JPH0159866B2 - - Google Patents
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- JPH0159866B2 JPH0159866B2 JP62163886A JP16388687A JPH0159866B2 JP H0159866 B2 JPH0159866 B2 JP H0159866B2 JP 62163886 A JP62163886 A JP 62163886A JP 16388687 A JP16388687 A JP 16388687A JP H0159866 B2 JPH0159866 B2 JP H0159866B2
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は新規なポリエーテル抗生物質を産生
する微生物の培養物に関する。より詳細には、本
発明は19−エピ−ダイアネマイシンを産生する新
菌株、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（Streptmyces hygroscopicus）の培養物に関す
る。 コクシジウム症、すなわち家禽類に共通で広く
蔓延する感染症はエイメリア（Eimeria）属の原
虫である数種の寄生虫のうちの１つあるいはそれ
以上によつて引き起される。２つのタイプのコク
シジウム症、すなわち盲腸性のものと腸性のもの
が知られている。第一のタイプはエイメリア・テ
ネラ（E.tenella）によつて引き起され、重篤な
出血を特徴とする。第二のタイプはエイメリア・
アセルブリナ（E.acervulina）、エイメリア・ネ
カトリツクス（E.necatrix）、エイメリア・マク
シア（E.maxima）、エイメリア・ハガニ（E.
hagani）、エイメリア・ミテイス（E.mitis）、エ
イメリア・プラエコツクス（E.praecox）および
エイメリア・ブルネツテイ（E.brunetti）のよう
なエイメリア属の種々の種によつて引き起され
る。七面鳥ではエイメリア・アデノイデス（E.
adenoides）およびエイメリア・マレアグリミテ
イス（E.maleagrimitis）がコクシジウム症の病
原微生物である。 胞子虫症の経済的影響は非常に大きく、胞子虫
症の撲滅と抑止は家禽業界にとつて非常に重大で
ある。 非常に広範囲の構造の化合物（ポリエーテル抗
生物質等）が抗コクシジウム剤として開示されて
いる。たとえば次のような抗生物質である： モネンシン〔Ｊ．Amer．Chem．Soc．、89、
5737（1967）〕；ニゲリシン〔Biochem．Biophys．
Res．Comm．、33、29（1968）〕；グリソリキシン
〔Ｊ．Chem．Soc．Chem．Commun．、1421
（1970）〕；ダイアネマイシン〔Ｊ．Antibiotics
22、161（1969）；U.S.Patent3、577、531of
May4、1971〕；サリノマイシン〔J.Antibiotics、
27、814（1971）〕；Ｘ−537A〔J.Chem.Soc.Chem.
Commun．、967（1972）〕；Ｘ−206〔J.Chem.Soc.
Chem.Commun．、927（1971）〕；A204A〔J.Amer.
Chem.Soc.、95、3399（1973）〕；ミユータロマイ
シン〔J.Antibiotics、30、903（1977）〕；イオノマ
イシン〔J.Amer.Chem.Soc．、101、3344
（1979）〕；Ｋ−41B〔J.Antibiotics、32、169
（1979）〕；Ａ−130BおよびＡ−130C〔J.
Antibiotics33、94（1980）〕；ロイセラマイシン
〔J.Antibiotics、33、137（1980）〕；およびＡ−
28695 Ｂ〔J.Antibiotics、33、252（1980）〕。この
問題はウエイレス（Westley、“Polyether
Antibiotics”、Ady.Appl.Miciobiol．、22、177
（1977））およびシユマードら（Shumard et.al.、
Antimicrob.Agents ＆ Chemother．369−377
（1967））によつて検討された。豚赤痢、すなわち
アメリカ合衆国で診断される最も普通の豚の疾病
の１つは他の多くの国でも流行しており、年間の
経済的損失は非常に大きい。最近、大きなスピロ
ヘータであるトレポネマ・ヒオデイセンテリアエ
（Treponema hyodysenteriae）が感染症の第１
次源であることがわかつた〔Harris、D.L.et al.
“Swine Dysentery−１ Inoculation of Pigs
with Treponema hyodysenteriae（New
Species）and Reproduction of the Disease、
“Vet.Med／SAC、67、61−64（1972）〕。 牛のような反すう動物の体位向上（生長速度の
増加および／または飼料利用効率の増加）は獣医
科学のもう１つの経済的に望ましい課題である。
特に重要なのは飼料利用効率を増加することによ
つて達成される生長促進である。反すう動物用飼
料の主栄養部分（炭水化物）の利用のメカニズム
は周知である。反すう動物の反すう胃中の微生物
は炭水化物を単糖類に分解し、これは次いでピル
ベートに転化される。ピルベートは微生物学的方
法で代謝されてアセテート、ブチレートまたはプ
ロピオナート（まとめて揮発性脂肪酸（VFA）
として知られる）を形成する。より詳しく検討す
るためには、Leng、“Physiology of Digestion
and Metabolism in the Ruminant、
“Phillipson et al.、Eds.、Oriel Press、
Newcastle−upon−Tyne、England、1970、
pp.408−410を参照されたい。 VFA利用の相対的効率については下記文献で
論じられている：Mc Cullough、“Feedstuffs、”
June19、1971、およびp19；Eskeland et al.J.
An.Sci．33、282（1971）；およびChurch et al.
“Digestive Physiology and Nutrition of
Ruminants、”Vol.2、1971、pp.622および625。 アセテートおよびブチレートも利用されるが、
プロピオネートを利用するとより大きな効率が得
られる。さらに、あまりにプロピオネートが少な
いと動物がケトン症になる可能性がある。したが
つて有利な化合物は動物が炭水化物から高い割合
のプロピオネートを産生するのを促進し炭水化物
の利用効率を増大せしめ、ケトン症の発疱率を低
減させるものである。 ワシントン市で集めた土壌試料から単離された
新菌株のスプレプトマイセス・ハイグロスコピカ
ス（Streptomyces hygroscopicus）が抗コクシ
ジウム特性を有する新規で価値ある抗生物質を産
生することがわかつた。この新規な生成物を単離
し、19−エピ−ダイアネマイシンと同定した。 本発明の抗生物質産生微生物はアメリカ合衆国
ワシントン市で集めた土壌試料から単離された。
これは培養物Ｎ−483−29と称した。この微生物
の分類学的研究はL.H.ハン（Huang）によつて
なされ、下記の特性が示された。彼の研究にもと
づいてこの菌株はストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス（ジエンセン）ワクスマン・エンド・
ヘンリシ（Streptomyces hygroscopicus
（Jensen）Waksman and Henrici）であること
が結論された。 この新しい培養物は放線菌目の細い菌糸を有
し、気菌糸上に胞子鎖をつくり、断裂していない
基質菌糸を形成する。全細胞分析の結果によりさ
らにストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属することがわかつた。 培養物Ｎ−483−29を斜面培養試験官から
ATCC＃172プロスに移植し３日間28℃で振とう
器上で生育させた。次いでこれを20分間遠心分離
し、３回滅菌蒸留水で洗い、通常放線菌目
（Actinomycetales）の菌の同定に使用される培
地に移植した。 この培養物を28℃でインキユベートし、結果を
経時的に測定しながら14日間観察するのがもつと
もふつうである。色は共通の用語で記述され、正
確な色はザ・カラー・ハーモニー・マニユアル
（The Color Harmony Manual）、第四版の色片
と比較することによつて測定される。全細胞アミ
ノ酸および糖分析の方法はBecker、B.et al.、
Appl.Microbiol．、12、421−423、（1964）、and
in Lechevalier、M.P.、J.Lab.Clin.Med．、71、
934−944（1968）に記載されている。 この培養物の特性を決定するのに使用した同定
用培地及びその組成は下記のとおりである： １ トリプトン−酵母エキスブロス−（ISP＃１
培地、デイフコ（Difco）） ２ 酵母エキス−麦芽エキス寒天−（ISS＃２培
地、デイフコ） ３ オートミール寒天−（ISP＃３培地、デイフ
コ） ４ 無機塩−でんぷん寒天−（ISP＃４培地、デ
イフコ） ５ グリセリン−アスパラギン寒天−（ISP＃５
培地、デイフコ） ６ ペプトン−酵母エキス鉄寒天−（ISP＃６培
地、デイフコ） ７ ツアペク−蔗糖寒天−S.W.Waksman、The
Actinomycetes、Vol.2、培地No.１、p328、
1961 ８ グルコース−アスパラギン寒天−S.W.
Waksman、The Actinomycetes、Vol.2、培
地No.２、p328、1961 ９ ベネツトの寒天−同上培地No.30、p331 10 エマーソンの寒天−同上培地No.28、p331 11 栄養寒天−同上培地No.14、p330 12 ゴードンおよびスミスのチロシン寒天−R.E.
Gordon and M.M.Smith、Jr.、Bact.69、147
−150、1955。 13 カゼイン寒天−同上 14 マレイン酸カルシウム寒天−S.A.
Waksman、Bact、Rev.21、１−29、1957 15 ゼラチン−R.E.Gordon and J.M.Mihm、
Jr.、Bact.73、15−27、1957 16 でんぷん−同上 17 有機硝酸塩ブロス−同上 18 デキストリン硝酸塩ブロス−30ｇの蔗糖の代
りに３ｇのデキストリンを使用して寒天を除い
た以外はS.A.Waksman、The
Actinomycetes、Vol.2、培地No.１、p328、
1961 19 ばれいしよにんじん寒天−M.P.Lechvalier、
Jr.、Iab.and Clinical Med.71、934−944、
1968しかし30ｇのばれいしよ、2.5ｇのにんじ
んおよび20ｇの寒天のみを使用する。 20 ２％水道水寒天 21 スキムミルク−デイフコ 22 セルロース利用 (a) H.L.Jensen、Proc.Linn.Soc.N.S.W.55、
231−248、1930 (b) M.Levine and H.W.Schoenlein、Ａ
Compilation of Culture Media、medium
No.2511、1930 23 炭水化物−ISP＃９培地、デイフコ 24 温度範囲−ISP＃２培地＋50mlのココやしの
果汁 酵母エキス−麦芽エキス寒天−生育良
好、黄色がかつた（2ea）隆起または膜が有
り、黄褐色（3ie近く）中位に盛り上がつた、
しわがよつているか膜状、気菌糸なし；裏面淡
黄色がかつて（2ea）、茶色の線（3gc、3ic）が
あり；可溶性色素茶色（3lc、3ne）。 オートミール寒天 生育中位、白色、黄色がかつた色ないし灰色
（１ 1/2ea、１ 1/2ga、灰色に近い一連の色3dc、
3fe）、薄いないしわずかに盛り上がり、なめら
か、いくつかの部分で疎水性、表面と同じ気菌
糸；裏面無色、クリーム色ないし灰色（１ 1/2
ca、灰色に近い一連の色3dc、3fe）；可溶性色素
淡黄色（１ 1/2ca）。 無機塩−でんぷん寒天 生育中位ないし良好、黄色がかつた色ないし灰
色（1ea、１ 1/2ea、灰色に近い一連の色3dc、
3fc、3ih）、薄いないし盛り上がり、なめらかだ
が縁に近いところはしわがより、いくつかの部分
では疎水性、表面と同じ気菌糸；裏面淡黄色ない
し灰色（2ea、灰色に近い一連の色3dc、3fe）；可
溶性色素淡黄色（１ 1/2ca）。 グリセリン−アスパラギン寒天 生育乏しいないし中位、無色ないしクリーム色
（灰色に近い一連の色1ba）、薄い、なめらか、気
菌糸なし；裏面無色、可溶性色素なし。 グルコース−アスパラギン寒天 生育良好、白色ないしクリーム色（2ca）、盛
り上がり、しわがより、縁が広がつており、気菌
糸なし；裏面無色；可溶性色素淡黄色（2ca、
2ea）。 ツアペツク−蔗糖寒天 生育中位ないし良好、クリーム色（2ca）、薄
い、なめらか、縁が広がり、気菌糸なし；裏面無
色ないしクリーム色（2ca）；可溶性色素クリー
ム色（2ca）。 エマーソン寒天 生育良好、黄褐色（3gc近く）、盛り上がり、
なめらかないしわずかにしわがより、気菌糸な
し；裏面表面と同じ；可溶性色素茶色（3lc）。 栄養寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca、2ca）わず
かに盛り上がり、なめらかあるいは離れたコロニ
ーとなり、気菌糸なし；裏面淡黄色（2ca、
2ea）；可溶性色素。 ベネツトの寒天 生育良好、クリーム（2ca）、中位盛り上がつ
ており、しわが寄るか隆起しており、気菌糸ない
か非常にわずか、白色；裏面クリーム色ないし淡
黄色（2ea）。 ゴードンおよびスミスのチロシン寒天 生育乏しいか中位、黄色がかつた茶色ないし暗
茶色（4ec、4nl、5nl）、薄いないしわずかに盛り
上がり、なめらか、気菌糸なし；裏面茶色ないし
暗茶色（5lg、5ni）；可溶性色素暗茶色ないし黒
色（5ni、5pn）。 マレイン酸カルシウム寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄いない
しわずかに盛り上がり、なめらか、気菌糸なし；
裏挙表面と同じ；可溶性色素なし。 カゼイン寒天 生育中位、クリーム色（2ca近く）、中位盛り
上がり、なめらかであるが縁近くにしわがあり、
気菌糸なし；裏面は表面と同じ；可溶性色素クリ
ーム色。 でんぷん寒天 生育良好、クリーム色（2ca近く）、中位盛り
上がり、しわがあるが縁に近づくにつれなめら
か、気菌糸なし；裏面は表面と同じ；可溶性色素
クリーム色。 ばれいしよにんじん寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄く、な
めらか、気菌糸まばら、白色；裏面無色ないしク
リーム色；可溶性色素なし。 水道水寒天 生育乏しく、無色ないしクリーム色（灰色に近
い一連の色2ba）、薄く、なめらか、ほとんど深
部、気菌糸まばら、白色；裏面表面と同じ；可溶
性色素なし。 形態学的特性： 形態学的特性は14日間インキユベーシヨン後無
機塩−でんぷん寒天上で観察された。グレイカラ
ーシリーズの胞子塊；うず巻き部分の胞子鎖はわ
ずかに開き、その直径は小さく（長さ６−10μ
ｍ、巾３−4.5μｍ）、３〜６巻／コイルであり、
８〜30胞子／胞子鎖；胞子体は単軸的に分枝し、
時々渦巻き状に分枝し；胞子は卵形ないし楕円形
時として棒状あるいは舟状で1.2〜2.0×0.9〜1.2μ
ｍ、走査電子顕微鏡によれば疣状を呈する。 生化学的特性： メラニン生成せず；硫化水素生成；ゼラチン液
化；でんぷん加水分解；両方の硝酸塩ブロスにお
いて硝酸塩を亜硫酸塩に還元し；ジエンセンのセ
ルロースおよびレビンおよびヨーエンラインのセ
ルロース上で生育乏しく分解せず；牛乳を透明化
するが凝固せず；カゼイン消化（＋）；マレイン
酸カルシウム消化（＋）；チロシン消化（＋）。炭
水化物利用：グルコース、アラビノース、フラク
トース、イノシトール、マンニトール、ラフイノ
ース、ラムノース、蔗糖およびキシロースはすべ
て利用される。 温度関係： 【表】 良好ないしす 良好な 中位の 生育な
ぐれた生育 生育 生育 し
全細胞分析： 細胞壁はLL−ジアミノピメリン酸を含有して
いるが特徴的な糖賑は含まない。 培養物Ｎ−483−29は灰色の胞子塊、らせん状
の胞子鎖、疣状の表面を有する胞子およびメラニ
ン反応が陰性であることを特徴とする。蔗糖とラ
フイノースの利用が陽性である以外はこの単離物
はInt.J.Syst.Bact.、22、265−394、1972に記載
されているストレプトマイセス・ハイグロスコピ
カス（Ｓ・hygroscopicus）の新基準菌株につい
ての記載と一致する。炭素源の利用はH.D.
TresnerおよびE.J.Backusによると菌株により異
なり、彼等はApplied Microbiology、４、243−
250、1956に記載された種について広い概念を提
案した。このようにこの培養物はストレプトマイ
セス・ハイグロスコピカス（ジエンセン）ワクス
マン・エンド・ヘンリチ（Streptomyces
hygroscopicus（Jensen）Waksman and
Henrici）と考えられる。これはメリーランド州
のロツクビルにあるアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されておりこの公認の
寄託機関は寄託物を永続的に保存し、出願に特許
が付与された場合公衆に分譲する。この微生物は
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）ATCC39205と
称される。この微生物は37CFR1.114および
35USC122にもとづいてアメリカ合衆国特許商標
庁の長官によつて決定された人に分譲される。寄
託された微生物の公衆への分譲についてのすべて
の制限は特許付与と同時に完全に取り除かれる。
この微生物の寄託は1986年12月10日にATCCにお
いてブタペスト条約下での寄託に変更された。 本発明の上記説明と完全に一致する上記微生物
の使用のみに限定されず、上記目的を達成する微
生物の使用を包含する。天然のあるいはＸ線照
射、紫外線照射、ナイトロジエンマスタードによ
る処理等の種々の方法で人工的に誘導した変異種
および／または変種；たとえば上記微生物から得
られるものを使用するのが特に望ましい。 発明者等はここに記載した種からの核酸または
その均等物を使用して形質転換、人工的抗原変
換、遺伝子組換えまたは他の遺伝子の処理により
形成されてここに記載した目的生成物を生成し上
述の如き生化学的変化を生ぜしめる能力を取得し
た微生物であればその外見または生理学的挙動に
かかわらず使用することを希望する。 培養物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカ
ス（S.hygroscopicus）ATCC39205の培養は深部
好気条件下に21゜〜37℃で水性栄養培地中で撹拌
しながら行なわれる。培養に有用な典型的な栄養
培地は同化し得る炭素源、たとえば糖、でんぷん
およびグリセリン、有機室素源、たとえばカゼイ
ン、カゼインの酵素分解物、カザミノ酸、大豆ひ
きわり紛、綿実粉、落花生粉、小麦グルテン、大
豆粉、酵母エキス、肉粉および魚粉；生長物質
源、たとえば殼物可溶物、魚粉、綿実粉および酵
母エキス；塩化ナトリウムおよび炭酸カルシウム
のような鉱物塩；および鉄、マグネシウム、亜
鉛、コバルトおよびマンガンのような微量元素；
および緩衝剤としての炭酸カルシウムおよびリン
酸カルシウムを含む。 もし過剰の泡が発酵中に生じたら、一般的に植
物性油またはシリコンのような消泡剤を発酵培地
に加える。深部生育のためのタンク中の培地の通
気に好ましくは約1/2〜２容量の滅菌した空気／
発酵ブロスの容量／分の割合でスパージヤーを通
してプロスの中に空気を強制的に通気することに
よつて維持される。撹拌は一般的に発酵技術の当
業者に周知の撹拌手段によつて維持される。撹拌
の速度は使用した撹拌装置のタイプに依る。振と
うフラスコな通常150〜200サイクル／分で運転さ
れ、発酵装置は通常300〜1700回転／分で運転さ
れる。もちろん無菌的条件は微生物の移植および
その生育を通して維持されなければならない。 接種物はＮ−483−29培養物を接種された斜面
またはルー（Roux）びんから栄養細胞をかき取
ることによつて調製する。斜面またはルーびん上
で最初に生育させるのに適した固体培地はATCC
培地＃172である。ATCC172 ｇ／ グルコース 10 可溶性でんぷん 20 酵母エキス ５ NZアミンＡ ５ 炭酸カルシウム １ 蒸留水で1000mlとし、KOHでPH7.0とする。 寒天添加 20 斜面からの栄養細胞を使用して振とうフラスコ
あるいは接種タンクを接種した。あるいは、別法
として、接種タンクは振とうフラスコから接種す
る。振とうフラスコ中での生育は一般に96〜120
時間で最庫に達するので接種タンク中での生育期
間は通常72〜96時間がもつとも好ましい。発酵装
置を完全に無菌条件下に接種フラスコまたはタン
クからの栄養細胞ブロスで接種し、96〜168時間
発酵させる。通気は振とうフラスコの場合は揺動
により、タンクの場合はスパージヤーを通して滅
菌した空気を1/2〜２容量／ブロスの容量／分の
速度で通気することによつて維持する。揺動（撹
拌）の速能は上述の如く使用されたタイプの撹拌
器に依る。温度は24℃〜36℃に調節する。 発酵完了時に抗生物質は全ブロスをｎ−ブタノ
ール、メチルイソブチルケトン、酢酸エチルまた
はクロロホルムのような水非混和性溶媒によつて
PH4.0〜8.0で抽出することによつて回収される。
別法として、菌糸を分離し上記溶媒の１つで抽出
して抗生物質を単離する。この抽出物を濃縮し、
濃縮物をヘプタンにとり、シリカゲル上でクロマ
トグラフイーにかける。 発酵の間の抗生物質産生の進行状況および発酵
ブロスの生物活性は黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus）または枯草菌
（Bacillus subtilis）の感受性菌株を使用して上
記ブロスの生物検定によつて監視できる。黄色ブ
ドウ球菌（S.anrens）ATCC6538および枯草菌
（B.sunbtilis）ATCC6633はこの目的に適した菌
株である。標準的プレート検定技術によれば該ブ
ロスで飽和した紙円板の周囲の阻止帯を抗生物
質の効力の目安とする。シリカゲルを使用する薄
層クロマトグラフイーは発酵培地中で産生される
抗生物質を分析する有用な手段であり、粗製のお
よび精製された物質の組成物が発酵ブロスから抽
出する。アナルテク（Analtech）シリカゲルGF
クロマトグラムを酢酸エチル：メタノール（９：
１）の混合物あるいはクロロホルム：メタノール
９：１の混合物で展開する。この抗生物質をバニ
リン試薬（75mlのエタノール中３ｇのバニリンお
よび25mlの85％リン酸）で噴霧しTLCプレート
を80℃で加熱することによつて目に見えるように
する。この抗生物質は紫色のスポツトとして見え
る。プレートは黄色ブドウ球菌（S.anrens）また
は枯草菌（B.subtilis）のいずれかを接種し、２，
３，４−トリフエニル−2H−テトラゾリウムク
ロリド−水和物を添加しておいた寒天を積層し37
℃で16時間インキユベートして該抗生物質を可視
化した（ピンク色の背景に対して白色）。 抗生物質19−エピ−ダイアネマイシンは種々の
グラム陽性微生物に対して生育阻止作用を示す。 この試験のために各微生物を栄養培地および
種々の濃度の19−エピ−ダイナマイシンを含有す
る一連の試験管に接種し微生物の生育を24時間以
上にわたつて阻止する抗生物質の最小濃度
（MIC）を測定する。 19−エピ−ダイアネマイシンおよびそのカチオ
ン塩は家禽のコクシジウム感染症に対するすぐれ
た活性を示す。にわとりの餌に50〜200ppmで混
入すると、これらの化合物はエイメリア・テネラ
（Eimeria tenella）、エイメリア・アセルブリナ
（E.acervulina）、エイメリア・マキシマ（E.
maxima）、エイメリア・ブルネツチ（E.
brunetti）およびエイメリア・ネカトリツクス
（E.necatrix）によつてひき起される感染症を抑
制するのに有効である。 にわとりのコクシジウム感染症に対する19−エ
ピ−ダイネマイシンおよびその塩の有効性のデー
タは下記のように得られた。３〜５日令のSPE白
色レグホンの雄どり群に19−エピ−ダイアネマイ
シンまたはそのナトリウムおよび／またはカリウ
ム塩を均一に分散させたすり餌を与えた。この餌
を24時間摂取させた後、各にわとりに経口でエイ
メリア属の特定種の接合子嚢を接種した。他の群
の３〜５日令のにわとりに19−エピ−ダイアネマ
イシンを含まない同様のすり餌を与え、コクシジ
ウムを感染させなかつた。これらは正常の対照と
して使用した。処理の結果はエイメリア・アセル
ブリナ（E.acervulina）の場合５日後に評価し他
の種についてはすべて６日後に評価した。 抗コクシジウム活性を測定するのに使用した基
準はエイメリア・テネラ（E.tenella）について
はJ.E.Lynch、“Ａ New Method for the
Primary Evaluation of Anticoccidial
Activity”、Am.J.Vet.Res.22、324〜326（1961）
に従つて障害点数０〜４とし；他の種については
J.Johnson and W.H.Reid、“Anticoccidial
Drugs Lesion Scoring Techniqes in Battery
and Floor Pen Experiments in Chiclcs”、
Exp.Parasit.28、30〜36（1970）によつて考案さ
れた点数方式の変形にもとづいて０〜３とした。
一定の比が各処理群の障害点数を感染対照の障害
点数で割ることによつて達成される。 19−エピ−ダイアネマイシンのコクシジウム感
染抑制剤としての活性を下記のような実験により
測定した：各群５羽の生後９日のバレツド・ロツ
ク・クロス（Barred Rock Cross）系ひよこに、
19−エピ−ダイアネマイシンを25〜150ppmの
種々の濃度で含有する基本飼料を与えた。下記組
成を有する市販のにわとり用スターター（ピユリ
ナ・コマーシヤル・チツク・スターター；ミズー
リ州、セントルイスのザ・ラルストン ピユリナ
社（The Ralston Purina Co.）を基本飼料とし
て使用し、感染の24時間前およびその後試験期間
を通して連続的に適宜にわとりに与えた。基本飼料組成 粗蛋白 18.0％以上 粗脂肪 3.0％以上 粗繊維 6.0％以下 ミネラル添加 3.5％以下 原料：肉および骨粉、魚粉、大豆粉、大豆ひき
わり粉、からす麦ひきわり粉、黄色とうもろこし
粉、脱水アルフアルフア粉、小麦中級品、ピタミ
ンB12添加物、エトキシキン（防腐剤）、動物性
脂肪（ブチル化ヒドロキシアニソールで防腐した
もの）、塩化コリン、ナイアシン、ビタミンＡ添
加物、リボフラビン添加物、パントテン酸カルシ
ウム、Ｄ活性化動物ステロール、ビタミンＥ添加
物、メナジオン重亜硫酸ナトリウム（２−メチル
−１，４−ナフタキノン重亜硫酸ナトリウム）
（ビタミンＫ活性源）、炭酸カルシウム、低弗素リ
ン鉱石、ヨウ化塩、硫酸マンガン、酸化第一マン
ガン、硫酸銅、酸化亜鉛。 投薬後24時間して、これらのにわとりにエイメ
リア・テネラ（Eimeria tenella）の200000個の
芽胞を有する接合子嚢（sporulated cocysts）を
経口で接種した。そして、各群の各にわとりの平
均均体重を測定した。さらに、10羽の群にもつと
多量の試験化合物を含む基本飼料を与えた。 （未感染、未処理対照群） さらにもう１つの10羽からなる群を未感染、未
処理対照群として使用した。これらのにわとりを
感染後５日目及び６日目に出血の徴候の有無につ
いて検査した。感染後８日目に、各群各にわとり
の平均体重を測定し、にわとりの死体を解剖し、
盲端（cecum）を肉眼でしらべた。そして病理イ
ンデツクス（平均感染重症度）を測定した。感染
後５日前に死亡したにわとりを毒死と見なした。
感染後５日以降に死亡したにわとりを感染病によ
る死亡と見なした。試験化合物の効果は、致死率
の低下および病理インデツクスを未投薬の感染対
照の病理インデツクスと比較することによつて測
定した。死体解剖に際して、病理インデツクスは
対照に対する障害％、すなわち、試験されたにわ
とりに対照のにわとりとの障害の数の差対対照の
にわとりの障害の数の百分率の比として表わし
た。 19−エピ−ダイアネマイシンの抗コクシジウム
活性は下記のとおりである： 【表】 動物飼料についてのデータは一般的に動物に飼
料を直接与えることによつて測定された。英国特
許明細書第1197826号はインビトロでの反すう胃
技術を詳しく説明しており、これによれば、微生
物によつてもたらされる飼料中の変化がより容易
に測定され、動物飼料の評価が非常に正確であ
る。 この技術は動物の消化過程をインビトロで行い
研究できる装置を使用することからなる。動物飼
料、反すう胃接種物、および種々の生育促進剤を
注意深く制御された条件下に実験室ユニツトに導
入し、それから取り出し、生じた変化を微生物に
よつて飼料が消化を受けている間臨界的且つ段階
的に研究する。反すう胃液体中のプロピオン酸含
量の増加は全般的な反すう動物の生育が飼料組成
物中の生長促進剤によつて望ましく促進されたこ
とを示している。プロピオン酸含量の変化は対照
反すう胃液に含まれるプロピオン酸の％として表
わされる。長期間にわたつてインビボで飼料を与
えて研究した結果、反すう胃液中のプロピオン酸
の増加と改善された動物の生長との間に信頼し得
る相関関係が示される。 市販の肥満させるための飼料に干草を加えて与
えておいた牛に穿孔して反すう胃液を集めた。反
すう胃液はただちにチーズクロスを通して過
し、10mlを400mgの標準物質（とうもろこしでん
ぷん68％＋セルロース17％＋大豆かす粉15％）を
含有する50mlのコニカルフラスコに入れ、10mlの
PH6.8緩衝液および試験化合物を加えた。フラス
コに酸素を含まない窒素を約２分間通気し、37℃
の振とう水浴中で約16時間インキユベートした。
すべての試験は三重に行つた。 インキユベート後、５mlの試料を１mlの25％メ
タリン酸と混合した。10分後、0.25mlの蟻酸を加
え、混合物を1500rpmで10分間遠心分離した。次
いで試料をD.W.Kellog、J.Dairy Science52、
1690（1969）の方法により気液クロマトグラフイ
ーによつて分析した。酢酸、プロピオン酸、およ
び酩酸のピークの高さを未処理および処理インキ
ユベーシヨンフラスコからの試料について測定し
た。 牛や羊のような反すう動物および豚やウサギの
ような単胃動物による飼料効率を改善するため
に、19−エピ−ダイアネマイシンは飼料組成物に
遊離酸、ナトリウム塩、カリウム塩またはそれら
の混合物として混入する。19−エピ−ダイアネマ
イシン粗生成物またはこの抗生物質を含有する乾
燥発酵ブロスを望ましい効力を示す濃度で飼料組
成物に混入する。 下記例は本発明をさらに充分説明するものであ
つて、決して本発明の範囲を限定するものではな
い。 例 １ 振とうフラスコに下記組成の培地を調製した：CL13M ｇ／ セレロース 20.0 大豆粉 10.0 蒸留可溶物 5.0 硫酸ナトリウム 0.5 塩化コバルト 0.002 炭酸カルシウム ２ 100mlの培地を300mlの振とうフラスコに入れ
120℃で15psiで30分間滅菌した。冷却後、培地に
ATCC172寒天培地で生育したストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカス（Strptomyces
hygroscopicus）ATCC39205の栄養細胞懸濁液
を接種した。これらのフラスコを28℃で3.81〜
6.35cm（１ 1/2〜２ 1/2インチ）の変位を有する
ロータリーシエーカーで150〜200サイクル／分
（CPM）で３〜４日間振とうした。１つのフラス
コを使用して３の下記培地を含む５発酵容器
を接種した：CL13M ｇ／ セレロース 20.0 大豆粉末 10.0 蒸留可溶物 5.0 硫酸ナトリウム 0.5 炭酸カルシウム 2.0 塩化コバルト 0.002 水で１にする。 PH6.9−7.0 １mlのL16シリコンを消泡剤として加え、容器
を密封し、120℃、15psiで45分間滅菌した。これ
らの容器（ポツト）に１つのフラスコ分の培養物
（約３％接種物）で接種し、96〜168時間30℃で
1700回転／分（RPM）で１容量の空気／液体の
容量／分の通気速度で撹拌しながら発酵させた。 発酵が完了したとき（枯草菌（B.subtiliss）
ATCC6633に対する抗生物質デイスク検定にもと
づいて）、発酵装置の運転を止めPHを調製するこ
となく珪藻土によつて過した。フイルターケー
キをメタノール中でスラリー化し、過し、溶媒
を真空下に濃縮し、２〜３容量の水で希釈し、次
いでメチルイソブチルケトンのような溶媒1/3〜
１／２容量で２回抽出した。溶媒層を水性相から吸
引又は遠心分離で分離し、加熱し真空下に濃縮し
て粘稠性の油状物とした。 別法として、この抗生物質は全ブロスをそのま
まのPHでメチルイソブチルケトンで抽出し、この
溶媒を濃縮して粘稠性の油状物とすることによつ
て単離された。この油状物をヘプタンに懸濁し、
バツチをシリカゲル60で処理した。シリカゲルケ
ーキをクロロホルム；クロロホルムと酢酸エチル
および酢酸エチルで溶出した。濃縮後、酢酸エチ
ルフラクシヨンから粗生成物を得、これから19−
エピ−ダイアネマイシンがナトリウムとカリウム
の混成塩として結晶した。 この粗生成物を下記系を使用して薄層クロマト
グラフイーにかけてダイアネマイシンと19−エピ
−ダイアネマイシンの混合物を分離し、19−エピ
−ダイアネマイシンのみ検出した。 【表】 この例の培地の代りに下記培地の１つを使用し
た場合も同様の結果が得られた。 培地Ｃ ｇ／ セレロース 10.0 とうもろこしでんぷん 10.0 大豆粉 10.0 とうもろこし発酵性固体 5.0 塩化ナトリウム 5.0 炭酸カルシウム 1.0 水で１にする。PH6.9−7.0 培地Ｍ ｇ／ セレロース 10.0 でんぷん 20.0 酵母エキス 5.0 塩化コバルト 0.002 NZアミンＡ 5.0 炭酸カルシウム 1.0 水で１にする。PH6.9−7.0 例 ２ 例１の方法を大きな発酵装置で規模を拡大して
行うために0.7リツトルのCL13培地を含有する振
とうフラスコをつくつた。この振とうフラスコ内
の接種物を３〜５日間28℃で発酵しCL13M培地
4542リツトル（1200ガロン）を含有する6434.5リ
ツトル（1700ガロン）の発酵装置に接種した。約
１リツトル（0.05％）の接種物をタンクの中で使
用した。この発酵装置を４日間発酵させた後回収
した（約4164リツトル（1100ガロン））。全ブロス
を1/5容量のメチルイソブチルケトンでそのまま
のPHで抽出し、ポドビールニアツク
（Pcdbielniack）抽出器で分離し、溶媒を真空濃
縮して油状物とした（30.3リツトル（８ガロ
ン））。 この油状物をさらにサイクロン蒸発器でシロツ
プ状に濃縮した。濃縮後この油状物をヘプタンに
懸濁してシリカゲル（メルクシリカゲル60）で撹
拌し、シリカゲル床に通して過し、ヘプタンで
繰返し洗つた。この抗生物質を順にクロロホル
ム、クロロホルム／酢酸エチル、酢酸エチルで溶
出し、最後に酢酸エチル中50％のアセトンで溶出
した。この溶出物を薄層クロマトグラフイーにか
けてフラクシヨンを生成検定した。活性なフラク
シヨンを集め、濃縮し、再びクロマトグラフイー
にかけて抗生物質を単離した。この処理の間にシ
リカゲルバツチ処理から得られた活性なフラクシ
ヨンについていくつかの問題が生じた。活性なフ
ラクシヨンを顆粒状ダルコ（Darco）カーボンに
通すと不純物が除かれ回収率が改善された。約40
ｇの結晶19−エピ−ダイアネマイシンが回収され
た。 例 ３ 例２の方法によつてストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカス（S.hygroscopicus）ATCC39205
の約4164リツトル（1100ガロン）発酵物をつくつ
た。全ブロスを1/5容量のメチルイソブチルケト
ンで抽出し、抽出物を真空下に茶色の油状物（約
3.79リツトル（１ガロン））とした。この濃縮物
を11.4リツトル（３ガロン）の撹拌されているヘ
プタンに注加し、得られたスラリーを珪藻土床を
通して過した。 この液を３Kgのメルクカラム級シリカゲル60
（70〜230メツシユ）でバツチ処理した。これらの
フラクシヨンを薄層クロマトグラフイーで検査
し、19−エピ−ダイアネマイシンが主としてアセ
トンとクロロホルムのフラクシヨンにあることが
わかつた。 アセトンフラクシヨン（180ｇ）を酢酸エチル
中メルクカラム級シリカゲル60（230〜400メツシ
ユ）を充填した８×100cmカラムでクロマトグラ
フイーにかけた。酢酸エチルを溶出溶媒として使
用した。流速は70ml／分で各々１のフラクシヨ
ンを採取した。各フラクシヨンをアナルテク
（Analtech）GFシリカゲルプレートで酢酸エチ
ルを展開溶媒として薄層クロマトグラフイーにか
けた。これらのプレートをバニリン試薬（75mlの
エタノールと25mlの85％リン酸中３ｇのバニリ
ン）で噴霧し80℃に加熱することにより可視化し
た。19−エピ−ダイアネマイシンはこれらの条件
下に紫色のスポツトとなつた。 19−エピ−ダイアネマイシンを含有するフラク
シヨンをいつしよにして蒸発させた。濃縮物を１
のクロロホルムに溶解させ、１の酸水溶液
（PH４）で洗い、次いで１の５％二塩基性リン
酸ナトリウム緩衝液（PH９）で洗い、無水の硫酸
ナトリウムで乾燥し、過し、蒸発させた。この
濃縮物をアセトンにとり、少量の（約10％）の水
を加えると19−エピ−ダイアネマイシンがナトリ
ウム塩として結晶した。結晶を取し室温で真空
下を乾燥した。収量は23ｇ（ナトリウム塩）。 シリカゲルバツチ処理からのクロロホルムフラ
クシヨンを１のクロロホルムに再び溶解し、ク
ロロホルム中顆粒状活性炭を充填した７×120cm
カラムに通した。カラムをクロロホルムで20ml／
分で溶出し、300mlのフラクシヨンを集めた。抗
生物質を含有するフラクシヨンを集め濃縮した。
濃議物を上記の如くアセトンフラクシヨンについ
てはナトリウム塩として結晶化した。収量は14ｇ
であつた。さらに10ｇの粗生成物を第二の収量と
して得た。 19−エピ−ダイアネマイシンのナトリウム塩の
融点は193−205℃であつた。他の特性は次のとお
りであつた： UVλnax＝232nｍ、Ｅ１％ １cm＝157 αD＝＋11.0゜（ｃ＝１、メタノール） 元素分析値： C47H77O14Naとして 計算値：Ｃ、63.49 Ｈ、8.73 Ｏ、27.78 実測値：Ｃ、63.10 Ｈ、8.86 Ｏ、28.04 ナトリウム塩のクロロホルム溶液を酸水溶液
（PH４）で洗い次いでクロロホルムを蒸発するこ
とによつて遊離酸を形成した。この化合物を結晶
化に導くことは出来なかつたが、ガラス状物とし
て得た。 UVλnax＝232nｍ、Ｅ１％ １cm＝163 αD＝＋15.6゜（ｃ＝１、メタノール） C47H78O14として 計算値：Ｃ、65.10 Ｈ、9.06 Ｏ、25.84 実測値：Ｃ、64.45 Ｈ、8.94 Ｏ、26.61 赤外スペクトル（19−エピ−ダイアネマイシン
のナトリウム塩として）（KBr中）： 2931、2874、2787、2731、2701、2651、2515、
1716、1667、1566、1462、1406、1373、1333、
1326、1293、1271、1237、1191、1164、1117、
1098、1065、1003、984、946、912、897、868、
843、786、775、732、664、590cm-1 呈色反応 19−エピーダイアネマイシンにバニリン試薬
（75mlのエタノール中３ｇのバニリンおよび25ml
の85％リン酸）を噴霧したTLCプレートを80℃
に熱すると紫色のスポツトとして見える。 溶剤に対する溶解性 メタノール、メチル、イソブチルケトン、酢酸
エチル、アセトン、水、クロロホルムに可溶性；
およびヘプタンに不溶性。
する微生物の培養物に関する。より詳細には、本
発明は19−エピ−ダイアネマイシンを産生する新
菌株、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（Streptmyces hygroscopicus）の培養物に関す
る。 コクシジウム症、すなわち家禽類に共通で広く
蔓延する感染症はエイメリア（Eimeria）属の原
虫である数種の寄生虫のうちの１つあるいはそれ
以上によつて引き起される。２つのタイプのコク
シジウム症、すなわち盲腸性のものと腸性のもの
が知られている。第一のタイプはエイメリア・テ
ネラ（E.tenella）によつて引き起され、重篤な
出血を特徴とする。第二のタイプはエイメリア・
アセルブリナ（E.acervulina）、エイメリア・ネ
カトリツクス（E.necatrix）、エイメリア・マク
シア（E.maxima）、エイメリア・ハガニ（E.
hagani）、エイメリア・ミテイス（E.mitis）、エ
イメリア・プラエコツクス（E.praecox）および
エイメリア・ブルネツテイ（E.brunetti）のよう
なエイメリア属の種々の種によつて引き起され
る。七面鳥ではエイメリア・アデノイデス（E.
adenoides）およびエイメリア・マレアグリミテ
イス（E.maleagrimitis）がコクシジウム症の病
原微生物である。 胞子虫症の経済的影響は非常に大きく、胞子虫
症の撲滅と抑止は家禽業界にとつて非常に重大で
ある。 非常に広範囲の構造の化合物（ポリエーテル抗
生物質等）が抗コクシジウム剤として開示されて
いる。たとえば次のような抗生物質である： モネンシン〔Ｊ．Amer．Chem．Soc．、89、
5737（1967）〕；ニゲリシン〔Biochem．Biophys．
Res．Comm．、33、29（1968）〕；グリソリキシン
〔Ｊ．Chem．Soc．Chem．Commun．、1421
（1970）〕；ダイアネマイシン〔Ｊ．Antibiotics
22、161（1969）；U.S.Patent3、577、531of
May4、1971〕；サリノマイシン〔J.Antibiotics、
27、814（1971）〕；Ｘ−537A〔J.Chem.Soc.Chem.
Commun．、967（1972）〕；Ｘ−206〔J.Chem.Soc.
Chem.Commun．、927（1971）〕；A204A〔J.Amer.
Chem.Soc.、95、3399（1973）〕；ミユータロマイ
シン〔J.Antibiotics、30、903（1977）〕；イオノマ
イシン〔J.Amer.Chem.Soc．、101、3344
（1979）〕；Ｋ−41B〔J.Antibiotics、32、169
（1979）〕；Ａ−130BおよびＡ−130C〔J.
Antibiotics33、94（1980）〕；ロイセラマイシン
〔J.Antibiotics、33、137（1980）〕；およびＡ−
28695 Ｂ〔J.Antibiotics、33、252（1980）〕。この
問題はウエイレス（Westley、“Polyether
Antibiotics”、Ady.Appl.Miciobiol．、22、177
（1977））およびシユマードら（Shumard et.al.、
Antimicrob.Agents ＆ Chemother．369−377
（1967））によつて検討された。豚赤痢、すなわち
アメリカ合衆国で診断される最も普通の豚の疾病
の１つは他の多くの国でも流行しており、年間の
経済的損失は非常に大きい。最近、大きなスピロ
ヘータであるトレポネマ・ヒオデイセンテリアエ
（Treponema hyodysenteriae）が感染症の第１
次源であることがわかつた〔Harris、D.L.et al.
“Swine Dysentery−１ Inoculation of Pigs
with Treponema hyodysenteriae（New
Species）and Reproduction of the Disease、
“Vet.Med／SAC、67、61−64（1972）〕。 牛のような反すう動物の体位向上（生長速度の
増加および／または飼料利用効率の増加）は獣医
科学のもう１つの経済的に望ましい課題である。
特に重要なのは飼料利用効率を増加することによ
つて達成される生長促進である。反すう動物用飼
料の主栄養部分（炭水化物）の利用のメカニズム
は周知である。反すう動物の反すう胃中の微生物
は炭水化物を単糖類に分解し、これは次いでピル
ベートに転化される。ピルベートは微生物学的方
法で代謝されてアセテート、ブチレートまたはプ
ロピオナート（まとめて揮発性脂肪酸（VFA）
として知られる）を形成する。より詳しく検討す
るためには、Leng、“Physiology of Digestion
and Metabolism in the Ruminant、
“Phillipson et al.、Eds.、Oriel Press、
Newcastle−upon−Tyne、England、1970、
pp.408−410を参照されたい。 VFA利用の相対的効率については下記文献で
論じられている：Mc Cullough、“Feedstuffs、”
June19、1971、およびp19；Eskeland et al.J.
An.Sci．33、282（1971）；およびChurch et al.
“Digestive Physiology and Nutrition of
Ruminants、”Vol.2、1971、pp.622および625。 アセテートおよびブチレートも利用されるが、
プロピオネートを利用するとより大きな効率が得
られる。さらに、あまりにプロピオネートが少な
いと動物がケトン症になる可能性がある。したが
つて有利な化合物は動物が炭水化物から高い割合
のプロピオネートを産生するのを促進し炭水化物
の利用効率を増大せしめ、ケトン症の発疱率を低
減させるものである。 ワシントン市で集めた土壌試料から単離された
新菌株のスプレプトマイセス・ハイグロスコピカ
ス（Streptomyces hygroscopicus）が抗コクシ
ジウム特性を有する新規で価値ある抗生物質を産
生することがわかつた。この新規な生成物を単離
し、19−エピ−ダイアネマイシンと同定した。 本発明の抗生物質産生微生物はアメリカ合衆国
ワシントン市で集めた土壌試料から単離された。
これは培養物Ｎ−483−29と称した。この微生物
の分類学的研究はL.H.ハン（Huang）によつて
なされ、下記の特性が示された。彼の研究にもと
づいてこの菌株はストレプトマイセス・ハイグロ
スコピカス（ジエンセン）ワクスマン・エンド・
ヘンリシ（Streptomyces hygroscopicus
（Jensen）Waksman and Henrici）であること
が結論された。 この新しい培養物は放線菌目の細い菌糸を有
し、気菌糸上に胞子鎖をつくり、断裂していない
基質菌糸を形成する。全細胞分析の結果によりさ
らにストレプトマイセス（Streptomyces）属に
属することがわかつた。 培養物Ｎ−483−29を斜面培養試験官から
ATCC＃172プロスに移植し３日間28℃で振とう
器上で生育させた。次いでこれを20分間遠心分離
し、３回滅菌蒸留水で洗い、通常放線菌目
（Actinomycetales）の菌の同定に使用される培
地に移植した。 この培養物を28℃でインキユベートし、結果を
経時的に測定しながら14日間観察するのがもつと
もふつうである。色は共通の用語で記述され、正
確な色はザ・カラー・ハーモニー・マニユアル
（The Color Harmony Manual）、第四版の色片
と比較することによつて測定される。全細胞アミ
ノ酸および糖分析の方法はBecker、B.et al.、
Appl.Microbiol．、12、421−423、（1964）、and
in Lechevalier、M.P.、J.Lab.Clin.Med．、71、
934−944（1968）に記載されている。 この培養物の特性を決定するのに使用した同定
用培地及びその組成は下記のとおりである： １ トリプトン−酵母エキスブロス−（ISP＃１
培地、デイフコ（Difco）） ２ 酵母エキス−麦芽エキス寒天−（ISS＃２培
地、デイフコ） ３ オートミール寒天−（ISP＃３培地、デイフ
コ） ４ 無機塩−でんぷん寒天−（ISP＃４培地、デ
イフコ） ５ グリセリン−アスパラギン寒天−（ISP＃５
培地、デイフコ） ６ ペプトン−酵母エキス鉄寒天−（ISP＃６培
地、デイフコ） ７ ツアペク−蔗糖寒天−S.W.Waksman、The
Actinomycetes、Vol.2、培地No.１、p328、
1961 ８ グルコース−アスパラギン寒天−S.W.
Waksman、The Actinomycetes、Vol.2、培
地No.２、p328、1961 ９ ベネツトの寒天−同上培地No.30、p331 10 エマーソンの寒天−同上培地No.28、p331 11 栄養寒天−同上培地No.14、p330 12 ゴードンおよびスミスのチロシン寒天−R.E.
Gordon and M.M.Smith、Jr.、Bact.69、147
−150、1955。 13 カゼイン寒天−同上 14 マレイン酸カルシウム寒天−S.A.
Waksman、Bact、Rev.21、１−29、1957 15 ゼラチン−R.E.Gordon and J.M.Mihm、
Jr.、Bact.73、15−27、1957 16 でんぷん−同上 17 有機硝酸塩ブロス−同上 18 デキストリン硝酸塩ブロス−30ｇの蔗糖の代
りに３ｇのデキストリンを使用して寒天を除い
た以外はS.A.Waksman、The
Actinomycetes、Vol.2、培地No.１、p328、
1961 19 ばれいしよにんじん寒天−M.P.Lechvalier、
Jr.、Iab.and Clinical Med.71、934−944、
1968しかし30ｇのばれいしよ、2.5ｇのにんじ
んおよび20ｇの寒天のみを使用する。 20 ２％水道水寒天 21 スキムミルク−デイフコ 22 セルロース利用 (a) H.L.Jensen、Proc.Linn.Soc.N.S.W.55、
231−248、1930 (b) M.Levine and H.W.Schoenlein、Ａ
Compilation of Culture Media、medium
No.2511、1930 23 炭水化物−ISP＃９培地、デイフコ 24 温度範囲−ISP＃２培地＋50mlのココやしの
果汁 酵母エキス−麦芽エキス寒天−生育良
好、黄色がかつた（2ea）隆起または膜が有
り、黄褐色（3ie近く）中位に盛り上がつた、
しわがよつているか膜状、気菌糸なし；裏面淡
黄色がかつて（2ea）、茶色の線（3gc、3ic）が
あり；可溶性色素茶色（3lc、3ne）。 オートミール寒天 生育中位、白色、黄色がかつた色ないし灰色
（１ 1/2ea、１ 1/2ga、灰色に近い一連の色3dc、
3fe）、薄いないしわずかに盛り上がり、なめら
か、いくつかの部分で疎水性、表面と同じ気菌
糸；裏面無色、クリーム色ないし灰色（１ 1/2
ca、灰色に近い一連の色3dc、3fe）；可溶性色素
淡黄色（１ 1/2ca）。 無機塩−でんぷん寒天 生育中位ないし良好、黄色がかつた色ないし灰
色（1ea、１ 1/2ea、灰色に近い一連の色3dc、
3fc、3ih）、薄いないし盛り上がり、なめらかだ
が縁に近いところはしわがより、いくつかの部分
では疎水性、表面と同じ気菌糸；裏面淡黄色ない
し灰色（2ea、灰色に近い一連の色3dc、3fe）；可
溶性色素淡黄色（１ 1/2ca）。 グリセリン−アスパラギン寒天 生育乏しいないし中位、無色ないしクリーム色
（灰色に近い一連の色1ba）、薄い、なめらか、気
菌糸なし；裏面無色、可溶性色素なし。 グルコース−アスパラギン寒天 生育良好、白色ないしクリーム色（2ca）、盛
り上がり、しわがより、縁が広がつており、気菌
糸なし；裏面無色；可溶性色素淡黄色（2ca、
2ea）。 ツアペツク−蔗糖寒天 生育中位ないし良好、クリーム色（2ca）、薄
い、なめらか、縁が広がり、気菌糸なし；裏面無
色ないしクリーム色（2ca）；可溶性色素クリー
ム色（2ca）。 エマーソン寒天 生育良好、黄褐色（3gc近く）、盛り上がり、
なめらかないしわずかにしわがより、気菌糸な
し；裏面表面と同じ；可溶性色素茶色（3lc）。 栄養寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca、2ca）わず
かに盛り上がり、なめらかあるいは離れたコロニ
ーとなり、気菌糸なし；裏面淡黄色（2ca、
2ea）；可溶性色素。 ベネツトの寒天 生育良好、クリーム（2ca）、中位盛り上がつ
ており、しわが寄るか隆起しており、気菌糸ない
か非常にわずか、白色；裏面クリーム色ないし淡
黄色（2ea）。 ゴードンおよびスミスのチロシン寒天 生育乏しいか中位、黄色がかつた茶色ないし暗
茶色（4ec、4nl、5nl）、薄いないしわずかに盛り
上がり、なめらか、気菌糸なし；裏面茶色ないし
暗茶色（5lg、5ni）；可溶性色素暗茶色ないし黒
色（5ni、5pn）。 マレイン酸カルシウム寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄いない
しわずかに盛り上がり、なめらか、気菌糸なし；
裏挙表面と同じ；可溶性色素なし。 カゼイン寒天 生育中位、クリーム色（2ca近く）、中位盛り
上がり、なめらかであるが縁近くにしわがあり、
気菌糸なし；裏面は表面と同じ；可溶性色素クリ
ーム色。 でんぷん寒天 生育良好、クリーム色（2ca近く）、中位盛り
上がり、しわがあるが縁に近づくにつれなめら
か、気菌糸なし；裏面は表面と同じ；可溶性色素
クリーム色。 ばれいしよにんじん寒天 生育中位、クリーム色（１ 1/2ca）、薄く、な
めらか、気菌糸まばら、白色；裏面無色ないしク
リーム色；可溶性色素なし。 水道水寒天 生育乏しく、無色ないしクリーム色（灰色に近
い一連の色2ba）、薄く、なめらか、ほとんど深
部、気菌糸まばら、白色；裏面表面と同じ；可溶
性色素なし。 形態学的特性： 形態学的特性は14日間インキユベーシヨン後無
機塩−でんぷん寒天上で観察された。グレイカラ
ーシリーズの胞子塊；うず巻き部分の胞子鎖はわ
ずかに開き、その直径は小さく（長さ６−10μ
ｍ、巾３−4.5μｍ）、３〜６巻／コイルであり、
８〜30胞子／胞子鎖；胞子体は単軸的に分枝し、
時々渦巻き状に分枝し；胞子は卵形ないし楕円形
時として棒状あるいは舟状で1.2〜2.0×0.9〜1.2μ
ｍ、走査電子顕微鏡によれば疣状を呈する。 生化学的特性： メラニン生成せず；硫化水素生成；ゼラチン液
化；でんぷん加水分解；両方の硝酸塩ブロスにお
いて硝酸塩を亜硫酸塩に還元し；ジエンセンのセ
ルロースおよびレビンおよびヨーエンラインのセ
ルロース上で生育乏しく分解せず；牛乳を透明化
するが凝固せず；カゼイン消化（＋）；マレイン
酸カルシウム消化（＋）；チロシン消化（＋）。炭
水化物利用：グルコース、アラビノース、フラク
トース、イノシトール、マンニトール、ラフイノ
ース、ラムノース、蔗糖およびキシロースはすべ
て利用される。 温度関係： 【表】 良好ないしす 良好な 中位の 生育な
ぐれた生育 生育 生育 し
全細胞分析： 細胞壁はLL−ジアミノピメリン酸を含有して
いるが特徴的な糖賑は含まない。 培養物Ｎ−483−29は灰色の胞子塊、らせん状
の胞子鎖、疣状の表面を有する胞子およびメラニ
ン反応が陰性であることを特徴とする。蔗糖とラ
フイノースの利用が陽性である以外はこの単離物
はInt.J.Syst.Bact.、22、265−394、1972に記載
されているストレプトマイセス・ハイグロスコピ
カス（Ｓ・hygroscopicus）の新基準菌株につい
ての記載と一致する。炭素源の利用はH.D.
TresnerおよびE.J.Backusによると菌株により異
なり、彼等はApplied Microbiology、４、243−
250、1956に記載された種について広い概念を提
案した。このようにこの培養物はストレプトマイ
セス・ハイグロスコピカス（ジエンセン）ワクス
マン・エンド・ヘンリチ（Streptomyces
hygroscopicus（Jensen）Waksman and
Henrici）と考えられる。これはメリーランド州
のロツクビルにあるアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに寄託されておりこの公認の
寄託機関は寄託物を永続的に保存し、出願に特許
が付与された場合公衆に分譲する。この微生物は
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）ATCC39205と
称される。この微生物は37CFR1.114および
35USC122にもとづいてアメリカ合衆国特許商標
庁の長官によつて決定された人に分譲される。寄
託された微生物の公衆への分譲についてのすべて
の制限は特許付与と同時に完全に取り除かれる。
この微生物の寄託は1986年12月10日にATCCにお
いてブタペスト条約下での寄託に変更された。 本発明の上記説明と完全に一致する上記微生物
の使用のみに限定されず、上記目的を達成する微
生物の使用を包含する。天然のあるいはＸ線照
射、紫外線照射、ナイトロジエンマスタードによ
る処理等の種々の方法で人工的に誘導した変異種
および／または変種；たとえば上記微生物から得
られるものを使用するのが特に望ましい。 発明者等はここに記載した種からの核酸または
その均等物を使用して形質転換、人工的抗原変
換、遺伝子組換えまたは他の遺伝子の処理により
形成されてここに記載した目的生成物を生成し上
述の如き生化学的変化を生ぜしめる能力を取得し
た微生物であればその外見または生理学的挙動に
かかわらず使用することを希望する。 培養物ストレプトマイセス・ハイグロスコピカ
ス（S.hygroscopicus）ATCC39205の培養は深部
好気条件下に21゜〜37℃で水性栄養培地中で撹拌
しながら行なわれる。培養に有用な典型的な栄養
培地は同化し得る炭素源、たとえば糖、でんぷん
およびグリセリン、有機室素源、たとえばカゼイ
ン、カゼインの酵素分解物、カザミノ酸、大豆ひ
きわり紛、綿実粉、落花生粉、小麦グルテン、大
豆粉、酵母エキス、肉粉および魚粉；生長物質
源、たとえば殼物可溶物、魚粉、綿実粉および酵
母エキス；塩化ナトリウムおよび炭酸カルシウム
のような鉱物塩；および鉄、マグネシウム、亜
鉛、コバルトおよびマンガンのような微量元素；
および緩衝剤としての炭酸カルシウムおよびリン
酸カルシウムを含む。 もし過剰の泡が発酵中に生じたら、一般的に植
物性油またはシリコンのような消泡剤を発酵培地
に加える。深部生育のためのタンク中の培地の通
気に好ましくは約1/2〜２容量の滅菌した空気／
発酵ブロスの容量／分の割合でスパージヤーを通
してプロスの中に空気を強制的に通気することに
よつて維持される。撹拌は一般的に発酵技術の当
業者に周知の撹拌手段によつて維持される。撹拌
の速度は使用した撹拌装置のタイプに依る。振と
うフラスコな通常150〜200サイクル／分で運転さ
れ、発酵装置は通常300〜1700回転／分で運転さ
れる。もちろん無菌的条件は微生物の移植および
その生育を通して維持されなければならない。 接種物はＮ−483−29培養物を接種された斜面
またはルー（Roux）びんから栄養細胞をかき取
ることによつて調製する。斜面またはルーびん上
で最初に生育させるのに適した固体培地はATCC
培地＃172である。ATCC172 ｇ／ グルコース 10 可溶性でんぷん 20 酵母エキス ５ NZアミンＡ ５ 炭酸カルシウム １ 蒸留水で1000mlとし、KOHでPH7.0とする。 寒天添加 20 斜面からの栄養細胞を使用して振とうフラスコ
あるいは接種タンクを接種した。あるいは、別法
として、接種タンクは振とうフラスコから接種す
る。振とうフラスコ中での生育は一般に96〜120
時間で最庫に達するので接種タンク中での生育期
間は通常72〜96時間がもつとも好ましい。発酵装
置を完全に無菌条件下に接種フラスコまたはタン
クからの栄養細胞ブロスで接種し、96〜168時間
発酵させる。通気は振とうフラスコの場合は揺動
により、タンクの場合はスパージヤーを通して滅
菌した空気を1/2〜２容量／ブロスの容量／分の
速度で通気することによつて維持する。揺動（撹
拌）の速能は上述の如く使用されたタイプの撹拌
器に依る。温度は24℃〜36℃に調節する。 発酵完了時に抗生物質は全ブロスをｎ−ブタノ
ール、メチルイソブチルケトン、酢酸エチルまた
はクロロホルムのような水非混和性溶媒によつて
PH4.0〜8.0で抽出することによつて回収される。
別法として、菌糸を分離し上記溶媒の１つで抽出
して抗生物質を単離する。この抽出物を濃縮し、
濃縮物をヘプタンにとり、シリカゲル上でクロマ
トグラフイーにかける。 発酵の間の抗生物質産生の進行状況および発酵
ブロスの生物活性は黄色ブドウ球菌
（Staphylococcus aureus）または枯草菌
（Bacillus subtilis）の感受性菌株を使用して上
記ブロスの生物検定によつて監視できる。黄色ブ
ドウ球菌（S.anrens）ATCC6538および枯草菌
（B.sunbtilis）ATCC6633はこの目的に適した菌
株である。標準的プレート検定技術によれば該ブ
ロスで飽和した紙円板の周囲の阻止帯を抗生物
質の効力の目安とする。シリカゲルを使用する薄
層クロマトグラフイーは発酵培地中で産生される
抗生物質を分析する有用な手段であり、粗製のお
よび精製された物質の組成物が発酵ブロスから抽
出する。アナルテク（Analtech）シリカゲルGF
クロマトグラムを酢酸エチル：メタノール（９：
１）の混合物あるいはクロロホルム：メタノール
９：１の混合物で展開する。この抗生物質をバニ
リン試薬（75mlのエタノール中３ｇのバニリンお
よび25mlの85％リン酸）で噴霧しTLCプレート
を80℃で加熱することによつて目に見えるように
する。この抗生物質は紫色のスポツトとして見え
る。プレートは黄色ブドウ球菌（S.anrens）また
は枯草菌（B.subtilis）のいずれかを接種し、２，
３，４−トリフエニル−2H−テトラゾリウムク
ロリド−水和物を添加しておいた寒天を積層し37
℃で16時間インキユベートして該抗生物質を可視
化した（ピンク色の背景に対して白色）。 抗生物質19−エピ−ダイアネマイシンは種々の
グラム陽性微生物に対して生育阻止作用を示す。 この試験のために各微生物を栄養培地および
種々の濃度の19−エピ−ダイナマイシンを含有す
る一連の試験管に接種し微生物の生育を24時間以
上にわたつて阻止する抗生物質の最小濃度
（MIC）を測定する。 19−エピ−ダイアネマイシンおよびそのカチオ
ン塩は家禽のコクシジウム感染症に対するすぐれ
た活性を示す。にわとりの餌に50〜200ppmで混
入すると、これらの化合物はエイメリア・テネラ
（Eimeria tenella）、エイメリア・アセルブリナ
（E.acervulina）、エイメリア・マキシマ（E.
maxima）、エイメリア・ブルネツチ（E.
brunetti）およびエイメリア・ネカトリツクス
（E.necatrix）によつてひき起される感染症を抑
制するのに有効である。 にわとりのコクシジウム感染症に対する19−エ
ピ−ダイネマイシンおよびその塩の有効性のデー
タは下記のように得られた。３〜５日令のSPE白
色レグホンの雄どり群に19−エピ−ダイアネマイ
シンまたはそのナトリウムおよび／またはカリウ
ム塩を均一に分散させたすり餌を与えた。この餌
を24時間摂取させた後、各にわとりに経口でエイ
メリア属の特定種の接合子嚢を接種した。他の群
の３〜５日令のにわとりに19−エピ−ダイアネマ
イシンを含まない同様のすり餌を与え、コクシジ
ウムを感染させなかつた。これらは正常の対照と
して使用した。処理の結果はエイメリア・アセル
ブリナ（E.acervulina）の場合５日後に評価し他
の種についてはすべて６日後に評価した。 抗コクシジウム活性を測定するのに使用した基
準はエイメリア・テネラ（E.tenella）について
はJ.E.Lynch、“Ａ New Method for the
Primary Evaluation of Anticoccidial
Activity”、Am.J.Vet.Res.22、324〜326（1961）
に従つて障害点数０〜４とし；他の種については
J.Johnson and W.H.Reid、“Anticoccidial
Drugs Lesion Scoring Techniqes in Battery
and Floor Pen Experiments in Chiclcs”、
Exp.Parasit.28、30〜36（1970）によつて考案さ
れた点数方式の変形にもとづいて０〜３とした。
一定の比が各処理群の障害点数を感染対照の障害
点数で割ることによつて達成される。 19−エピ−ダイアネマイシンのコクシジウム感
染抑制剤としての活性を下記のような実験により
測定した：各群５羽の生後９日のバレツド・ロツ
ク・クロス（Barred Rock Cross）系ひよこに、
19−エピ−ダイアネマイシンを25〜150ppmの
種々の濃度で含有する基本飼料を与えた。下記組
成を有する市販のにわとり用スターター（ピユリ
ナ・コマーシヤル・チツク・スターター；ミズー
リ州、セントルイスのザ・ラルストン ピユリナ
社（The Ralston Purina Co.）を基本飼料とし
て使用し、感染の24時間前およびその後試験期間
を通して連続的に適宜にわとりに与えた。基本飼料組成 粗蛋白 18.0％以上 粗脂肪 3.0％以上 粗繊維 6.0％以下 ミネラル添加 3.5％以下 原料：肉および骨粉、魚粉、大豆粉、大豆ひき
わり粉、からす麦ひきわり粉、黄色とうもろこし
粉、脱水アルフアルフア粉、小麦中級品、ピタミ
ンB12添加物、エトキシキン（防腐剤）、動物性
脂肪（ブチル化ヒドロキシアニソールで防腐した
もの）、塩化コリン、ナイアシン、ビタミンＡ添
加物、リボフラビン添加物、パントテン酸カルシ
ウム、Ｄ活性化動物ステロール、ビタミンＥ添加
物、メナジオン重亜硫酸ナトリウム（２−メチル
−１，４−ナフタキノン重亜硫酸ナトリウム）
（ビタミンＫ活性源）、炭酸カルシウム、低弗素リ
ン鉱石、ヨウ化塩、硫酸マンガン、酸化第一マン
ガン、硫酸銅、酸化亜鉛。 投薬後24時間して、これらのにわとりにエイメ
リア・テネラ（Eimeria tenella）の200000個の
芽胞を有する接合子嚢（sporulated cocysts）を
経口で接種した。そして、各群の各にわとりの平
均均体重を測定した。さらに、10羽の群にもつと
多量の試験化合物を含む基本飼料を与えた。 （未感染、未処理対照群） さらにもう１つの10羽からなる群を未感染、未
処理対照群として使用した。これらのにわとりを
感染後５日目及び６日目に出血の徴候の有無につ
いて検査した。感染後８日目に、各群各にわとり
の平均体重を測定し、にわとりの死体を解剖し、
盲端（cecum）を肉眼でしらべた。そして病理イ
ンデツクス（平均感染重症度）を測定した。感染
後５日前に死亡したにわとりを毒死と見なした。
感染後５日以降に死亡したにわとりを感染病によ
る死亡と見なした。試験化合物の効果は、致死率
の低下および病理インデツクスを未投薬の感染対
照の病理インデツクスと比較することによつて測
定した。死体解剖に際して、病理インデツクスは
対照に対する障害％、すなわち、試験されたにわ
とりに対照のにわとりとの障害の数の差対対照の
にわとりの障害の数の百分率の比として表わし
た。 19−エピ−ダイアネマイシンの抗コクシジウム
活性は下記のとおりである： 【表】 動物飼料についてのデータは一般的に動物に飼
料を直接与えることによつて測定された。英国特
許明細書第1197826号はインビトロでの反すう胃
技術を詳しく説明しており、これによれば、微生
物によつてもたらされる飼料中の変化がより容易
に測定され、動物飼料の評価が非常に正確であ
る。 この技術は動物の消化過程をインビトロで行い
研究できる装置を使用することからなる。動物飼
料、反すう胃接種物、および種々の生育促進剤を
注意深く制御された条件下に実験室ユニツトに導
入し、それから取り出し、生じた変化を微生物に
よつて飼料が消化を受けている間臨界的且つ段階
的に研究する。反すう胃液体中のプロピオン酸含
量の増加は全般的な反すう動物の生育が飼料組成
物中の生長促進剤によつて望ましく促進されたこ
とを示している。プロピオン酸含量の変化は対照
反すう胃液に含まれるプロピオン酸の％として表
わされる。長期間にわたつてインビボで飼料を与
えて研究した結果、反すう胃液中のプロピオン酸
の増加と改善された動物の生長との間に信頼し得
る相関関係が示される。 市販の肥満させるための飼料に干草を加えて与
えておいた牛に穿孔して反すう胃液を集めた。反
すう胃液はただちにチーズクロスを通して過
し、10mlを400mgの標準物質（とうもろこしでん
ぷん68％＋セルロース17％＋大豆かす粉15％）を
含有する50mlのコニカルフラスコに入れ、10mlの
PH6.8緩衝液および試験化合物を加えた。フラス
コに酸素を含まない窒素を約２分間通気し、37℃
の振とう水浴中で約16時間インキユベートした。
すべての試験は三重に行つた。 インキユベート後、５mlの試料を１mlの25％メ
タリン酸と混合した。10分後、0.25mlの蟻酸を加
え、混合物を1500rpmで10分間遠心分離した。次
いで試料をD.W.Kellog、J.Dairy Science52、
1690（1969）の方法により気液クロマトグラフイ
ーによつて分析した。酢酸、プロピオン酸、およ
び酩酸のピークの高さを未処理および処理インキ
ユベーシヨンフラスコからの試料について測定し
た。 牛や羊のような反すう動物および豚やウサギの
ような単胃動物による飼料効率を改善するため
に、19−エピ−ダイアネマイシンは飼料組成物に
遊離酸、ナトリウム塩、カリウム塩またはそれら
の混合物として混入する。19−エピ−ダイアネマ
イシン粗生成物またはこの抗生物質を含有する乾
燥発酵ブロスを望ましい効力を示す濃度で飼料組
成物に混入する。 下記例は本発明をさらに充分説明するものであ
つて、決して本発明の範囲を限定するものではな
い。 例 １ 振とうフラスコに下記組成の培地を調製した：CL13M ｇ／ セレロース 20.0 大豆粉 10.0 蒸留可溶物 5.0 硫酸ナトリウム 0.5 塩化コバルト 0.002 炭酸カルシウム ２ 100mlの培地を300mlの振とうフラスコに入れ
120℃で15psiで30分間滅菌した。冷却後、培地に
ATCC172寒天培地で生育したストレプトマイセ
ス・ハイグロスコピカス（Strptomyces
hygroscopicus）ATCC39205の栄養細胞懸濁液
を接種した。これらのフラスコを28℃で3.81〜
6.35cm（１ 1/2〜２ 1/2インチ）の変位を有する
ロータリーシエーカーで150〜200サイクル／分
（CPM）で３〜４日間振とうした。１つのフラス
コを使用して３の下記培地を含む５発酵容器
を接種した：CL13M ｇ／ セレロース 20.0 大豆粉末 10.0 蒸留可溶物 5.0 硫酸ナトリウム 0.5 炭酸カルシウム 2.0 塩化コバルト 0.002 水で１にする。 PH6.9−7.0 １mlのL16シリコンを消泡剤として加え、容器
を密封し、120℃、15psiで45分間滅菌した。これ
らの容器（ポツト）に１つのフラスコ分の培養物
（約３％接種物）で接種し、96〜168時間30℃で
1700回転／分（RPM）で１容量の空気／液体の
容量／分の通気速度で撹拌しながら発酵させた。 発酵が完了したとき（枯草菌（B.subtiliss）
ATCC6633に対する抗生物質デイスク検定にもと
づいて）、発酵装置の運転を止めPHを調製するこ
となく珪藻土によつて過した。フイルターケー
キをメタノール中でスラリー化し、過し、溶媒
を真空下に濃縮し、２〜３容量の水で希釈し、次
いでメチルイソブチルケトンのような溶媒1/3〜
１／２容量で２回抽出した。溶媒層を水性相から吸
引又は遠心分離で分離し、加熱し真空下に濃縮し
て粘稠性の油状物とした。 別法として、この抗生物質は全ブロスをそのま
まのPHでメチルイソブチルケトンで抽出し、この
溶媒を濃縮して粘稠性の油状物とすることによつ
て単離された。この油状物をヘプタンに懸濁し、
バツチをシリカゲル60で処理した。シリカゲルケ
ーキをクロロホルム；クロロホルムと酢酸エチル
および酢酸エチルで溶出した。濃縮後、酢酸エチ
ルフラクシヨンから粗生成物を得、これから19−
エピ−ダイアネマイシンがナトリウムとカリウム
の混成塩として結晶した。 この粗生成物を下記系を使用して薄層クロマト
グラフイーにかけてダイアネマイシンと19−エピ
−ダイアネマイシンの混合物を分離し、19−エピ
−ダイアネマイシンのみ検出した。 【表】 この例の培地の代りに下記培地の１つを使用し
た場合も同様の結果が得られた。 培地Ｃ ｇ／ セレロース 10.0 とうもろこしでんぷん 10.0 大豆粉 10.0 とうもろこし発酵性固体 5.0 塩化ナトリウム 5.0 炭酸カルシウム 1.0 水で１にする。PH6.9−7.0 培地Ｍ ｇ／ セレロース 10.0 でんぷん 20.0 酵母エキス 5.0 塩化コバルト 0.002 NZアミンＡ 5.0 炭酸カルシウム 1.0 水で１にする。PH6.9−7.0 例 ２ 例１の方法を大きな発酵装置で規模を拡大して
行うために0.7リツトルのCL13培地を含有する振
とうフラスコをつくつた。この振とうフラスコ内
の接種物を３〜５日間28℃で発酵しCL13M培地
4542リツトル（1200ガロン）を含有する6434.5リ
ツトル（1700ガロン）の発酵装置に接種した。約
１リツトル（0.05％）の接種物をタンクの中で使
用した。この発酵装置を４日間発酵させた後回収
した（約4164リツトル（1100ガロン））。全ブロス
を1/5容量のメチルイソブチルケトンでそのまま
のPHで抽出し、ポドビールニアツク
（Pcdbielniack）抽出器で分離し、溶媒を真空濃
縮して油状物とした（30.3リツトル（８ガロ
ン））。 この油状物をさらにサイクロン蒸発器でシロツ
プ状に濃縮した。濃縮後この油状物をヘプタンに
懸濁してシリカゲル（メルクシリカゲル60）で撹
拌し、シリカゲル床に通して過し、ヘプタンで
繰返し洗つた。この抗生物質を順にクロロホル
ム、クロロホルム／酢酸エチル、酢酸エチルで溶
出し、最後に酢酸エチル中50％のアセトンで溶出
した。この溶出物を薄層クロマトグラフイーにか
けてフラクシヨンを生成検定した。活性なフラク
シヨンを集め、濃縮し、再びクロマトグラフイー
にかけて抗生物質を単離した。この処理の間にシ
リカゲルバツチ処理から得られた活性なフラクシ
ヨンについていくつかの問題が生じた。活性なフ
ラクシヨンを顆粒状ダルコ（Darco）カーボンに
通すと不純物が除かれ回収率が改善された。約40
ｇの結晶19−エピ−ダイアネマイシンが回収され
た。 例 ３ 例２の方法によつてストレプトマイセス・ハイ
グロスコピカス（S.hygroscopicus）ATCC39205
の約4164リツトル（1100ガロン）発酵物をつくつ
た。全ブロスを1/5容量のメチルイソブチルケト
ンで抽出し、抽出物を真空下に茶色の油状物（約
3.79リツトル（１ガロン））とした。この濃縮物
を11.4リツトル（３ガロン）の撹拌されているヘ
プタンに注加し、得られたスラリーを珪藻土床を
通して過した。 この液を３Kgのメルクカラム級シリカゲル60
（70〜230メツシユ）でバツチ処理した。これらの
フラクシヨンを薄層クロマトグラフイーで検査
し、19−エピ−ダイアネマイシンが主としてアセ
トンとクロロホルムのフラクシヨンにあることが
わかつた。 アセトンフラクシヨン（180ｇ）を酢酸エチル
中メルクカラム級シリカゲル60（230〜400メツシ
ユ）を充填した８×100cmカラムでクロマトグラ
フイーにかけた。酢酸エチルを溶出溶媒として使
用した。流速は70ml／分で各々１のフラクシヨ
ンを採取した。各フラクシヨンをアナルテク
（Analtech）GFシリカゲルプレートで酢酸エチ
ルを展開溶媒として薄層クロマトグラフイーにか
けた。これらのプレートをバニリン試薬（75mlの
エタノールと25mlの85％リン酸中３ｇのバニリ
ン）で噴霧し80℃に加熱することにより可視化し
た。19−エピ−ダイアネマイシンはこれらの条件
下に紫色のスポツトとなつた。 19−エピ−ダイアネマイシンを含有するフラク
シヨンをいつしよにして蒸発させた。濃縮物を１
のクロロホルムに溶解させ、１の酸水溶液
（PH４）で洗い、次いで１の５％二塩基性リン
酸ナトリウム緩衝液（PH９）で洗い、無水の硫酸
ナトリウムで乾燥し、過し、蒸発させた。この
濃縮物をアセトンにとり、少量の（約10％）の水
を加えると19−エピ−ダイアネマイシンがナトリ
ウム塩として結晶した。結晶を取し室温で真空
下を乾燥した。収量は23ｇ（ナトリウム塩）。 シリカゲルバツチ処理からのクロロホルムフラ
クシヨンを１のクロロホルムに再び溶解し、ク
ロロホルム中顆粒状活性炭を充填した７×120cm
カラムに通した。カラムをクロロホルムで20ml／
分で溶出し、300mlのフラクシヨンを集めた。抗
生物質を含有するフラクシヨンを集め濃縮した。
濃議物を上記の如くアセトンフラクシヨンについ
てはナトリウム塩として結晶化した。収量は14ｇ
であつた。さらに10ｇの粗生成物を第二の収量と
して得た。 19−エピ−ダイアネマイシンのナトリウム塩の
融点は193−205℃であつた。他の特性は次のとお
りであつた： UVλnax＝232nｍ、Ｅ１％ １cm＝157 αD＝＋11.0゜（ｃ＝１、メタノール） 元素分析値： C47H77O14Naとして 計算値：Ｃ、63.49 Ｈ、8.73 Ｏ、27.78 実測値：Ｃ、63.10 Ｈ、8.86 Ｏ、28.04 ナトリウム塩のクロロホルム溶液を酸水溶液
（PH４）で洗い次いでクロロホルムを蒸発するこ
とによつて遊離酸を形成した。この化合物を結晶
化に導くことは出来なかつたが、ガラス状物とし
て得た。 UVλnax＝232nｍ、Ｅ１％ １cm＝163 αD＝＋15.6゜（ｃ＝１、メタノール） C47H78O14として 計算値：Ｃ、65.10 Ｈ、9.06 Ｏ、25.84 実測値：Ｃ、64.45 Ｈ、8.94 Ｏ、26.61 赤外スペクトル（19−エピ−ダイアネマイシン
のナトリウム塩として）（KBr中）： 2931、2874、2787、2731、2701、2651、2515、
1716、1667、1566、1462、1406、1373、1333、
1326、1293、1271、1237、1191、1164、1117、
1098、1065、1003、984、946、912、897、868、
843、786、775、732、664、590cm-1 呈色反応 19−エピーダイアネマイシンにバニリン試薬
（75mlのエタノール中３ｇのバニリンおよび25ml
の85％リン酸）を噴霧したTLCプレートを80℃
に熱すると紫色のスポツトとして見える。 溶剤に対する溶解性 メタノール、メチル、イソブチルケトン、酢酸
エチル、アセトン、水、クロロホルムに可溶性；
およびヘプタンに不溶性。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス
（Streptomyces hygroscopicus）ATCC39205を
含有する培養物であつて、炭素、窒素及び無機物
質の同化し得る源を含有する水性栄養培地中で発
酵せしめると下記理化学的性質を有する抗生物質
19−エピ−ダイアネマイシンを回収し得る量で産
生し得る培養物。 元素分析値： C47H78O14として 計算値：Ｃ、65.10 Ｈ、9.06 Ｏ、25.84 実測値：Ｃ、64.45 Ｈ、8.94 Ｏ、26.61 分子量：866 融点（ナトリウム塩として）：193−205℃ 比旋光度： 〓Ｄ＝＋15.6゜（Ｃ＝１、メタノー
ル） 紫外線吸収スペクトル（最大吸収波長）： UVλmax＝232nｍ、Ｅ１％ １cm＝163 赤外線吸収スペクトル： （ナトリウム塩として）（KBr中）： 2931、2874、2787、2731、2701、2651、
2515、1716、1667、1566、1462、1406、1373、
1333、1326、1293、1271、1237、1191、1164、
1117、1098、1065、1003、984、946、912、
897、868、843、786、775、732、664、590cm-1 溶剤に対する溶解性： メタノール、メチルイソブチルケトン、酢酸
エチル、アセトン、水、クロロホルムに可溶
性；およびヘプタンに不溶性。 呈色反応： 19−エピ−ダイアネマイシンにバニリン試薬
（75mlのエタノール中３ｇのバニリンおよび25
mlの85％リン酸）を噴霧したTLCプレートを
80℃に熱すると紫色のスポツトとして見える。
また、プレートに、２，３，４−トリフエニル
−2H−テトラゾリウムクロリド−水和物を添
加しておいた寒天に黄色ブドウ球菌（S.
anrens）または枯草菌（B.subtilis）のいずれ
かを接種したものを積層し37℃で16時間インキ
ユベートして該抗生物質を可視化した（ピンク
色の背景に対して白色）。 酸性 性状：ガラス状。 ２ 凍結乾燥された形の特許請求の範囲第１項の
培養物。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US46646883A | 1983-02-15 | 1983-02-15 | |
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| JPS63152392A JPS63152392A (ja) | 1988-06-24 |
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59019820A Granted JPS59224691A (ja) | 1983-02-15 | 1984-02-06 | １９‐エピ‐ダイアネマイシン、その製法および組成物 |
| JP62163886A Granted JPS63152392A (ja) | 1983-02-15 | 1987-06-30 | １９−エピ−ダイアネマイシン産生培養物 |
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|---|---|---|---|
| JP59019820A Granted JPS59224691A (ja) | 1983-02-15 | 1984-02-06 | １９‐エピ‐ダイアネマイシン、その製法および組成物 |
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