【発明の詳細な説明】
Ｋ．ラクチス (Ｋ．ｌａｃｔｉｓ) トランスアルドラーゼ遺伝子のプロモーター
およびその使用
本発明は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、転写プロ
モーター活性をもつ新規なＤＮＡ配列、この配列を含む発現ベクター、およびそ
の使用による組み換えタンパク質、例えば異種タンパク質の生産に関する。また
、本発明は、このＤＮＡ配列を含む組み換え細胞にも関する。
分子生物学の分野において遂げられた進歩は、微生物を改変し、その微生物に
、異種タンパク質を生産させることを可能にした。特に、数種の遺伝的研究は、
細菌Ｅ．コリ (Ｅ．ｃｏｌｉ) において実施されてきた。しかしながら、これら
の新規な生産方法の工業的使用は、特に、これらの組み換え微生物における遺伝
子の発現効率の問題により、なお制限される。したがって、これらの生産系の働
きを増大する目的で、異種タンパク質の高い発現レベルが得られる強力なプロモ
ーターを単離するための研究が実施されてきた。Ｅ．コリに関しては、トリプト
ファンおよびラクトースオペロンのプロモーターを、特に挙げることができる。
より最近では、酵母Ｓ．セレビシエ (Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ) における研
究が、解糖に関与する遺伝子から得られるプロモーターに関して行われてきた。
３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子ＰＧＫのプロモーター (Dobson et al.,
Nucleic Acid Res. 10, 1982, 2625; Hitzman et al., Nucleic Acid Research
1982, 7791) 、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ＧＡ ＰＤＨ
のプロモーター (Holland et al., J. Biol. Chem. 254, 1979, 9839; Mu
sti et al., Gene
25
, 1983, 133) 、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子ＡＤＨ１のプロモータ
ー (Bennentzen et al., J. Biol. Chem. 257, 1982, 3018; Denis et al., J.
Biol. 25, 1983, 1165) ，エノラーゼ１遺伝子ＥＮＯ１のプロモーター (Uemura
et al., Gene 45, 1986, 65) 、ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター (
Johnston and Davis, Mol. Cell. Biol. 4, 1984, 1440) ，またはＣＹＣ１遺伝
子のプロモーター (Guarente and Ptashne, PNAS 78 (1981) 2199) 、に関する
研究を、特に挙げることができる。
最近では、組み換えタンパク質の生産の宿主細胞として酵母クルイベロミセス
(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ) を使用するための遺伝的道具が、開発された。
Ｋ．ドロソフィラルム (Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ) (プラスミドｐＫＤ
１−欧州特許第２４１，４３５号) に本来存在する２ミクロンタイプのプラスミ
ドの発見が、組み換えタンパク質の生産の非常に効率的な宿主／ベクター系を確
立させた (欧州特許第３６１，９９１号) 。しかしながら、この系で使用される
プロモーターは、現在まで、まだ最適なものではなかった。特に、そのプロモー
ターは、本質的に異種のプロモーター、すなわち特にＳ．セレビシエのような他
の微生物に由来するプロモーターである。このことは、種々の不都合を引き起こ
し、特に、転写機構のある要素 (例えば、トランス−アクチベーター) の欠如の
ために、そのプロモーターの活性が制限され、制御の欠如による宿主細胞に対す
るある種の毒性を示すか、ベクターの安定性に影響を与える。
これらの条件下で、クルイベロミセスの強い相同プロモーターを欠くことは、
この発現系の工業的使用における制限因子となっている。
今、本発明者は、転写プロモーター活性をもつクルイベロミセス・ラクチス (Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ
) ゲノムのある領域を同定し、クロ
ーン化し、そして配列を決定した (配列番号：１、参照) 。より正確には、この
領域は、Ｋ．ラクチスのトランスアルドラーゼをコードしている遺伝子プロモー
ター (ＫｌＴＡＬ１遺伝子と呼ばれる) に対応する。この領域、またはその誘導
体もしくは断片は、クルイベロミセス属酵母における組み換えタンパク質の生産
において、非常に効率的に使用することができる。この配列は、また他の宿主生
物にも使用できると考えられる。
さらに、得られたプロモーター領域の一つの優位性は、グルコースによるリプ
レッションを受けないので、慣用の工業的培養液において、その使用を可能にす
ることである。
それ故、本発明は、配列番号：１またはその相補的鎖、またはこれらの誘導体
、の全部もしくは一部を含み、転写プロモーター活性を有するＤＮＡ配列に関す
る。 本発明の明細書において、誘導体とは、配列番号：１から、遺伝的および
／または化学的性質の改変によって得られ、プロモーター活性を保持している、
いかなる配列をも意味すると理解される。遺伝的および／または化学的性質の改
変は、一つまたは複数のヌクレオチドのいかなる変異、欠失、置換、付加および
／または改変をも意味すると理解される。そのような改変は、種々の目的、特に
、ポータブルプロモーターの作製のため、または特定のベクターもしくは宿主タ
イプでの発現に好適なプロモーターの作製のため、転写プロモーターのサイズを
縮小し、活性を増大して、誘導可能なプロモーターの生成、調節レベルの改良、
または調節の性質の変更のために、実施することがで
きる。そのような改変は、例えば、試験管内での突然変異誘発によって、付加的
な調節要素もしくは合成配列の導入によって、または元の調節要素の欠失もしく
は置換によって、実施することができる。
前記のような誘導体が作製されるならば、その転写プロモーター活性は、種々
の方法、特に、問題の配列の制御下に、発現が検出できるレポーター遺伝子を置
くことによって示すことができる。もちろん、当業者に既知のいかなる他の技術
も、この目的のために使用できる。
配列番号：１は、実施例記載の操作により、Ｋ．ラクチスゲノム２３５９／１
５２の断片およびＥ．コリの遺伝子ｌａｃＺ間の融合体バンク(ｂａｎｋ) から
得られた。当業者は、図１に示した配列またはその相補的鎖の全部もしくは一部
を含むプローブによるハイブリダイゼーションによって、この領域を単離できる
と考えられる。次いで、本発明による誘導体は、実施例に示されるように、この
配列から作製することができる。
またこの発明は、前記のようなＤＮＡの配列を含んでなる組み換えＤＮＡに関
する。
この組み換えＤＮＡは、例えば、プロモーター配列・配列番号：１または“ポ
ータブル”プロモーター (配列番号：３、参照) としてこの配列の使用を容易に
する制限酵素部位が挿入されているプロモーター配列の誘導体を含むことができ
る。
好ましくは、また、この組み換えＤＮＡは、一つもしくは複数の構造遺伝子を
含有する。特に、これらは、医薬もしくは農産栄養物 (ａｇｒｏ−ｎｕｔｒｉｔ
ｉｏｎａｌ) 用のタンパク質をコードしている遺伝子であってもよい。例として
は、酵素類 (例えば、特にスーパーオキシド
ジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン等)
、血液誘導物 (例えば、血清アルブミン、α−もしくはβ−グロブリン、ファク
ターＶＩＩＩ、ファクターＩＸ、フォンビルブランド因子，フィブロネクチン、
１−α−アンチトリプシン等) 、インシュリンおよびその変異体、リンホカイン
[例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子 (Ｇ−ＣＳ
Ｆ，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ・・・) 、ＴＮＦ、ＴＲＦ、等] 、増殖因子 (例
えば、成長ホルモン、エリスロポイエチン、ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦ
Ｎ等)、アポリポタンパク質、ワクチン (肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタ
イン・バール、ヘルペス、等) 生産のための抗原ポリペプチド、あるいはまた、
特に、安定化部分に融合された活性部分を含有する融合体のようなポリペプチド
融合体 (例えば、アルブミンもしくはアルブミン断片およびウイルスレセプター
もしくはウイルスレセプター [ＣＤ４、等]の一部との融合体) を挙げることが
できる。
なお一層好ましくは、また、その組み換えＤＮＡは、該構造遺伝子もしくは遺
伝子群の発現産物の分泌を可能にするシグナルを含有する。これらのシグナルは
、問題のタンパク質の本来の分泌シグナルに対応しているが、それらは、また異
なる起源のものであってもよい。特に、キラー毒素 (Stark and Boyd, EMBO J. 5
(1986) 1995) もしくはαフェロモン (Kurjan and Herskowitz, cell 30 (198
2) 933; Brake et al., Yeast 4 (1988) S436) の遺伝子の分泌シグナルのよう
に、酵母遺伝子由来の分泌シグナルが使用できる。
本発明の特定の実施態様においては、組み換えＤＮＡは、自律的にもしくは組
み込まれて複製できる発現プラスミドの部分である。
特に、自律的複製ベクターは、選ばれた宿主の自律的複製配列を用いて得るこ
とができる。特に、酵母の場合には、これらは、プラスミド(ｐＫＤ１、２μ、
等) もしくは染色体配列 (ＡＲＳ) 由来の複製起点であってもよい。
組み込みベクターは、特に、相同組み換えによって、そのベクターの組み込み
を可能にする宿主ゲノムのある領域に相同な配列を用いて得ることができる。
また、本発明は、前記のようなＤＮＡ配列を含んでなる組み換え細胞にも関す
る。
有利には、その細胞は、酵母から、なお一層好ましくは、クルイベロミセス属
の酵母から選ばれる。しかしながら、本発明は、真核細胞でもまた原核細胞であ
っても、本発明のプロモーター領域が活性をもつ全ての組み換え細胞を包含する
と理解される。
かくして、真核細胞には、植物もしくは動物細胞、酵母もしくは真菌類を挙げ
ることができる。特に、酵母に関しては、サッカロミセス (Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ
) 、ピヒア (Ｐｉｃｈｉａ) 、シュワニオミセス (Ｓｃｈｗａｎｎｉｏ ｍｙｃｅｓ
) もしくはハンゼヌラ (Ｈａｎｓｅｎｕｌａ) 属の酵母を挙げること
ができる。動物細胞に関しては、細胞ＣＯＳ，ＣＨＯ、Ｃ１２７、等を挙げるこ
とができる。本発明において使用される真菌類には、より具体的には、アスペル
ギルス (Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ) 種もしくはトリコデルマ (Ｔｒｉｃｈｏｄｅ ｒｍａ
)種を挙げることができる。使用される原核生物宿主は、エシェリヒア・
コリ (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) のような細菌、またはコリネバクテ
リウム (Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ) 、バチルス (Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ
) もしくはストレプトミセス (Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)に属す
る細菌が使用されてもよい。
これらの種々の宿主における本発明の配列の転写プロモーター活性は、例えば
、問題のプロモーター配列の制御下で、問題の宿主中で発現されるリポーター遺
伝子を含んでなる組み換えＤＮＡを、問題の宿主細胞中に導入することによって
確認することができる。
本発明の組み換え細胞は、外来ＤＮＡを細胞中に導入させ得るいかなる方法に
よっても得ることができる。これは、特に、形質転換、エレクトロポレーション
、接合、プロトプラスト融合、または当業者により既知の他の全ての技術である
。形質転換に関しては、種々の方法が、先行技術文献に記載されている。特に、
これは、Ito et al.(J. Bacteriol.153 (1983) 163-168)記載の技術による酢酸
リチウムおよびポリエチレングリコールの存在下で、またはDurrens et al. (Cu
rr.Gent.18 (1990) 7) の技術によりエチレングリコールおよびジメチルスルホ
キシド存在下で、細胞全体を処理することによって実施される。また、その他の
方法は、特許明細書・欧州特許第３６１ ９９１号にも記載されている。エレク
トロポレーションに関しては、これは、Becker and Guarentte (in: Methods in
Enzymolgy vol.194 (1991) 182)の方法により実施されてもよい。
また、本発明は、前記のような配列を使用して組み換え遺伝子を発現させるこ
とにも関する。本発明によるＤＮＡ配列は、実際に、高レベルで組み換えタンパ
ク質を生産することができる。
有利には、本発明の配列は、医薬もしくは農産栄養物用のタンパク質をコード
している遺伝子の発現のために使用できる。例としては、先に
示したタンパク質を挙げることができる。
また、本発明は、前記のような組み換え細胞を培養し、生産されたタンパク質
を回収することにより、組み換えタンパク質の生産方法を実現できる。タンパク
質の例としては、先に挙げたタンパク質を挙げることができる。
好ましくは、本発明の方法は、ヒト血清アルブミンもしくはその分子変異体の
一つを生産するために応用できる。アルブミンの分子変異体は、アルブミンの多
形性による天然の変異体、切断された形、またはアルブミンに基づく全てのハイ
ブリッドタンパク質を意味すると理解される。
本発明の他の優位性は、続く実施例を読むことにより明らかにされるであろう
が、その実施例は、例示として、また限定されないものとして考慮されるべきで
ある。図の説明
図１： プラスミドｐＹＧ１０１８およびｐＹＧ１８２の制限酵素地図。
配列番号：１： Ｋ．ラクチスのプロモーターＫ１ＴＡＬ１に対応する１．３
ｋｂ断片のヌクレオチド配列。
図２： トランスポゾンｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１の作製。
図３： トランスポゾンｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１の制限酵素地図。
図４： クローン１２Ｃ４の制限酵素地図。
図５： プロモーターＫ１ＴＡＬ１を担持するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの
２．５ｋｂ断片の制限酵素地図。一般的クローニング技術
分子生物学において使用される慣例の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製
的抽出、塩化セシウム濃度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースも
しくはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製
、フェノールもしくはフェノール／クロロホルムによるタンパク質の抽出、エタ
ノールもしくはイソプロパノールを用いる生理食塩水中でのＤＮＡ沈殿、エシェ
リヒア・コリ等における形質転換は、専門家にとって周知であり、広く文献に記
述されている［Maniatis T. et al.,“Molecular Cloning, a Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausub
el F.M. et al., (editors),“Current Protocols in Molecular Biology”, Jo
hn Wiley & Sons, New York 1987 ]。
制限酵素は、New England Biolabs (Biolabs)もしくは Pharmaciaによって供
給され、供給先の指示に従って使用された。
タイプｐＢＲ３２２およびｐＵＣのプラスミドは、市販のものである(Bethesd
a Research Laboratoies)。
連結反応のためには、ＤＮＡ断片が、アガロースもしくはアクリルアミドゲル
の電気泳動によってサイズに従って分別され、フェノールもしくはフェノール／
クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次いで供
給先の指示に従ってファージＴ４のＤＮＡリガーゼ (Boehringer)の存在でイン
キュベートされる。
突き出た５’末端のフィリング−イン (ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ) は、供給先の
指示に従ってＥ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント (Boehri
nger)を用いて行われる。突き出た３’の末端の破壊は、製造者の指示に従って
使用されるファージＴ４のＤＮＡポリメラー
ゼ(Biolabs)の存在で行われる。突き出た５’末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１
による管理された処理によって実施される。
合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる試験管内での制御された変異誘発は
、Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]により開発された
方法に従って実施される。
いわゆるＰＣＲ技術 [Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄＣｈａｉｎ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ，Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mu
llis K.B. and Faloona F. A., Meth. Enzym. 155(1987) 335-350] によるＤＮ
Ａ断片の酵素的増幅は、製造者の指示により、“ＤＮＡ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙ
ｃｌｅｒ” (Perkin Elmer Cetus)を用いて実施される。
ヌクレオチド配列の確認は、Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 4
(1977) 5463-5467] により開発された方法によって実施される。
Ｋ．ラクチスの形質転換は、当業者に既知のいかなる技術によっても実施され
、その実施例は本明細書中に示される。
別に述べられる場合以外は、使用される細菌菌株は、Ｅ．コリＤＨ１(Hanahan
D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557) もしくはＥ．コリＪＭ１０９：：（Ｍｕ
ｃｔｓ） (Daignan-fornier and Bolotin-Fukuhara,Gene 62 (1988) 45) である
。
使用される酵母菌株は、出芽酵母、より特別には、クルイベロミセス属酵母に
属する。菌株Ｋ．ラクチス２３５９／１５２およびＫ．ラクチスＳＤ６が、特に
使用された。
プラスミドによって形質転換された酵母菌株は、三角フラスコもしく
は２１容パイロットファーメンター (SETRIC, France) 中で、２８℃で定常的に
撹拌をしつつ高栄養培地 (ＹＰＤ：１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％
グルコース；またはＹＰＬ：１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％ラクト
ース) において培養される。実施例 Ｉ− Ｋ．ラクチスのＫ１ＴＡＬ１プロモーターの単離
配列番号：１は、Ｋ．ラクチスゲノム２３５９／１５２の断片およびＥ．コリ
ｌａｃＺ遺伝子間の融合体バンクから単離された。この実施例は、 (Ａ) 融合体
バンクの作製において、 (Ｂ) Ｋ．ラクチスのトランスアルドラーゼＴＡＬ１の
遺伝子プロモーターを担持するこのバンクのクローンの選択および同定において
記載する。Ａ／融合体バンクの作製
Ａ．１．ｍｉｎｉ−ｍｕトランスポゾンＭｕｄＩＩＺＫ１ (図２および図３)
の作製。
ｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１は、Daignan-Fornier and Bolotin-Fukuhara
(Gene 62(1988)45)により記されたｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＺ１から構築さ
れた。それは、ｍｉｎｉトランスポゾンＭｕｄＩＩＺＺ１の複製起点を、クルイ
ベロミセスにおける機能的複製起点：プラスミドｐＫＤ１の複製起点で置換する
ことによって得られた (欧州特許第２３１４３５号) 。
Ａ．１．１．プラスミドｐＫＤ１の複製起点を担持するカセットの構築 (断片
Ｓ１１) 。
次に続く操作を容易にするために、断片Ｓ１１ (プラスミドｐＫＤ１の複製起
点を担持する) が、ＮｏｔＩカセットの形中に置かれた。この
ために、プラスミドｐＵＣ１８の誘導体が、クローニング多重部位 (ＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位) の外側部位が、ＮｏｔＩ部位に変えられて構築され
た。これは、対応する酵素による消化、クレノウ酵素の作用およびＮｏｔＩ部位
に対応する合成オリゴヌクレオチド[オリゴｄ (ＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴ) ；Biola
bs]による連結によって行われた。得られたプラスミドは、ｐＧＭ６７と名付け
られる。次に、プラスミドＫＥｐ６ (Chen et al., Nucl. Acids Res. 114 (198
6) 4471) の酵素Ｓａｕ３Ａによる消化によって得られた９６０ｂｐの断片Ｓ１
１が、プラスミドｐＧＭ６７のＢａｍＨＩ適合部位に挿入された。このようにし
て得られたプラスミドは、ｐＧＭ６８と命名され、ＮｏｔＩカセットの形で、断
片Ｓ１１を含む。
Ａ．１．２．トランスポゾンＭｕｄＩＩＺＺ１の２μ複製起点のサプレッショ
ン。
ｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＺ１ (Daignan-Fornier and Bolotin-Fukuhara、
前出) を担持するプラスミドｐＧＭ１５は、酵素ＳａｌＩによる消化によって２
μ領域から欠失された。このようにして得られた単一ＳａｌＩ部位は、次いで、
クレノウ酵素の作用の後、ＮｏｔＩ部位に対応する合成オリゴヌクレオチドの連
結によって、ＮｏｔＩ部位に転換された。得られたプラスミドは、ｐＧＭ５９と
呼ばれる。
Ａ．１．３．断片Ｓ１１の挿入
改変されたプラスミドｐＵＣ１８由来のプラスミドｐＫＤ１の複製起点を担持
するカセットＮｏｔＩ (断片Ｓ１１) は、次いで、プラスミドｐＧＭ５９の単一
ＮｏｔＩ部位中に導入された。
得られたプラスミドは、ｐＧＭ８３と命名され、ＭｕｄＩＩＺＫ１と
呼ばれるｍｉｎｉ−ｍｕを担持し、酵母クルイベロミセス・ラクチス、ならびに
Ｋ．ラクチスにおけるｌｅｕ２変異を相補できるＳ．セレビシ
(1991) 109) に好適である。ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の制限酵素地図
は、図３に示される。
Ａ．２．ＭｕヘルパーＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ) を担持する菌株Ｅ．コリ
中へのｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の導入： 菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕ
ｃｔｓ) ：： (ＭｕｄＩＩＺＫ１) が得られる。
菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ) は、塩化カルシウムの存在で、ｍｉｎｉ−
ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１を含むプラスミドｐＧＭ８３によって形質転換された。次
に、形質転換後、転位が、Castilho et al.(J. Bacteriol. 158 (1984) 488)に
よる記載の技術に従い、熱ショックによって誘導された。次いで、誘発後得られ
たファージ溶菌液が、菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ) を重感染するために使
用される。菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ) は、ｒｅｃＡであるので、ファー
ジによって包膜された直鎖状ＤＮＡは、再閉鎖して複製プラスミドを生成するこ
とができない。次いで、組み込まれたユニット [菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔ
ｓ) ：： (ＭｕｄＩＩＺＫ１) ] は、クロラムフェニコール耐性 (ＣｍR) およ
びアンピシリン感受性 (Ａｍｐs) クローンとして選択される。
Ａ．３．Ｅ．コリＤＨ１におけるＫ．ラクチスのゲノムバンクの調製
高分子量ＤＮＡが、Ｋ．ラクチス２３５９／１５２株から調製され、酵素Ｓａ
ｕ３Ａによって部分的に消化された。サイズ４〜８ｋｂの断片が、ＬＭＰアガロ
ースゲル (“低融点”、SEAKAM) 上で回収され、ＢａｍＨＩにより直鎖化された
プラスミドｐＢＲ３２２中にクローン化され、
コウシ腸ホスファターゼ (Biolabs) の作用で脱リン酸された。このようにして
、Ｅ．コリＤＨ１における１０００コロニーの３５プールが作出された。各プー
ルの１０００コロニーは、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン感受性であ
り、このことは、それらが、ｐＢＲ３２２中に、Ｋ．ラクチスのゲノムＤＮＡ断
片を全て挿入したことを示している。
Ａ．４．融合体バンクの調製
Ａ．４．１．菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ) ：： (ＭｕｄＩＩＺＫ１) 中
へのＫ．ラクチスのゲノムバンクの導入。
ＤＨ１において作製された各プールのプラスミドＤＮＡが抽出される(Maniati
s)。次いで、このＤＮＡが、塩化カルシウムの存在下、菌株ＪＭ１０９：： (Ｍ
ｕｃｔｓ) ：： (ＭｕｄＩＩＺＫ１) を、形質転換するために使用される。ゲノ
ムバンクの各プールに含まれる１０００コロニーを代表にして、プール当たり３
０００クローン以上が、形質導入を可能にする菌株ＪＭ１０９：： (Ｍｕｃｔｓ
) ：： (ＭｕｄＩＩＺＫ１)において回収された。
Ａ．４．２．ｍｉｎｉ−ｍｕ ＭｕｄＩＩＺＫ１の転位
融合体バンクは、Ｋ．ラクチスのゲノムＤＮＡバンクを形成するプラスミドに
おけるｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１の広範な転位によって作製される。ｍｉ
ｎｉ−ｍｕｄｕｃｔｉｏｎは、Castilho et al. (J.Bacteriol. 158 (1984) 488
)に記載の方法により実施され、形質導入株が、ＬＢＡＣ選択培地 (アンピシリ
ン５０ｍｇ／ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／ｍｌを補足されたＬＢ培地 (
Gibco BRL) ) 上で、プラスミドによって付与されるマーカーＡｍｐRおよびｍｉ
ｎｉ−ｍｕによるマーカーＣｍRについて、選択された。各プールについて、転
位は、
直列に遂行され、プール当たり１０，０００〜２０，０００の形質導入株が回収
される。形質導入株のＤＮＡは、次に、調製物１００ｍｌから抽出され、ポリエ
チレングリコールを用いる沈殿によって精製され (Maniatis et al., 1989) 、
水１００μｌに再懸濁される。次いで、このＤＮＡは、Ｋ．ラクチスを形質転換
し、プロモーターを担持するクローンを選択するために使用される。Ｂ／ Ｋ．ラクチスのＫ１ＴＡＬ１プロモーターの単離
上記のように作製された融合ＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、Ｋ
．ラクチスの受容菌株を形質転換するために使用された。この受容菌株は、ＳＤ
６と呼ばれ、変異ｌｅｕ２ (ｍｉｎｉ−ｍｕＭｕｄＩＩＺＫ１の選択マーカーに
対応する) およびｌａｃ４−８を担持している。この後者の変異は、その菌株が
、唯一の炭素源としてラクトースを含有する培地上で成長するのを妨げるが、そ
れは、β−ガラクトシダーゼをコードしているＥ．コリのｌａｃＺ遺伝子の過発
現によって相補される(Chen et al., J. Bacic Microbiol. 28 (1988) 211) 。
それ故、β−ガラクトシダーゼに融合したタンパク質の発現は、形質転換後ラク
トースでのＳＤ６株の成長を可能にする。このポジティブスクリーニングは、強
力なプロモーターをもつクローンを素早く選択するのに使用された。
Ｂ．１．受容菌株Ｋ．ラクチスＳＤ６の構築。
菌株ＳＤ６ (Chen et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 97) は、菌株Ｋ．
ラクチスＣＸＪ１−７Ａ (ａ，ｌａｃ４−８、ｕｒａ３Ａ，ａｄｅｌ−１，ｋ１
，ｋ２，ｐＫＤ１) (Chen and Fukuhara, Gene 69 (1988) 181) を、菌株ＡＷ
Ｊ−１３７ (ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ホモタリッ
伝子型ＡＤＥ+，ｕｒａＡ，ｌｅｕ２，ｌａｃ４−８をもつ胞子を選択して得ら
れた。得られた胞子は、プロトプラストによる形質転換後には再生することがで
きないので、戻し交雑が、菌株ＣＸＪ１−７Ａを用いて行われた。一緒に胞子形
成後、選択された遺伝子型の胞子が、塩化リチウム中で、Ito et al.(J. Bacter
iol. 153 (1983) 163)(ＬｉＣｌ濃度２０ｍＭ、すなわちＳ．セレビシエについ
てItoによって使用された濃度の１０倍以下) 記載の技術からの方法により、プ
ラスミドＫＥｐ６を用いる形質転換によって試験された。菌株ＣＸＪ１−７Ａは
、形質転換対照株として使用された。
これらの基準で選択された菌株ＳＤ６は、正確に形質転換され：ＤＮＡμｇ当
たり１〜３ｘ１０4の形質転換株、そして形質転換株は十分安定である：非選択
培地で６継代後、コロニーの３０〜４０％が表現型 [Ｕｒａ+] を保持している
。 Ｂ．２．Ｋ１ＴＡＬ１プロモーターの単離
菌株ＳＤ６は、Becker and Guarante (in Methods in Enzymology vol.194 (1
991) 182)(Ｊｏｕａｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ；２５００Ｖ／ｃｍ； ８０−１０
０ｎｇＤＮＡ／形質転換) によるエレクトロポレーションによって、Ａ．４．２
． (Ｅ．コリにおける１１，０００クローンのバンクに対応) において得られた
形質導入株の１１プールのＤＮＡを用いて形質転換された。ＹＰＤ培地 (酵母エ
キス１０ｇ／ｌ；ぺプトン１０ｇ／ｌ；グルコース２０ｇ／ｌ) で５時間再生後
、その細胞は、最少ラクトース培地に撒かれた。ラクトースで成長可能な形質転
換株が、再びストリーク培養され、そして各クローンについて、そのプラスミド
が抽出され、Ｅ．コリで増幅され、ベクターおよびｍｉｎｉ−ｍｕの制限酵素地
図を素早く確認した後、酵母ＳＤ６を再形質転換するために使用
された。再形質転換後、得られたＫ．ラクチスのクローンの中で、その一つ、ク
ローン１２Ｃ４が、制限酵素 (図４、参照) によって、そしてＫ．ラクチスのタ
ンパク質とβ−ガラクトシダーゼとの結合体の配列の分析によって研究された。
このために、ｍｉｎｉ−ｍｕのｌａｃＺ末端から始まる結合体の配列 (二本鎖配
列) が、結合体から−５９ヌクレオチドの位置にある次のオリゴヌクレオチド：
５′−ＣＴＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＡＧＣＧＣＧ−３′
（配列番号：２）
を用いる配列決定によって決定された。
他の酵母もしくは真核生物のタンパク質バンク (Ｇｅｎｂａｎｋ，ＭＩＰＳ，
ＥＭＢＬ，等) の配列と比較して、このように得られたヌクレオチド配列から推
定されるタンパク質配列の分析は、クローン１２Ｃ４による配列により担持され
る配列が、Ｋ．ラクチスのトランスアルドラーゼＴＡＬ１遺伝子のプロモーター
に対応することを示している。次いで、融合体の上流領域を含む２．５ｋｂのＢ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
クローン化され、制限酵素地図が作られ (図５) 、そしてその配列が、約１．３
ｋｂにわたる逐次欠失によって決定された (配列番号：１) 。また、配列要素の
収得により、専門家は特異的なプローブを作製でき、そして分子生物学の慣用技
術によるハイブリダイゼーションによって、本発明のプロモーター領域を再クロ
ーン化できる。ＩＩ−クルイベロミセスの形質転換
。
酵母中にＤＮＡを導入できる種々の技術が使用される。
有利には、使用されるクルイベロミセスの種々の菌株が、Ito et al.
(J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168)記載の技術による酢酸リチウムおよびポリ
エチレングリコールの存在下で、細胞全体を処理することによって形質転換され
る。エチレングリコールおよびジメチルスルホキシドを用いるDurrens et al. (
Curr. Gent. 18 (1990) 7)の形質転換技術も、同様に使用された。また、例えば
、Karube et al.(FEBS Letters 182 (1985) 90)記載の方法により、エレクトロ
ポレーションによって酵母を形質転換することもできる。
また、その他の方法は、既に欧州特許第３６１９９１号明細書に詳細に記載さ
れている。ＩＩＩ−図１のプロモーターの使用による異種遺伝子の発現
。
配列番号：１に記載のＫ．ラクチスの領域の転写プロモーター活性は、菌株Ｓ
Ｄ６のｌａｃ４−８変異の相補を導く能力によって、その単離の時において示さ
れる。事実、この能力は、Ｅ．コリのｌａｃＺ遺伝子の発現の結果であり、異種
遺伝子の発現能を同じ証拠によって表している。ＩＶ−ポータブルＫ１ＴＡＬ１プロモーターの構築
ポータブルプロモーターは、ＰＣＲによって、２．５ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ断片中に、遺伝子Ｋ１ＴＡＬ１のＡＴＧコドンに関して位置＋１にＨ
ｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を、そして１１９７ｂｐ上流においてＭｌｕＩおよび
ＳａｌＩ制限酵素部位を、挿入することによって作製される (配列番号：３) 。
ＰＣＲ生産物は、ベクターｐＣＲＩＩ(Ｋｉｔ ＴＡ ＣｌｏｎｉｎｇTM Ｓｙ
ｓｔｅｍ，Invitrogen) 中にクローン化されて、ベクターｐＹＧ１７６を得る。
この構築物により、プロモーターＫ１ＴＡＬ１がＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化
によって出現することができ、ＬＡＣ４プロモーター制御下のヒト・プレプロ−
ア
ルブミン遺伝子を含む発現ベクターｐＹＧ１０１８の対応する部位へのクローニ
ングを容易にする。そのプラスミドｐＹＧ１０１８は、欧州特許出願第４０２２
１２号に記載のべクターｐＹＧ１０２３と同一であるが、遺伝子Ｋ１ＰＧＫをも
つＢｓｓＨＩＩ−ＭｌｕＩ断片を含まない点が異なる。
ｐＹＧ１７６およびｐＹＧ１０１８ベクターの５μｇが、ＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＭｌｕＩの６０ユニットによって消化される。０．８％のアガロースゲルでの
移動後、ｐＹＧ１７６について約１．２ｋｂのバンド(プロモーターＫ１ＴＡＬ
１に対応する) および約９ｋｂのバンド (ベクター部分に対応する) およびｐＹ
Ｇ１０１８について２ｋｂ (アルブミン断片に対応する) が、電気溶出される。
次いで、３パートナーの連結 (供給者New England biolabsによるバッファーお
よび温度の指示に従い) が、実施される。Chung and Miller [Nucleic acids Re
s., 16(1988) 3580] 記載の技術によるＥ．コリの形質転換後、得られた形質転
換株のプラスミドの調製は、Ish-Horowicz and Burke [Nucleic Acids Res., 9
(1981) 2989] により改変されたBirboim and Doly[NucleicAcids Res., 6 (1979
) 1513]のＳＤＳを用いるアルカリ溶菌の方法に従って行われる。酵素消化後、
好適な制限酵素プロフィルをもつプラスミドは、ｐＹＧ１８２ (図１) と命名さ
れる。
Ｋ．ラクチスの菌株ＣＢＳ２９３．９１の形質転換は、Durrens et al.[Curr.
Genetics, 18 (1990) 7]記載の方法により、ｐＹＧ１８２の１０μｇで実施さ
れる。形質転換株は、抗生物質ゲネチシン (２００μｇ／ｍｌ) を補足したＹＰ
Ｄ培地 (２％グルコース、１％酵母エキス、２％ｂａｃｔｏ−ペプトン、１．５
％ｂａｃｔｏ−寒天) 上で選択され
る。
ｐＹＧ１８２を含む菌株の数種の形質転換株によるアルブミン生産が、欧州特
許第３６１９９１号および欧州特許第５２１７６７号明細書記載の方法により試
験される。種々の形質転換株によって分泌されたアルブミンの量は、類似してお
り、約５０ｍｇ／ｌであると評価される。
配列表
（２） 配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３４９ 塩基対
（Ｂ）型： 核酸
（Ｃ）鎖の数： 二本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces
lactis)
（ix）特徴：
（Ａ）配列を表す記号：ＣＤＳ
（Ｂ）存在位置：１２９７．．１３４９
（xi）配列
（２） 配列番号：２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９ 塩基対
（Ｂ）型： 核酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（xi）配列
（２） 配列番号：３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２２６ 塩基対
（Ｂ）型： 核酸
（Ｃ）鎖の数： 二本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii）ハイポセティカル：ＮＯ
（iii）アンチセンス：ＮＯ
（vi）起源：
（Ａ）生物名：クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces
lactis)
（xi）配列
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ
// Ａ６１Ｋ 38/00
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(Ｃ１２Ｎ 1/19
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:645）