JPH0191779A - ウイルス遺伝子導入により形質転換したヒト正常細胞を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子を製造する方法 - Google Patents
ウイルス遺伝子導入により形質転換したヒト正常細胞を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子を製造する方法Info
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- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産呈上立肌■分！
本発明は、ウィルス遺伝子導入により形質転換して得ら
れるヒト正常細胞を利用して組織プラスミノーゲン（ｔ
−プラスミノーゲン）活性化因子を製造する方法に関す
る。
れるヒト正常細胞を利用して組織プラスミノーゲン（ｔ
−プラスミノーゲン）活性化因子を製造する方法に関す
る。
且来伎歪
近年、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−プラスミ
ノーゲンアクチベーター）の血栓塞栓症に対する治療剤
としての有用性が注目されるようになり、ｔ−ブラスミ
ノーゲンアクチベーター（以下ｔ−ＰＡと称する）の生
産方法についても多（の提案がなされている。
ノーゲンアクチベーター）の血栓塞栓症に対する治療剤
としての有用性が注目されるようになり、ｔ−ブラスミ
ノーゲンアクチベーター（以下ｔ−ＰＡと称する）の生
産方法についても多（の提案がなされている。
従来、ｔ−ＰＡを生産する方法としてそれの生産能を有
する細胞を培地中で培養する方法が知られており、また
、ｔ−ＰＡの高生産能細胞として、がん化細胞並びに種
々の形質転換細胞（例えばＳＶ４０で形質転換したＷ１
３Ｂ並びにＷ Ｉ ２６）等が知られている。
する細胞を培地中で培養する方法が知られており、また
、ｔ−ＰＡの高生産能細胞として、がん化細胞並びに種
々の形質転換細胞（例えばＳＶ４０で形質転換したＷ１
３Ｂ並びにＷ Ｉ ２６）等が知られている。
一方、最近、ヒト胎児肺由来正常２倍体線維芽細胞（１
ＭＲ９０）を培養することにより新しいタイプのｔ−Ｐ
Ａを生産する方法（特開昭６１−２４６１３１号）が提
案されている。
ＭＲ９０）を培養することにより新しいタイプのｔ−Ｐ
Ａを生産する方法（特開昭６１−２４６１３１号）が提
案されている。
ところで、ヒト正常細胞は、元来、無限に増殖できるも
のでなく有限分裂回数（通常５０〜６０ＰＤＬ）を有し
ているものであるから、これらの細胞を培養してｔ−Ｐ
Ａを工業的に大量生産する場合大きな障害となる。した
がって、ヒト正常細胞を利用してｔ−ＰＡを生産する方
法の生産性を向上させるためには、上記分裂回数を著し
く多くするか、また更には実質上無限増殖能を付与した
細胞を調製し、該細胞を培養することが必要となる。
のでなく有限分裂回数（通常５０〜６０ＰＤＬ）を有し
ているものであるから、これらの細胞を培養してｔ−Ｐ
Ａを工業的に大量生産する場合大きな障害となる。した
がって、ヒト正常細胞を利用してｔ−ＰＡを生産する方
法の生産性を向上させるためには、上記分裂回数を著し
く多くするか、また更には実質上無限増殖能を付与した
細胞を調製し、該細胞を培養することが必要となる。
■が ° しようとする蕾
本発明は、畝上のようなヒト正常細胞を培養してｔ−Ｐ
Ａを生産する場合にみられる問題点に鑑みなされたもの
であって、ヒト正常細胞にウィルス遺伝子を導入するこ
とにより得られる形質転換細胞を培地中に培養すること
により、ｔ−ＰＡを効率よく大量生産し得る方法を提供
することを課題とする。
Ａを生産する場合にみられる問題点に鑑みなされたもの
であって、ヒト正常細胞にウィルス遺伝子を導入するこ
とにより得られる形質転換細胞を培地中に培養すること
により、ｔ−ＰＡを効率よく大量生産し得る方法を提供
することを課題とする。
以下本発明の詳細な説明する。
１皿色盪底
本発明の特徴は、ヒト正常細胞に、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝
子を含むベクターを導入することにより形質転換して得
られるｔ−ＰＡ生産能を有する形質転換細胞を培地中で
培養し、培養液からｔ−ＰＡを採取することにある。
子を含むベクターを導入することにより形質転換して得
られるｔ−ＰＡ生産能を有する形質転換細胞を培地中で
培養し、培養液からｔ−ＰＡを採取することにある。
を ゛ るための
本発明において利用するヒト正常細胞由来の形質転換細
胞は、次のようにして調製し得る。
胞は、次のようにして調製し得る。
形質転換細胞の調製：
ヒト正常細胞を形質転換するのに用いられるＳＶ４０Ｔ
抗原遺伝子を含むベクターｐＳＶ、ｎｅｏは、スタンフ
ォード大学のＰ、Ｂｅｒｇによって作成されたベクター
であって、それを図示すると添付図のとおりである。
抗原遺伝子を含むベクターｐＳＶ、ｎｅｏは、スタンフ
ォード大学のＰ、Ｂｅｒｇによって作成されたベクター
であって、それを図示すると添付図のとおりである。
このベクターの長さは９．１ｋｂであり、マーカーとし
てアンピシリン耐性遺伝子、アミノグリコシド系抗生物
質耐性遺伝子を有している。
てアンピシリン耐性遺伝子、アミノグリコシド系抗生物
質耐性遺伝子を有している。
また、このベクターに含まれているＳＶ４０Ｔ抗原遺伝
子は、ＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子であって、１ａｒ
ｇｅＴ抗原をコードする。ここでいう″１ａｒｇｅＴ抗
原”とは、胆癌ハムスターの血清と反応する腫瘍抗原と
して発見された大小２種の蛋白質のうち大きい方のもの
で分子量は約９４．０００のものを意味する。このｌａ
ｒｇｅＴ抗原は、発癌または細胞の形質転換に必須のも
のであって、ウィルスの増殖に関与している。また、１
ａｒｇｅＴ抗原は、多機能蛋白質であって、細胞ＤＮＡ
合成誘導、リポソーム遺伝子の発現、蛋白質合成開始因
子の修節、ＤＮＡとの結合、細胞性腫瘍抗原ｐ５３との
結合、ＡＴＰ分解酵素活性等の機能を有する。特に、形
質転換に関する機能としては、正常細胞を不死化する機
能と、不死化した細胞をがん化する機能があると考えら
れている。
子は、ＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子であって、１ａｒ
ｇｅＴ抗原をコードする。ここでいう″１ａｒｇｅＴ抗
原”とは、胆癌ハムスターの血清と反応する腫瘍抗原と
して発見された大小２種の蛋白質のうち大きい方のもの
で分子量は約９４．０００のものを意味する。このｌａ
ｒｇｅＴ抗原は、発癌または細胞の形質転換に必須のも
のであって、ウィルスの増殖に関与している。また、１
ａｒｇｅＴ抗原は、多機能蛋白質であって、細胞ＤＮＡ
合成誘導、リポソーム遺伝子の発現、蛋白質合成開始因
子の修節、ＤＮＡとの結合、細胞性腫瘍抗原ｐ５３との
結合、ＡＴＰ分解酵素活性等の機能を有する。特に、形
質転換に関する機能としては、正常細胞を不死化する機
能と、不死化した細胞をがん化する機能があると考えら
れている。
なお、１ａｒｇｅＴ抗原は、その大部分が核内に蓄積さ
れてｐ５３と結合してｐ５３を核内に蓄積することによ
って協同で形質転換に働くものと考えられている。
れてｐ５３と結合してｐ５３を核内に蓄積することによ
って協同で形質転換に働くものと考えられている。
ヒト正常細胞に上記ベクターｐＳＶ、ｎｅｏを導入して
形質転換を行うには、まず、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含
むベクターｐｓＶ１ｎｅｏを保有する大腸菌ＨＢ １０
１を常法に従って大量培養した後、精製してベクターＤ
ＮＡを得る。
形質転換を行うには、まず、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含
むベクターｐｓＶ１ｎｅｏを保有する大腸菌ＨＢ １０
１を常法に従って大量培養した後、精製してベクターＤ
ＮＡを得る。
次に、得られたベクターＤＮＡを制限酵素Ｅｃ。
Ｒ１により消化して、その環状形態のＤＮＡを線状形態
のＤＮＡとなし、ついで線状化したベクターＤＮＡをフ
ェノール、クロロホルム処理により除タンパクを行った
後、滅菌処理する。この滅菌処理は、上述のようにして
タンパクを除去した線状化ベクターＤＮＡを常法に従っ
てエタノールで沈澱させ、遠心分離により、上清を除去
して得られた沈澱物に７０％エタノールを加え、−夜装
置した後再び遠心分離して無菌的に上清を除去した後沈
澱物を乾燥させ、次いで滅菌した１ｍＭ）リス・１）ｃ
Ｉ（ｐＨ７，９） Ｏ，ｌｎＭ ＥＤＴＡの緩衝液に
溶解して行う。
のＤＮＡとなし、ついで線状化したベクターＤＮＡをフ
ェノール、クロロホルム処理により除タンパクを行った
後、滅菌処理する。この滅菌処理は、上述のようにして
タンパクを除去した線状化ベクターＤＮＡを常法に従っ
てエタノールで沈澱させ、遠心分離により、上清を除去
して得られた沈澱物に７０％エタノールを加え、−夜装
置した後再び遠心分離して無菌的に上清を除去した後沈
澱物を乾燥させ、次いで滅菌した１ｍＭ）リス・１）ｃ
Ｉ（ｐＨ７，９） Ｏ，ｌｎＭ ＥＤＴＡの緩衝液に
溶解して行う。
次に、上述のようにして調製して得られる、ｐｓＶ３ｎ
ｅｏを保有するベクターＤＮＡ （滅菌済）を前記のヒ
ト正常細胞に導入するために、該細胞の培養懸濁液を下
記により調製する。
ｅｏを保有するベクターＤＮＡ （滅菌済）を前記のヒ
ト正常細胞に導入するために、該細胞の培養懸濁液を下
記により調製する。
なお、本発明でいうヒト正常細胞は、主にヒト胎児肺正
常２倍体線維芽細胞であって、ＩＭＲ９０（Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ） 、Ｆｌｏｗ ２０００ （Ｐｌｏｗ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）等が例示し得るが、その他にもＭＲＣ
−５、ＭＲＣ−９Ｗ ｌ−２６、Ｗ ｌ−３８、ＨＥＬ
２９９、ＨＥＬＬ、Ｈｓ ７３８ Ｌｕ（以下ＡＴ Ｃ
Ｃ） 、０Ｍ１６０４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅｏｆ Ｈｅａｌｔｈ 、 Ｕ Ｓ Ａ）等のヒ
ト胎児肺正常２倍体線維芽細胞、更には肺に限らず皮膚
、脳、腎、扁桃腺、包皮、脳下垂体、甲状腺、小腸及び
肝等の正常２倍体線維芽細胞も本発明で用いることがで
きる。
常２倍体線維芽細胞であって、ＩＭＲ９０（Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ） 、Ｆｌｏｗ ２０００ （Ｐｌｏｗ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）等が例示し得るが、その他にもＭＲＣ
−５、ＭＲＣ−９Ｗ ｌ−２６、Ｗ ｌ−３８、ＨＥＬ
２９９、ＨＥＬＬ、Ｈｓ ７３８ Ｌｕ（以下ＡＴ Ｃ
Ｃ） 、０Ｍ１６０４（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅｏｆ Ｈｅａｌｔｈ 、 Ｕ Ｓ Ａ）等のヒ
ト胎児肺正常２倍体線維芽細胞、更には肺に限らず皮膚
、脳、腎、扁桃腺、包皮、脳下垂体、甲状腺、小腸及び
肝等の正常２倍体線維芽細胞も本発明で用いることがで
きる。
上掲したヒト正常細胞を、生育培地！ （ＤＭＥＭ、
１０％ＦＣ３−１００Ｕ／ｍＪｌペニシリンＧ、 １０
０１）ｇ／＋ｍｊ！ストレプトマイシン）中で５０〜７
０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（集密的）になるまで生育させ
たものの培地を除去してＰＢＳで２回洗浄した後、トリ
プシンを用いて細胞をはがし、これに上記生育培地■を
加えてピペッティングにより懸濁状態となして遠心分離
を行って上清を除く。
１０％ＦＣ３−１００Ｕ／ｍＪｌペニシリンＧ、 １０
０１）ｇ／＋ｍｊ！ストレプトマイシン）中で５０〜７
０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ（集密的）になるまで生育させ
たものの培地を除去してＰＢＳで２回洗浄した後、トリ
プシンを用いて細胞をはがし、これに上記生育培地■を
加えてピペッティングにより懸濁状態となして遠心分離
を行って上清を除く。
上記により沈澱した細胞を氷冷したダルベツコ（Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ）のＰＢＳで懸濁し、再び遠心分離を行って
上清を可及的に除去した後、沈澱した細胞を再び氷冷し
たＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐ Ｂ Ｓで懸濁して培養細
胞の懸濁液を得る。
ｂｅｃｃｏ）のＰＢＳで懸濁し、再び遠心分離を行って
上清を可及的に除去した後、沈澱した細胞を再び氷冷し
たＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐ Ｂ Ｓで懸濁して培養細
胞の懸濁液を得る。
このようにして調製した細胞懸濁液に、前記により調製
したベクターＤＮＡ溶液を加えて、ベクターＤＮＡの細
胞への導入を行う。
したベクターＤＮＡ溶液を加えて、ベクターＤＮＡの細
胞への導入を行う。
上記ベクターＤＮＡの細胞への導入は、エレクトロポレ
ーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を採用
して下記のような手順で行う。
ーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を採用
して下記のような手順で行う。
上記細胞懸濁液をＢ ｌｏ−ＲＡＤ社製のシーンパルサ
ー用キューペットに入れ、これにベクターＤＮＡ１液を
加え、２ＩＩ１）！用のピペットを軽くピペッティング
した後、水中で１０分程度静置し、ついで更に上記ピペ
ッティングを再度行う。
ー用キューペットに入れ、これにベクターＤＮＡ１液を
加え、２ＩＩ１）！用のピペットを軽くピペッティング
した後、水中で１０分程度静置し、ついで更に上記ピペ
ッティングを再度行う。
次に、このピペッティングを行った細胞懸濁液の一部（
１／９）を細胞生存率算定用のコントロールとして前記
生育培地■を収容しであるＴ７５フラスコ（７５ｃＪ）
に植え込み、残りの細胞懸濁液が入っている上記キュー
ペットをシーンパルサーのチャンバーに置き、パルスを
一回発生させた後、水中に戻し、更に１０分間静置する
。なお、このときのエレクトロポレーションの好適な設
定条件は、電場強度２５００ Ｖ ／ｃ醜キャパシター
２５μＦＤである。
１／９）を細胞生存率算定用のコントロールとして前記
生育培地■を収容しであるＴ７５フラスコ（７５ｃＪ）
に植え込み、残りの細胞懸濁液が入っている上記キュー
ペットをシーンパルサーのチャンバーに置き、パルスを
一回発生させた後、水中に戻し、更に１０分間静置する
。なお、このときのエレクトロポレーションの好適な設
定条件は、電場強度２５００ Ｖ ／ｃ醜キャパシター
２５μＦＤである。
ついでこの細胞懸濁液を生育培地■を収容しであるＴ１
７５フラスコ（１７５ｃｄ）に植え込む。
７５フラスコ（１７５ｃｄ）に植え込む。
ＤＮＡ導入による細胞の生存率の算定は、上記の植え込
みを用いて下記により行うことができる。
みを用いて下記により行うことができる。
上述のようにして植え込んだＴ７５フラスコとＴ１７５
フラスコを、２日後に常法に従ってトリプシンを用いて
分散させた細胞数を数え、下記式により細胞生存率を求
める。
フラスコを、２日後に常法に従ってトリプシンを用いて
分散させた細胞数を数え、下記式により細胞生存率を求
める。
上記細胞生存率を調べた後、エレクトロポレーションを
行った形質転換細胞を下記手順に従って選択する。
行った形質転換細胞を下記手順に従って選択する。
上記によりベクターＤＮＡを導入した細胞を生育培地■
を用いて一定濃度に希釈し、１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０
ｍｊづつ植え込み、１２〜１６時間後選択培地■（ＤＭ
ＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μ５ｅｔｓ Ｉ Ｇ４１８
）で全量交換し、４日後再び選択培地■で全量交換する
０次いで４〜５日おきに選択培地ＩＩ （ＤＭＥＭ、１
０％ＦＣ５，４００μｇｅｍ ｌ Ｇ４１８、５０％
（□ｙｌｄｉｔｉｏｎｅｄｗｅｄｌｕｍ （正常な細
胞を生育させて継代培養する直前の培養上清を意味し、
０．２２μ鋼のフィルターを通して細胞の破片等を除い
たもの）〕で全量交換する。
を用いて一定濃度に希釈し、１０ｃｍ ｄｉｓｈに１０
ｍｊづつ植え込み、１２〜１６時間後選択培地■（ＤＭ
ＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μ５ｅｔｓ Ｉ Ｇ４１８
）で全量交換し、４日後再び選択培地■で全量交換する
０次いで４〜５日おきに選択培地ＩＩ （ＤＭＥＭ、１
０％ＦＣ５，４００μｇｅｍ ｌ Ｇ４１８、５０％
（□ｙｌｄｉｔｉｏｎｅｄｗｅｄｌｕｍ （正常な細
胞を生育させて継代培養する直前の培養上清を意味し、
０．２２μ鋼のフィルターを通して細胞の破片等を除い
たもの）〕で全量交換する。
次に、上述のようにして選択を開始してから約１０日で
形質転換細胞のコロニーが出現し、２ａ間を経過した頃
には肉眼で確認できるようになるので、この段階以後に
上記細胞のクローニングを行う、クローニングを行うに
は、その２〜５日前に前記生育培地Ｉまたは生育培地Ｉ
Ｉ （ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，１００Ｕ／ｍＪｔペニ
シリンＧ、１００μｇｅｍ ｌストレプトマイシン、５
０％ｃｏｎｄｉ ｔｉｏｎｅｄｌＩｍｅｄｉｕ＋ｓ）で
全量交換しておき、クローニングに際しては上記培地を
除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプトシンをし
み込ませた濾紙を細胞のコロニーの上に注意深くして載
せ、数分後に、生育培地■（ＤＭＥＭ、２０％Ｆ ＣＳ
、 ｌ０ＱＵ／鵠ｌペニシリンＧ１）００１） ｇ／
ｌａ ｊストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）をＩＩＩＩｌづつ入れた２４ｗｅ
ｌ １プレートに移す。
形質転換細胞のコロニーが出現し、２ａ間を経過した頃
には肉眼で確認できるようになるので、この段階以後に
上記細胞のクローニングを行う、クローニングを行うに
は、その２〜５日前に前記生育培地Ｉまたは生育培地Ｉ
Ｉ （ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，１００Ｕ／ｍＪｔペニ
シリンＧ、１００μｇｅｍ ｌストレプトマイシン、５
０％ｃｏｎｄｉ ｔｉｏｎｅｄｌＩｍｅｄｉｕ＋ｓ）で
全量交換しておき、クローニングに際しては上記培地を
除去した後、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプトシンをし
み込ませた濾紙を細胞のコロニーの上に注意深くして載
せ、数分後に、生育培地■（ＤＭＥＭ、２０％Ｆ ＣＳ
、 ｌ０ＱＵ／鵠ｌペニシリンＧ１）００１） ｇ／
ｌａ ｊストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄｉｔｉｏ
ｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）をＩＩＩＩｌづつ入れた２４ｗｅ
ｌ １プレートに移す。
このプレートを軽（たたいて細胞を濾紙から離れるよう
にし、濾紙はそのまま−ｅｌｌ中に沈めておく。
にし、濾紙はそのまま−ｅｌｌ中に沈めておく。
上述のようにしてクローニングを行った後、−週間で細
胞はほぼｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するので常法に従って
トリプトシンを用いて１２ｗａｌｌプレートに継代培養
を行う、なお、この際、前記生育培地■を用いて細胞を
植え込み、翌日、前記選択培地■で全量交換して培養を
続ける。この培養により形態的に形質転換していること
が確認できた段階で以後生育培地■を用いて継代培養を
行い得る。
胞はほぼｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するので常法に従って
トリプトシンを用いて１２ｗａｌｌプレートに継代培養
を行う、なお、この際、前記生育培地■を用いて細胞を
植え込み、翌日、前記選択培地■で全量交換して培養を
続ける。この培養により形態的に形質転換していること
が確認できた段階で以後生育培地■を用いて継代培養を
行い得る。
次に、上述のようにして形質転換した細胞のｔ−ＰＡ生
産能は、形質転換株を生育培地■で培養した後、培地を
除いた細胞株をＰＢＳで洗浄し、ついで生産培地を用い
て培養して培地中のｔ−ＰＡ活性を調べ得るので、その
生産能の高いグループを選択してｔ−ＰＡの大量生産に
利用することができる。
産能は、形質転換株を生育培地■で培養した後、培地を
除いた細胞株をＰＢＳで洗浄し、ついで生産培地を用い
て培養して培地中のｔ−ＰＡ活性を調べ得るので、その
生産能の高いグループを選択してｔ−ＰＡの大量生産に
利用することができる。
因に、形質転換株をＴフラスコ２５又はＴ７５に植え込
み、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するまで生育培地Ｉで培養
した後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した転換株を生産
培地（ＤＭＥＭ、１％ペプトン、ＩＯＵ／ｗｊペニシリ
ンＧ、１０Ｍｇ／ｓ ｌストレプトマイシン）を用いて
ｔ−ＰＡの生産を行い、生産開始後４日目の培地中のｔ
−ＰＡ活性を調べた結果、形質転換株のｔ−ＰＡ活性は
、正常細胞に比べて４０倍以上に達するものから、活性
がほとんど認められないものまであったが、全般的には
、形質転換株のｔ−ＰＡ生産性は正常細胞に比べて高く
なることが認められた。
み、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するまで生育培地Ｉで培養
した後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した転換株を生産
培地（ＤＭＥＭ、１％ペプトン、ＩＯＵ／ｗｊペニシリ
ンＧ、１０Ｍｇ／ｓ ｌストレプトマイシン）を用いて
ｔ−ＰＡの生産を行い、生産開始後４日目の培地中のｔ
−ＰＡ活性を調べた結果、形質転換株のｔ−ＰＡ活性は
、正常細胞に比べて４０倍以上に達するものから、活性
がほとんど認められないものまであったが、全般的には
、形質転換株のｔ−ＰＡ生産性は正常細胞に比べて高く
なることが認められた。
次に、上述のようにして調製したヒト正常細胞の形質転
換細胞を利用してｔ−ＰＡを製造するには、常法に悌っ
て該細胞をＴフラスコの開放状態で３７℃の温度に、５
％ＣＯｔのインキュベーターで培養を行う。
換細胞を利用してｔ−ＰＡを製造するには、常法に悌っ
て該細胞をＴフラスコの開放状態で３７℃の温度に、５
％ＣＯｔのインキュベーターで培養を行う。
次いで、得られた無血清培養液をＵＦ膜（肚−１０，０
００）を用いて濃縮したのち、抗ｔ−ＰＡモノクローナ
ル抗体アフィニティークロマトグラフィーにかけ、溶出
緩衝液（０，１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｈａ（ＩＨ，ｐＨ
９，５，３Ｍ Ｎａ５ＣＮ、 ０．０２％Ｔｗｅｅｎ
８０）を用いて溶出する。
００）を用いて濃縮したのち、抗ｔ−ＰＡモノクローナ
ル抗体アフィニティークロマトグラフィーにかけ、溶出
緩衝液（０，１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｈａ（ＩＨ，ｐＨ
９，５，３Ｍ Ｎａ５ＣＮ、 ０．０２％Ｔｗｅｅｎ
８０）を用いて溶出する。
次に、エタノールを終濃度が７５％になるように加え、
−２０℃で２４〜７２時間放置し、ｔ−ＰＡの沈澱を形
成させる。この沈澱を遠心分離後、最小容量０．０２Ｍ
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，ｐＨ７，４，３Ｍ Ｎａ
５ＣＮに溶解しＨＰＬＣを用いてゲル濾過を行う、溶出
液は０．１ＭＧｌｙｃｌｎｅ−ＮａＯＨＳｐＨ７，４，
３Ｍ Ｎａ５ＣＮを用いる。更に、再度エタノールを用
いてｔ−ＰＡを沈澱させ、遠心分離をする。・このエタ
ノール沈澱の操作を少くとも３回くり返して完全に脱塩
する。
−２０℃で２４〜７２時間放置し、ｔ−ＰＡの沈澱を形
成させる。この沈澱を遠心分離後、最小容量０．０２Ｍ
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，ｐＨ７，４，３Ｍ Ｎａ
５ＣＮに溶解しＨＰＬＣを用いてゲル濾過を行う、溶出
液は０．１ＭＧｌｙｃｌｎｅ−ＮａＯＨＳｐＨ７，４，
３Ｍ Ｎａ５ＣＮを用いる。更に、再度エタノールを用
いてｔ−ＰＡを沈澱させ、遠心分離をする。・このエタ
ノール沈澱の操作を少くとも３回くり返して完全に脱塩
する。
以下実施例を示して本発明とその効果を具体的に説明す
る。
る。
実施例１
本例では、ヒト正常細胞としてヒト正常２倍体線維芽細
胞ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１８８）を用いた。
胞ＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ−１８８）を用いた。
ヒト 、２ 線 細胞ＩＭＲ９０の・ 五換：１）
ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含むベクターＤＮＡＳＶ４０Ｔ
抗原遺伝子を含むベクターＰ Ｓ Ｖ ｓｎｅ。
ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含むベクターＤＮＡＳＶ４０Ｔ
抗原遺伝子を含むベクターＰ Ｓ Ｖ ｓｎｅ。
を保有する大腸菌ＨＢＩＯＩを常法に従って大量培養し
、得られた培養菌体を精製して約６６０μｇのベクター
ＤＮＡを得た。
、得られた培養菌体を精製して約６６０μｇのベクター
ＤＮＡを得た。
コノヘクターＤＮＡ（ベクターｐ Ｓ Ｖ ｚｎｅｏ）
３００ ｕ ｇを制限酵素ＥｃｏＲＴを用いて消化し
てその環状ＤＮＡを線状ＤＮＡに形成した。
３００ ｕ ｇを制限酵素ＥｃｏＲＴを用いて消化し
てその環状ＤＮＡを線状ＤＮＡに形成した。
ついで得られた線状化ベクターＤＮＡをフェノール、ク
ロロホルムで処理してタンパク質を除去した後、エタノ
ールで沈澱させ、遠心分離により上清を除去した。得ら
れた沈澱物に７０％エタノールを加えて一夜−２０℃に
放置した後、再び遠心分離を行い、クリーンベンチ内で
無菌的に上滑を除去し、放置して沈澱物を乾燥させた。
ロロホルムで処理してタンパク質を除去した後、エタノ
ールで沈澱させ、遠心分離により上清を除去した。得ら
れた沈澱物に７０％エタノールを加えて一夜−２０℃に
放置した後、再び遠心分離を行い、クリーンベンチ内で
無菌的に上滑を除去し、放置して沈澱物を乾燥させた。
得られた乾燥ＤＮＡをオートクレーブで滅菌したＩＴＩ
Ｍ ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）−０，１蒙ＥＤＴＡ
から成る緩衝液に溶解し、ｌａｇ／ｍ ｊ！の溶液にな
るように調整した。
Ｍ ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，９）−０，１蒙ＥＤＴＡ
から成る緩衝液に溶解し、ｌａｇ／ｍ ｊ！の溶液にな
るように調整した。
ｉｉ）ヒト正 ２ １胞ＩＭＲ９０（７）
胞懸ヒト正常２倍体線維芽細胞ＩＭＲ９０を生育培地１
（ＤＭＥＭ、１０％Ｆ ＣＳ、 １０００／＋ｗｌペニ
シリンＧ及び１００μｇ／■ｌストレプトマイシンを含
む）中で５０〜７０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するまで
生育させた。
胞懸ヒト正常２倍体線維芽細胞ＩＭＲ９０を生育培地１
（ＤＭＥＭ、１０％Ｆ ＣＳ、 １０００／＋ｗｌペニ
シリンＧ及び１００μｇ／■ｌストレプトマイシンを含
む）中で５０〜７０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するまで
生育させた。
次いで、培地を除去して得られた生育細胞をＰＢ Ｓ
（１／１００ Ｍリン酸塩緩衝液−０，１５Ｍ ＮａＣ
１、ｐＨ７，４）で２回洗浄した後、トリプシンを用い
て細胞をはがし、生育培地Ｉを加えて懸濁し、遠心分離
を行って、上清を除去した。得られた沈澱細胞を、水冷
したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰ Ｂ Ｓに懸濁し、１．Ｏ
Ｘ ｌｏ’ｃｅｌｌｓ／ｍ １になるように調整して細
胞懸濁液を得た。
（１／１００ Ｍリン酸塩緩衝液−０，１５Ｍ ＮａＣ
１、ｐＨ７，４）で２回洗浄した後、トリプシンを用い
て細胞をはがし、生育培地Ｉを加えて懸濁し、遠心分離
を行って、上清を除去した。得られた沈澱細胞を、水冷
したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰ Ｂ Ｓに懸濁し、１．Ｏ
Ｘ ｌｏ’ｃｅｌｌｓ／ｍ １になるように調整して細
胞懸濁液を得た。
ｉｉｉ ）ベクターＤＮＡの細胞への
上記導入は、従来から用いられているリン酸カルシウム
法に代えてエレクトロポレーション法を採用して行った
。
法に代えてエレクトロポレーション法を採用して行った
。
上記ｉｉ）で得た細胞懸濁液０．９＋ｗＪをＢＩＯ−Ｒ
ＡＤ社製のシーンパルサー用キュベツトに入れ、これに
上記ｉ）により調製したベクターＤＮＡ溶液を加えて２
０Ｍｇ／ｍ １になるように調整し、ついで２ａ＋１用
のピペットで軽くピペッティングした後、水中で１０分
間静置した。その後、再度軽くピペッティングして、細
胞懸濁液のうち１００μｌを細胞生存率算定用のコント
ロールとして、１５−１の生育培地の入ったＴ７５フラ
スコ（７５ｃｄ）に植え込み、残りの０．８ｍ １２の
細胞懸濁液の入ったキュベツトをシーンパルサーのチャ
ンバーに置き、パルスを一回発生させた後水中に戻し、
更に１０分間静置した。
ＡＤ社製のシーンパルサー用キュベツトに入れ、これに
上記ｉ）により調製したベクターＤＮＡ溶液を加えて２
０Ｍｇ／ｍ １になるように調整し、ついで２ａ＋１用
のピペットで軽くピペッティングした後、水中で１０分
間静置した。その後、再度軽くピペッティングして、細
胞懸濁液のうち１００μｌを細胞生存率算定用のコント
ロールとして、１５−１の生育培地の入ったＴ７５フラ
スコ（７５ｃｄ）に植え込み、残りの０．８ｍ １２の
細胞懸濁液の入ったキュベツトをシーンパルサーのチャ
ンバーに置き、パルスを一回発生させた後水中に戻し、
更に１０分間静置した。
この際のエレクトロポレーションの設定条件は、電場強
度２５００ Ｖ ／ｃｍ 、キャパシター２５μＦＤで
行い、その測定値は２５２ＳＶ／ｃｍ 、時定数０．５
ｍ５ｅｃであった。
度２５００ Ｖ ／ｃｍ 、キャパシター２５μＦＤで
行い、その測定値は２５２ＳＶ／ｃｍ 、時定数０．５
ｍ５ｅｃであった。
次いで、上記静置後、細胞懸濁液を５０＋＋＋ １の生
育培地Ｉの入ったＴ１７５フラスコ（１７５ｃｄ）に植
え込んだ。
育培地Ｉの入ったＴ１７５フラスコ（１７５ｃｄ）に植
え込んだ。
ｉｖ）ベクターＤＮＡ による 胞の生 ・の定
上記により植え込んだＴ７５フラスコと７１７５フラス
コについて、植え込みの２日後に常法に従ってトリプシ
ンを用いて細胞を分散させてそれらの細胞数を数え、下
記式により細胞生存率を求めた。
コについて、植え込みの２日後に常法に従ってトリプシ
ンを用いて細胞を分散させてそれらの細胞数を数え、下
記式により細胞生存率を求めた。
その結果、細胞生存率は約３０〜４０％であった。
■）星１に艮槻ｌ見選択
上記により細胞生存率を調べた後、エレクトロポレーシ
ョンを行った細胞を、生育培地Ｉを用いて２〜３ Ｘ
１０’ｃｅｌｌｓ／Ｉ１）に希釈し、１０ｃｎ＋ ｄｉ
ｓｈに１０ｍ ｌづつ植え込み、１２〜１６時間後に選
択培地■（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μｇｅｍ
ｌ Ｇ４１８）で全量交換を行った。４日後、再び選択
培地Ｉで全量交換を行い、以後４〜５日おきに、選択培
地ｎ（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μｇ／ｓｌ
Ｇ４１８ 、５０％ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄ
ｉｕｍ）で全量交換を行った。
ョンを行った細胞を、生育培地Ｉを用いて２〜３ Ｘ
１０’ｃｅｌｌｓ／Ｉ１）に希釈し、１０ｃｎ＋ ｄｉ
ｓｈに１０ｍ ｌづつ植え込み、１２〜１６時間後に選
択培地■（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μｇｅｍ
ｌ Ｇ４１８）で全量交換を行った。４日後、再び選択
培地Ｉで全量交換を行い、以後４〜５日おきに、選択培
地ｎ（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣ３，４００μｇ／ｓｌ
Ｇ４１８ 、５０％ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄ
ｉｕｍ）で全量交換を行った。
ｖｉ） −胞のクローニング
上記による選択を開始してから約１０日で形質転換細胞
のコロニーが出現し、２週間を過ぎた時点では肉眼で確
認できるようになり、３週間でクローニングするのに十
分の大きさになった。
のコロニーが出現し、２週間を過ぎた時点では肉眼で確
認できるようになり、３週間でクローニングするのに十
分の大きさになった。
したがって、この時点で、クローニングする２〜５日前
に、生産培地■または生育培地ＩＩ（ＤＭＥＭ、１０％
ＦＣ３，１００Ｕ／ｍＪペニシリンＧ１）００ ｐ １
７ｍ １）ストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄｉｔｉ
ｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）で全量交換を行っておく、クロ
ーニングを行うに際しては、滅菌濾紙（５×５〜１０
Ｘ １０ｏ＋ｍ）と滅菌ビンセットを用意しておき、ま
ず、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した上記形質転換
細胞を上記ビンセットを用いて濾紙にトリプシンをしみ
込ませたものをコロニーの上に注意深くのせた。
に、生産培地■または生育培地ＩＩ（ＤＭＥＭ、１０％
ＦＣ３，１００Ｕ／ｍＪペニシリンＧ１）００ ｐ １
７ｍ １）ストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄｉｔｉ
ｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ）で全量交換を行っておく、クロ
ーニングを行うに際しては、滅菌濾紙（５×５〜１０
Ｘ １０ｏ＋ｍ）と滅菌ビンセットを用意しておき、ま
ず、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した上記形質転換
細胞を上記ビンセットを用いて濾紙にトリプシンをしみ
込ませたものをコロニーの上に注意深くのせた。
この場合、コロニーを取扱う毎にビンセットをガスバー
ナーでよく焼いて汚染を避けた。上記濾紙をコロニーの
上にのせてから数分後に、それを、生育培地ＩＩＩ（Ｄ
ＭＥＭ、２０％ＦＣ５，１００Ｕ／ｍｊペニシリンＧ、
１００μｇ／■ｌストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を１ｍｊづつ入れであ
る２４ｗａｌｌプレートに移し、プレートを軽くたたい
て細胞を濾紙から離れるようにし、濾紙はそのまま−ａ
ｌｌの中に沈めておいた。
ナーでよく焼いて汚染を避けた。上記濾紙をコロニーの
上にのせてから数分後に、それを、生育培地ＩＩＩ（Ｄ
ＭＥＭ、２０％ＦＣ５，１００Ｕ／ｍｊペニシリンＧ、
１００μｇ／■ｌストレプトマイシン、５０％ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を１ｍｊづつ入れであ
る２４ｗａｌｌプレートに移し、プレートを軽くたたい
て細胞を濾紙から離れるようにし、濾紙はそのまま−ａ
ｌｌの中に沈めておいた。
ｖｉ） −の １立。
上記によるクローニングを行った後−週間で細胞はほぼ
ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するので常法に従って、トリプ
シンを用いて１２ｓｅｅｌｌプレートに継代培養を行っ
た。この際には生育培地■を用いて細胞を植え込み、翌
日選択培地■で全量交換を行って培養を続けた＠ １２
ｗｅｌｌプレートがｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で
細胞集団倍加数（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａＨｏｎ ｄｏ
ｕｂｌｉｎｇｌｅｖｅｌＳＰ Ｄ Ｌ ）を１とした。
ｃｏｎｆｌｕｅｎｔに達するので常法に従って、トリプ
シンを用いて１２ｓｅｅｌｌプレートに継代培養を行っ
た。この際には生育培地■を用いて細胞を植え込み、翌
日選択培地■で全量交換を行って培養を続けた＠ １２
ｗｅｌｌプレートがｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった時点で
細胞集団倍加数（ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａＨｏｎ ｄｏ
ｕｂｌｉｎｇｌｅｖｅｌＳＰ Ｄ Ｌ ）を１とした。
因に、エレクトロボレーシコンを行った際、ヒト正常細
胞のＰＤＬは２９であったので、計算によりヒト正常細
胞のＰＤＬでは４８に当る。培養の２〜３日後にはｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｔになるので、常法とおりトリプシンを用
いてＴ２５フラスコ（２５ｃｄ）に継代培養を行い、１
２ｗｅｌｌの場合と同様に生育培地■を用いて植え込み
、翌日選択培地■で全量交換を行った。
胞のＰＤＬは２９であったので、計算によりヒト正常細
胞のＰＤＬでは４８に当る。培養の２〜３日後にはｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｔになるので、常法とおりトリプシンを用
いてＴ２５フラスコ（２５ｃｄ）に継代培養を行い、１
２ｗｅｌｌの場合と同様に生育培地■を用いて植え込み
、翌日選択培地■で全量交換を行った。
この場合７２５フラスコがｃｏｎｆｌｕｅｎｔになった
時点でＰＤＬは３となる。なお、生育培地■を用いずに
、直接選択培地■を用いて継代培養を行っても培養を効
果的にできるので、ＰＤＬ−３からＰＤＬ−５は、選択
培地■のみを用いて継代培養を行った。
時点でＰＤＬは３となる。なお、生育培地■を用いずに
、直接選択培地■を用いて継代培養を行っても培養を効
果的にできるので、ＰＤＬ−３からＰＤＬ−５は、選択
培地■のみを用いて継代培養を行った。
この継代培養により形態的に形質転換していることがｆ
ｉ！！できたので、以後は生育培地■を用いて継代培養
を行った。
ｉ！！できたので、以後は生育培地■を用いて継代培養
を行った。
暢）星ｉ転盪四！
次に、エレクトロポレーションの設定条件が形質転換効
率に与える影響を調べた結果を示すと表１のとおりであ
る。
率に与える影響を調べた結果を示すと表１のとおりであ
る。
表１
表１にみられるとおり、患１の条件の場合に形質転換効
率が良好であることがわかる。
率が良好であることがわかる。
ヒト正 １ＭＲ９０の 転 を１用したｔ−且
人辺生皮 上述のようにして調製して得られた形質転換細胞のうち
、ｔ−“ＰＡ生産能の特に高い株を選択し、該株を下記
ｍｍの培地中で培養を行った。
人辺生皮 上述のようにして調製して得られた形質転換細胞のうち
、ｔ−“ＰＡ生産能の特に高い株を選択し、該株を下記
ｍｍの培地中で培養を行った。
Ｉ）培地組成
生産培地：
ＤＭＥＭ、、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ。
１％プロテオースペプトン、
１０Ｕ／１）１ペニシリンＧ１
１０Ｍｇ／ｍ ｌストレプトマイシン。
ｉｉ ）培養条件
培養は、３７℃、５％ＣＯｔの条件でＴフラスコを用い
、上記培地中で行った。なお、Ｔ２５フラスコには７Ｉ
Ｉ１）、Ｔ７５フラスコ２０ｍｊ！５Ｔ１７５フラスコ
には５０ｔｓ １をそれぞれ用いた。因に、大量培養を
行う際には、セラミックベツドリアクターもしくはマイ
クロキャリアーを用いる。
、上記培地中で行った。なお、Ｔ２５フラスコには７Ｉ
Ｉ１）、Ｔ７５フラスコ２０ｍｊ！５Ｔ１７５フラスコ
には５０ｔｓ １をそれぞれ用いた。因に、大量培養を
行う際には、セラミックベツドリアクターもしくはマイ
クロキャリアーを用いる。
ｉｉｉ ）培養液からのｔ−ＰＡの分離、精製得られた
無血清培養液をＵＦ膜（ａｎ−１０，０００）を用いて
濃縮した後、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体アフイニテ
イクロマトグラフイーにかけ、溶出緩衝液（０，ＩＭ
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨＳｐＨ９，５，３１’ｌ Ｎ
ａ５ＣＮ。
無血清培養液をＵＦ膜（ａｎ−１０，０００）を用いて
濃縮した後、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体アフイニテ
イクロマトグラフイーにかけ、溶出緩衝液（０，ＩＭ
Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨＳｐＨ９，５，３１’ｌ Ｎ
ａ５ＣＮ。
０．０２％Ｔｗｅｅｎ ８０）を用いて溶出した０次に
エタノールを終濃度が７５％になるように加え、−２０
℃で２４〜７２時間放置し、ｔ−ＰＡの沈澱を形成させ
た。
エタノールを終濃度が７５％になるように加え、−２０
℃で２４〜７２時間放置し、ｔ−ＰＡの沈澱を形成させ
た。
この沈澱を遠心分離後、最小容量の０．０２Ｍ Ｇｌｙ
ｃｉｎｅ−Ｎａｉｌ 、ｐＨ７，４，３Ｍ Ｎａ５ＣＮ
に溶解し、ＨＰＬＣを用いてゲル濾過を行った。溶出液
は０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ｐＨ７，４，
３Ｍ Ｎａ５ＣＮを用いた。さらに、再度エタノールを
用いてｔ−ＰＡを沈澱させ、遠心分離を行った。このエ
タノール沈澱の操作を少くとも３回くり返して完全に脱
塩した。
ｃｉｎｅ−Ｎａｉｌ 、ｐＨ７，４，３Ｍ Ｎａ５ＣＮ
に溶解し、ＨＰＬＣを用いてゲル濾過を行った。溶出液
は０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ、ｐＨ７，４，
３Ｍ Ｎａ５ＣＮを用いた。さらに、再度エタノールを
用いてｔ−ＰＡを沈澱させ、遠心分離を行った。このエ
タノール沈澱の操作を少くとも３回くり返して完全に脱
塩した。
実施例２
本例は、ＩＭＲ９０以外のヒト正常２倍体線維芽細胞と
してＰＩＯＮ ２０００ （Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓより入手）を用いた。
してＰＩＯＮ ２０００ （Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓより入手）を用いた。
実施例１に記載したと全く同様の操作により、ヒト正常
細胞Ｆｌｏｗ ２０００の形質転換を行った。
細胞Ｆｌｏｗ ２０００の形質転換を行った。
なお、その際のエレクトロポレーションの設定条件及び
形質転換効率は表２に示すとおりである。
形質転換効率は表２に示すとおりである。
表２
次に、形質転換して得られた細胞を実施例１に記載した
と同様の手順で生産培地中で培養を行って、ｔ−ＰＡの
産生を確認した。
と同様の手順で生産培地中で培養を行って、ｔ−ＰＡの
産生を確認した。
添付図は、本発明で利用する形質転換細胞を調製するの
に用いるベクターＰＳＶｓｎｅｏを図示したものである
。
に用いるベクターＰＳＶｓｎｅｏを図示したものである
。
Claims (3)
- （１）ヒト正常細胞に、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含むベ
クターを導入することにより形質転換して得られる組織
プラスミノーゲン活性化因子産生能を有する形質転換細
胞を培地中で培養し、培養液から組織プラスミノーゲン
活性化因子を採取することを特徴とする組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の製造方法。 - （２）上記形質転換細胞は、ＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を含
むベクターｐＳＶ＿３ｎｅｏを保有する大腸菌ＨＢ１０
１を培養して得られるベクターＤＮＡを制限酵素により
線状化し、ついで得られた線状化ベクターＤＮＡの溶液
を、ヒト正常細胞の培養懸濁液に加え、エレクトロポレ
ーシヨン法に従つて上記ベクターＤＮＡを上記細胞に導
入して形質転換したものである特許請求の範囲第（１）
項記載の製造方法。 - （３）ヒト正常細胞は、ヒト正常２倍体線維芽細胞ＩＭ
Ｒ９０である特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項
記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62249713A JPH0191779A (ja) | 1987-10-05 | 1987-10-05 | ウイルス遺伝子導入により形質転換したヒト正常細胞を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子を製造する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62249713A JPH0191779A (ja) | 1987-10-05 | 1987-10-05 | ウイルス遺伝子導入により形質転換したヒト正常細胞を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子を製造する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0191779A true JPH0191779A (ja) | 1989-04-11 |
Family
ID=17197092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62249713A Pending JPH0191779A (ja) | 1987-10-05 | 1987-10-05 | ウイルス遺伝子導入により形質転換したヒト正常細胞を用いて組織プラスミノーゲン活性化因子を製造する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0191779A (ja) |
-
1987
- 1987-10-05 JP JP62249713A patent/JPH0191779A/ja active Pending
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