JPH0158948B2 - - Google Patents
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- JPH0158948B2 JPH0158948B2 JP61064808A JP6480886A JPH0158948B2 JP H0158948 B2 JPH0158948 B2 JP H0158948B2 JP 61064808 A JP61064808 A JP 61064808A JP 6480886 A JP6480886 A JP 6480886A JP H0158948 B2 JPH0158948 B2 JP H0158948B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は微生物に関する。詳しくはプロテアー
ゼ活性の少ない新規な変異微生物に関する。 （発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を
備え、また食品、医薬品、飼料等の原料として、
人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用な微
生物であり、遺伝子工学における宿主としての開
発が期待されている。 しかし、通常酵母を宿主として遺伝子組換え技
術により異種蛋白質を生産する場合、生産された
蛋白質の一部がプロテアーゼによつて分解されて
実際に発現された蛋白質が変化し、完全な形の目
的物が得られなかつたり、目的物の収量が大幅に
減少することがある。 本発明者等は、酵母サツカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とし
て遺伝子組換え技術により蛋白質を生産する際、
生成蛋白質の分解の少ない宿主を得ることを目的
として研究の結果達成されたものである。 本発明を詳細に説明するに、本発明の変異微生
物サツカロマイセス セレビシエXMF11−44は
微工研菌寄第8600号（FERM Ｐ−8600）とて寄
託されており、例えば下記(1)及び(2)の工程により
調製される (1) サツカロマイセス セレビシエXMF1−４の
調製 まず周知のサツカロマイセス セレビシエ
20B−12（α、pep4−３、trp１）を周知のサツ
カロマイセス セレビシエS144（ａ、met3、
leu2、gal1、gal2）と接合してサツカロマイセ
ス セレビシエXMF1−４（ａ、trp1、pep4−
３）を選択調製する。 即ち、上記20B−12株及びS144株を適当な培
地上で混合して培養し、二倍体（接合体）細胞
のみを選択採取し、これを液体培地を用いて増
殖させ、集菌後、胞子形成培地中で培養する。
生成した分生胞子をマイクロマニピユレーター
を用いて分離し、夫々の胞子の持つ遺伝子型
（接合型、栄養要求性、pep−４変異）を常法
により解析し、目的の遺伝子型を持つXMF1−
４（ａ、trp1、pep4−３）株を取得する。 なお、上記20B−12株及びS144株は何れも、
イースト ゼネテイツク ストツク センター
（YEAST GENETIC STOCK CENTER、略
称YGSC、米国カリフオルニア大学バークレイ
校内）から分譲を受けたもので、夫々同センタ
ー発行のカタログ、第５版（1984年）30頁及び
21頁に記載されている。 (2) サツカロマイセス セレビシエXMF11−44
（α、trp1、pep4−３、his4C、ade、ski5）の
調製 周知のサツカロマイセス セレビシエUK35
（α、ade、his4C、ski5）［Current Genetics7
巻、449〜456頁（1983年）に記載され、同記載
の発表者でああるMcGill Universityの
Professor Howard Bussey氏から入手したも
の］と上記XMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）
と、上記(1)と同様の方法により接合させ、胞子
を分離する。夫々の胞子の持つ遺伝子型の解析
は、接合型（α、ａ）、栄養要求性（trp1、
ade、his4C）、pep−４変異については常法に
より行い、またski5変異（スーパーキラー変
異）については、サツカロマイセス イタリカ
ス（Saccharomyces italicus、）IFO 0253を
二重鎖RNAキラー感受性菌として用い、生育
阻止円の大きさにより検定した。以上の方法に
よりXMF11−44（α、trp1、pep4−３、his4C、
ade、ski5）が得られる。 （発明の効果） 本発明の微生物サツカロマイセス セレビシエ
XMF11−44は、PEP4遺伝子に由来する液胞中
のプロテアーゼを欠失していると共に、SKI5遺
伝子に由来する菌体外のフエニル メチルスルフ
オニルフルオライド（PMSF）感受性のプロテア
ーゼを欠失していることに基づき、これを宿主と
して遺伝子組換え技術により異種蛋白質を生産す
る場合、前記のサツカロマイセス セレビシエ
YNN27、サツカロマイセス セレビシエ20B−
12、サツカロマイセス セレビシエS144、サツ
カロマイセス セレビシエXMF1−４、サツカロ
マイセス セレビシエUK35等の類似の酵母菌体
よりも、生産された蛋白質がプロテアーゼによつ
て分解されることが少なく、目的とする蛋白質を
収量よく生産することができる。 （実施例） 以下本発明を実施例について更に詳細に説明す
る。 実施例 (1) サツカロマイセス セレビシエXMF1−４の
調製 YEPD固体培地（酵母エキス10ｇ、ブドウ糖
20ｇ、バクト・ペプトン20ｇ及び水1000mlから
なる）上で、サツカロマイセス セレビシエ
20B−12（α、pep4−３、trp1）とサツカロマ
イセス セレビシエS144（ａ、met3、leu2、
gal1、gal2）を混合し、30℃で30分間保持して
接合させた。次いでこれをSD培地［0.67％の
酵母ナイトロジエンベース（除アミノ酸）、２
％ブドウ糖からなる］上に塗布し30℃で培養し
て二倍体（接合体）のみを選択採取した。 二倍体細胞をYEPD液体培地上で培養して増
殖させ、集菌後胞子形成培地（１％酢酸カリウ
ム、0.1％酵母エキス、0.05％グルコースから
なる）中に懸濁し、30℃で３〜４日間培養し
た。次いで生成した分生胞子をマイクロマニピ
ユレーターを用いて分離し、夫々の胞子の持つ
遺伝子型（接合型、栄養要求性、pep4変異）
を常法により解析し、目的の遺伝子型を持つ
XMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）株を取得し
た。 (2) サツカロマイセス セレビシエXMF11−44
（α、trp1、pep4−３、his4C、ade、ski5）の
調製 上記で得たXMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）
株とサツカロマイセス セレビシエUK35（α、
ade、his4C、ski5）とを、上記(1)と全く同様に
方法により接合させ、胞子を分離した。 夫々の胞子の持つ遺伝子型を解析して目的と
する遺伝子型を有するXMF11−44（α、trp1、
pep4−３、his4C、ade、ski5）株を得た。 (3) XMF11−44株を宿主とする蛋白質生産 ヒトのβ−エンドルフイン（βE）の遺伝子
を適当なベクターに挿入し、これを用いて
XMF11−44株を形質転換することによつて得
られた形質転換株XMF11−44−βE−１を培養
し、分泌されるβ−エンドルフインの収量を測
定した。 なお、以下の実施例においては、β−エンド
ルフインの遺伝子（βE DNA）を挿入したプ
ラスミドとして後述するpRE059を使用した。 (イ) 形質転換株の調製 サツカロマイセス セレビシエXMF11−
44株の培養菌体を、集菌洗浄後２×
108cells／mlとなるように、TE緩衝液［10ｍ
Ｍのトリス塩酸（PH8.0）及び１ｍＭの
EDTAからなる］に懸濁し、その500μに
0.2Mの酢酸リチウムを500μ加えて30℃で
１時間保持した。 その後、上記懸濁液100μを採取して氷
冷し、これにプラスミドpRE059を加え、
氷水中で30分間保持した後、70％ポリエチレ
ングリコール4000を含むTE緩衝液100μを
添加混合して30℃で１時間保持した。 次いで42℃で５分間保持して集菌し、水で
洗浄し、滅菌水に懸濁した後選択培地上に塗
布し、30℃で培養して形質転換株XMF11−
44−βE−１株を調製した。 (ロ) β−エンドルフインの調製 ［培地の組成］ 酵母窒素ベース（硫安を含む） 0.67ｇ デキストロース ２ｇ 水 80ml アミノ酸、核酸、 20ml 塩基混合物 （＊） （＊）硫酸アデニン12mg、ウラシル12mg、Ｌ
−ヒスチジン−HC112mg、Ｌ−アルギニン
−HC112mg、Ｌ−メチオニン12mg、Ｌ−チ
ロシン18mg、Ｌ−ロイシン18mg、Ｌ−イソロ
イシン18mg、Ｌ−リジン18mg、Ｌ−フエニル
アラニン30mg、Ｌ−グルタミン酸60mg、Ｌ−
アスパラギン酸60mg、Ｌ−バリン90mg、Ｌ−
スレオニン120mg、Ｌ−セリン225mg、水120
ml． ［培養方法］ 上記組成の培地25mlを用い、細胞密度
（107cells／ml）で37℃、48時間上記の形質転
換株を培養した結果β−エンドルフインの収
量は68.8ng／107cellsであつた。 なお、細胞数はA650（A650＝１×107cells／
ml）の値から計算した。また、β−エンドル
フイン量の測定は、β−エンドルフイン
［RIA］キツトNew England Nuclear社、
カタログ番号NEK−003を使用し、同カタロ
グ記載の方法に従つてラジオイムノアツセイ
を行つた。 なお参考までに、周知のサツカロマイセス
セレビシエYNN27［液胞中に存在するプ
ロテアーゼ（PEP4産物）と菌体外のフエニ
ル メチルスルフオニル フルオライド
（PMSF）感受性プロテアーゼ（SKI5産物）
を有する］を宿主とし、上記と全く同様の方
法によりpREI059を用いて形質転換して得ら
れたYNN27−βE−１株のβ−エンドルフイ
ンの収量は47.6ng／107cellsであつた。 本実施例に用いたプラスミドpRE059は、サ
ツカロマイセス セレビシエのαフエロモン遺伝
子（MFα1）のプロモーターとリーダー配列を含
む領域の間にヒトのβ−エンドルフイン前駆体遺
伝子を挿入してあり、その他マーカーとして、サ
ツカロマイセス セレビシエのTRP1遺伝子、
pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Apr）、更に
E.coliの複製起点（ori）及び2μｍプラスミドの
ARS等を含むシヤトルベクターであつて、その
詳細は、例えば、特願昭60−112287号（特開昭61
−271988号）に記載されているが、以下にその構
築の概要を示す。 ［β−エンドルフイン遺伝子を含む分泌ベクター
プラスミドpRE059の構築］ (1) サツカロマイセス・セレビシエα因子DNA
を含むプラスミドpLS01（4.4kb）の調製 サツカロミセス・セレビシエ（IFO1136）の
染色体DNA500μｇを500μの緩衝液［100ｍ
Ｍのトリス塩酸（PH7.5）、50ｍＭのNaCl、10
ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのジチオス
レイトールからなる］中で15単位のEcoRで
37℃、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖
密度勾配遠心にかけ、2kb前後のDNA断片を
集めた。これをプラスミドpUC13（Pharmacia
社カタログ、Ｐ−Ｌ Biochemicals、27頁、
27−4973記載）のEcoRにより切断した断片
1μｇとT4リガーゼ２単位を用いて連結し、得
られたプラスミドで大腸菌JM83株を形質転換
し、アンピシリン耐性（Apr）株を選択した。 合成オリゴヌクレオチド
5′GGCCAACCAATGTACT3′ をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンを行ない、陽性のコロニーを選択し、プラ
スミドDNAを分離し、制限酵素による解析と
塩基配列の決定により、Cell、30巻、937頁
（1982）の記載と一致する塩基配列を有する酵
母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
（4.4kb）を選択採取した。 (2) プラスミドpREI032（5.8kb）の調製 プラスミドYRp7［5.7kb、酵母のTRP1を含
む断片とpBR322を結合したプラスミド、
Nature、282巻、39〜43頁（1974）記載］を
EcoRで部分切断し、粘着末端を充填した後、
T4リガーゼで連結してYRp7の一方のEcoR
サイトが除去されたpREI032（5.8kb）を調製し
た。 (3) プラスミドpUC8−βE（2.9kb）の調製 プラスミドpYT3−24（特開昭58−92696号公
報、２頁記載）をHaeで切断することによつ
てβE DNA（93bp）を含む160bpのHae〜
Hae断片を採取した。 一方、フアージM13mp7（Nucleic Acids Re
−search9巻、309〜321頁記載）のRFDNA
（二本鎖DNA）をHincで切断し、エタノー
ルを添加してエタノールに溶解する断片
5′GACCTGCAGGTC3′（Hinc〜Hinc）を
除去した後、Hinc部位に、上記βE DNAを
含む160bpのHae〜Hae断片をT4リガーゼ
で連結した。これを大腸菌HB101株に導入し、
得られた形質転換株からRFDNAを調製しこ
れをBamHで切断して、得られたBamH
〜BamH断片をプラスミドpUC8［Bethesda
Research Laboratories、Inc.発行のBRLカタ
ログ（August1、1983）、Cat／No.53595A記載］
のBamHサイトに挿入してpUC8−βE
（2.9kb）を得た。 (4) プラスミドpREI046（7.4kb）の調製 (イ) pLS01（4.4kb）をEcoR及びHindで切
断してプロモーター配列及びリーダー配列を
含むEcoR〜Hind断片（1.4kb）を得た。 (ロ) pUC8−βE（2.9kb）をHind及びEcoR
で切断してHind〜EcoR断片（0.2kb）
を得た。 (ハ) pREI032（5.8kb）をEcoRで切断し、こ
れを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してpREI046（7.4kb）を得
た（第１図）。 (5) プラスミドpREI052（5.2kb）の調製 (イ) pREI032（5.8kb）をEcoR及びPstで切
断してTRP1を含むEcoR〜Pst断片
（0.8kb）を得た。 (ロ) 2μｍプラスミドをEcoRで切断し、その
粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pst
で切断して複製開始点を含むPst〜EcoR
断片（2kb）を得た。 (ハ) 上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を、
pBR322をEcoR及びPvuで切断したPvu
〜EcoR断片（2.3kb）と共にT4リガー
ゼにより連結してpREI051（5.1kb）を作製
し、EcoRで部分切断した後、粘着末端を
充填して平滑末端としてT4リガーゼで連結
し、一方のEcoR切断部位を欠失した
pREI052（5.2kb）を得た（第２図）。 (6) プラスミドpREI059（6.8kb）の調製 (イ) pREI046（7.4kb）をEcoR及びSmaで
切断し、得られたプロモーター配列、リーダ
ー配列及びβE DNA配列を含むEcoR〜
Sma断片（1.6kb）を採取した。 (ロ) pLS01（4.4kb）をHinc及びEcoRで切
断しターミネーター配列を含むHinc〜
EcoR断片（0.3kb）を採取した。 (ハ) pREI052（5.2kb）をEcoRで切断し、バ
クテリアルアルカリンフオスフアターゼ
（BAP）を加えて末端のリン酸基を外した
後、上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してプラスミドpREI059
（6.8kb）を得た（第３図）。
ゼ活性の少ない新規な変異微生物に関する。 （発明の構成） 酵母は、細胞の構造や機能が高等生物の特徴を
備え、また食品、医薬品、飼料等の原料として、
人間の日常生活と深い係わり合いを持つ有用な微
生物であり、遺伝子工学における宿主としての開
発が期待されている。 しかし、通常酵母を宿主として遺伝子組換え技
術により異種蛋白質を生産する場合、生産された
蛋白質の一部がプロテアーゼによつて分解されて
実際に発現された蛋白質が変化し、完全な形の目
的物が得られなかつたり、目的物の収量が大幅に
減少することがある。 本発明者等は、酵母サツカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）を宿主とし
て遺伝子組換え技術により蛋白質を生産する際、
生成蛋白質の分解の少ない宿主を得ることを目的
として研究の結果達成されたものである。 本発明を詳細に説明するに、本発明の変異微生
物サツカロマイセス セレビシエXMF11−44は
微工研菌寄第8600号（FERM Ｐ−8600）とて寄
託されており、例えば下記(1)及び(2)の工程により
調製される (1) サツカロマイセス セレビシエXMF1−４の
調製 まず周知のサツカロマイセス セレビシエ
20B−12（α、pep4−３、trp１）を周知のサツ
カロマイセス セレビシエS144（ａ、met3、
leu2、gal1、gal2）と接合してサツカロマイセ
ス セレビシエXMF1−４（ａ、trp1、pep4−
３）を選択調製する。 即ち、上記20B−12株及びS144株を適当な培
地上で混合して培養し、二倍体（接合体）細胞
のみを選択採取し、これを液体培地を用いて増
殖させ、集菌後、胞子形成培地中で培養する。
生成した分生胞子をマイクロマニピユレーター
を用いて分離し、夫々の胞子の持つ遺伝子型
（接合型、栄養要求性、pep−４変異）を常法
により解析し、目的の遺伝子型を持つXMF1−
４（ａ、trp1、pep4−３）株を取得する。 なお、上記20B−12株及びS144株は何れも、
イースト ゼネテイツク ストツク センター
（YEAST GENETIC STOCK CENTER、略
称YGSC、米国カリフオルニア大学バークレイ
校内）から分譲を受けたもので、夫々同センタ
ー発行のカタログ、第５版（1984年）30頁及び
21頁に記載されている。 (2) サツカロマイセス セレビシエXMF11−44
（α、trp1、pep4−３、his4C、ade、ski5）の
調製 周知のサツカロマイセス セレビシエUK35
（α、ade、his4C、ski5）［Current Genetics7
巻、449〜456頁（1983年）に記載され、同記載
の発表者でああるMcGill Universityの
Professor Howard Bussey氏から入手したも
の］と上記XMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）
と、上記(1)と同様の方法により接合させ、胞子
を分離する。夫々の胞子の持つ遺伝子型の解析
は、接合型（α、ａ）、栄養要求性（trp1、
ade、his4C）、pep−４変異については常法に
より行い、またski5変異（スーパーキラー変
異）については、サツカロマイセス イタリカ
ス（Saccharomyces italicus、）IFO 0253を
二重鎖RNAキラー感受性菌として用い、生育
阻止円の大きさにより検定した。以上の方法に
よりXMF11−44（α、trp1、pep4−３、his4C、
ade、ski5）が得られる。 （発明の効果） 本発明の微生物サツカロマイセス セレビシエ
XMF11−44は、PEP4遺伝子に由来する液胞中
のプロテアーゼを欠失していると共に、SKI5遺
伝子に由来する菌体外のフエニル メチルスルフ
オニルフルオライド（PMSF）感受性のプロテア
ーゼを欠失していることに基づき、これを宿主と
して遺伝子組換え技術により異種蛋白質を生産す
る場合、前記のサツカロマイセス セレビシエ
YNN27、サツカロマイセス セレビシエ20B−
12、サツカロマイセス セレビシエS144、サツ
カロマイセス セレビシエXMF1−４、サツカロ
マイセス セレビシエUK35等の類似の酵母菌体
よりも、生産された蛋白質がプロテアーゼによつ
て分解されることが少なく、目的とする蛋白質を
収量よく生産することができる。 （実施例） 以下本発明を実施例について更に詳細に説明す
る。 実施例 (1) サツカロマイセス セレビシエXMF1−４の
調製 YEPD固体培地（酵母エキス10ｇ、ブドウ糖
20ｇ、バクト・ペプトン20ｇ及び水1000mlから
なる）上で、サツカロマイセス セレビシエ
20B−12（α、pep4−３、trp1）とサツカロマ
イセス セレビシエS144（ａ、met3、leu2、
gal1、gal2）を混合し、30℃で30分間保持して
接合させた。次いでこれをSD培地［0.67％の
酵母ナイトロジエンベース（除アミノ酸）、２
％ブドウ糖からなる］上に塗布し30℃で培養し
て二倍体（接合体）のみを選択採取した。 二倍体細胞をYEPD液体培地上で培養して増
殖させ、集菌後胞子形成培地（１％酢酸カリウ
ム、0.1％酵母エキス、0.05％グルコースから
なる）中に懸濁し、30℃で３〜４日間培養し
た。次いで生成した分生胞子をマイクロマニピ
ユレーターを用いて分離し、夫々の胞子の持つ
遺伝子型（接合型、栄養要求性、pep4変異）
を常法により解析し、目的の遺伝子型を持つ
XMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）株を取得し
た。 (2) サツカロマイセス セレビシエXMF11−44
（α、trp1、pep4−３、his4C、ade、ski5）の
調製 上記で得たXMF1−４（ａ、trp1、pep4−３）
株とサツカロマイセス セレビシエUK35（α、
ade、his4C、ski5）とを、上記(1)と全く同様に
方法により接合させ、胞子を分離した。 夫々の胞子の持つ遺伝子型を解析して目的と
する遺伝子型を有するXMF11−44（α、trp1、
pep4−３、his4C、ade、ski5）株を得た。 (3) XMF11−44株を宿主とする蛋白質生産 ヒトのβ−エンドルフイン（βE）の遺伝子
を適当なベクターに挿入し、これを用いて
XMF11−44株を形質転換することによつて得
られた形質転換株XMF11−44−βE−１を培養
し、分泌されるβ−エンドルフインの収量を測
定した。 なお、以下の実施例においては、β−エンド
ルフインの遺伝子（βE DNA）を挿入したプ
ラスミドとして後述するpRE059を使用した。 (イ) 形質転換株の調製 サツカロマイセス セレビシエXMF11−
44株の培養菌体を、集菌洗浄後２×
108cells／mlとなるように、TE緩衝液［10ｍ
Ｍのトリス塩酸（PH8.0）及び１ｍＭの
EDTAからなる］に懸濁し、その500μに
0.2Mの酢酸リチウムを500μ加えて30℃で
１時間保持した。 その後、上記懸濁液100μを採取して氷
冷し、これにプラスミドpRE059を加え、
氷水中で30分間保持した後、70％ポリエチレ
ングリコール4000を含むTE緩衝液100μを
添加混合して30℃で１時間保持した。 次いで42℃で５分間保持して集菌し、水で
洗浄し、滅菌水に懸濁した後選択培地上に塗
布し、30℃で培養して形質転換株XMF11−
44−βE−１株を調製した。 (ロ) β−エンドルフインの調製 ［培地の組成］ 酵母窒素ベース（硫安を含む） 0.67ｇ デキストロース ２ｇ 水 80ml アミノ酸、核酸、 20ml 塩基混合物 （＊） （＊）硫酸アデニン12mg、ウラシル12mg、Ｌ
−ヒスチジン−HC112mg、Ｌ−アルギニン
−HC112mg、Ｌ−メチオニン12mg、Ｌ−チ
ロシン18mg、Ｌ−ロイシン18mg、Ｌ−イソロ
イシン18mg、Ｌ−リジン18mg、Ｌ−フエニル
アラニン30mg、Ｌ−グルタミン酸60mg、Ｌ−
アスパラギン酸60mg、Ｌ−バリン90mg、Ｌ−
スレオニン120mg、Ｌ−セリン225mg、水120
ml． ［培養方法］ 上記組成の培地25mlを用い、細胞密度
（107cells／ml）で37℃、48時間上記の形質転
換株を培養した結果β−エンドルフインの収
量は68.8ng／107cellsであつた。 なお、細胞数はA650（A650＝１×107cells／
ml）の値から計算した。また、β−エンドル
フイン量の測定は、β−エンドルフイン
［RIA］キツトNew England Nuclear社、
カタログ番号NEK−003を使用し、同カタロ
グ記載の方法に従つてラジオイムノアツセイ
を行つた。 なお参考までに、周知のサツカロマイセス
セレビシエYNN27［液胞中に存在するプ
ロテアーゼ（PEP4産物）と菌体外のフエニ
ル メチルスルフオニル フルオライド
（PMSF）感受性プロテアーゼ（SKI5産物）
を有する］を宿主とし、上記と全く同様の方
法によりpREI059を用いて形質転換して得ら
れたYNN27−βE−１株のβ−エンドルフイ
ンの収量は47.6ng／107cellsであつた。 本実施例に用いたプラスミドpRE059は、サ
ツカロマイセス セレビシエのαフエロモン遺伝
子（MFα1）のプロモーターとリーダー配列を含
む領域の間にヒトのβ−エンドルフイン前駆体遺
伝子を挿入してあり、その他マーカーとして、サ
ツカロマイセス セレビシエのTRP1遺伝子、
pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Apr）、更に
E.coliの複製起点（ori）及び2μｍプラスミドの
ARS等を含むシヤトルベクターであつて、その
詳細は、例えば、特願昭60−112287号（特開昭61
−271988号）に記載されているが、以下にその構
築の概要を示す。 ［β−エンドルフイン遺伝子を含む分泌ベクター
プラスミドpRE059の構築］ (1) サツカロマイセス・セレビシエα因子DNA
を含むプラスミドpLS01（4.4kb）の調製 サツカロミセス・セレビシエ（IFO1136）の
染色体DNA500μｇを500μの緩衝液［100ｍ
Ｍのトリス塩酸（PH7.5）、50ｍＭのNaCl、10
ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのジチオス
レイトールからなる］中で15単位のEcoRで
37℃、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖
密度勾配遠心にかけ、2kb前後のDNA断片を
集めた。これをプラスミドpUC13（Pharmacia
社カタログ、Ｐ−Ｌ Biochemicals、27頁、
27−4973記載）のEcoRにより切断した断片
1μｇとT4リガーゼ２単位を用いて連結し、得
られたプラスミドで大腸菌JM83株を形質転換
し、アンピシリン耐性（Apr）株を選択した。 合成オリゴヌクレオチド
5′GGCCAACCAATGTACT3′ をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンを行ない、陽性のコロニーを選択し、プラ
スミドDNAを分離し、制限酵素による解析と
塩基配列の決定により、Cell、30巻、937頁
（1982）の記載と一致する塩基配列を有する酵
母のα因子DNAを含むプラスミドpLS01
（4.4kb）を選択採取した。 (2) プラスミドpREI032（5.8kb）の調製 プラスミドYRp7［5.7kb、酵母のTRP1を含
む断片とpBR322を結合したプラスミド、
Nature、282巻、39〜43頁（1974）記載］を
EcoRで部分切断し、粘着末端を充填した後、
T4リガーゼで連結してYRp7の一方のEcoR
サイトが除去されたpREI032（5.8kb）を調製し
た。 (3) プラスミドpUC8−βE（2.9kb）の調製 プラスミドpYT3−24（特開昭58−92696号公
報、２頁記載）をHaeで切断することによつ
てβE DNA（93bp）を含む160bpのHae〜
Hae断片を採取した。 一方、フアージM13mp7（Nucleic Acids Re
−search9巻、309〜321頁記載）のRFDNA
（二本鎖DNA）をHincで切断し、エタノー
ルを添加してエタノールに溶解する断片
5′GACCTGCAGGTC3′（Hinc〜Hinc）を
除去した後、Hinc部位に、上記βE DNAを
含む160bpのHae〜Hae断片をT4リガーゼ
で連結した。これを大腸菌HB101株に導入し、
得られた形質転換株からRFDNAを調製しこ
れをBamHで切断して、得られたBamH
〜BamH断片をプラスミドpUC8［Bethesda
Research Laboratories、Inc.発行のBRLカタ
ログ（August1、1983）、Cat／No.53595A記載］
のBamHサイトに挿入してpUC8−βE
（2.9kb）を得た。 (4) プラスミドpREI046（7.4kb）の調製 (イ) pLS01（4.4kb）をEcoR及びHindで切
断してプロモーター配列及びリーダー配列を
含むEcoR〜Hind断片（1.4kb）を得た。 (ロ) pUC8−βE（2.9kb）をHind及びEcoR
で切断してHind〜EcoR断片（0.2kb）
を得た。 (ハ) pREI032（5.8kb）をEcoRで切断し、こ
れを上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してpREI046（7.4kb）を得
た（第１図）。 (5) プラスミドpREI052（5.2kb）の調製 (イ) pREI032（5.8kb）をEcoR及びPstで切
断してTRP1を含むEcoR〜Pst断片
（0.8kb）を得た。 (ロ) 2μｍプラスミドをEcoRで切断し、その
粘着末端を充填して平滑末端とした後、Pst
で切断して複製開始点を含むPst〜EcoR
断片（2kb）を得た。 (ハ) 上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片を、
pBR322をEcoR及びPvuで切断したPvu
〜EcoR断片（2.3kb）と共にT4リガー
ゼにより連結してpREI051（5.1kb）を作製
し、EcoRで部分切断した後、粘着末端を
充填して平滑末端としてT4リガーゼで連結
し、一方のEcoR切断部位を欠失した
pREI052（5.2kb）を得た（第２図）。 (6) プラスミドpREI059（6.8kb）の調製 (イ) pREI046（7.4kb）をEcoR及びSmaで
切断し、得られたプロモーター配列、リーダ
ー配列及びβE DNA配列を含むEcoR〜
Sma断片（1.6kb）を採取した。 (ロ) pLS01（4.4kb）をHinc及びEcoRで切
断しターミネーター配列を含むHinc〜
EcoR断片（0.3kb）を採取した。 (ハ) pREI052（5.2kb）をEcoRで切断し、バ
クテリアルアルカリンフオスフアターゼ
（BAP）を加えて末端のリン酸基を外した
後、上記(イ)及び(ロ)で得たDNA断片とT4リガ
ーゼを用いて連結してプラスミドpREI059
（6.8kb）を得た（第３図）。
第１〜第３図は本発明に使用したプラスミド
pREI059の構成ルートを示す模式図であつて、図
中、ＥはEcoRを、ＨはHindを、ＳはSal
を、ＰはPstを、ＢはBamHを、PvはPvu
を、SmはSmaを、HcはHincを、ＸはXba
を夫々示す。
pREI059の構成ルートを示す模式図であつて、図
中、ＥはEcoRを、ＨはHindを、ＳはSal
を、ＰはPstを、ＢはBamHを、PvはPvu
を、SmはSmaを、HcはHincを、ＸはXba
を夫々示す。
Claims (1)
- １ サツカロマイセス セレビシエ20B−12を、
サツカロマイセス セレビシエS144と接合して
得られるサツカロマイセス セレビシエXMF1−
４と、サツカロマイセス セレビシエUK35とを
接合して得られる、類似の酵母菌株よりもプロテ
アーゼ活性の少ないサツカロマイセス セレビシ
エXMF11−44（微工研菌寄第8600号）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61064808A JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61064808A JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62224284A JPS62224284A (ja) | 1987-10-02 |
| JPH0158948B2 true JPH0158948B2 (ja) | 1989-12-14 |
Family
ID=13268913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61064808A Granted JPS62224284A (ja) | 1986-03-25 | 1986-03-25 | 微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62224284A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0327797B1 (de) * | 1988-01-05 | 2003-09-03 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten |
| AU614121B2 (en) * | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| JPH0671434B2 (ja) * | 1989-09-18 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
-
1986
- 1986-03-25 JP JP61064808A patent/JPS62224284A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62224284A (ja) | 1987-10-02 |
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