JPH0843391A

JPH0843391A - 抗原抗体反応の測定方法

Info

Publication number: JPH0843391A
Application number: JP17835894A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Munebayashi; 孝明宗林
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-07-29
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1996-02-16

Abstract

(57)【要約】【構成】不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を用い
る抗原抗体反応の測定方法において、不溶性磁性粒子と
反応した不溶性標識粒子に抗原抗体反応による特異的結
合を解離させる解離液を加えて該不溶性標識粒子を解離
させ、解離した該不溶性標識粒子の標識強度を測定する
方法。【効果】本発明方法によれば、磁性粒子および標識粒
子を用いることにより、迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が実施
でき、かつ、通常のＦＩＡよりも測定感度を上昇させて
抗原、抗体反応を測定することができるだけでなく、抗
原抗体反応の特異的結合を解離させて遊離した標識粒子
のみを計測するため、磁性粒子の影響を受けることな
く、より正確な標識強度の計測が可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗原・抗体反応の測定方
法に関する。詳しくは、磁性粒子および標識粒子を用い
る抗原・抗体反応の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定
法が種々の疾病の早期検出法や、極微量の物質の検出法
として知られている。高感度な免疫測定法には種々の方
法があり、抗体または抗原に対し標識物質としての、放
射性同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などを
結合して用いるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素
イムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩ
Ａ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）などが知られてい
る。また、ラテックス等の不溶性担体粒子に担持された
抗体または抗原と、それに対応する抗原または抗体とを
反応させ、その反応に伴う反応混合物の透過光の変化か
ら抗原抗体反応の速度を測定する方法（ＬＰＩＡ）が知
られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、かかる従来技
術は種々の問題を持つ。たとえば、ＲＩＡはＲＩの取扱
いおよび廃棄に対する制約がある。ＬＰＩＡは簡便性、
操作性などに優れた方法であるが、検出感度の改良が望
まれている。ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡなどは取扱いの安
全性については有利であるが、検出感度はＲＩＡに若干
劣る。また、ＥＩＡは酵素反応を伴うため取扱いもＦＩ
Ａほど簡便ではない。ＬＩＡも、分離後、発光させるた
めに水酸化ナトリウムなどの試薬を加える必要があるた
めＦＩＡに比べると複雑であるという欠点があった。

【０００４】ところで、ＥＩＡ、ＦＩＡ、ＬＩＡなどの
方法は、通常、反応結合物と未反応物を分離、洗浄する
操作（Ｂ／Ｆ分離）を必要とするが、これらの方法にお
いて、測定操作を煩雑にし、時間のかかるものにしてい
る主な原因はこれらのＢ／Ｆ分離である。Ｂ／Ｆ分離と
しては、通常、チューブ、マイクロタイターウェルなど
の反応管から、未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗
浄液の供給、インキュベーション、洗浄液の廃棄という
洗浄操作を数回繰り返すことが行われている。

【０００５】Ｂ／Ｆ分離を比較的迅速、簡便に行うため
にメンブレン、グラスファイバーなどのフィルターを利
用したものがある。これらは、液の流れる方向が一方向
であるため（液の廃棄時に吸い出す必要がない）、洗浄
工程に必要とする時間も短くてすみ、また、自動化など
装置化しやすい特徴がある。しかしながら、これらの方
法にも、種々の問題点がある。

【０００６】フィルターに一次抗体又は抗原を直接結合
させたものでは、フィルターと測定したい項目とが対応
している必要があり、フィルターの保管、供給などを考
えると自動化装置とする場合に問題がある。また、ラテ
ックス等の微粒子に一次抗体または抗原を結合し、反応
後、フィルターに捕集するタイプのものでは、フィルタ
ー上に孔径より大きい粒子を捕集するものと、フィルタ
ーへの粒子の吸着を利用するものがある。前者では、フ
ィルターが目詰まりすることにより二次抗体などの標識
物が完全に洗浄しきれなくて、バックグラウンドの上昇
を生じる可能性がある。また、後者では、フィルターへ
の吸着の原因が解明されていないため、粒子を完全に捕
集しているかどうかの判断、また、吸着しやすい素材を
用いることによるバックグラウンドの上昇などの問題が
残る。また、フィルター内部への吸着を利用するため、
ＥＩＡには応用できるが、ＦＩＡの場合、励起光がとど
かない可能性もあり応用できない。

【０００７】一方、Ｂ／Ｆ分離の改良法として、磁性粒
子を用いたものも種々報告されている。この方法は、磁
力を利用して磁性粒子を集める操作を迅速、簡便にでき
る特徴がある。しかしながら、標識としてＲＩを用いる
もの以外の、酵素、蛍光色素、化学発光性色素、あるい
はそれらを標識した不溶性担体粒子を使用する系では、
いずれも最終的には光学的計測を必要とするため最終測
定液中に残存する磁性粒子の光学的計測に与える影響が
大きいことが知られている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を解決すべく鋭意検討した結果、磁性粒子を用いること
により迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が実施でき、かつ、標識
粒子を用いることにより通常のＦＩＡよりも測定感度を
上昇させた免疫分析方法を見出した。即ち本発明の要旨
は、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を用いる抗原
抗体反応の測定方法において、不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子に抗原抗体反応による特異的結合を解
離させる解離液を加えて該不溶性標識粒子を解離させ、
解離した該不溶性標識粒子の標識強度を測定する方法に
存する。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を用いる
抗原抗体反応の測定方法としては、例えば、以下のよう
な方法が挙げられる。方法１：下記の工程からなる抗原・抗体反応の測定方
法。（ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）工程（ａ）と同一の測定しようとする抗原又は抗
体に対する抗体又は抗原を担持させた不溶性標識粒子か
らなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した
該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１０】方法２：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。（ａ）測定しようとする抗体に対する抗原を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）測定しようとする抗体の免疫グロブリンクラスと
特異的に反応する物質を担持させた不溶性標識粒子から
なる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した該
不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１１】方法３：下記の工程からなる抗体の測定方
法。（ａ）測定しようとする抗体に対する抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、測定しようとする
抗体とを反応容器の液体媒体中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）測定しようとする抗体と特異的に結合する抗原を
担持させた不溶性標識粒子からなる第２試薬と、工程
（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液
体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１２】方法４：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。（ａ）測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は
抗原を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
測定しようとする抗原又は抗体とを反応容器の液体媒体
中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）測定しようとする抗原又は抗体と同じ特異性を有
する抗原又は抗体を担持させた不溶性標識粒子からなる
第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶
性磁性粒子とを液体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１３】方法５：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。（ａ）測定しようとする抗原又は抗体と同一の抗原又は
抗体を担持させた不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、
該測定しようとする抗原又は抗体に対する抗体又は抗原
の一定量とを、該測定しようとする抗原又は抗体の存在
下反応容器の液体媒体中で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）工程（ａ）で不溶性磁性粒子に担持した該抗原又
は抗体と反応した該抗体又は抗原と反応しうる物質を担
持させた不溶性標識粒子からなる第２試薬と、工程
（ｂ）の反応容器壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液
体媒体中で反応させる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１４】方法６：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。（ａ）測定しようとする抗原に対する抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、ビオチンで標識し
た該測定しようとする抗原と同一の抗原の一定量とを、
該測定しようとする抗原の存在下反応容器の液体媒体中
で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）アビジンまたは抗ビオチン抗体を担持させた不溶
性標識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器
壁に付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応さ
せる。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１５】方法７：下記の工程からなる抗原・抗体反
応の測定方法。（ａ）測定しようとする抗体と同一の抗体を担持させた
不溶性磁性粒子からなる第１試薬と、ビオチンで標識し
た該測定しようとする抗体に対する抗原の一定量とを、
該測定しようとする抗体の存在下反応容器の液体媒体中
で反応させる。（ｂ）工程（ａ）の反応後の該不溶性磁性粒子を磁場の
作用により反応容器壁に付着させ、該液体媒体を除去す
る。（ｃ）アビジン又は抗ビオチン抗体を担持させた不溶性
標識粒子からなる第２試薬と、工程（ｂ）の反応容器壁
に付着した該不溶性磁性粒子とを液体媒体中で反応させ
る。（ｄ）工程（ｃ）の該不溶性磁性粒子を磁場の作用によ
り反応容器壁に付着させ、該液体媒体及び未反応の不溶
性標識粒子を除去し、次いで該不溶性磁性粒子と反応し
た不溶性標識粒子の標識強度を測定する。

【００１６】本発明で使用する不溶性磁性粒子は、たと
えば、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、三二酸化鉄（γ−Ｆ
ｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケ
ル、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケ
ル、マンガンなどの合金からなる微粒子またはこれらの
磁性粒子を内部に含んだポリスチレン、ポリアクリロニ
トリル、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリル酸メ
チル、ポリカプラミド、ポリエチレンテレフタレートな
どの疎水性重合体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリ
ルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、ポリ（２−オキシエチルアクリレート）、ポリ（２
−オキシエチルメタクリレート）、ポリ（２，３−ジオ
キシプロピルアクリレート）、ポリ（２，３−ジオキシ
プロピルメタクリレート）、ポリエチレングリコールメ
タクリレートなどの架橋した親水性重合体、またはそれ
ぞれのモノマーの２−４種程度の共重合体などのラテッ
クス、ゼラチン、リポソームまたは、上記磁性微粒子を
ラテックス、ゼラチン、リポソームなどの表面に固定化
した粒子などが用いられる。

【００１７】不溶性磁性粒子の粒径は０．０５μｍ〜５
μｍのものが用いられ、０．１μｍ〜１μｍの範囲内の
粒径を有する不溶性磁性粒子が好ましい。本発明で使用
される不溶性標識粒子に担持させる標識としては、既に
種々のものが知られており、本発明でも特に制限はされ
ない。好ましくは、蛍光色素、酵素、化学発光性色素が
挙げられる。酵素標識では、たとえばペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が良く利
用される。また、蛍光色素としては、たとえば、ユーロ
ピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓ
ｍ）などの希土類キレートや、フィコシアニン、フィコ
エリスリンなどのフィコビリプロテイン、フルオレッセ
イン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、４−
メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマ
リンなどが知られている。また、化学発光性色素では、
例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソル
ミノール、あるいはこれらの誘導体などがある。

【００１８】これらの標識を施す不溶性担体粒子として
は、反応させる時に用いる液体媒体に実質的に不溶性
で、０．０５〜５μｍ、好ましくは０．１〜１μｍの平
均粒径を有するものが用いられる。担体粒子の材質は上
記不溶性磁性粒子で述べたものと同様に、ポリスチレ
ン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、
ポリメタクリル酸メチル、ポリカプラミド、ポリエチレ
ンテレフタレートなどの疎水性重合体、ポリアクリルア
ミド、ポリメタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、ポリ（２−オキシエチルアクリ
レート）、ポリ（２−オキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２，３−ジオキシプロピルアクリレート）、ポリ
（２，３−ジオキシプロピルメタクリレート）、ポリエ
チレングリコールメタクリレートなどの架橋した親水性
重合体、またはそれぞれのモノマーの２−４種程度の共
重合体などのラテックス、ゼラチン、リポソームに加え
て、赤血球のような生体成分、金コロイドのような金属
コロイド粒子等が用いられる。

【００１９】不溶性担体粒子に標識を担持させる方法と
しては、粒子表面の官能基を利用して化学的に結合させ
る方法、粒子を重合して合成する際に、標識を加えて粒
子内部に封じ込める方法、粒子内部または表面に物理的
に吸着、封入させる方法、あらかじめ、タンパク質、ペ
プチドなどと物理的または化学的に標識を結合させてお
いてからそのタンパク質、ぺプチドを粒子に固定化する
方法などがある。たとえば、特開昭５４−１０１４３９
号公報には希土類キレートをＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オク
チルホスフィンオキシド）との協同抽出法を利用して有
機高分子のラテックスの内部に閉じ込める方法が述べら
れている。これに従って作製した標識粒子は標識強度、
安定性共に良好である。

【００２０】本発明において、不溶性磁性粒子及び不溶
性標識粒子に担持させる抗体としては通常ＩｇＧが用い
られるが、ペプシン、パパインなどの消化酵素あるいは
ジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元
剤を用いて、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′、Ｆａｂなどの
低分子化したものを用いても良い。また、ＩｇＧだけで
なくＩｇＭあるいはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子
化したフラグメントを用いても良い。また、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも適用できる。
モノクローナル抗体を用いる時は、Ｂ型肝炎ウイルス表
面抗原のように繰り返し構造をもつタンパク質や、ＣＡ
１９−９抗原のように分子内にエピトープを複数持つ抗
原に対してはモノクローナル抗体は１種類以上で使用で
きる。また、認識エピトープの異なるものを２種類以上
組み合わせても使用できる。

【００２１】一方、担持させる抗原としては、たとえば
タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂
質、花粉、遺伝子工学的に産生された組換えタンパク
質、薬物など種々のものが挙げられる。即ち、本発明で
言う「抗原」とは、人、あるいは動物に対し抗体産生を
惹起する能力のあるすべての物質のうち、例えば診断等
特別の目的の下に選択された単一あるいは複数の物質、
ないしはそれらを含有する混合物が挙げられる。

【００２２】本発明においては、測定しようとする物質
が抗体の場合、不溶性磁性粒子に測定しようとする抗体
に対する抗原を担持させ、不溶性標識粒子に測定しよう
とする抗体の免疫グロブリンクラスと特異的に反応する
物質を担持させることもできる（上記方法２）。不溶性
磁性粒子を担持させる抗原としては上記と同様のものが
挙げられる。不溶性標識粒子に担持させる抗体の免疫グ
ロブリンクラスと特異的に反応する物質としては、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの
抗体軽鎖部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成
分の一種であるＣｌｑ等のように、ある種の抗体分子の
特徴を選択的に認識して結合する能力を有する物質を言
う。

【００２３】さらに、本発明においては、測定しようと
する物質が抗体の場合、不溶性磁性粒子に測定しようと
する抗体に対する抗体を担持させ、不溶性標識粒子に測
定しようとする抗体と特異的に結合する抗原を担持させ
ることもできる（上記方法３）。不溶性磁性粒子に担持
させる測定しようとする抗体に対する抗体（以下、後者
の抗体を便宜上「抗体’」と略すことがある）とは、測
定しようとする抗体に対するいわゆる免疫グロブリンと
称するタンパク、および測定しようとする抗体の免疫グ
ロブリンクラスと特異的に反応する物質を意味する。

【００２４】前者を担持させる場合、通常ＩｇＧクラス
の免疫グロブリンが用いられるが、ペプシン、パパイン
などの消化酵素、あるいはジチオスレイトール、メルカ
プトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ′）₂
化、Ｆａｂ′化、Ｆａｂ化する等の低分子化したものを
用いても良い。また、ＩｇＧだけでなく、ＩｇＭ、ある
いはこれをＩｇＧと同様の処理で低分子化したフラグメ
ントを用いても良い。また、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体のいずれも適用可能である。

【００２５】後者を担持させる場合は上記と同様のもの
が挙げられる。不溶性標識粒子に担持させる測定しよう
とする抗体と特異的に結合する抗原とは、上記で挙げた
通りである。本発明において、不溶性標識粒子に、測定
しようとする抗原または抗体と同じ特異性を有する抗原
または抗体が担持される場合（上記方法４）、これら
は、前述のとおり物理的または化学的に固定化される。
本発明における「特異性を有する」とは、測定しようと
する物質が抗原である場合、前述した抗原と生物学的あ
るいは生理学的に同一なものとして生体に非自己として
認識され、抗体の産生を導く物質全般を指す。測定しよ
うとする物質が抗体である場合は、かかる抗体の免疫グ
ロブリンクラスと反応するもの、すなわちＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥもしくはそれらの抗体軽鎖
部分に対する抗体、プロテインＡまたは補体成分の一種
であるＣｌｑ等のように、ある種の抗体分子の特徴を選
択的に認識して結合する能力を有する物質を言う。

【００２６】また、本発明の上記方法５において標識粒
子に固定化する不溶性磁性粒子に担持した抗原又は抗体
と反応した抗体又は抗原と反応し得る物質としては、上
記不溶性磁性粒子で挙げたような抗体（ポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体いずれも可）または抗原に加
え、上記のような抗体の免疫グロブリンクラスと特異的
に反応する物質、アビジン又はストレプトアビジン等の
抗ビオチン抗体が挙げられる。

【００２７】不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子に上
記のような抗原、抗体等を担持させる方法としては、こ
れらの物質を物理的に吸着させるか、あるいは化学的に
担持させることにより行われる。物理的に吸着させる方
法としては、不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子に、
抗原、抗体等を直接固定化する方法、アルブミンなどの
他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固
定化する方法が挙げられる。

【００２８】化学的に担持させる方法としては、不溶性
磁性粒子および不溶性標識粒子の表面に存在するアミノ
基、カルボキシル基、メルカプト基、ヒドロキシル基、
アルデヒド基、エポキシ基などを化学的に修飾すること
により抗原分子、抗体分子等と結合させることができる
官能基を利用して、直接粒子上に固定化する方法、粒子
と抗原分子、抗体分子等の間にスペーサー分子を化学結
合で導入して固定化する方法、アルブミンなどの他のタ
ンパク質に抗原、抗体等を化学結合させた後、そのタン
パク質を粒子に化学結合させる方法が挙げられる。

【００２９】その他、固定化したい抗原、抗体等と特異
的に結合する物質（たとえば抗体、プロテインＡ、な
ど）を粒子表面に物理的または化学的に結合させた後、
目的の抗原、抗体等を結合させることにより粒子表面に
固定化する方法も挙げられる。一般的に担持される抗
原、抗体等の量は、用いる不溶性担体粒子の表面積、官
能基量等により異なるが、通常担体粒子１ｇあたり１ｍ
ｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇであ
る。

【００３０】不溶性標識粒子において標識と上記抗体、
抗原等を担持する順序には特に制限はないが、標識を担
持した後、抗体、抗原等を担持するのが好ましい。次に
本発明の代表的反応系を例にして、本発明についてさら
に詳細に説明する。試料溶液中の抗原を測定することを
目的とし、不溶性磁性粒子に該抗原に対する抗体、ま
た、標識として蛍光色素を用い、該不溶性蛍光色素標識
粒子に該抗原に対する抗体を担持させた粒子を用いた系
として説明する。

【００３１】まず測定しようとする抗原を含むと考えら
れる試料溶液と、該抗原に対する抗体を担持させた不溶
性磁性粒子（第１試薬) とを反応容器の液体媒体中で混
合し反応させる（第一反応) 。反応開始時の混合は十分
に行う必要があるが、均一に混合された後は混合を止め
放置して反応させてもよい。反応は一般の免疫化学反応
と同様にｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７〜９にて行
う。温度については、２〜５０℃の範囲で実施可能であ
るが、望ましくは室温乃至は３７〜４０℃で反応させ
る。反応時間は、反応直後から１昼夜まで任意である
が、感度、操作性を考慮して、通常３〜６０分の範囲で
設定される。これらの反応条件は、以降の工程について
も同様である。

【００３２】目的のｐＨを維持するために、通常緩衝液
が用いられる。緩衝液としては、例えばリン酸、トリス
（ヒドロキシメチル) アミノメタン等が用いられるが、
中性から弱アルカリ性で常用される殆どの緩衝液が使用
可能である。多くの場合、非特異反応を避けるために、
塩化ナトリウム等の塩類及び牛血清アルブミン等のタン
パク質が添加される。

【００３３】この時、不溶性磁性粒子は反応液に対して
０．０００１〜１重量％、好ましくは０．００１〜０．
１重量％となるように使用される。不溶性磁性粒子と試
料とを混合すると、試料中に含まれる抗原が粒子表面上
の抗体と結合する。次いで、磁場の作用により、不溶性
磁性粒子を反応液から分離し、反応容器壁に付着させ
る。残存する反応液を除いた後、必要に応じて洗浄工程
（適当な洗浄液を加え、攪拌し、直ちに磁場を付与して
分離後、溶液を除く) を数回繰り返す。その後、分離し
た不溶性磁性粒子と第一反応と同一の測定しようとする
抗原に対する抗体を担持させた不溶性蛍光色素標識粒子
（第２試薬) とを混合し第一反応と同様にして液体媒体
中で反応させる（第二反応) 。不溶性蛍光色素標識粒子
も、上記の不溶性磁性粒子と同様に緩衝液に懸濁させて
使用される。このとき不溶性蛍光色素標識粒子は反応液
中に０．００００１〜０．１重量％、好ましくは０．０
００１〜０．０１重量％で用いられる。

【００３４】不溶性磁性粒子と不溶性蛍光色素標識粒子
とを混合すると上記第一反応で不溶性磁性粒子と結合し
た抗原が、蛍光粒子表面上の抗体と結合する。次いで磁
場の作用により不溶性磁性粒子を反応液から分離し反応
容器壁に付着させる。残存する反応液を除いた後、必要
に応じて洗浄工程を数回繰り返す。その後、分離した不
溶性磁性粒子に最終分散液を加え、懸濁液として、該溶
液に含まれる不溶性蛍光色素標識粒子の量を、蛍光色素
に固有の励起光を照射し、放出される蛍光強度を計測す
ることにより測定する。例えば、Ｅｕキレートを標識色
素とした場合、励起光は３００〜３８０ｎｍまたは２４
０〜２７０ｍｍの紫外光であり、蛍光は６００〜６３０
ｎｍ（６１５ｎｍに極大値を有する) である。

【００３５】この時、最終的に残った標識粒子の蛍光強
度の測定を磁性粒子を分散させた懸濁液の状態で行う
と、分散している磁性粒子による光学的な妨害により正
確な計測は困難である。すなわち、磁性粒子濃度が高す
ぎると計測を極めて困難なものにするため、使用する磁
性粒子濃度に制限が生じてしまう。この点を改善するた
め、本発明は、上記最終分散液のかわりに抗原・抗体反
応による特異的な結合を解離させることのできる解離液
を加え、混合後、磁場の作用により不溶性磁性粒子を液
体媒体から分離し、計測に影響しない反応容器壁に付着
させ、特異的結合を解離して遊離した標識粒子のみを計
測することによって、より正確な標識粒子強度の計測を
可能とした。

【００３６】粒子状のものが存在するいわゆる懸濁液で
は、光学的計測は不利であることは広く知られている。
また、免疫測定法において標識した不溶性担体粒子を用
いた場合、免疫反応、分離、次いで、洗浄後、最終的に
残存している粒子は一般的に不溶性磁性粒子の方がかな
り高い比率で存在するため、解離して遊離した不溶性標
識粒子の影響は磁性粒子に比べて小さく、光散乱などを
起こして計測に影響するレベルではない。従って磁性粒
子のみでも計測系から除去する効果は極めて大きい。

【００３７】抗原・抗体反応による特異的な結合を解離
される条件としては、アフィニティークロマトグラフィ
ー等で種々のものが知られている（例えば、”Ａｆｉｎ
ｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｐｒｉｎｃｉ
ｐｌｅｓ＆ｍｅｔｈｏｄｓ” Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）が、本
発明の解離液としても、これらで知られている条件が利
用できる。即ち、本発明で使用される解離液としては、
塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッ
ファー等の酸性溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、アンモニア、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液、
３Ｎ塩化ナトリウム、４．５Ｍ塩化マグネシウム等の高
イオン強度溶液、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔ
ｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液、ジオキサン、エ
チレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝
液、トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピッ
クイオンや尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が
挙げられる。

【００３８】なお解離液を加える量は１反応容器あたり
５０μｌ〜１ｍｌである。抗原または抗体を定量する場
合は、予め抗原又は抗体濃度既知品を、或は抗原又は抗
体基準品を試料として測定を行い、得られた定量値を試
料の抗原又は抗体濃度に対して図示すれば該抗原又は抗
体の検量線が得られるので、濃度未知試料の反応定量値
から該抗原又は抗体の濃度が求められる。

【００３９】磁場のかけ方に関しては、第一反応後の不
溶性磁性粒子を約１〜３分程度で、また、同様に第二反
応後の不溶性蛍光色素標識粒子と結合した不溶性磁性粒
子も約１〜３分程度で分離できるような磁場の強度及び
反応系の形状が好ましい。分離に要する時間が短すぎる
と、一般に感度、再現性の低下を招き、長すぎると操作
性を悪化させる。こうした理由から反応系の大きさは比
較的小さい方が扱い易い。９６穴マイクロプレートなど
は個々のウェルのサイズは小さく、ウェル間の隙間に小
磁石を置けば、マイクロプレートを利用したＥＩＡと同
様にマイクロプレートリーダを用いて容易に抗原又は抗
体を定量できるので本発明の実施に適した反応容器のた
めの材料である。また、ポリスチレン、アクリルなどの
プラスチックや、ガラスで作成したチューブ、キュベッ
トなども本発明に適した反応容器のための材料である。
磁石としては、永久磁石、電磁石等を使用する。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において使用した洗浄液の組成はす
べて同一で、５０ｍＭトリス、０．９％ＮａＣｌ、
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０からなり、解離
液は０．１ＮＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳからなる。実施例１平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗ＴＳＨモノクローナル抗体をカルボジイミドを用
いて、化学結合法により固定化した後、牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で処理することにより粒子を安定化させ、
緩衝液に、０．０５％、０．４％の濃度で懸濁させ、Ｍ
ｇラテックス試薬を作成した。

【００４１】希土類キレートのＥｕ−ＴＴＡ（テノイル
トリフルオロアセトン) 化合物（イーストマンコダック
社) １×１０^-4モルとＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィ
ンオキシド) （同仁化学) ２×１０^-4モルをアセトン４
０ｇに溶解した後、平均粒径０．６５３μｍのポリスチ
レンラテックス（Ｓｅｒａｄｙｎ社) ３ｇを水４０ｍｌ
に懸濁させたものを混合し、エバポレーターによりアセ
トンを除去することにより、ラテックス粒子にＥｕ−キ
レート化合物をＴＯＰＯと協同抽出し、Ｅｕキレート標
識ラテックス（以下、Ｅｕラテックスとする。) を作製
した。

【００４２】ＥｕラテックスにもＭｇラテックスと同様
に化学結合法で、Ｍｇラテックスに固定化したものとは
別のエピトープを認識する抗ＴＳＨモノクローナル抗体
を固定化し、ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化
させ、緩衝液に、０．００３％の濃度で懸濁させ、Ｅｕ
ラテックス試薬を作成した。ヒトＴＳＨ標準液（Ｚｙｍ
ｅｄ社）を正常ウサギ血清含有緩衝液で希釈して、０、
０．１、０．３、１、３ＩＵ／Ｌの標準液を作成した。

【００４３】標準液４０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液
２５０μＬ、上記２種の濃度のＭｇラテックス試薬４０
μＬを加えた後撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次
に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックスを反応液
から分離し、上清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記
Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間
免疫反応を行わせた。

【００４４】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。上清
を除去し、洗浄液を加えて撹拌する。この分離、洗浄工
程を３回繰り返した後、Ｍｇラテックスを磁石で分離
し、上清を除去し、最終分散液として洗浄液３００μＬ
を加え撹拌した後、懸濁液の蛍光強度を測定する場合
（分散系）と、最終分散液に解離液を３００μＬ加えて
撹拌した後、磁石を用いて反応セル壁にＭｇラテックス
を分離した後、遊離したＥｕラテックスの蛍光強度を測
定する場合（解離系）の２とおりについて比較した。

【００４５】最終サンプル中のＥｕラテックスの量は、
３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を計測す
ることにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと光電子
増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間分解蛍
光測定装置を用いて測定した結果を図１に示した。図
中、分散系でＭｇラテックス濃度が０．０５％を□で、
解離系でＭｇラテックス濃度が０．０５％を◆で、分散
系でＭｇラテックス濃度が０．４％を■で、解離系でＭ
ｇラテックス濃度が０．４％を◇で表す。

【００４６】Ｍｇラテックス濃度が０．０５％の場合
は、分散系でも解離系でも大差ない結果が得られたが、
Ｍｇラテックス濃度が０．４％の場合、分散系では、残
存したＭｇラテックスの光散乱等の影響を受けて蛍光強
度は非常に小さい値になっているが、解離液を用いた系
ではＭｇラテックスの影響を受けないので良好な蛍光強
度が計測された。実施例２平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、遺伝子組換え法により産生したＢ型肝炎ウイルスコ
ア抗原（ＨＢｃＡｇ）（化学及血清療法研究所）をカル
ボジイミドを用いて、化学結合方により固定化した後、
ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化させ、緩衝液
に、０．０５％の濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬
を作成した。

【００４７】実施例１で作成したＥｕラテックスに抗Ｈ
ＢｃＡｇモノクローナル抗体をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．００３％
の濃度で懸濁させ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｒ
ＩＡ法で抗ＨＢｃＡｇ抗体を測定済の、陽性検体２検
体、陰性検体１検体を用いて特異性を調べた。

【００４８】検体１０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液２
５０μＬ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μＬを加えた後
撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を用い
て反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、上
清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記Ｅｕラテックス
試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間免疫反応を行わ
せた。

【００４９】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。この
分離、洗浄工程を２回繰り返した後、Ｍｇラテックスを
磁石で分離し、上清を除去し、最終分散液として０．１
％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯＨ３００μＬを加え、撹
拌して免疫反応によりＭｇラテックスと結合しているＥ
ｕラテックスを解離させた後、磁石でＭｇラテックスを
分離した上清中のＥｕラテックスの蛍光強度を測定し
た。

【００５０】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を表１に示し
た。阻害法であるため、陰性検体では高い蛍光強度、陽
性検体では低い蛍光強度が観測された。

【００５１】

【表１】

【００５２】実施例３平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗Ｔ３モノクローナル抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．０５％の
濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬を作成した。

【００５３】実施例１で作成したＥｕラテックスにＴ３
（Ｓｉｇｍａ）をカルボジイミドを用いて、化学結合法
により固定化した後、ＢＳＡで処理することにより粒子
を安定化させ、緩衝液に、０．００３％の濃度で懸濁さ
せ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｔ３を緩衝液に溶
解した０、１．５６、６．２５、２５、１２５ｎｇ／ｍ
ｌの標準液を用いて、反応性を調べた。

【００５４】検体４０μＬ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液２
５０μＬ、上記Ｍｇラテックス試薬４０μＬを加えた後
撹拌し、５分間免疫反応を行わせた。次に、磁石を用い
て反応セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、上
清を除いた後、緩衝液２５０μＬ、上記Ｅｕラテックス
試薬４０μｌを加えて攪拌し、１０分間免疫反応を行わ
せた。

【００５５】磁石を用いて反応セル中のＭｇラテックス
を反応液から分離し、残りの反応液を除去し、洗浄液を
３００μＬ加え、攪拌し、直ちに磁石で分離する。この
分離、洗浄工程を２回繰り返した後、Ｍｇラテックスを
磁石で分離し、上清を除去し、最終分散液として０．１
％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯＨ３００μＬを加え、撹
拌して免疫反応によりＭｇラテックスと結合しているＥ
ｕラテックスを解離させた後、磁石でＭｇラテックスを
分離した上清中のＥｕラテックスの蛍光強度を測定し
た。

【００５６】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を図２に示し
た。阻害法であるため、検体中のＴ３濃度が高くなれば
なるほど、低い蛍光強度が観察された。

【００５７】実施例４平均粒径０．７μｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下、Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社)
に、抗Ｔ４モノクローナル抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）をカルボジイミドを用い
て、化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理する
ことにより粒子を安定化させ、緩衝液に、０．０５％の
濃度で懸濁させ、Ｍｇラテックス試薬を作成した。

【００５８】実施例１で作成したＥｕラテックスに抗ビ
オチン抗体（Ｓｉｇｍａ）をカルボジイミドを用いて、
化学結合法により固定化した後、ＢＳＡで処理すること
により粒子を安定化させ、緩衝液に、０．００３％の濃
度で懸濁させ、Ｅｕラテックス試薬を作成した。Ｔ４を
ビオチン化試薬ＮＨＳ−ＬＣ−ＢｉｏｔｉｎＩＩ（Ｐｉ
ｅｒｃｅ社）を用いてビオチン標識し、トリス緩衝液で
５×１０^-10ｍｏｌ／ｌに希釈して、標識抗原溶液とし
た。

【００５９】Ｔ４を緩衝液に溶解した０、１０、３０、
１００、３００、１０００ｎｇ／ｍｌの標準液を用い
て、反応性を調べた。検体２０μＬ、ＢＳＡ含有トリス
緩衝液２００μＬ、上記標識抗原溶液４０μＬ、上記Ｍ
ｇラテックス試薬４０μＬを加えた後撹拌し、５分間免
疫反応を行わせた。

【００６０】次に、磁石を用いて反応セル中のＭｇラテ
ックスを反応液から分離し、上清を除いた後、緩衝液２
５０μＬ、上記Ｅｕラテックス試薬４０μｌを加えて攪
拌し、１０分間免疫反応を行わせた。磁石を用いて反応
セル中のＭｇラテックスを反応液から分離し、残りの反
応液を除去し、洗浄液を３００μＬ加え、攪拌し、直ち
に磁石で分離する。この分離、洗浄工程を２回繰り返し
た後、Ｍｇラテックスを磁石で分離し、上清を除去し、
最終分散液として０．１％ＳＤＳ含有０．１規定ＮａＯ
Ｈ３００μＬを加え、撹拌して免疫反応によりＭｇラテ
ックスと結合しているＥｕラテックスを解離させた後、
磁石でＭｇラテックスを分離した上清中のＥｕラテック
スの蛍光強度を測定した。

【００６１】上清サンプルに含まれるＥｕラテックスの
量は、３４０ｎｍの励起光に対する６１５ｎｍの蛍光を
計測することにより測定した。Ｘｅフラッシュランプと
光電子増倍管（浜松ホトニクス社）により自作した時間
分解蛍光測定装置を用いて測定した結果を図３に示し
た。阻害法であるため、検体中のＴ４濃度が高くなれば
なるほど、低い蛍光強度が観察された。

【００６２】

【発明の効果】本発明方法によれば、磁性粒子および標
識粒子を用いることにより、迅速、簡便にＢ／Ｆ分離が
実施でき、かつ、通常のＦＩＡよりも測定感度を上昇さ
せて抗原、抗体反応を測定することができるだけでな
く、抗原抗体反応の特異的結合を解離させて遊離した標
識粒子のみを計測するため、磁性粒子の影響を受けるこ
となく、より正確な標識強度の計測が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で解離液での解離を行った場合と行わ
なかった場合の反応液の蛍光強度とＴＳＨ濃度との関係
を表す図である。

【図２】実施例３の検体中のＴ３濃度と蛍光強度との関
係を表す図である。

【図３】実施例４の検体中のＴ４濃度と蛍光強度との関
係を表す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不溶性磁性粒子および不溶性標識粒子を
用いる抗原抗体反応の測定方法において、不溶性磁性粒
子と反応した不溶性標識粒子に抗原抗体反応による特異
的結合を解離させる解離液を加えて該不溶性標識粒子を
解離させ、解離した該不溶性標識粒子の標識強度を測定
する方法。
【請求項２】不溶性標識粒子が、蛍光色素標識粒子、
酵素標識粒子または化学発光性色素標識粒子であること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】解離液が、酸性溶液、アルカリ性溶液、
高イオン強度溶液、界面活性剤含有溶液、極性を下げる
物質を含有する緩衝液、尿素および塩酸グアニジンを含
有する緩衝液またはカオトロピックイオンを含有する緩
衝液であることを特徴とする請求項１記載の方法。