JPH0191783A - 微生物または細胞を固定するためのアミン含有表面層を有する無機担体、それらの製造方法およびそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物あるいはヒト、動物または植物の細胞
を固定するための、塩基性のアミン含有表面層を有する
、特にガラスまたはセラミックよりなる無機担体ならび
にそれらの製造方法および用途に関する。

微生物の固定は、ずっと以前から生物工学的方法の実施
に際して重要な役割を演じてきた。何故ならば、この方
法によって、そこから一般に液状の反応混合物が比較的
容易に分離されうる、局部的に限定された著しく濃度の
高い生物学的に有効なマスが利用されうるからである。

すなわち、ブナのおがくず、麦藁、鋸屑、アルファルフ
ァ−切り藁その他のような有機の担体物質が、ずっと以
前からガラス玉、石屑、石器、軽石、溶岩、砂および類
似物の形の無機物質と同様にずっと以前から知られてい
た。カルボキシメチルセルロース、ポリウレタンフォー
ム、エチレンマレイン酸無水物−共重合体、三酢酸セル
ロースおよび類似物のような、比較的大きな表面を有す
る合成担体物質もまた既に知られている。

ガラス表面（特に多孔性膜の）を重合体フィルムにより
、またはシラノール基を多官能性基を有する有機の分子
と反応させることにより、変化させることもかなり以前
から知られている（ドイツ特許第２．４５４．１１１号
参照）。

クロマトグラフィーの目的では、グラフトされた分子ま
たはアミノ基を有する巨大分子により変性された、場合
によっては架橋された多糖で被覆されたガラス担体が知
られており（フランス特許出願公開第２．４２２，６９
９号参照：特定の例として、ここではグラフトされた生
物特定的化合物（ｂｉｏ−ｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅ　Ｖ
ｅｒｂｉｎｄｕｎｇｅｎ）によって変性されたセルロー
スまたは架橋されたＤＩ！ＡＨ−デキストランよりなる
層を有するミクロ細孔性のガラスが挙げられている）あ
るいは化学的に結合されたポリエチレンイミンを有する
ガラス担体もまた知られている（ジャーナル・オプ・ク
ロマトグラフィー、第１２０巻（１９７６年）第３２１
−３３３頁（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔ。

皿（１９７６）　３２１−３３３）参照）。

多孔性のガラス表面を変化させるそのような技術は、ま
た微生物のための担体にもすでに施されている。すなわ
ち、ＰＣＴ−出願−０８７１０２７０３にはアミノ基ま
たはヒドロキシル基を有する重合体で被覆された、多孔
性のガラスよりなるいわゆるマイクロキャリヤーが記載
されている。その際、多数の可能性の中からキトサン、
セルロース、アルギン酸および後刻架橋された寒天、ゼ
ラチンまたはに一カラゲーナンが特記される。

米国特許第４．１５３．５１０号によれば、細胞および
微生物の固定化のためには、細胞自体の化学的結合もま
た考慮された。

更に、米国特許第４．１８９，５３４号から架橋ＤＥＡ
Ｅ−デキストランよりなる細胞培養のためのマイクロキ
ャリヤーが知られている。ＤＥＡＨ−セファデックスへ
の細胞の付加についてもまたネイチュアー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）誌第２１６巻（１９６７年）第６４−６５頁にヴア
ン・ヴエルゼル（ｖａｎ　Ｗｅｌｚｅｌ）によって報告
されている。

シー・デー・バック（Ｃ，Ｄ、　Ｂｕｃｋ）らの雑文（
Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０　（１９８５）、
　１７１−１８４参照）にはもちろんポリアクリルアミ
ド、ポリスチレンおよび架橋ＥＤＡＥ−デキストランよ
りなるマイクロキャリヤーの比較が報告され、その場合
、架橋ＤＥＡＦ、−デキストランよりなるマイクロキャ
リヤーの不十分な性状が見出されたことが報告されてい
る。

驚くべきことには、本発明者らは、この度、未架橋のジ
アルキルアミノアルキル−デキストラン、特にＤＥＡＩ
Ｅ−デキストランでガラスを被覆することにより、無機
担体、特にガラス上への微生物の特に良好な固定化が達
成され得ることを立証した。

冒頭に述べた型の本発明による担体は、表面層がジアル
キルアミノアルキル−デキストラン、特にＤＥＡＥ−デ
キストランにより形成され、そして無機担体に吸着的に
または特に共有結合的に結合されていることによって特
徴づけられる。

そのような、未架橋のジアルキルアミノアルキル−デキ
ストランよりなる吸着的または特に共有結合的に結合さ
れた表面層を施された担体は、微生物および細胞のため
の明らかに改善された付加能力を示し、そして従って生
物工学的方法の領域において特に有利に使用されうる。

被覆されるべき担体は、特に酸化物系またはケイ酸塩系
の物体、例えばガラス、石英、酸化アルミニウム、酸化
ジルコニウムその他よりなり、その際、ガラスが比較的
容易に入手し得るゆえに好ましい。

被覆されるべき担体は、膜、繊維ないし糸、管、毛細管
、マイクロキャリヤーまたは特に、任意の形状の多孔性
の担体として存在しうる。

特に好ましいものは、ドイツ特許出願公開第３．４１０
．６５０号公報に記載された特定の多孔性構造、すなわ
ち、担体内部から周囲への液体およびガスの交換を妨げ
ないための、多孔度を決定する貫通マクロ細孔（特に２
０−５００　ｕ−の）ならびにマクロ細孔の壁を貫通す
るミクロ細孔（特に１１−１Ｏ１Ｉの）（その大きさは
微生物または細胞の大きさの範囲内になければならない
）を包含する多孔性構造を有する多孔性の担体である。

本発明に従って被覆された担体は、非限定的にオートク
レーブ処理されうる。それらは、通常の未処理のガラス
またはセラミックの表面上ではほとんど付着または成長
しない微生物または細胞の無菌培養に特に適している。

被覆された多孔性の担体は、その形状安定性および高い
密度のゆえに、多大のガス発生を伴う好気性または嫌気
性の方法あるいは輸送制限のおそれのある方法がその中
で進行し、その際従って高い開放多孔度を有する担体が
使用される固定床および流動床反応器用に特に好適であ
る。

ＤＥＡｆ！−デキストラン被覆を有するガラスよりなる
担体が特に研究された。それによれば、高い窒素含量を
有するが二量体ＤＥＡＥ−基の割合が比較的低くそして
特定の大きさの分子量範囲を有するＤＥＡＥ−デキスト
ランが特に好ましく使用される：単純なりＥＡＥ−基は
９．２のｐに一値を有するが、二量体ＤＥＡＥ−基は約
６．３のそれを有するので、これらの二世体基は、生物
工学の領域において極めて普通の操作条件（ｐＨＴ付近
）においては非常に僅少な部分しか解離せず、従ってあ
まり役立たない。

その割合は、好ましくは５０％以下であり、特に３５％
を超えない。

被覆のために用いられるＤＥＡＥ−デキストランの分子
量は、おおよそ１００．０００ないし２．ＯＯＯ，００
０、好ましくは≦１０’とすべきであるが、上方の領域
においては伸びるべきＤＥＡＥ−デキストランの分子量
の望ましくない屈曲が始まる。従って、６００，０００
付近の分子量が好ましい。

窒素含量は、好ましくは０．５ないし５％、特に３ない
し４％付近とすべきであり、３．３％の窒素含量を有す
る物質を用いた場合に優れた結果が得られた。

この接着性仲介層は、好ましくは無機担体と共有結合的
に結合され、従らて種々の条件に曝されることがある担
体上に、接着性仲介層の剥離される恐れなしに永続的に
被覆される。それ故に二つの生物工学的使用の間に担体
物質の清浄化および再生は、特に問題は無い。

ガラス担体へのジアルキルアミノアルキルデキストラン
のそのような結合にとっては、グリシジルオキシアルキ
ルガラス（エポキシアルキルガラス）またはクロロアル
キルガラスの表面を有するものあるいはまたアミノアル
キルガラスの表面を有するものも好適であり、後者の場
合にはジイソシアネートを用いる結合が行われる。

ヒドロキシル基を含有する担体には、ジアルキルアミノ
アルキルデキストランが同様な方法で結合される。

ジアルキルアミノアルキルデキストランのアルキル基は
、同一かまたは異なるものでよく、そして特にｌないし
４個の炭素原子、特にｌまたは２個の炭素原子を有する
低級アルキル基を意味する。

上記の研究は、更にジエチルアミノエチルデキストラン
（ＤＥＡＥ−デキストラン）を用いて実施されたので、
それについて特に記載する。

結合反応の実施には、原則的に何ら変わった点はない。

例として、ジメチルスルフオキシド中でのグリシジルガ
ラスへのＤＥＡＥ−デキストランの結合を以下に記載す
る。

５％ＨＮＯｆｆ中で４時間煮沸され、洗滌されそして乾
燥された、ドイツ特許出願公開第３，４１０，６５０号
による焼結ガラス材料１１０ｇを、γ−グリシジルオキ
シブロピルトリメトキシシラン１０−１および無水のア
セトン４９０ｍ１に添加し、真空を適用することにより
脱ガスを行いそして室温に一日放置した。

次いで上記材料を無水アセトンで三回洗滌しそして６０
℃において２時間そして室温において一日乾燥した。そ
の後で、そのように処理された焼結ガラスを無水のジメ
チルスルフオキシド中のＤＥＡＦ！−デキストラン３％
の溶液に加え、真空により脱ガスを行い、そして室温に
おいて三日間、次いで６０°Ｃおいて一日ふりまぜ、最
後に洗滌しそして乾燥した。

ジメチルスルフオキシドの代わりに、水もまた溶剤とし
て使用されうる。

多孔性のガラス担体上に単一の吸着層を作るために、こ
れらは、好ましくは、ＤＥＡＥ−デキストラン水溶液、
特に３％のＤＥＡＥ−デキストラン溶液に添加され、そ
して減圧にかけることによって、担体の表面内部まで溶
液が十分に浸入するように留意する。

これらは、好ましくは、予め強酸を用いて処理され、そ
の場合硝酸中でより長時間煮沸することが有効であるこ
とが立証された。特定的には、乾燥された担体が約５％
の硝酸中で歓待Ｂ（例えば約４時間）煮沸され、酸から
分離され、洗滌され、乾燥され、そして次に約３％のＤ
ＥＡｔ！−デキストラン溶液と共に室温において減圧室
内にほぼ一日間放置するか、または減圧を適用すること
によってオートクレーブ処理される。最後に、デキスト
ラン溶液から取出された担体は、過剰の溶液を除去され
、乾燥され、そして次に直ちにあるいは貯蔵後に、微生
物の固定化のために使用されうる。

本発明による無機担体の被覆の有利な作用を、コリネバ
クテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｇｌｕｔａｍｉｃｕ−Ａ
ＴＣＣ１３０３２）　　を用いてα−ケトイソカプロエ
ートよりのし一ロイシン産生の例を添付のグラフを参照
しつつ以下に説明する： 第１〜３図は、ドイツ特許出願公開第３，４１０，６５
０号による開放細孔性焼結ガラスよりの種々に処理され
たガラス担体を使用して、それぞれ比較しうる条件下に
Ｃ，グルタミクム（Ｃ，Ｇｌｕｔａａ＋ｉｃｕｍ）　Ａ
ＴＣＣ１３０３２を用いてα−ケトイソカプロエートよ
りのＬ−ロイシンの産生についての比較値を示す。第１
図から明らかなように、ガラスのＤＥＡＥ−デキストラ
ン被覆によって、被覆されていないかまたは前記のキト
サンを含む他の物質によって被覆されたガラスに比較し
て、明らかにより高い生産性が得られ、これは改善され
た固定化および固定化された微生物の活性によるもので
ある。

全部のガラスは、被覆される前に、５％の硝酸溶液と共
に３．５時間煮沸され、徹底的に洗滌されそして乾燥さ
れたものである。

第２図から比較試験の結果が明らかであり、それは、固
定化に必要な被覆処理の前に強酸によってガラスを前処
理することの有利な効果を示す。

第３図においては、硝酸を用いる前処理の後のＤＥＡＥ
−デキストランで被覆された担体を得られた最終的な比
較データが記載されている；明らかに生産的微生物の固
定化のためには、比較的低い二量体含量、高い窒素含量
および限定された鎖長が必要である。

第４図においては、２％ＮａＣ１溶液中のＣ，グルタミ
クムＡＴＣＣ１３０３２の細胞懸濁液中における滞留期
間（醗酵条件下の通常のイオン強度に対応する）に対す
るＤＥＡＥ−デキストランで被覆されたガラスに固定さ
れた微生物の数（ガラス１ｇ当たり微生物１０９個）が
示されている。その場合、約２・ＩＱＩ１１細胞／ｍｌ
を含有する細胞懸濁液４０ｍ１中でホウケイ酸ガラスの
担体２０ｇがふりまぜられた。未処理のガラスがＤＥＡ
Ｅ−デキストランで処理されたガラスと比較された。更
に、ＤＥＡｔｉ−デキストランで処理されたガラスが、
特にこのガラスへのＤＨＡＥ−デキストラン吸着層の接
着力を試験するために、２％のＮａＣ１溶液で二日間洗
滌された。明らかに、特に洗滌されたガラスへの微生物
の固定は、僅かしか減少しない。バイオマスの絶対値は
、極めて高くそして幾何学的測定による最大の可能な担
体被覆にほとんど達しており、このことは、また顕微鏡
による試験によっても証明され得るであろう。

実際の操作においては、はとんど３か月に亘る連続的な
醗酵が、ＤＥＡＥ−デキストランで被覆された担体への
バイオマスの同様に優れた固定化をもって成功裏に行わ
れた。

第５図は、最後に、酸により前処理されたガラスへのオ
ートクレーブ処理によるガラス被覆が行われた溶液のＤ
ＥＡＢ−デキストラン濃度の、種々に被覆されたガラス
担体の微生物懸濁液（それぞれ２％ＮａＣ１溶液１＋＋
１当たり約１．６−１０”個の細胞数を有する）中にお
ける種々の滞留期間（１）の間に蓄積された微生物の数
に及ぼす影響について例示している。

被覆溶液のＤＥＡＥ−デキストラン濃度は、少なくとも
約０．３％、好ましくは約３％とすべきことが判る。

付着された微生物の数に実質的に影響を及ぼすのは、も
ちろんその懸濁液中における滞留期間である。

本発明の利用性をコリネバクテリウム・グルタミクム（
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｓｉｃｕ
ｓ）を用いた試験の参照の下に上述した。もちろん本発
明は、特定の細菌の使用に限定されるものではなく、第
６図に示された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）　Ｋ１２、変異株ＤＨ５（ＤＮＡクローニングＶ
ｏ１．１．Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ、Ｍ。

編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ、１９８５参照
）およびパン酵母〔ウニフエルム社（Ｕｎｉｆｅｒｍ　
ＧｓｂＨ＆Ｃｏ−＋４７１２１１ｅｒｎｅ、　Ｃｈａｒ
ｇｅ　６３１２２８）　］を使用した試験結果は以下の
ことを示している： それぞれ１．１　ｘ　１０Ｉ′１／ｍｌ　（大腸菌）ま
たは４．３ｘ　１０”／ｍｌ（パン酵母）の出発濃度を
有する２％のＮａＣ１溶液中のそれぞれの細胞懸濁液中
における滞留期間に対する、ＤＥＡＥ−デキストランで
被覆されたガラスに固定された微生物の数が示されてい
る。

試験のためにドイツ特許出願公開筒３．４１０，６５０
号による開放細孔性の焼結ガラスよりなる被覆された担
体のそれぞれ２０ｇが４０■ｌの細胞懸濁液中でふりま
ぜられた。両方の微生物がＤ［１ＡＥ−デキストランで
被覆された担体によって同様に良く吸収されることが判
明する。大腸菌に比較してパン酵母によってはより僅か
しかガラスが覆われていないことは、それらの細胞の大
きさの比に実質的に対応し、従って両方の微生物におい
てガラス担体に吸着された細胞のほぼ匹敵し得る表面密
度となりうる。

第７および８図においては、ドイツ特許出願公開筒３．
４１０．６５０号による開放細孔性焼結ガラスの種々に
処理された担体を用いて、それぞれ比較し得る条件下に
行われたコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　）＾
ＴＣＣ１３０３２の固定化についての比較値が示されて
いる：洗滌された微生物が、２％のＮａＣ１溶液中に懸
濁され（それぞれ約２　ｘ　１０”細胞／−１）、これ
らの懸濁液のそれぞれ４０ｍ１づつがそれぞれ前記規定
の担体２０ｇに添加されそして室温においてふりまぜら
れた。

第７図は、ＤＥＡＨ−デキストランで吸着的にまたは共
有結合的に変性された担体の蓄積能力を示している。Ｄ
ＦｉＡＥ−デキストランの共有的結合は、グリシジルシ
ランで処理されたガラスに対して、３％溶液より一回は
水性相中でそして一回は無水ジメチルスルフオキシド中
で行われた。３種のＤｌｌ！ＡＥ−デキストランで処理
されたガラスの固定化能力は、はぼ同様でありそして明
らかに未処理のガラスよりも優れていることが判明する
。

第８図は、吸着的にのみ変性された担体に比較して共有
的に変性された担体の卓越した性質を示す。この場合、
上記物質は、固定化試験の前にｐＨ１１，５のＮａｚＣ
Ｏｘ　１■を用いて１週間洗滌された。

すべての百分率の表示は、二量体の０ＥＡＥ−基につい
ての表示を除いては重量％を意味し、後者の場合には、
ＤＥＡＥ−デキストラン中に存在するＤＦｉＡＥ−基の
全量が示されている。

【図面の簡単な説明】

第１ないし３図は、種々の担体を用いた場合におけるロ
イシンの収量の時間に対する依存関係を示すグラフであ
る。 第４図および第６ないし８図は、担体１グラム当たりの
固定化された微生物の数を示すグラフである。 第５図は、種々の濃度の溶液から得られたＤＥＡＥ−デ
キストラン被覆層への種々の時間における固定化された
微生物の、担体ｌグラム当たりの数を示すグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微生物あるいはヒト、動物または植物の細胞を固定
   するための、塩基性のアミン含有表面層を有する、特に
   ガラスまたはセラミックよりなる無機担体において、表
   面層がジアルキルアミノアルキル−デキストラン、特に
   ＤＥＡＥ−デキストランにより形成されており、そして
   無機担体に吸着的にまたは特に共有結合的に結合されて
   いることを特徴とする上記無機担体。 ２、表面層が＜５０％、特に≦３５％の二量体ＤＥＡＥ
   基含量および１００，０００ないし２×１０＾６、特に
   １０＾６までの分子量を有するＤＥＡＥ−デキストラン
   によって、０．５ないし５％、特に３ないし４％のＮ−
   含量において形成される請求項１記載の担体。 ３、表面層が約２５％の二量体ＤＥＡＥ基含量および６
   ００，０００付近の分子量を有するＤＥＡＥ−デキスト
   ランによって３．３％のＮ−含量において形成される請
   求項２記載の担体。 ４、表面層がヒドロキシ基を有するガラス体またはセラ
   ミック体に共有結合的に結合されている請求項１〜３の
   いずれかに記載の担体。 ５、表面層がエポキシアルキルガラスまたはクロロアル
   キルガラスの表面に、あるいはジイソシアネートによっ
   てアミノアルキルガラスの表面に共有結合的に結合され
   ている請求項４記載の担体。 ６、表面層が開放細孔を有する焼結ガラス担体の表面上
   に施されている請求項１〜５のいずれかに記載の担体。 ７、多孔度を決定する直径２０〜５００μｍの貫通マク
   ロ細孔およびマクロ細孔の壁を貫通している直径１〜１
   ０μｍのミクロ細孔を有する焼結ガラスの細孔二重構造
   によって特徴づけられる請求項６記載の担体。 ８、吸着的に結合されたジアルキルアミノアルキル（Ｄ
   ＡＡＡ）デキストラン層を有する請求項１記載の担体の
   製造方法において、大きな表面を有する無機担体をまず
   ≧５％の強酸中で少なくとも１時間煮沸し、そして洗滌
   および乾燥の後に≧１％のＯＡＡＡ−デキストラン溶液
   を減圧下に内部空隙内に浸入せしめ、そして最後に上記
   溶液から取出された担体から過剰の溶液を除去し、そし
   て乾燥することを特徴とする上記担体の製造方法。 ９、担体を〜５％の硝酸中で約４時間煮沸する請求項８
   記載の方法。 １０、酸で処理され、洗滌されそして乾燥された担体を
   、ＤＡＡＡ−デキストラン溶液で空隙を湿潤させるため
   に、約３％のＤＡＡＡ−デキストラン溶液中に減圧下に
   室温において約１日間置くかまたは溶液中で減圧の適用
   による脱ガス後に、特に１２０℃および１気圧（ゲージ
   圧）において２０分間オートクレーブ処理する請求項８
   または９記載の方法。１１、微生物あるいはヒト、動物
   または植物の細胞によって進行する生物工学的方法に請
   求項１〜７のいずれかに記載の担体を使用する方法。