JPH0159546B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は様々な蛋白質含有種（species）をラ
ベルするのに有用な螢光ラベルに関し、更に詳し
くは螢光ラベルした抗原又は抗体を含む免疫試薬
の調製に有用な螢光ラベルに関する。 免疫分析は測定する被検体レベルが低いので測
定感度が最も重要な分野である。放射線免疫分析
の感度は10^-12Mまでに制限されており、そして
10^-8ないし10^-10Mの範囲内である場合が多い。
更に放射性ラベルには半減期が短いことや取り扱
いが危険である等の欠点がある。 螢光分析の感度は、理論的に非常に高いけれど
もバツクグラウンド螢光の存在によつて制限され
る。多くの場合バツクグラウンドを十分に減少さ
せて（適切な過及び業界公知のその他の方法に
よる）所望の感度を得ることは不可能である。 時間分解法は、目的とする特定の螢光信号を他
の非特定バツクグラウンド螢光から単離する独立
した手段を提供する。これは、ラベルがバツクグ
ラウンドよりずつと寿命の長い螢光を有する場合
であつて、かつ、系が、断続的な光源により、寿
命の短いバツクグラウンドの減衰後の暗間隔に寿
命の長いラベルが測定可能なように照射される場
合に行うことが出来る。 かような技術は詳しくはドイツ国公開公報第
2628158号に記載されている。 ユウロピウムベンゾイルアセトネート及びユウ
ロピウムベンゾイルトリフルオルアセトネートの
ような希土類金属の芳香族ジケトンキレートの寿
命の長い螢光（0.1−５ｍsec）は公知であつた。
キレート化剤は光を吸収しそして光を金属イオン
へ移し、そして金属イオンが螢光を発する。ドイ
ツ国公開公報第2628158号には螢光ラベルの使用
によるフルオロメトリー免疫分析（FIA）におけ
る時間分解法の使用が記載されており、前記螢光
ラベルの放射は、かような分析におけるバツクグ
ラウンド妨害を生成する種の放射と比べて寿命が
長い。この文献にはまたFIA法についての有用な
記載やFIA法のラジオ免疫分析（RIA）のような
その他の免疫分析方法よりすぐれた点が記載され
ている。 ドイツ国公開公報第2628158号に記載の螢光性
免疫試薬には、希土類キレートと“連結した
（conjugated）”免疫−補足系の少くとも一つの
メンバー（即ち抗体又は抗原）が含まれる。かよ
うな“連結（conjugation）”は次の二つの方法の
一つにより達成可能である。 (1) 先ず“Fluorescent Antibody Techniques
and Their Application”by A.Kawamura、
Ed.、University Park Press、Baltimore、
Meryland、1969、に記載されているような抗
原へ希土類キレートをラベル即ち取り付け、次
いで連結した抗原へ抗体を添加し、よつて抗体
と抗原を有用な様式で結合することによるか又 (2) 抗体とキレートとの双方へ結合する化学基を
介して抗体をキレートへ共有結合することによ
る。 ドイツ国公開公報第2628158号に記載の型の免
疫試薬に関する問題は、螢光ラベル種、即ち希土
類キレートが水と接触する時急冷されること、即
ち螢光を失うことである。螢光ラベル免疫試薬の
主な用途が、血液、血清等のような水性生物学的
液体の分析にあるので以下“水安定性”問題と呼
ぶこの問題は特に重大である。水安定性をこれら
物質に与えることが可能であるならばこれらの物
質は前記生物学的液体の螢光ラベルとして有用で
あり、かくしてバツクグラウンドからの信号を時
間的分解法により測定することにより、螢光免疫
分析感度を増大させることが可能となる。 ベルギー国特許公報第843647号には、ラテツク
スから導かれ、そして少くとも一つの疎水性螢光
体（hydrophobic fluor）をロードした重合体粒
子を含むシンチレーシヨン計測組成物並びに前記
ラテツクスを製造する方法が記載されている。 Leif、R.C.et al、Clinical Chemistry、
Vol.23、No.８（1977）には、水性液体に用いる希
土類キレートを安定化する技術が記載されてい
る。この方法は一般にキレート化剤を重合体ビー
ズ表面に取り付け、次いでいくつかのその他のキ
レート化剤とビーズを取り付けたキレート化剤と
を、単一の希土類原子にキレート化する工程を含
む。 米国特許第3853987号には、ラテツクス中のア
クリル酸誘導体粒子の体積全体への“トレーサ
ー”分子の組み入れ及び免疫試薬のラベルとして
のかような粒子の使用が記載されている。この特
許には粒子体積全体へのトレーサーの組み入れが
記載されているが、いかにしてトレーサー（放射
性又は螢光性）を粒子中へ組み入れるかについて
は記載されていない。かようなトレーサーをアク
リル重合体へ取り付けるか又はかような重合体の
表面へ固着させることのみが記載されている。 ラテツクスから導かれた重合体粒子中へ螢光希
土類キレートを組み入れることにより、これら螢
光希土類キレートの水性液体による螢光消失が排
除されることが見出された。従つて本発明によ
り、蛋白質含有種、特に抗原及び抗体免疫学的種
の非常に有効な水安定化螢光ラベルの類が提供さ
れる。本発明により、蛋白質含有試薬、特に前記
のような非常に有用な螢光ラベルを有する免疫試
薬の新規な類も提供される。 更に詳しくは本発明により、ロード性重合体ラ
テツクスから導かれた重合体ラテツクス粒子中に
組み入れられた螢光希土類キレートを含む水安定
化螢光ラベルが提供される。 本発明の別の態様に従つて、本発明により、ロ
ード性重合体ラテツクスから導かれた重合体ラテ
ツクス粒子に組み入れられた螢光希土類キレート
を含む水安定化螢光ラベルへ収着もしくは共有結
合した蛋白質を含む螢光ラベル蛋白質が供給され
る。 本発明の更に別の態様に従つて、本発明によ
り、ロード性重合体ラテツクスから導かれた重合
体ラテツクス粒子に組み入れられた螢光希土類キ
レートを含む水安定化螢光ラベルへ収着もしくは
共有結合した抗原又は抗体を含む螢光ラベル免疫
試薬が提供される。 また本発明の異なる態様に従つて、本発明によ
り、ロード性重合体ラテツクスから導かれた重合
体ラテツクス粒子に組み入れられた螢光希土類キ
レートを含む水安定化螢光ラベルへ収着又は共有
結合した抗原又は抗体をラベル免疫試薬として用
いることを特徴とするラベル免疫試薬を用いた免
疫分析を行う方法が提供される。 従つて本発明により、希土類金属のキレート、
好ましくはユウロピウム及びテルビウムをラテツ
クス粒子中へ組み入れることにより製造した寿命
の長い螢光希土類キレートが示される。キレート
化剤は強力に光を吸収しそしてエネルギーを有効
に金属へ移す。ラテツクスの形態により、従来は
水性液体中で螢光の消失をうけた螢光希土類キレ
ートへ水安定性が与えられる。ラテツクスから導
かれた重合体粒子であつて自身に組み入れられた
希土類キレートを有する粒子を、次いで螢光ラベ
ルとして用い、ラベル試薬を製造することが出来
る。このことは、抗原、抗体、植物レシチン、炭
水化物又はその他のかような蛋白質含有化合物を
重合体ラテツクス粒子の表面へ収着又は共有結合
させることにより達成される。 これら寿命の長い螢光ラベルを用いることによ
り、たとえば螢光免疫分析システムにおけるバツ
クグラウンドを減少させる方法のような時間的分
解法の長所を取り入れることが可能である。更に
螢光希土類キレートを前記ベルギー国特許第
843647号に記載の方法に従つてラテツクス粒子中
へ組み入れる場合、前記キレートは高レベルで粒
子表面に付着した抗原又は抗体と協働することが
出来、よつて一つの免疫学的単位、即ち一つの抗
原又は抗体の反応性を示しかつ自身に大量のラベ
ルが付着した免疫剤が生成しかくしてフルオロメ
トリー免疫分析の有効性が一層増大する。 螢光希土類キレートに関してこの明細書で用い
る場合、“安定化”もしくは“安定性”という表
現は、ラベルを水性媒質中に浸すか又は別の方法
でそれにさらした場合に、キレートが螢光性を失
われないことを意味する。 一般に螢光性挙動を示す希土類キレートはこの
明細書記載の組成物に用いることができる。かよ
うな物質に関する詳細な記載をChapter ８ of
Sinha、Shiama P.、Complexes of Rare
Earths、Pergamon Press、1966に見ることが出
来る。以下の文献にもまた本発明の組成物に有用
な型の希土類キレートに関する広範囲に亘る記載
が見られる。Lytle、F.E.、Applied
Spectroscopy、24：319（1970）及びFilipescu、
N.、et al、J.Phys.Cham.、68：3324（1964）。 螢光組成物は希土類元素、好ましくはユウロピ
ウム及びテルビウムのキレートを含む。かような
希土類元素に有用なキレート化剤は前記文献に広
範囲に亘つて記載されており、そして以下の例示
に限定されるものではない。 (1) アセチルアセトネート、ベンゾイルアセトネ
ート、ベンゾイルベンゾエート、トリフルオロ
−２−フリルアセチルアセトネートのような
１，３−ジケトン (2) フタレート (3) ナフトイルメチド、ナフトリールメチドのよ
うなナフタレート (4) ２，2′−ビピリジン−１，1′−ジオキシド、
２，2′，6′，2″−テルピリジン、４，4′−ジメ
チル−２，2′−ジピリジンのようなジピリジン
及びテルピリジン (5) フエナントロリンイソチオシアネートのよう
なフエナントロリン １，３−ジケトンは移転効率が高いのでこの発
明における使用に好ましい。 前記Filipescu等により記載された特殊なキレ
ートには、ユウロピウムジベンゾイルメチド、ユ
ウロピウムｐ−メトキシジベンゾイルメチド、ユ
ウロピウムジ−ｐ−メトキシジベンゾイルメチ
ド、ユウロピウムｐ−ニトロジベンゾイルメチ
ド、ユウロピウムジ−ｐ−ニトロジベンゾイルメ
チド、ユウロピウムジ−ｍ−メトキシジベンゾイ
ルメチド、ユウロピウムｍ−メトキシジベンゾイ
ルメチド、ユウロピウムｍ−ニトロジベンゾイル
メチド、ユウロピウムジ−ｍ−ニトロベンゾイル
メチド、ユウロピウムｐ−フエニルジベンゾイル
メチド、ユウロピウム−ｐ−フルオロジベンゾイ
ルメチド、ユウロピウムジフロイルメチド、ユウ
ロピウムジテオイルメチド、ユウロピウムジ−１
−ナフトイルメチド、ユウロピウムジ−２−ナフ
トイルメチド、ユウロピウムジイソニコチルメチ
ド、ユウロピウムベンゾイルアセトネート、ユウ
ロピウムベンゾイルトリフルオロアセトネート、
ユウロピウムテオニルトリフルオロアセトネー
ト、ユウロピウムアセチルアセトネート、ユウロ
ピウムトリフルオロアセチルアセトネート、ユウ
ロピウムヘキサフルオロアセチルアセトネート、
テルビウムジベンゾイルメチド、テルビウムｐ−
メトキシジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｍ
−メトキシジベンゾイルメチド、テルビウムｍ−
ニトロジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｍ−
ニトロジベンゾイルメチド、テルビウムｐ−フエ
ニルジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｐ−メ
トキシジベンゾイルメチド、テルビウムｐ−ニト
ロジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｐ−ニト
ロジベンゾイルメチド、テルビウムｍ−メトキシ
ジベンゾイルメチド、テルビウムジ−ｐ−フルオ
ロジベンゾイルメチド、テルビウムジフロイルメ
チド、テルビウムジテオニルメチド、テルビウム
ジ−１−ナフトイルメチド、テルビウムジ−２−
ナフトイルメチド、テルビウムジイソニコチルメ
チド、テルビウムテオニルトリフルオロアセトネ
ート、テルビウムベンゾイルアセトネート、テル
ビウムベンゾイルトリフルオロアセトネート、テ
ルビウムアセチルアセトネート、テルビウムトリ
フルオロアセチルアセトネート及びテルビウムヘ
キサフルオロアセチルアセトネートがある。 かようなキレートの螢光生成を強化する為にこ
の発明では安定化ラベル粒子に、Kleinerman、
et al.、J.Chem.Phys.、41：4009（1964）及び
Halverson et al.、J.Chem.Phys.、41：157
（1964）に記載されているような少量のルイス塩
基を含めるのが所望でありかつ好ましい場合があ
る。前記Kleinerman及びHalversonの文献に記
載されているトリオクチルフオスフインオキシド
（TOPO）以外の螢光強化物質のいずれもTOPO
と同様に有用でありそしてある使用雰囲気下で好
ましい場合があるけれども、TOPOは好ましい
ルイス塩基である。 本発明のラテツクスは必ずしもそうでなくても
よいけれども、好ましくは、前記ベルギー国特許
第843647号に記載の物質及び方法を用いて製造す
る。前記方法は一般に未凝固、未溶解のロード性
重合体ラテツクス粒子の存在下で水混和性溶媒の
疎水性物質溶液の親水性を、疎水性物質が実質的
に水混和性溶媒相中に溶解状態で存在しない点ま
で増大させる工程を含む。水混和性溶媒の疎水性
物質溶液へ水を添加することにより親水性を増大
させる。この方法を用いることによるキレート組
み入れの利点は螢光希土類キレートを重合体ラテ
ツクス粒子の約7.5重量％までの濃度で粒子中へ
組み入れられることである。 ロードは、更に、水混和性溶媒を蒸発させるこ
とにより行い、そして完了する。 好ましい水混和性溶媒は有機溶媒であつて次の
(a)−(e)の性質を有するものである。 (a) 20℃において蒸留水中に溶解可能である（即
ち混和可能である）（20℃において水80容量部
中に溶媒少なくとも約20容量部程度まで）。 (b) 約20℃を超える沸点を有する（大気圧におい
て）。 (c) 本発明の実施に有用なロード性重合体ラテツ
クスと化学的に反応して有害効果を及ぼさな
い。 (d) 20℃において前記ロードポリマーラテツクス
の約５重量％を超える量を溶解しない。 (e) 以下に記載する螢光希土類キレートの溶媒と
して働く。 本発明の好適な実施に有用な水混和性溶媒に
は、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノー
ル、アセトン等があるがこれらに限定されるもの
ではない。 この明細書で用いる“ロード性重合体ラテツク
ス”という表現は、(i)重合体不連続相（粒子）を
有し、(ii)水性連続相を有しそして(iii)以下の試験を
行う際凝固又は沈殿しない重合体ラテツクスとし
て定義される。 25℃において約10ないし約20重量％の分散相を
含有する重合体ラテツクス250mlを等容のアセト
ン中へゆつくり撹拌混入する。添加はアセトンを
緩徐に撹拌しながら、安定な均一速度で１分間に
亘つて行わねばならない。撹拌を中断しそして得
られたブレンドを約25℃で10分間放置する。10分
間経過した時点でブレンドを観察する。ロード性
重合体ラテツクスはこれら試験条件下で目に見え
る凝固を実質上おこさないか又は沈殿しない重合
体ラテツクスである。 前記(i)−(iii)の条件に適合する重合体ラテツクス
は有用であるが、本発明の好適な実施に特に有用
な重合体ラテツクスは不連続相（粒子）が次の(a)
−(c)を重合した重合体を含む重合体ロード性ラテ
ツクスである。 (a) 式 （式中R¹は水素又はメチルであり；R³及びR⁴
は水素又は炭素数１ないし４の低級アルキルで
あり；R⁵及びR⁶は水素、置換カルボニルもし
くはスルホニル（たとえばハロアルキルカルボ
ニル、ビニルスルホニル等）であるか又はハロ
ゲン、アルキルスルホニルハライド等でα位を
置換可能な炭素数１ないし４の低級アルキルで
あり；またR⁵はR⁴と共に融合ベンゼン環を完
成させるに必要な原子を構成してもよい）で表
わされるスチレン単量体０ないし100重量％。
特に有用なスチレン単量体にはスチレン、ビニ
ルトルエン、２−ビニルメシチレン、１−ビニ
ルナフタリン（２−クロロエチルスルホニルメ
チル）スチレン及びｍ＋ｐ−クロロメチルスチ
レンがある。 (b) 式 （式中Ｒは水素であるか炭素数１ないし約５の
アルキルであり；R¹は水素又はメチルであ
り；R²は水素、ハロゲン、メチル、シアノ、
基

【式】又はエステル

【式】 （式中R⁷は炭素数１ないし６の脂肪族基であつ
て、アミン基で置換可能であり、そのアミン基
は更に第四級アンモニウム基に置換可能であ
る）であり；そしてR¹⁰は水素又はR⁷である）
で表わされる一以上のエテン型単量体から誘導
した単位０ないし約95重量％、並びに (c) スルホン酸基又はそのアンモニウムもしくは
アルカリ金属塩含有親水性エテン型単量体約０
ないし約10重量％。 前記エテン型単量体の分子量は、(a)、(b)及び(c)
の少くとも一つが存在するという条件で多くて約
300である。更に(a)、(b)又は(c)以外の単量体を共
重合が可能な場合に添加することが出来る。 この明細書記載の単量体の割合は、単量体を慣
用のフリーラジカル重合プロセスにおいて重合反
応器に装填する時の種々の単量体の相対割合に基
づくことに注目されたい。かような反応からの生
成物では、装填した単量体から由来する割合があ
る程度合成重合体ラテツクス製造の当業者に周知
である種々な理由により変わるかもしれない。 “ロード性”重合体ラテツクスは一、二、三、
四又はそれ以上の異なる単量体から製造可能であ
るが、本発明の実施に用いるに好ましいラテツク
スは、本発明の最終生成物に所望の特定の性質に
依存して一般に二ないし四個の異なる単量体を含
む。この型のラテツクスの製造は周知であるの
で、前記好ましいロード性重合体ラテツクスを一
般に、水性媒質中に分散した単量体と一つ以上の
適当な界面活性剤とのフリーラジカル開始反応に
より製造することを指てきする以外はかような操
作の詳細をこの明細書中に記載する必要はないと
思う。例えば、米国特許第2914499号、同第
3033833号、同第3547899号及びカナダ国特許第
704778号参照。 ロード性ポリマーラテツクスとして用いるに一
層好ましい重合体では(i)式

【式】で表 わされるエテン型単量体がアクリロニトリルか又
は、メチル、エチル、プロピル及びｎ−ブチルア
クリレート並びにこれらのメタクリレートから成
る群から選んだエステルでありそして(ii)親水性エ
テン型単量体が好ましくは末端炭素原子へスルホ
ン酸基（又はその水溶性塩）が付いた単量体から
選んだものであり、これら単量体には次のような
構造を有するものがある。 （＊＝Ｈのかわりにアルカリ性金属カチオン、好
ましくはNa⁺もしくはK⁺又はアンモニウムイオ
ンとすることが可能である。） スルホン酸塩を含む親水性エテン型単量体の好
ましいサブクラスの一般式は次の通りである： （式中R¹はメチル又は水素であり；R⁸は炭素数
１ないし５の直鎖又は分枝鎖アルキレン基であ
り、メチレン、エチレン、２−メチルエチレン、
トリメチレン、テトラメチレン、２，２−ジメチ
ルエチレン、３−メチルプロピレン、３，３−ジ
メチルプロピレン、２−メチルプロピレン等があ
り；Ｍはアンモニウム、水素又はアルカリ金属カ
チオンであり；そしてＱはＯ又はNHである）。 非常に好ましいビーズ組成物には、 (1) ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−コ−スチレ
ン−コ−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸（30：65：５） (2) ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−コ−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸
（90：10） (3) ポリ〔スチレン−コ−（２−クロロエチルス
ルホニルメチル）スチレン−コ−２−アクリル
アミド−２−メチルプロパンスルホン酸（88：
７：５） (4) ポリ〔スチレン−コ−アクリルアミド−コ−
（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレ
ン−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロ
パンスルホン酸（75：14：６：５） (5) ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−コ−スチレ
ン−コ−ｍ＋ｐ−クロロメチルスチレン−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスル
ホン酸（33：30：35：２） (6) ポリ〔ｎ−ブチルアクリレート−コ−スチレ
ン−コ−ｍ＋ｐ−クロロメチルスチレン−コ−
２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチ
ルアンモニウムメトサルフエート〕（35：50：
10：５）及び (7) ポリ〔スチレン−コ−アクリルアミド−（２
−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン〕
（70：25：５） がある。 前述から、単量体の多くの組み合せを、本発明
の最も好ましい態様に従つた合成重合体状ラテツ
クスの製造に使用可能であることは明らかであ
る。しかしながら多くの重合体ラテツクスは前述
の“ロード性重合体ラテツクス”ではない。この
為所定のラテツクスを“ロード性”であると想定
する前に前述の試験をラテツクスに行うことが望
ましい。重合体ラテツクスを商業生産する際、バ
ツチ間の再現性がわりあいに低くなることが時々
あるので前記試験を対照操作として用いることも
望ましい。ロード性重合体ラテツクス製造の好ま
しい方法を実施例に先立つて以下に掲げる。 前記方法で製造したラテツクスの不連続相から
成る分散重合体粒子の平均径は約0.01ないし約
0.2μｍである。従つてこのラテツクスはコロイド
性の分散液であると考えることが出来る。更にラ
テツクス粒子の好ましい濃度範囲は、螢光希土類
キレートは別として計算して粒子の重合体部分の
濃度が約0.03ｇ／c.c.ないし約0.25ｇ／c.c.である。 ラテツクス粒子中の螢光希土類キレートの濃度
も粒子が目的とされる特定の有用性に依存してあ
る程度変化する。それ故、個々の粒子には最低一
つの螢光希土類キレートがそして最高約7.5重量
％のキレートが含まれうる。この範囲の上限での
キレート濃度レベルにより、10^-14〜10^-15Mもの
低レベルの被検体の検出が可能になる。金属１：
キレート化剤３：ルイス塩基２のモル比が好まし
い態様である。螢光ラベルを用いる特殊目的に基
づいてラテツクスの粒子サイズを選ぶことが出来
る。しかしながら0.01ないし0.15μｍの径のラテ
ツクス粒子がほとんどの免疫分析に好ましい。 好ましいラテツクス製造方法 本発明の組成物を製造する好ましい方法では、
水混和性溶媒に溶解した螢光希土類キレートの溶
液中へロード性重合体ラテツクスを添加する順序
が重要である。この順序を逆にすると、ラテツク
スから凝固及び沈殿が全く望ましくない形が少し
も有用でない形で生じるか又はラテツクス粒子の
外側にかなりの割合の螢光希土類キレートの堆積
が生じる。 本発明の実施に用いるロードされた重合体ラテ
ツクス組成物の製造において、所要の方法で混合
する (a) ロード性重合体ラテツクス及び (b) 螢光希土類キレートの溶液（水混和性溶媒の
溶液） の相対的な体積は一般に臨界的でないと思われ
る。即ち螢光希土類キレートが溶液から押し出さ
れる間（前述のごとく溶液の親水性が増大するた
めに）、ロード性重合体ラテツクス粒子が溶液中
に存在する限り、ロードされた重合体ラテツクス
粒子が生成する。たとえば本発明の一般的な方法
の一態様では次の(a)及び(b)の工程が含まれる。 (a) 螢光希土類キレートの溶液の親水性に悪影響
を与えるには不十分な量のロード性重合体ラテ
ツクスを溶液からキレートを押し出すのに必要
な程度まで導入すること。及び (b) 水混和性溶媒からラテツクス粒子中への螢光
希土類キレートの移動を生じさせるのに十分な
量の水の生成した混合物への添加。 このようにしてキレートの比較的希い溶液を用
いて粒子に対し比較的大量の螢光希土類キレート
を含むロードされた重合体ラテツクスを製造する
ことができる。それ故螢光希土類キレート溶液の
親水性の必要な増大（この間に螢光希土類キレー
トは溶液に不溶性になる）が得られる一つ以上の
方法があることが理解されよう。この為“螢光希
土類キレートを溶液中で不溶性にするのに少なく
とも十分な水”（本発明の本質的な工程参照）と
いう表現をこの明細書で用いる場合、この表現で
意味される“水”は水ばかりでなく、前記ロード
性重合体ラテツクスの“水性”部分並びに一つ以
上の溶解塩溶液の形の水等も含まれる。 しかしながら、ロード性重合体ラテツクスの分
散相重合体“固体”（即ち粒子）が10重量％を超
える場合、かようなラテツクスと混合する螢光希
土類キレートの相対量はロード性重合体ラテツク
ス100容量部に対し約50ないし約200容量部である
ことが一般に好ましく、そして特に、ラテツクス
に重合体ラテツクス粒子が約12ないし約20重量％
が含まれる場合、ロード性重合体ラテツクス１容
量部につき螢光希土類キレート約１容量部である
のが更に好ましい。本発明に従つて、(i)ラテツク
スと(ii)螢光希土類キレート溶液とを徐徐に混合す
るのに必要とされる最適時間は、たとえば次の
(a)、(b)、(c)の因子に依存していろいろな場合に変
化する。 (a) ロード性重合体ラテツクス、螢光希土類キレ
ート及び水混和性溶媒の同一性； (b) 混合すべきそれぞれの物質における螢光希土
類キレート及び重合体ラテツクス粒子の相対濃
度並びに (c) ロード性重合体ラテツクス及び螢光希土類キ
レート溶液の相対量。 しかしながら螢光希土類キレート溶液中へのロ
ード性重合体ラテツクスの緩徐な混合は少なくと
も約10秒を超える時間で行うのが一般に好まし
い。詳しくはロード性重合体ラテツクスの重合体
“固体”含量が約12重量％を超える場合に前記時
間をかけた混合が好ましい。速すぎる混合によつ
て系の第二固相の生成及び／又は重合体ラテツク
ス粒子の凝固又は沈殿が生じることがわかつた。
少なくとも約20秒を超える緩徐な混合が一層好ま
しい。 一般に前述のような有用なロードされた重合体
ラテツクス組成物を最初に製造した後、かような
ロードされた重合体ラテツクス組成物の価値ある
有用性を害することなく、場合によつては、水混
和性溶媒の一部又は全部を組成物から除去するこ
とができる。種々な条件下（たとえば約40℃未満
の温度）、好ましくは減圧下で蒸発させることに
より水混和性溶媒を除去する事が好ましい。好ま
しくは、水混和性溶媒の少なくとも約半分を最初
の相溶性ブレンド（ロード性重合体ラテツクス／
螢光希土類キレート／水混和性溶媒のブレンド）
から除去し、それによつて好ましい有用なロード
された重合体ラテツクスの一つを生成する。かよ
うな好ましいラテツクスは自身のラテツクス特性
を保持している。即ち前記ラテツクスは、場合に
よつては水混和性溶媒を含む（水混和性溶媒は前
記連続相の約30重量％以下であるのが好ましい）
水性連続相並びに、螢光希土類キレートが均一に
分布したロードされた重合体ラテツクス粒子を含
む分散相を有する。ラテツクスと水混和性溶媒と
の最初のブレンドから水混和性溶媒及び／又は水
を除去することにより当然高“固体”含量の組成
物となる。 ロードされた重合体ラテツクスの安定性を改善
して長期間の貯蔵の際ラテツクスが徐々に沈殿す
る傾向を阻止することが所望な場合には、ラテツ
クスをゼラチンのような親水性コロイドの水性溶
液と混合することができる。かような態様が特に
好ましい。所望ならロードされた重合体ラテツク
ス重量に基づき約１重量％以上の親水性コロイド
を用いて安定化ラテツクス生成物を製造すること
もできるが、得られた混合物中の親水性コロイド
及び／又はグラフト化澱粉のような澱粉の好まし
い最低量は前記重量に基づき約１重量％である。 前述のような適切な“ロード性”重合体ラテツ
クスを与える、装填重量比50：40：10におけるポ
リ（ｎ−ブチルメタクリレート−コ−スチレン−
コ−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸の製造例を以下に掲げるが本発明はこれに限
定されるものではない。 ｎ−ブチルメタクリレート200ｇ、スチレン160
ｇ並びにNaOH7.7ｇ、H₂O350ml、２−アクリル
アミド−２−メチルプロパンスルホン酸及び“ト
ライトン770”（40％）２ｇから成る溶液を容積１
の添加フラスコに加えた。前記“トライトン
770”はロームアンドハース社により製造されて
いる液状のアルキルアリールポリエーテルサルフ
エートのアニオン性ナトリウム塩界面活性剤であ
る。添加工程の前に混合物を30分間撹拌した。
250mlの添加漏斗にK₂S₂O₈2ｇ含有H₂O200mlを添
加した。添加フラスコ及び添加漏斗を両方とも３
容の反応フラスコへ接続した。このフラスコは
撹拌下95℃に保たれており、H₂O800ml及び“ト
ライトン770”（40％）４ｇが含まれていた。重合
を開始する為にNa₂S₂O₅1.2ｇを反応フラスコへ
添加し、すぐ続いて単量体混合物とK₂S₂O₈溶液
を添加した。添加時間は約30分であつた。重合を
更に30分間すすめた。次いでラテツクスを冷却
し、そして一晩透析して13.8％の固体含量を得
た。 ロード性重合体ラテツクスの螢光希土類キレー
トのロードは前述のごとく行う。次いでロードさ
れた重合体ラテツクス粒子を種々な蛋白質含有種
のラベルに使用可能であり、ラベルは、収着又は
共有結合のいずれかにより粒子表面へ蛋白質を結
合することにより行う。このようにしてラベルす
ることができる蛋白質含有種としては、酵素、抗
原、抗体、植物レシチン及び同様の組成物があ
る。 蛋白質を重合体粒子表面へ結合する方法は周知
であり、そしてかような方法及び結合を行う為の
特殊な結合基についての多数の特許及び技術文献
がある。ドイツ国公開公報第2548427号には有用
なかような方法が記載されている。以下の例１及
び２には本発明に従つた有用な収着及び共有結合
方法が示されている。 蛋白質含有種を重合体状粒子へ共有結合するこ
とが所望な場合、重合体ラテツクス製造において
次のような単量体を用いることが好ましい。即ち
前記単量体とは結合さるべき酵素、抗体、抗原、
蛋白質含有種又は炭水化物上のアミノ、アミド又
はスルホンアミド基と反応しうるクロロベンジ
ル、クロロアセチル、クロロエチルカルボニル、
クロロエチルスルホニル、アクリロイル、又はビ
ニル−スルホニル基を粒子形成後も保有する単量
体である。 蛋白質含有種の取り付けに従つて、重合体ラテ
ツクスとして用いるに非常に好ましい螢光ラベル
重合体は次の構造式 （式中Q¹は蛋白質含有種、ｎは０又は１、そし
てR⁹は(a)−SO₂CH₂CH₂−、

【式】から成る基から選んだ結 合基である）で表わされる重合体である。 結合を行う為のその他の代表的な方法は次の特
許に記載されている。米国特許第3088875号、同
第3766013号、同第3619371号、同第3809613号、
同第3853987号、同第3963441号、同第3551555号
及び同第3646346号。 前記特許のすべてに、蛋白質含有種、特に抗原
及び抗体を、本発明の実施に用いる重合体ラテツ
クス粒子に有用な型の種々な重合体種へ収着又は
共有結合する方法が記載されている。 いつたん前述のごとく製造したなら、螢光ラテ
ツクス粒子でラベルした免疫学的に反応性のある
種を螢光免疫分析、詳しくは前記ドイツ国公開公
報第2628158号に記載のような、バツクグラウン
ドから区別する為の特殊な検出信号の時間的分解
法を利用した螢光免疫分析に用いることが出来
る。この時間的分解様式（即ち時間的分解法）で
は、試料を断続的に励起させ、そして寿命の長い
螢光ラベルが依然として強く発光し、螢光のその
他の源が衰微する暗サイクル間でのみ情報を得
る。パルス化レーザー、連続励起ビームの機械的
チヨツプ、励起ビーム内外への試料の移動等のよ
うな種々な方法で断続的励起をさせることが出来
る。更に断続的励起には試料によるエネルギーの
大量の吸収をおこすことなく、高い放射力の使用
を可能にするという利点があり、従つて試料の光
劣化が減じられる。 この明細書に記載の免疫試薬が有用であること
が分つている典型的な前記螢光放射線免疫分析法
は米国特許第4020151号、同第3939350号及び同第
391654号に記載されている。 以下の例により本発明の首尾よい実施を示すが
本発明はこれに制限されるものではない。 すべての例においてラテツクス中に、ユウロピ
ウムコンプレツクス、ユウロピウム（）（テオ
ニルトリフルオロアセトン）₃とトリオクチルフオ
スフインオキシド（TOPO）（比：Eu コンプレ
ツクス１：TOPO ２）を組み入れた。このこと
はベルギー国特許第843647号の方法に従つて行つ
た。 例 １ ロードされた重合体ラテツクス粒子への牛のγ
−グロブリンの収着 牛のγ−グロブリン（BGG）（50mg）を蒸留水
100mlに溶解した。これへユウロピウム組み入れ
ラテツクス、ポリ（ｎ−ブチルアクリレート−コ
−スチレン−コ−２−アクリルアミド−２−メチ
ルプロパンスルホン酸（30：65：５）の７％懸濁
液250μを添加しそしてカーボネート緩衝液を
用いてPHを９に合せた。この混合物をバイオゲル
Ａ−５（バイオラツド、リツチモンド、カリフオ
ルニアから入取）樹脂（50ml、100〜200メツシ
ユ）を用いてクロマトグラフさせ、そして水を溶
出した。使用前に0.22μｍのミリポア フイルタ
ーでラテツクスを過した。ラテツクスはBGG
を反応する抗体により特異的に沈殿性であつた。 例 ２ ロードされた重合体ラテツクス粒子への抗原の
共有結合 Ａ ユウロピウム組み入れラテツクスへのBGG
の結合 BGG（100mg）を撹拌しながら蒸留水200mlに
溶解した。次いでPHを6Nの水酸化ナトリウム
で9.6に合せそして溶液を水浴振とう機中で11
℃に冷却した。ユウロピウム組み入れラテツク
ス、ポリ〔スチレン−コ−（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレン−コ−２−アクリ
ルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸
（88：７：５）の７％懸濁液0.5mlを添加しそし
て反応混合物を11℃で72時間振とうした。これ
へエタノールアミン0.1mlを添加しそして混合
物を11℃で更に24時間振とうした。この混合物
を蒸留水流に対して72時間透析した。透析後、
透析物をバイオーゲルＡ−５樹脂（50ml、100
〜200メツシユ）で２回クロマトグラフさせそ
して各回毎に水で溶出した。凍結乾燥後の収量
は87.5mgであつた。 Ｂ ユウロピウム組み入れラテツクスへのＬ−チ
ロキシンの結合 Ｌ−チロキシン（0.15ｇ）をPH12（6Nの水酸
化ナトリウムで調製）において撹拌蒸留水60ml
に溶解した。径0.05μｍのユウロピウム組み入
れラテツクス、ポリ〔スチレン−コ−（２−ク
ロロエチルスルホニルメチル）スチレン−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスル
ホン酸〕（88：７：５）の７％懸濁液９mlを添
加しそして反応混合物のPHを6Nの水酸化ナト
リウムで12に合せた。反応混合物を11℃で４日
間振とうした。ブチルアミン（0.5ml）を添加
しそして振とうを24時間継続した。反応混合物
を蒸留水流に対し３日間、次いで１％の牛の血
清アルブミン４に対し更に３日間透析した。
透析反応混合物を徐々に２回バイオゲールＡ−
５樹脂50mlに通した。溶出液焼結ガラス漏斗
（粗グレード）に通し、次いで蒸留水流に対し
４日間透析し、そして凍結乾燥した。生成物の
重量は0.5ｇであつた。沃素の理論値20.5％
（重合体の完全な反応）；実測値3.8％。 Ｃ ユウロピウム組み入れユウロピウムへのＬ−
チロキシン−うさぎのγ−グロブリンの結合 パート１ Ｌ−チロキシン−うさぎのγ−グロ
ブリンの製造： 撹拌蒸留水200mlにうさぎのγ−グロブリ
ン（RGG）0.5ｇ（3.3×10^-6モル）を溶解し
た。１−シクロヘキシル−３−（２−モルホ
リノエチル）−カルボジイミドメト−ｐ−ト
ルエンスルホン酸0.3ｇ（7.1×10^-4モル）を
撹拌溶液へ添加した。 Ｌ−チロキシン（T₄）0.4ｇ（5.2×10^-4モ
ル）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド120ml
に溶解した。溶液のPHを6.5に合せ（希塩酸
で）、そしてこの溶液を徐々に20分間に亘つ
て撹拌蛋白質溶液へ添加した。添加終了時点
で更にカルボジイミド0.4ｇを添加しそして
反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合
物を蒸留水流に対し４日間、次いで１％の牛
の水性血清アルブミン４に対し３日間透析
した。透析物を凍結乾燥した。その重量は
0.53ｇであつた。Ｌ−チロキシン含量のスペ
クトロフオトメトリー分析によりうさぎのγ
−グロブリン一個につき14個のＬ−チロキシ
ン単位の割合が示された。単位14に基づく沃
素の理論値4.4％；実測値4.7％。 パート２ ユウロピウム組み入れラテツクスへ
のＬ−チロキシン−うさぎのγ−グロブリン
の結合： 前述のごとく製造したＬ−チロキシン−う
さぎのγ−グロブリン（0.1ｇ）を蒸留水200
mlに溶解した。PHを6Nの水酸化ナトリウム
で9.5に合せそしてユウロピウム組み入れラ
テツクス、ポリ〔スチレン−コ−（２−クロ
ロエチルスルホニルメチル）スチレン−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
ルホン酸〕（88：７：５）の７％懸濁液0.5ml
を添加した。反応混合物を11℃で３日間振と
うした。エタノールアミン（0.1ml）を添加
しそして振とうを24時間継続した。反応混合
物を蒸留水流に対し48時間透析し次いでバイ
オーゲルＡ−５樹脂50ml上で２回クロマトグ
ラフさせた。液体の最終体積は約200mlであ
つた（0.2mg／固形分dl）。78 T₄−RGG／ラ
テツクスとして計算した沃素の理論値（100
分率）、1.4％；実測値0.88％ T⁴−RGG／ラテツクス＝40 例 ３ 螢光性ラテツクスラベル抗原の抗体への特異的
な結合 Ａ 抗血清によるラテツクス−結合抗原のアグル
チネーシヨン 牛のγ−グロブリンが共有結合している径
0.1μｍのユウロピウム組み入れラテツクス粒子
の0.02％懸濁液10マイクロリツトルを、牛のγ
−グロブリンに対するうさぎの抗血清25μと
共にスナツプキヤツプ付きのプラスチツク製管
中で温置した。全体積は145μであつた（リ
ン酸塩緩衝生理的食塩水、PH7.5）。数時間後沈
殿が見られこれは365nｍの光をあてた時螢光
を発した。免疫のないうさぎの血清を用いた平
行試験では沈殿は見られなかつた。 Ｂ 抗体を被覆したマイクロメーターサイズのビ
ーズへの抗原を被覆した螢光ラテツクス粒子の
特異的結合 以下のものを含む1.5ml容のスナツプキヤツ
プ付きのプラスチツク管中で試験溶液を製造し
た： １ 0.075モルナトリウムバルビトール緩衝液、
PH8.5の３％トライトンＸ−100（ロームアン
ドハース社）溶液100μ、及び ２ 牛のγ−グロブリンが共有結合しているユ
ウロピウム組み入れラテツクス粒子（即ち抗
原被覆ラテツクス粒子）、ポリ〔スチレン−
コ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）
スチレン−コ−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸〕（88：７：５）0.1μｍ
の0.1％懸濁液（0.075モルナトリウムバルビ
トール緩衝液、PH8.5中）100μ、及び ３ （うさぎの）抗−BGGのγ−グロブリン
画分が収着したビーズ（径6μｍ）（即ち抗体
被覆ビーズ）10、５、2.5、1.25、0.63又は
0.31mg、及び ４ 免疫のないうさぎのγ−グロブリンが収着
したビーズ（即ち対照ビーズ）10、５、2.5、
1.25、0.63又は0.31mg 対照ビーズ又は抗体被覆ビーズの添加後管を
１時間放置した。径6μｍのビーズが沈殿しそ
して管をUV（365nｍ）光で観察しラテツクス
の分布をしらべた。すべての対照において、沈
殿ビーズ中にユウロピウムによる赤色螢光を見
ることは出来なかつた。溶液とビーズの界面に
おいてラテツクスのフイルムが見られた。抗体
被覆ビーズ含有物では沈殿ビーズにおいてかな
りの螢光が見られそして、これらの管を比較し
うる量の不活性ビーズが存在する管と比べた場
合上澄の螢光の減少は明らかであつた。 Ｃ BGG被覆螢光性ラテツクス／抗BGG被覆ビ
ーズ系のBGGに対する応答 パートＢに記載の抗体被覆ビーズの10％懸濁
液100μ、パートＢに記載の0.1％抗原被覆ラ
テツクス100μ並びに10^-4、５×10^-5、2.5×
10^-5、1.25×10^-5、6.25×10^-6、3.13×10^-6及び
0Mの牛のγ−グロブリン含有バルビタール緩
衝液100μを1.5ml容のスナツプキヤツプ付き
プラスチツク管へ装入した。室温で１時間温置
後ビーズは沈殿しそしてビーズ及び上澄のユウ
ロピウム螢光が365nｍの光を照射した時測定
可能であつた。牛のγ−グロブリンの濃度を増
大させるにつれ上澄の螢光の一定の単調な増大
及びビーズの螢光の同時の減少がみられた。こ
の系の中点は牛のγ−グロブリン1.25×10^-5M
と2.5×10^-5Mとの間であつた（管中で１：３
に希釈した場合、4.1ないし8.3×10^-6Mの値と
なつた）。 例 ４ 比較例 以下の例によりユウロピウムキレートを多糖類
ビーズへロードする試みを示した。 材料：AH−セフアロース−4B、フアーマシア
フアインケミカル社（ニユージヤージー州、ピス
カタウエイ）により販売されている湿潤ビーズ径
40〜190μのビーズ生成アガロースゲル AH−セフアロース4Bビーズ（食塩中）の10％
懸濁液２ｇを25℃で混合しながらアセトンの0.5
％Eu⁺³溶液２ｇへ添加した。溶媒を60℃で除去
した。ビーズはこの工程で除かれてしまつたので
過を全く行わなかつた。可視の沈殿が10分以内
に生じた。次いでビーズに紫外線をあて螢光の存
在を検出したが螢光は見られなかつた。従つてこ
れらのビーズは本発明方法によりロード不可能で
あるという結論が得られた。 抗原のような蛋白質をビーズ表面へ取りつける
ことは可能であるけれども、免疫学的反応（即ち
抗体＋Ag→抗体Ag）の結果として生じることの
ある沈殿を、単に重く溶液中に不可能な為生じた
沈殿から区別することは不可能であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ロード性重合体ラテツクスから導かれた重合
   体ラテツクス粒子に螢光希土類キレートを組み入
   れて成る水安定性螢光ラベル。 ２ ロード性重合体ラテツクスから導かれた重合
   体ラテツクス粒子に螢光希土類キレートを組み入
   れて成る水安定性螢光ラベルへ収着もしくは共有
   結合した蛋白質を含んで成る螢光ラベルされた蛋
   白質。