、まず適当な界面活性剤によつて
コレステロールもコレステロールエステルもとも
に複合体から遊離しなければならない。次にコレ
ステロールエステルはコレステロールエステラー
ゼによつて加水分解して遊離コレステロールと
し、これをさらにコレステロールオキシダーゼに
よつて酸化してコレステノンと過酸化水素とを得
る。 本発明による方法は、自動分析器を使つた自動
化方法に使うことができ、また手動で行なうこと
もできる。 本発明の方法による検定に使う組成物の調製に
おいては、界面活性剤と酵素の他に、当分野で公
知であつてそのような目的に使われる他の補助成
分をも含む、水性溶液を作る。 たとえば、コレステロール検定においては次に
示す成分を使い、その量は以下のようである。 成 分 コレステロール検定 パオキシダーゼ 0.8〜2.0U／ コレステロールオキシダーゼ 0.025〜0.3U／ml コレステロールエステラーゼ 0.025〜0.3U／ml 界面活性剤 0.05〜0.5ｇ／dl コラン酸ナトリウム 0.05〜0.5ｇ／dl ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム
2.5〜６ｇ／dl ４−アミノアンチピリン 0.5〜2.0ｍＭ マレイン酸 0.1〜0.5M PH 5.5〜7.0 試料／試薬比 10.0〜400 前記の組成物においては、動物起源、例えば膵
臓を起源とするコレステロールエステラーゼを使
うのが好ましいが、微生物を起源とするコレステ
ロールエステラーゼを使つても同様の結果を得
る。 例 １ コレステロールエステラーゼの作用としての透
明化 マレイン酸カリウム（0.1M）、コラン酸ナトリ
ウム（0.25ｇ／dl）、ラウリン酸ジエタノールア
ミド（0.2ｇ／dl）、コレステロールエステラーゼ
（0.08〜0.8U／ml）を含み、最終的なPHが6.4であ
る透明化用試薬３mlを脂肪含有血清（トリグリセ
リド含量約1400mg／dl）0.025mlと混合する。45
℃で10分以内に、反応混合物は透明になる。透明
化のためのコレステロールエステラーゼは膵臓か
ら、または微生物から得たものでよい。 例 ２ コレステロール検定への使用 本実施例に説明するように、検定の終点を決め
るために、コレステロール検定用成分を透明化試
薬に含有させる。 コレステロールエステラーゼ（0.125U／ml）、
コレステロールオキシダーゼ（0.125U／ml）、パ
ーオキシダーゼ（1.6U／ml）、４−アミノアンチ
ピリン（0.6ｍＭ）、ヒドロキシ安息香酸ナトリウ
ム（25ｍＭ）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／
dl）、ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇ／
dl）およびマレイン酸カリウム（0.1M）を含み、
PH6.0の組成物３ml。この試薬全部を脂質含有血
清試料0.025mlと混合する。次にこの混合物を45
℃で４〜５分間インキユーベートした後、520nm
で色濃度の測定をして全コレステロールを定量す
る。ラウリン酸ジエタノールアミドとコレステロ
ールエステラーゼの透明化作用がないと、濁つた
試料中でのコレステロールの定量結果は常に誤つ
たものになる。 例 ３ カンジダリパーゼ（カンジダ・シリドラシア
cylindracea）による透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇへ／
dl）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／dl）および
リパーゼ（25U／ml）およびマレイン酸塩緩衝剤
（0.1M）を含む、PH6.0の透明化試薬３mlを、脂
質含有血清0.025mlと混合する。45℃で５分間イ
ンキユーベートすると、濁つた試料が透明にな
る。 ラウリン酸ジエタノールアミドとエポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含む
透明化試薬を、前記と同量使用しても、同様の透
明化効果を得る。 例 ４ 式 （式中、ｘとｙとの合計は５である） で表わされる界面活性剤（0.2ｇ／dl）、TritonX
−100（0.4ｇ／dl）、マレイン酸カリウム（0.2M）
およびリパーゼ（25U／ml）を含むPH6.0の透明
化試薬３mlを、脂質含有試料0.05mlと混合し、45
℃でインキユベートする。３分後には、濁つてい
た試料が透明になる。緩衝剤の濃度を高めると、
透明化の速度が増す。 Triton Ｘ−100の添加なしに、エポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）をさらに高濃度で
使うと、同様の結果を得る。 例 ５ Ａ 組成 次の成分を使つて診断用試薬組成物を１の
水溶液として調製する。 成 分 濃度 リンゴ酸 11.6ｇ KOH 10.0ｇ EDTA（K2） 2.7ｍＭ コラン酸ナトリウム 5.8ｍＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム 25.0ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.6ｍＭ ラウリン酸ジエタノールアミド 2.0ｇ コレステロールエステラーゼ 125ユニツト コレステロールオキシダーゼ 125ユニツト セイミウワサビ・パーオキシダーゼ
800ユニツト PHは6.0に調節する。 この試薬組成物は、水溶液の形で保存および
使用することができ、またその溶液は通常の方
法で凍結乾燥し、使用時に水で再生させること
もできる。 Ｂ 検定−全コレステロールの定量 前記の試薬３mlと、血清または再生させたコ
レステロール含量500mg／dlまでの血清標準試
料0.025mlとを混合する。45℃で４〜５分間反
応させる。試薬をブランクとし、525nｍにお
ける試料の吸光度を測定する。 例 ６ 脂質含有血清のクレアチンホスフエートキナー
ゼ（CPK）活性の定量における透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.4％）、膵臓
を起源とするコレステロールエステラーゼ
（25U／dl）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ％）お
よびチオールグリセロール（20ｍＭ）を含む。PH
6.7のイミダゾール−酢酸緩衝溶液（0.1M）２ml
を脂質含有血清0.05mlと混合する。37℃で15分間
インキユベートすると、340nｍにおける濁度は
2.3O.D.から0.02O.D.に低下する。透明になつた
試料を次にCPK試薬１mlと混合する。この試薬
は、クレアチンホスフエート（116.7ｍＭ）、
ADP（6.7ｍＭ）、AMP（16.7ｍＭ）、EDTA（6.7ｍ
Ｍ）、NADP（6.7ｍＭ）、ヘキソキナーゼ
（125U／dl）、グリコース−６−ホスフエートデ
ヒドロゲナーゼ（G6PDH）（100U／dl）を含み、
PH6.7の0.1Mイミダゾール−酢酸緩衝液として調
製したものである。通常の方法で、340nｍ、37
℃におけるCPK活性を測定する。 当業者には明らかなように、前記特許請求の範
囲に規定され本明細書に記載された本発明の意図
と範囲から逸脱することなく、本発明には変化変
形が可能であり、それらもすべて本発明の範囲内
に含まれるものである。
果的に透明化する方法およびその方法に使う試薬
に関する。さらにくわしく言うと本発明は、界面
活性剤と酵素とからなる試薬および濁り除去剤と
してのその試薬の使用方法に関する。 生成試料の濁りは重大な問題をひきおこす。濁
りのために読み取れなかつたり、読みが不正確に
なつたりし、そのため非常に疑わしい定量結果が
出る。 血清および血しよう試料の濁りは、臨床上の光
学的分析において常に重大な問題であり、誤つた
データを生み、血清成分の光学的定量をしばしば
誤らせる。濁りの主な原因は、全コレステロール
量が増加しているかまたはしていない、高りポタ
ンパク質症（hyperlipoproteinemia）の患者の血
清中のトリグリセリドの増加であると思われる。
血清中のコレステロールの異常な増加は、非常に
危検なアルテロスクレロシス（artherosclerosis）
と互いに関連があることがわかつている。医師が
高リポタンパク質症の患者を診断し、心臓疾患を
予想する際にはコレステロールおよびトリグリセ
リドの正確な値が役立つため、これらの定量は重
要である。他の試験例えばアスパラギン酸アミノ
基転移酵素（GOT）、アラニンアミノ基転移酵素
（GPT）および乳酸化脱水素酵素（LDH）等に
ついての試験においても、濁つた試料を試験する
場合は、前記のようなコレステロールまたはトリ
グリセリドの定量における問題と同じ難点があ
る。 高濃度の界面活性剤例えばポリオキシエチレン
化されたラウリン酸で試料を処理することによ
り、濁つた血清の臨床試験が行なわれている（米
国特許第3853465号および4184848号）。そこでは
界面活性剤だけを使うため、効果的に透明化るに
はかなり高濃度の界面活性剤が必要である。高濃
度の界面活性剤は他の化学物質または酵素の反応
と相互作用し、分析を複雑にする。 本発明で使う界面活性剤は比較的低濃度であ
る。これは透明化用試薬に加える酵素（コレステ
ロール・エステラーゼまたはリパーゼ）の作用に
よる。 本発明による透明化の正確な機構たまだ知られ
ていない。しかし患者が高リポタンパク質症の場
合は、血清試料中の濁りはトリグリセリド含量の
増加が主な原因であることが推測できる。トリグ
リセリドは水不溶性であり、通常はリポタンパク
質複合体の中でコレステロールエステルと一緒に
脂肪核の内部に埋まつている。脂質含有試料の透
明化は、まず界面活性剤例えばラウリン酸ジエタ
ノールアミド（DEA）によつてリポタンパク質
を粉砕し、次に酵素塩基によつてトリグリセリド
を加水分解して行なわれる。界面活性剤は、放出
される脂肪酸を溶解する役目を持つ。酵素がなけ
れば透明にならない。 本発明の目的は、生物試料中の濁りを透明にす
る効果のある試薬およびそれによる透明化の方法
を提供することであり、とりわけ、特定の成分、
例えばコレステロールについて光学的に検定また
は分析する場合の試料を対象とする。 本発明は、式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘおよびｙはそれぞれ１
である） で表わされる界面活性剤、およびコレステロール
エステラーゼまたはリパーゼまたはそれらの混合
物から成る群から選んだ酵素から成る。生物試料
の濁りを透明にする効果のある試薬を要旨とす
る。 水性緩衝液の形の前記試薬は、全試薬組成物に
対して、界面活性剤約0.05〜約2.5ｇ／dlおよび
酵素（コレステロールエステラーゼ）好ましくは
0.1〜約0.5ｇ／dlそして少なくとも約0.025U／ml
から成るのが好ましい。得られる組成物のPH値は
約5.5〜約7.0の範囲である。 組成物が酵素としてリパーゼを含む場合は、得
られる全試薬組成物に対して界面活性剤約0.05〜
約2.5ｇ／dl、好ましくは0.1〜約0.5ｇ／dlおよび
リパーゼ少なくとも約1.0U／mlから成り、組成
物のPH値は約5.5〜約8.0の範囲である。 組成物に含まれる酵素が前記のいずれの場合
も、使える緩衝剤は、マレイン酸のナトリウム塩
またはカリウム塩、リン酸塩、ホウ酸塩、クエン
酸塩、コハク酸塩、イミダゾール酢酸塩の緩衝
剤、トリス等である。その他でも適当な緩衝剤を
使える。そのような緩衝剤とは、組成物のいずれ
の成分とも相互作用することなく所望の一定のPH
値に保つことができるものである。 マレイン酸塩、例えばカリウムまたはナトリウ
ム塩の緩衝剤を使う場合は、約0.05〜約0.5Mで、
得られる組成物のPH値が約5.0〜約7.0になる量で
加える。 他の緩衝剤についても同様な濃度で使う。 前記の酵素組成物には、前記の成分の他に溶解
促進剤を加えることもできる。そのような溶解促
進剤とは、界面活性剤の可溶化を助ける材料であ
る。例えば胆じゆう酸塩例えばコラン酸ナトリウ
ム、デオキシコラン酸ナトリウム等がとりわけ有
効である。 別の好ましい例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基である前記の式で表わされるもの例え
ばラウリン酸ジエタノールアミドまたはオレイン
酸ジエタノールアミドである。 酵素は動物例えば膵臓または微生物を起源とす
る。 本発明による処理法に適する試料には、ヒト血
清および血しようを含む。 前記の試薬を生物試料と組み合わせると濁りが
効果的に透明になる。試薬は通常水性緩衝溶液の
形である。 式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘとｙとは、それらの合
計が11以下の整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種、および
コレステロールエステラーゼまたはリパーゼまた
はそれらの混合物から選んだ酵素から成り、光学
的に検定または分析する生物試料の濁りを透明に
する効果のある試薬も、本発明の範囲内である。 好ましい試薬は、界面活性剤が前記の式におい
てＲがアルキル基好ましくはラウリル基でありｘ
とｙとの合計が５である化合物であり、酵素がリ
パーゼであるものである。この試薬組成物は、好
ましくはポリエチレングリコール−ｐ−イソオク
チルフエニルエーテルまたは他の適当な界面活性
剤を含む。 PH２〜10で濁つた試料を透明にする効果がある
好ましい試薬としてはさらに、２種の界面活性剤
混合物、すなわちラウリン酸ジエタノールアミド
（ｘ＝ｙ＝１）とエポキシ化されたラウリン酸
（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含むものがある。 前記の酵素組成物は、前記の界面活性剤を使つ
て調製する。 前記の組成物中に含まれる適当な界面活性剤と
しては、ラウリン酸ジエタノールアミド、ミリス
チン酸ジエタノールアミド、カプリン酸ジエタノ
ールアミド、オレイン酸ジエタノールアミドおよ
びココヤシ酸ジエタノールアミドである。 本発明の試薬を生物試料と組み合わせると、試
料の濁りを効果的に透明化することができ、試料
の正確な光学的検定または分析ができる。コレス
テロールについて光学的分析を行なう試料は、こ
のようにして有利に処理される。 本発明はまず第一に、特性の界面活性剤と酵素
を使つて生物試料の濁りを効果的に透明にする方
法、およびそのための試薬を対象とする。ここ
で、界面活性剤は式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個のアルキル基また
はアルケニル基であり、ｘとｙとはそれぞれ１で
ある） で表わされる。好ましくは、Ｒがアルキル基であ
る、例えばラウリン酸ジエタノールアミドであ
る。 酵素成分は、コレステロールエステラーゼまた
はリパーゼまたはそれらの混合物である。 得られる組成物は驚くべきことに、生物試料の
濁りを透明にするのに非常に有効であることがわ
かつた。従つて、濁つた生物試料を透明な試料に
変えるのに非常に役立つ。 界面活性剤と酵素との相互作用と、検定用試薬
の作用との間で、抑制や妨害が起きないならば、
前記の本発明の組成物で処理した試料は、どのよ
うな特定の成分についても、比色検定または分析
を行なえる。 前記試薬を利用して行なうことのできる典型的
な検定の例としては、コレステロール、トリグリ
セリドおよびクレアチンホスフエートキナーゼの
定量である。 酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。 本発明は第二番目に、光学的検定を行なう濁つ
た生物試料を効果的に透明にする方法およびその
ための試薬を対象とする。この試薬は、前記第一
の界面活性剤より広い定義を持つ式 （式中、Ｒは炭素原子５〜17個を持つアルキル基
またはアルケニル基であり、ｘとｙとは、それら
の合計が11以下である整数である） で表わされる界面活性剤少なくとも１種と、コレ
ステロールエステラーゼまたはリパーゼまたはそ
れらの混合物から選んだ酵素とを含む。 好ましい具体例においては、界面活性剤はＲが
アルキル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
前記の式で表わされる。例としては、ラウリン酸
ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノール
アミドおよびカプリン酸ジエタノールアミドであ
る。好ましい界面活性剤としてはさらに、Ｒがア
ルケニル基であり、ｘとｙとがそれぞれ１である
もの、例えばオレイン酸ジエタノールアミドおよ
びココヤシ酸ジエタノーあアミドも挙げられる。
さらに別の好ましい例としては、Ｒがアルキル基
であり、ｘとｙとの合計が５である界面活性剤も
挙げられる。 酵素成分は動物を起源として、例えば膵臓か
ら、または微生物を起源として誘導したものであ
る。 前記の試薬を検定に使う際には、水性緩衝溶液
の形にして生物液体と組み合わせる。濁つていた
試料は透明になり、検定することができる。 効果的に透明化され、検定に供される試料には
ヒト血清および血しようが挙げられる。 本発明による方法と試薬は、少なくとも２つの
点で独特である。濁りによる妨害なしに、透明、
澄明な状態での生物試料中の成分定量を可能にし
たこと、および使用する特性の界面活性剤と酵素
との相互作用によつて、従来のコレステロール定
量で使われていた量より少量の酵素で十分となつ
たことである。 生体液のコレステロールの臨床検査で最も一般
的なのは、遊離のコレステロールとコレステロー
ルエステルとの合わせた全コレステロールの定量
である。コレステロールもそのエステルも、血清
の中でリポタンパク質と呼ばれる低分子複合体中
に他の脂質および種類のタンパク質と一緒になつ
て存在し、全コレステロールのうちではコレステ
ロールエステルが通常は成分（60〜80％）であ
る。コレステロールは一般的に水不溶性であり、
通常は複合体内部に埋まつていて酵素は近づけな
い。全コレステロールの定量を全体として酵素を
使つて行なう場合は、自動化された方法でも手動
による方法でも、まず適当な界面活性剤によつて
コレステロールもコレステロールエステルもとも
に複合体から遊離しなければならない。次にコレ
ステロールエステルはコレステロールエステラー
ゼによつて加水分解して遊離コレステロールと
し、これをさらにコレステロールオキシダーゼに
よつて酸化してコレステノンと過酸化水素とを得
る。 本発明による方法は、自動分析器を使つた自動
化方法に使うことができ、また手動で行なうこと
もできる。 本発明の方法による検定に使う組成物の調製に
おいては、界面活性剤と酵素の他に、当分野で公
知であつてそのような目的に使われる他の補助成
分をも含む、水性溶液を作る。 たとえば、コレステロール検定においては次に
示す成分を使い、その量は以下のようである。 成 分 コレステロール検定 パオキシダーゼ 0.8〜2.0U／ コレステロールオキシダーゼ 0.025〜0.3U／ml コレステロールエステラーゼ 0.025〜0.3U／ml 界面活性剤 0.05〜0.5ｇ／dl コラン酸ナトリウム 0.05〜0.5ｇ／dl ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム
2.5〜６ｇ／dl ４−アミノアンチピリン 0.5〜2.0ｍＭ マレイン酸 0.1〜0.5M PH 5.5〜7.0 試料／試薬比 10.0〜400 前記の組成物においては、動物起源、例えば膵
臓を起源とするコレステロールエステラーゼを使
うのが好ましいが、微生物を起源とするコレステ
ロールエステラーゼを使つても同様の結果を得
る。 例 １ コレステロールエステラーゼの作用としての透
明化 マレイン酸カリウム（0.1M）、コラン酸ナトリ
ウム（0.25ｇ／dl）、ラウリン酸ジエタノールア
ミド（0.2ｇ／dl）、コレステロールエステラーゼ
（0.08〜0.8U／ml）を含み、最終的なPHが6.4であ
る透明化用試薬３mlを脂肪含有血清（トリグリセ
リド含量約1400mg／dl）0.025mlと混合する。45
℃で10分以内に、反応混合物は透明になる。透明
化のためのコレステロールエステラーゼは膵臓か
ら、または微生物から得たものでよい。 例 ２ コレステロール検定への使用 本実施例に説明するように、検定の終点を決め
るために、コレステロール検定用成分を透明化試
薬に含有させる。 コレステロールエステラーゼ（0.125U／ml）、
コレステロールオキシダーゼ（0.125U／ml）、パ
ーオキシダーゼ（1.6U／ml）、４−アミノアンチ
ピリン（0.6ｍＭ）、ヒドロキシ安息香酸ナトリウ
ム（25ｍＭ）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／
dl）、ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇ／
dl）およびマレイン酸カリウム（0.1M）を含み、
PH6.0の組成物３ml。この試薬全部を脂質含有血
清試料0.025mlと混合する。次にこの混合物を45
℃で４〜５分間インキユーベートした後、520nm
で色濃度の測定をして全コレステロールを定量す
る。ラウリン酸ジエタノールアミドとコレステロ
ールエステラーゼの透明化作用がないと、濁つた
試料中でのコレステロールの定量結果は常に誤つ
たものになる。 例 ３ カンジダリパーゼ（カンジダ・シリドラシア
cylindracea）による透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.2ｇへ／
dl）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ／dl）および
リパーゼ（25U／ml）およびマレイン酸塩緩衝剤
（0.1M）を含む、PH6.0の透明化試薬３mlを、脂
質含有血清0.025mlと混合する。45℃で５分間イ
ンキユーベートすると、濁つた試料が透明にな
る。 ラウリン酸ジエタノールアミドとエポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）との混合物を含む
透明化試薬を、前記と同量使用しても、同様の透
明化効果を得る。 例 ４ 式 （式中、ｘとｙとの合計は５である） で表わされる界面活性剤（0.2ｇ／dl）、TritonX
−100（0.4ｇ／dl）、マレイン酸カリウム（0.2M）
およびリパーゼ（25U／ml）を含むPH6.0の透明
化試薬３mlを、脂質含有試料0.05mlと混合し、45
℃でインキユベートする。３分後には、濁つてい
た試料が透明になる。緩衝剤の濃度を高めると、
透明化の速度が増す。 Triton Ｘ−100の添加なしに、エポキシ化さ
れたラウリン酸（ｘ＋ｙ＝５）をさらに高濃度で
使うと、同様の結果を得る。 例 ５ Ａ 組成 次の成分を使つて診断用試薬組成物を１の
水溶液として調製する。 成 分 濃度 リンゴ酸 11.6ｇ KOH 10.0ｇ EDTA（K2） 2.7ｍＭ コラン酸ナトリウム 5.8ｍＭ ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム 25.0ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.6ｍＭ ラウリン酸ジエタノールアミド 2.0ｇ コレステロールエステラーゼ 125ユニツト コレステロールオキシダーゼ 125ユニツト セイミウワサビ・パーオキシダーゼ
800ユニツト PHは6.0に調節する。 この試薬組成物は、水溶液の形で保存および
使用することができ、またその溶液は通常の方
法で凍結乾燥し、使用時に水で再生させること
もできる。 Ｂ 検定−全コレステロールの定量 前記の試薬３mlと、血清または再生させたコ
レステロール含量500mg／dlまでの血清標準試
料0.025mlとを混合する。45℃で４〜５分間反
応させる。試薬をブランクとし、525nｍにお
ける試料の吸光度を測定する。 例 ６ 脂質含有血清のクレアチンホスフエートキナー
ゼ（CPK）活性の定量における透明化 ラウリン酸ジエタノールアミド（0.4％）、膵臓
を起源とするコレステロールエステラーゼ
（25U／dl）、コラン酸ナトリウム（0.25ｇ％）お
よびチオールグリセロール（20ｍＭ）を含む。PH
6.7のイミダゾール−酢酸緩衝溶液（0.1M）２ml
を脂質含有血清0.05mlと混合する。37℃で15分間
インキユベートすると、340nｍにおける濁度は
2.3O.D.から0.02O.D.に低下する。透明になつた
試料を次にCPK試薬１mlと混合する。この試薬
は、クレアチンホスフエート（116.7ｍＭ）、
ADP（6.7ｍＭ）、AMP（16.7ｍＭ）、EDTA（6.7ｍ
Ｍ）、NADP（6.7ｍＭ）、ヘキソキナーゼ
（125U／dl）、グリコース−６−ホスフエートデ
ヒドロゲナーゼ（G6PDH）（100U／dl）を含み、
PH6.7の0.1Mイミダゾール−酢酸緩衝液として調
製したものである。通常の方法で、340nｍ、37
℃におけるCPK活性を測定する。 当業者には明らかなように、前記特許請求の範
囲に規定され本明細書に記載された本発明の意図
と範囲から逸脱することなく、本発明には変化変
形が可能であり、それらもすべて本発明の範囲内
に含まれるものである。
１ 多数の血沈測定管を垂直に支持する静止した
測定管支持体と、血沈測定管を挟んで相対し血沈
測定管の測定部全体を照射しうる光源装置とイメ
ージセンサーとからなる赤血球沈降長測定系と、
光源とイメージセンサーとの間に血沈測定管が
次々に介在するように前記測定系を血沈測定管を
横切る方向に沿つてのみ移動させる機構と、各血
沈測定管取付位置における測定管の有無を検知す
る測定管取付け検知機構と、各測定管についての
測定時間を個別に計時する計時機構とを設けてな
り、前記測定管取付け検知機構により血沈測定管
の取付けを確認すると同時に前記計時機構により
該測定管についての計時を開始し、計時開始より
定められた時間毎に前記測定系により該測定管内
の全血液柱面の高さおよび沈降赤血球柱面の高
さ、または沈降赤血球柱面の高さを測定してメモ
リーし、これらの値から赤血球沈降長を演算して
記録することを特徴とする赤血球沈降速度自動測
定装置。 ２ 測定管取付け検知機構が赤血球沈降長測定系
の下部に測定管を挟んで相対するように取付けた
光源および受光器とからなる特許請求の範囲第１
測定管支持体と、血沈測定管を挟んで相対し血沈
測定管の測定部全体を照射しうる光源装置とイメ
ージセンサーとからなる赤血球沈降長測定系と、
光源とイメージセンサーとの間に血沈測定管が
次々に介在するように前記測定系を血沈測定管を
横切る方向に沿つてのみ移動させる機構と、各血
沈測定管取付位置における測定管の有無を検知す
る測定管取付け検知機構と、各測定管についての
測定時間を個別に計時する計時機構とを設けてな
り、前記測定管取付け検知機構により血沈測定管
の取付けを確認すると同時に前記計時機構により
該測定管についての計時を開始し、計時開始より
定められた時間毎に前記測定系により該測定管内
の全血液柱面の高さおよび沈降赤血球柱面の高
さ、または沈降赤血球柱面の高さを測定してメモ
リーし、これらの値から赤血球沈降長を演算して
記録することを特徴とする赤血球沈降速度自動測
定装置。 ２ 測定管取付け検知機構が赤血球沈降長測定系
の下部に測定管を挟んで相対するように取付けた
光源および受光器とからなる特許請求の範囲第１
Claims (1)
- 項１に記載の方法。 ４ 前記式中のｘ＝ｙ＝１である界面活性剤約
0.05〜約2.5ｇ／dlと、酵素としてのコレステロ
ールエステラーゼが少なくとも約0.025U／mlと
を加え、PH約5.5〜約7.0の水性緩衝溶液の形とす
る、前項１に記載の方法。 ５ 界面活性剤を約0.1〜約0.5ｇ／dl加える、前
項４に記載の方法。 ６ 緩衝剤としてマレイン酸塩を約0.05〜約
0.5Mの濃度で加え、PHを約5.0〜約7.0とする、前
項４に記載の方法。 ７ 溶解促進剤を加える、前項４に記載の方法。 ８ 溶解促進剤としてコラン酸ナトリウムまたは
デオキシコラン酸ナトリウムを約0.25ｇ／dl加え
る、前項７に記載の方法。 ９ 前記式中のｘ＝ｙ＝１である界面活性剤約
0.05〜約2.5ｇ／dlと、酵素としてのリパーゼ少
なくとも約1.0U／mlとを加え、PH約5.5〜約8.0の
水性緩衝溶液の形とする、前項１に記載の方法。 １０ 界面活性剤を約0.1〜約0.5ｇ／dl加える、
前項９に記載の方法。 １１ 緩衝剤としてマレイン酸塩を約0.05〜約
0.5Mの濃度で加え、PHを約5.0〜約7.0とする、前
項９に記載の方法。 １３ 溶解促進剤としてコラン酸ナトリウムまた
はデオキシコラン酸ナトリウムを約0.25ｇ／加
える、前項１２に記載の方法。 １４ 界面活性剤として前記式中Ｒがアルキル基
でありそしてｘ＝ｙ＝１であるものを加える、前
項１に記載の方法。 １５ 界面活性剤としてラウリン酸ジエタノール
アミドを加える、前項１４に記載の方法。 １６ 界面活性剤としてミリスチン酸ジエタノー
ルアミドを加える、前項１４に記載の方法。 １７ 界面活性剤としてカプリン酸ジエタノール
アミドを加える、前項１４に記載の方法。 １８ 界面活性剤として前記式中Ｒがアルケニル
基でありそしてｘ＝ｙ＝１であるものを加える、
前項１に記載の方法。 １９ 界面活性剤としてオレイン酸ジエタノール
アミドを加える、前項１８に記載の方法。 ２０ 界面活性剤としてココヤシ酸ジエタノール
アミドを加える、前項１８に記載の方法。 ２１ 酵素として動物または微生物を起源として
誘導されたものを加える、前項１に記載の方法。 ２２ 酵素として動物の膵臓から誘導されたコレ
ステロールエステラーゼを加える、前項２１に記
載の方法。 ２３ 前記式中のｘとｙの合計が５以下である界
面活性剤約0.05〜約2.5ｇ／dlと、酵素としての
コレステロールエステラーゼ少なくとも約
0.025U／mlとを加え、PH約5.5〜約8.0の水性緩衝
溶液の形とする、前項１に記載の方法。 ２４ 緩衝剤としてマレイン酸塩を約0.05〜約
0.5Mの濃度で加え、PHを約5.0〜約7.0とする、前
項２３に記載の方法。 ２５ 前記式中のｘとｙの合計が５以下である界
面活性剤約0.05〜約0.5ｇ／dlと、酵素としての
リパーゼ少なくとも約1.0U／mlとを加え、PH約
2.0〜約10.0の水性緩衝溶液の形とする、前項１
に記載の方法。 ２６ 緩衝剤としてマレイン酸塩、クエン酸塩、
コハク酸塩、Trisまたはホウ酸塩を、約0.05〜約
0.5Mの濃度で加え、PHを約2.0〜約10.0とする、
前項２５に記載の方法。 ２７ 酵素として動物または微生物を起源として
誘導されたものを加える、前項１に記載の方法。 ２８ 酵素として動物の膵臓から誘導したコレス
テロールエステラーゼを加える、前項２７に記載
の方法。 ２９ 界面活性剤として前記式中Ｒがアルキル基
であり、ｘとｙとの合計が５であるものを加えそ
して酵素としてリパーゼを加える、前項１に記載
の方法。 ３０ ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチ
ルフエニルエーテル（Triton Ｘ−100）を加え
る、前項２９に記載の方法。 ３１ 界面活性剤としてラウリン酸ジエタノール
アミドとエポキシ化されたラウリン酸との混合物
（ｘ＋ｙ＝５）約0.05〜約2.0ｇ／dlを加え、PH約
2.0〜約10.0の水性緩衝溶液の形とする、前項１
に記載の方法。
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