JPS6027517B2 - その場で重合させて蛋白質を固定化する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はその分子構造中に特定のシスチン及びシスティ
ン基を含有する蛋白質特に酵素を支持体上に化学的に固
定化して、蛋白質をその場で重合させることによって長
期有効寿命を有する生物学的に活性な複合物を形成する
方法に関する。

酵素類は特定の反応に対して触媒作用を行なう生物学的
に活性な蛋白質である。酵素類は広範囲の工業用及び研
究上の応用、特に発酵、医薬、医学的研究及び食品処理
に使用されている。これらは生物学的活性度に高度に特
異性があり、一般的に望ましくない創生物を顕著量発生
しない。近年有効な回収及び再使用のために色々な支持
体上に酵素類を化学的あるいは物理的に固定する試みが
行なわれている。過去においては酵素類を無機支持体に
、共有結合、吸着及びイオン結合によって付着させて固
定している。水不溶性支持体に対する酵素類の共有結合
は集中的に調査されている。大抵の支持体は有機重合体
類であるが、最近の報告ではカップリング剤が酵素類を
セラミック材料に付着させるのに使用されている。有機
物であれ無機物であれ水不港性支持体への酵素の吸着は
今日まで最も簡単な不溶化技術である。

これは酵素を溶液中支持体材料に単にさらすだけでよい
からである。しかしながら吸着の容易性はそれに対応す
る脱着の容易性によって相殺される。米国特許第３５５
６９４５号明細書及び第３８５０７５１号明細書は酵素
の多孔性無機支持体に対する吸着技術を開示している。
酵素を固定する他の技術は、これを不活性則ち非反応性
の支持体に吸着させ、該酵素を二官能性交サ結合剤によ
って交サ結合させるものである。

かかる技術の例は米国特許第３７０５０８４号明細書及
びアール・ゴールドマン、オー・ケデム、アイ。シルマ
ン、ェス・カプラン及びイー・カチヤルスキー著、バイ
オケミストリーの１９６母王２自発行第４８６−５００
頁「パパィンーコロジオン膜、１、製造及び性質」と題
する論文に記載されている。後者の場合の支持体の非反
応性又は不活性は、支持体を例えばメタノール中に溶解
して交サ結合したパパィン膜が得られるようにすること
ができるという事実によって示される。これら既往技術
においては、酵素交サ結合剤は二官能性であった。これ
にはジアルデヒド類、単量体ポリイソシアネート類、ビ
スアミドェステル、ジスルホニルハライド類、及びビス
ジアゾベンジディンー２，２′−ジスルホン酸がある。
他の酵素固定化技術は米国特許出願第６１５１５６号明
細書（１９７３牢９月１９日出願）及び米国特許第３９
３３５８ｙ号明細書に開示されている。

かかる既往技術の更に詳細はジョージ・アール．スタル
ク著「バイオケミカル・アスベクツ・オブ。リアクシヨ
ンズ・オン・ソリツド・サポーッ」１９７１年ニューヨ
ーク州ニューヨーク、アカデミック・プレス刊行、１９
７１年１２月号リサーチ・デベロツプメントに見られる
エイチ・エイチ・ウイートオール著「ェンチームス・ィ
ンモビラィズト・オン・インオーガニツク・キヤリヤー
ズ」の論文、１９７１年１２月号ブリューワーズ・ダイ
ジェストに見られるアール・ェィ・メツシング著「ザ・
ポテンシヤル・アプリケーシヨンズ・オプ・モレキユラ
ー・インクルージヨン・ツ−・ビア・プロセシングＪの
論文、米国特許第３５１２９８７号明細書及び第３１６
７４８５号明細書に見出すことができる。これら既往技
術は多くの応用に適当であるけれども、化学的に酵素ウ
レアーゼを固定して酵素的に活性な合成物を形成し、こ
れが長期貯蔵および使用状態の後においても初期の活性
度を比較的高割合に保持するよにする簡単で効果的且つ
経済的な方法を求める必要が存在する。固定化ウレアー
ゼは米国特許第３９２６７３４号明細書記載のようにウ
レアーゼの分析に特に有用である。

ウレアーゼの重合は過去において研究され続けているこ
とが認められる。

例えば１９７１年アーカィブス・オブ・／ゞイオケミス
トリー・アンド・ノゞイオフィジックス第１４隼登第７
００−７１４頁、ウィリアム・ヱヌ・フィッシュベイン
及びケイ・ナガラヤン著「ウレアーゼ・キャタリシス・
アンド・アストラクチャー一皿、ウレアーゼ重合及びそ
の動力学的模型に包含される因子の論文、「ウレアーゼ
・キヤタリシス・アンド・ストラクチヤー」脚、がある
。この論文では一つの方法が報告されているが、この中
ではウレアーゼをゲル櫨過クロマトグラフィによって精
製している。しかしながらこの方法中にウレアーゼの固
定化は起っていないことが明瞭に思える。該論文中に説
明されている総てのク。マィトグラフ類においては、該
ウレァーゼ画分は空間容積中に溶離され、従ってウレア
ーゼカラムに対して結合がないことを示している。更に
ウレアーゼの８５なし、し９５％は、アミノ酸に対する
フオーリン・フェノール試験を使用して熔離液画分の分
析により計数することができる。従ってこの論文はゲル
猿過によるウレアーゼのクロマトグラフィを開示ている
が、この中で可溶性ゥレァーゼ重合体類を含むウレアー
ゼのピークはカラムの空間容積中に溶離され（即ちカラ
ムに対する結合がない）、そしてカラムに適用されたウ
レアーゼを包含するすべての蛋白質が実験誤差内で溶離
される。文献例えば１９７２モアーカィプス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオブイジックス第１５
１巻第３７０−３７７頁ウィリアム・ェヌ・フィッシュ
ベィン及びケィ・ナガラャン著「イオニツク・ストレン
グス・デイベンデンス・オブ・ウレアーゼ・ポリメリゼ
イシヨン・アンド・ポリマーハ１９６亀王７月１２日発
行、ネィチュア、第２２鏡蓋第１９１−１９３頁、ウィ
リアム・ェヌ・フイツシユベイン、力ルロス・エル・ス
ペアース及びワーレン・スクルズィ著「スベクトラム・
オブ・ウレアーゼ：ジエネテイツク・ポリメリツク・ア
ンド・コンフオーメリツク」があり、１９７３年ザ・ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２４
器蓋、第２２号、第７８７０一７８７刀自、ウイリアム
・エヌ・フイツシユベイン、ケイ・ナガラャン、及びワ
ーレン・スクルズィ著「ウレアーゼ・キヤタリシス・ア
ンド・ストラクチヤー」Ｋ、ザ・ハーフユニット・アン
ド・ヘミポリマーズ・オブ・ジヤツク・ビーン・ウレア
ーゼではウレァーゼの重合には影響するがウレアーゼの
固定化又はウレアーゼの支持体上での重合には関係しな
いパラメータを論じている。本発明は蛋白質及び酵素の
重合を不活性支持体上のその場での反応により行なって
長期有効寿命を有する生物学的に活性な複合物を形成す
る重合方法を提供することによりこれら技術上の進歩を
主張するものである。

本発明の目的を達成するにあたり、一つの態様は蛋白質
好ましくは酵素を支持体上に固定化して生物学的に活性
な複合物を形成せしめる方法にあり、これは蛋白質とし
て、１モル当たりのシスチンアミノ酸残基数の１／２と
システィンアミノ酸残基数との合計が１仏〆上のものを
選び、該蛋白質の水溶液を、寸法的に安定であり、該蛋
白質の保持に充分な表面をもち、そして該蛋白質に対し
て不動態である、多孔性不活性支持体に接触させて合浸
し、該蛋白質をこの支持体表面上に収着して蛋白質／支
持体複合物を形成し、該蛋白質の重合を容易にする舟お
よび該蛋白質を重合させるのに充分な温度に充分な時間
、該複合物を維持して該蛋白質を該支持体上にその場で
固定化する段階を有する。

本発明の実施に当っては、シスチンアミ／酸残基数の１
′２とシスティンアミ／酸残基数との合計が蛋白質１モ
ル当たり１４よ上の蛋白質（例えば酵素）の選択は重要
なことである。

何れかの理論に制約されているものではないが、固定化
反応には蛋白質分子内の二硫化物転位を包含するように
思える。シスチン又はシスティンのアミノ酸残基数の何
れかは、両方の合計が上記比率を充す限り零とすること
ができる。しかしながらシステインが存在しない時には
、痕跡量のスルフヒドリル基を有する化合物（例えば反
応混合物がスルフヒドリル基で１０‐８ないし１０‐５
モルとなるような量）例えばＰ一メルカプトェタノール
又はジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏ比ｒｉｅｊｔｏ
ｌ）を添加して該二硫化物交換反応を開始するようにす
ることが必要又は望ましくなろう。アミノ酸残基数なる
用語は、本明細書ではその通常の意味で使用し、化学的
に結合して蛋白質分子を形成するアミノ酸残基数を示す
。システィンアミノ酸残基は−ＳＨ基を有し、シスチン
残基は−Ｓ−Ｓ−基を有し、ここに特定する−条件の下
ではこれらの基は二硫化物転位を行なって蛋白質の重合
を起こすと理論づけられている。この二硫化物転位は酸
及び塩基接触をなし、約６．６なし・し約９．４の範囲
のｐＨにおいては受容しうる速度で進行しない。この理
論が本発明の機構の原因であるかどうかは重要ではない
が、これは発明の利益が実験的に確立されているからで
ある。上記のように１４によって表わされるシスティン
及びシスチンの割合は実験により重要であることが見出
されており、システィン及びシスチンアミノ酸残基数が
この割合より少ない蛋白質および酵素類はこの発明原理
による信頼出来る重合を行なわないようである。次の表
は本発明実施に有用な数種の酵素についてのシスティン
とシスチンの割合を示す。

本発明実施に特に通した酵素の形の他の蛋白質にはウレ
アーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ、ヒスタダーゼ
（ｈｉｓｔａ船ｓｅ）、Ｌーアミノ酸オキシダーゼ、Ｇ
モーグロブリン、グリコースー６−リン酸塩デヒドロゲ
ナーゼＥＣＩ．１．１．４９グリコース−６−リン酸塩
デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸塩シンターゼ、グルタ
ミン・ホスホリポシルピロリン酸塩アミドトランスフェ
ラーゼＰ−３００単量体、グルタミニル−ｔ ＲＮＡシ
ンセターゼ、グルタチオンシンセターゼ、グリセロアル
デヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、グリセリン−
３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、ＥＣＩ．１．１．＆グ
リシンーＮーメチルトランスフエラーゼ、グリシニン、
グリコーゲンシンセターゼ、糖蛋白質、ａ２−糖蛋白質
、ヒスタジン、８２一糖蛋白質、ハプトグロビン、ヘモ
シアニン、ヒスチジンアンモニアリアーゼ及び他のドナ
ルド・ェム・キルシェンバウム著、１９７３王、アナリ
テイカル・バイオケミストリー、第６鏡筈、第３０３−
３２９頁、「ア・コンビレーション・オブ・アミノ・ア
シッド・アナリシス・オプ・プ。

テインズ肌」及び本稿中同著者の他の文献記載のような
酵素がある。本発明実施に当って重合を容易にする酸性
ｐＨは約３なし、し約６．ふ効率的および経済的には好
ましくは約４．５なし、し６の範囲である。

重合を容易にする塩基性ｐＨは約９．５なし、し約１１
の範囲である。ウレアーゼに対しては、重合反応はｐＨ
５．１のウレアーゼの等竜点において明らかに効果的に
進行する。

ウレアーゼ及び他の酵素類は強い酸及び塩基中において
は変性し、この因子は重合の母条件の選択において考慮
しなければならない。数時間の時間中にｐＨ８．２にお
いては長期有効寿命をもたらすウレアーゼの充分な重合
が起こらないことが観察されている（米国特許第３９２
６７３４号明細書の例４参照）。本発明方法を実施する
にあたり、酵素又は他の蛋白質および支持体は酵素の水
性溶液中で接触させ、そして酵素は完全に緑潤し、そし
て支持体中に浸透する。

酵素溶液の柵は上記のように酵素を重合させて支持体上
にその場で固定化するのに充分な時間および温度に維持
される。これは通常、温度、濃度、酵素及び他の因子に
よって数分ないし数時間（例えば１０餌時間）の範囲の
時間を要する。１なし、し約５加持間の期間が大抵の用
途に適当である。

温度は通常約５０ｏｏ未満に維持して酵素の変性を防ぐ
ようにするが、約０℃ないし２０℃の範囲の温度が大抵
の用途に満足である。この接触を完成するにあたり、酵
素又は他の蛋白質をなるべく最初に支持体中又は支持体
上に付着（例えば収着又は含浸）させる。

収着なる語は支持体を酵素水性溶液で浸して吸着又は吸
収することを含むために使用する。水性溶液は過早重合
を防止するため通常解約７．５なし、し９に緩衝する。
支持体の与えられた重量又は容積当りの酵素使用量は全
く可変的にすることができるが、これは本発明実施に使
用出来る酵素調合物の純度ならびに組成と同様に支持体
の多孔性及び表面活性度に広範囲な差異があるからであ
る。固定化したた酵素複合物は少なくとも約０．００１
酵素単位（Ｕ．）／ｃ．ｃ．又はの‘を実際上の効率を
求めるために含有しなければならない。反応溶液中の酵
素馬度は溶解度パラメータによって約０．０１ないし約
９の重量％の範囲にすることができる。生物学的活性度
の酵素単位（Ｕ．）は、基質を生成物に毎分１マイクロ
モルの速度で変換する活性酵素の量として定義されてい
る。

酵素溶液は支持体との接触後、又は過早重合が支持体上
への収着を妨げない限り、直前において重合を容易にす
るｐＨに調節する。

この母調整は通常の酸類（例えばＨＣＩ又は日２Ｓ０４
）又は塩基（例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ）又は緩衝液（例
えば酢酸塩又はリン酸塩緩衝液）を必要に応じ添加する
ことによって完成される。いよいよ酵素に有害に働かな
い稀薄緩衝液を使用するが、強い酸及び塩基を実質的に
酵素が変性しない条件の下で使用することができる。二
、三の試験は特定のｐＨ調整添加物が酵素に有害に働く
かどうかを確立するであるつ。重合を容易にするための
餌調整の前、又はその後僅かの間（例えば２〜３分）に
酵素を支持体上に付着することは本発明の重要な態様で
ある。

酵素「単量体」としてこれは支持体に効果的に浸透して
酵素／支持体の複合物の表面積、容積又は重量単位当り
最高の酵素量を達成することができる。ある場合には酵
素をまず８−メルカプトェタノール又はシスティンのよ
うなメルカプタンと反応させて任意の酵素を支持体との
接触前に「解重合一するようにすることができる。本発
明の固定化技術は米国特許第３９２６７３４号明細書に
よる尿素分析用のウレアーゼ固定に特に有用である。

支持体はこの反応系列において不活性であり、酵素は支
持体に共有結合しているとは信じられない。

支持体の組成はこれが不活性で、寸法的に安定であり、
かつ酵素の保持に充分な表面を提供する限りは特に臨界
的でない。

支持体は米国特許第３８３９１７５号明細書におけるよ
うに多孔性で流動物浸透性の膜、あるいは第３８５０７
５１号明細書におけるように多孔性微粒子であることが
できる。多孔性支持体を使用する時には、これは十分な
酵素を保持して生物学的に活性な複合物を形成するよう
充分に多孔性でありかつ収着能の有するものにしなけれ
ばならない。本発明の商業的に顕著な実施態様において
は、固定化した酵素／支持体の複合物は少なくとも約１
×１０‐海蓬素単位（Ｕ．）／複合物立方複の活性度を
発揮するであろう。複合物の低酵素活性度はいよいよ製
造に使用する不純な酵素源に起因する。本発明の技術は
又米国特許第３８３９１７５号明細書又は１９７３王９
月１０日に出願された米国特許出願第３９５９７５号明
細書に記載された技術によって付着した時にはウレアー
ゼを重合するのに使用することもできる。

１０％ないし８０％、なるべくは１５−５０％の範囲の
容積孔度を有する多孔性粒子又は多孔性マトリックスは
本発明の目的に全く適していることが見出されている。

支持体の孔寸法は臨界的で、これはその上に酵素を固定
するのを妨げないようあまり小さくしてはならない。０
．０１仏ないし１０仏の範囲の流動物透過膜あるいは多
孔性粒子の平均孔寸法直径が大抵の応用に適当であって
効率的および経済的には０．０１なし、し２仏が好まし
い。

多孔性粒子支持体は耐火性セラミック酸化物粉末例えば
アルミナ粉末、ジルコニア粉末、マグネシア粉末、シリ
カ粉末、トリア粉末、ガラス粉末、粉末粘土、粉末タル
ク等であることができる。多孔性微粒子の粒度は臨界的
ではないが、一５メッシュないし＋４００メッシュの寸
法範囲が実際的である。効率的および経済的には寸法範
囲−２０ないし十１００メッシュ（米国師）が通常使用
される。多孔性で、不活性で、剛性を有し、寸法安定性
を有する耐火性流動物透過性膜支持体は、かかる耐火性
酸化物粉末を圧密化して希望形態の「グリーンコンパク
ト（禾焼成圧密化物）」を形成することによって製造す
ることができる。

このグリーンコンパクトを次に短時間暁結に充分な温度
で焼くと多孔性で、不活性で、剛性を有し、寸法安定性
を有する流動物透過性の耐火物支持体類が生ずる。暁結
は粒子が崩壊又は合体を起こして非多孔性物体を形成す
るような温度、時間にしてはならない。競結の程度は焼
結された圧密化物の実際の密度を、競続酸化物の理論密
度と比較することにより知ることができる。本発明に使
用することのできる多くの酸化物の中でアルミナがその
イｂ学的耐久性及び加工容易性のため好ましい。粉末化
耐火性酸化物から支持体を形成するにあたり、粉末化粒
子寸法を選択して前記範囲の多孔率及び孔寸法を有する
鯛結圧密化物を生じさせる。

多孔性支持体類の圧密化および糠結の技術は当業者によ
く知られており、本発明の一部を構成するものではない
。１０００ないし１００００そｂ／ｉｎ２の圧密化圧力
および１００ぴ０ないし１７００ｑｏの範囲の凝結温度
が工業的に便宜であると言えば充分である。

耐火性酸化物類の圧密化および暁結の詳細は１９６０玉
ニューヨーク州、ニューヨーク、アカデミック・プレス
によって刊行されたイー・リシュケウィッチ著「酸化物
セラミックス」なる本かち得ることができる。多孔性マ
トリックスは又多孔性金属例えば多孔性銀又は多孔性不
銭鋼製とすることもできる。

多孔性マトリックスは任意の幾何学的形態例えば樟状体
類、円筒類、円板類、板類、榛類、及び鬼状体類等とす
ることができる。他の適当な支持体類は天然又は合成の
繊維例えばポリプロピレン、ポリエチレン、木綿又は羊
毛、ナイロン、レーヨン、ポリエステル又はアクリル繊
維とすることができる。該支持体は又天然および合成の
両繊維の混合物とすることもでき、又は炭素、石綿、ガ
ラス又は類似の繊維性セラミックス例えばケイ酸アルミ
ニウム等から作った無機繊維とすることもできる。金属
類例えば銅及び不銭鋼の繊維状形態も使用することがで
きる。支持体繊維直径は約０．００１なし、し約０．２
５インチの範囲とすることができる。このような繊維性
物質は米国特許第３８２８９３４号明細書におけるよう
に固定化した酵素を用いる処理および猿過を１回の操査
で行うことからなるィンーラィン（ｉｎ−ｌｉｎｅ）猿
過操査に使用するためにフィルターカートリッジを作る
場合には非常に有用である。次の実施例においては特記
なければ総ての部は重量部、総ての％は重量％、総ての
温度は℃である。

例１ Ａ部 ２０夕の微粒子状多孔性アルミナを４その蒸留水により
フラスコ中渦状にし、汚濁上澄み液をデカンテーション
することにより洗練する。

該微粒子状アルミナは−８０なし、し十１００メッシュ
（米国師）範囲の粒子寸法および約０．１ないし０．２
山の平均孔寸法直径を有し、これに伴ない約１０％ない
し２０％の容積多孔度を有する。次に該アルミナを１そ
の蒸留水で真空櫨過により洗糠する。最後に該アルミナ
に３００の‘の２×１０‐３モル、ＰＨ８５のトリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタンーマレィン酸緩衝液（
トリスマレィン酸塩）を添加し、水アスピレーター真空
によりフラスコを連続的に約時間真空にして脱気する。
この緩衝液を廃棄し、３００の‘の新しいトリスーマレ
ィン酸塩緩衝液を添加する。Ｂ部０．５６夕のウレアー
ゼ（マイルスーサーブアツク、バッチ１１）を１２０の
上の２×１０‐３モルのトリスマレィン酸塩緩衝液中に
溶解してゥレアーゼ水溶液を調製する。

この溶液を２０分間１００００夕で遠心分離する。生じ
た上澄み液を沈澱物からデカンテーションし、この上澄
み液をＡ部のトリスマレィン酸塩緩衝液中のアルミナに
添加する。この緩衝液中のウレアーゼとアルミナの混合
物を３５分間０なし、し５℃で混合する。ウレアーゼ上
澄み液をこのアルミナからデカンテーションし、前記Ａ
部に記載のように前処理した第二の、新鮮なアルミナ試
料（粒子寸法が−６０〜十８０メッシュであること以外
はＡ部同様）に移す。できた混合物を約３０分間間０な
し・し５℃で混合する。Ｃ部 上記アルミナ溶液の恥は８．２である。

次にｐＨ４．５を有する０．０２モルの酢酸ナトリウム
−酢酸緩衝溶液を徐々に添加することによりＰＨを５．
０に調整する。緩衝液は０．０２モルの酢酸ナトリウム
を０．０２モルの酢酸に滴定してｐＨ４．５にすること
により製造する。全量で９８．２泌の緩衝液が酵素ーア
ルミナ混合物のｐＨ調整に必要となる。酢酸塩の添加の
後に緩衝が完成し、できた混合物を１時間０なし、し５
℃で振りまぜる。この期間中にウレアーゼがその場で重
合し、できたポリウレアーゼ重合体が固定化し、アルミ
ナ支持体の中又は上に捕捉されて生物学的に活性な複合
物を形成する。できた「ポリＪウレアーゼ／アルミナの
複合物を猿過し、約０．５ぐずつの３．０モル塩化ナト
リウム、５×１０‐３モルのエチレンジアミン／四酢酸
（ＥＤＴＡ）及び２．０×１０‐３モルのトリスマレイ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で洗糠する。該「ポリ」ウ
レアーゼ／アルミナの複合物は分析により活性度２１２
Ｕ．／複合物ｃｃを有するが、これは米国特許第３９２
６７私号明細書の例４の分析方法におけるように長期使
用に有効である。この例の手順をＣ部を行わないで繰返
す時には、ウレアーゼはアルミナに固着せず、米国特許
第３９２６７乳号明細書の例４記載のような分析方法に
おいて短時間使用後に急速にその効果を失う。

例２Ａ部 微粒子状多孔性アルミナ各２０夕の試料（一６０〜十７
０メッシュ）２個を各４その蒸留水で洗浴し、次に約３
００の【の２×１０‐３モルのトリスマレィン酸塩緩衝
液（ｐＨ８．９）により水アスピレーター真空の下で約
１時間脱気する。

Ｂ部 １夕のウレアーゼ（マイルス・サーブアツク、バック１
１）を１２０泌のトリスマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ８．
９）に溶解する。

室温に約１８分間放置した後、該ウレアーゼ溶液を限外
猿過セル（アミコン・コーポレーションよりのモデルＢ
１５マニコン濃縮器）中の限外猿過により濃縮して残留
濃縮物容積約９の‘になるようにする。この限外猿過方
法において、ウレアーゼは実質的に保持され低分子量不
純物はセルを透過する。次にこの濃縮ウレアーゼ溶液を
トリスマレイン酸塩緩衝液（ｐＨ８．９）により稀釈し
て容積１２０の‘とする。０ないし５℃に一晩冷蔵した
後、ウレアーゼ溶液を２０００夕で２０分間遠心分離し
、上澄み液を前記アルミナ試料の一つと、１００磁のト
リスマレィン酸塩緩衝液と共にスラリ−化する。

ウレアーゼの濃度は約４．６のｏ／の【である。ゥレア
ーゼノアルミナの混合物を温度０なし、し５℃で３５分
間混合する。この手順はウレア−ゼ溶液を更に精製する
ものと居ぜられている。Ｃ部Ｂ部からのアルミナ上の上
澄み液をデカンテーションし、第二の予備処理したアル
ミナ試料と混合し、３び分間ないし５℃で混合する。

この時点におけるウレアーゼのｐＨは約８．２であり、
これを９０泌の０．０２モル酢酸ナトＩＪワム−酢酸緩
衝液（ｐＨ４．４）の添加によりｐＨ５．０に調整する
。該酢酸塩緩衝液には殺菌剤として０．１重量％のＮａ
ＯＣＩを含有する。この混合物を約３時間０なし・し５
℃の温度で縄拝する。この期間中にウレアーゼはその場
で重合を行ない、できたポリウレアーゼは固定化してア
ルミナ支持体の中又は上に捕捉され、生物学的に活性な
複合物を形成する。できたポリウレアーゼ／アルミナの
複合物を真空櫨過器により猿過し、塩化ナトリウム１．
０モル・エチレンジアミン四酢酸のナトリウム塩（Ｎａ
２ＥＤＴＡ）５×１０‐３モル、及びトリスマレィン酸
塩緩衝液（ｐＨ７．０）２×１０‐３モルからなる２そ
の溶液で洗糠する。

ゥレアーゼノアルミナの複合物試料は洗膝前の分析によ
り活性度２７５Ｕ．／ｃｃを有する。

洗液した複合物は活性度１１７Ｕ．／ｃｃを有する。洗
総した複合物を例１のように試験して類似の結果が得ら
れる。例３ 微粒子状多孔性アルミナ（一６０〜十７０メッシュ）を
４その蒸留水で洗練する。

このアルミナ２０．５夕を次に真空フラスコ中にて２０
０奴のトリスマレィン酸塩緩衝液（２×１０‐３モル、
ｐＨ８．５）により洗練し、約３０分間混合する。（本
例を通じて同一緩衝液を使用する。）緩衝液を廃棄し、
アルミナを再び追加２００肌‘の緩衝液で洗練する。ウ
レアーゼ（マイルス・サーヴアツク、バッチ１１）の１
夕を１００の‘の緩衝液及び１．５の‘の８−メルカプ
トェタノール中に溶解する。できた溶液を０ないし５℃
で１時間鷹拝し、続いて１６０００夕で２５分間遠心分
離する。上澄み液をミリポール１４２側実験室用限外櫨
過セル（カタログ番号××４２、１４２、ＳＩ）を使用
し、圧力５０なし、し１００〆ｂ／肘にて濃縮精製して
容積５なし、し１０の‘となるようにする。

このセルに使用する櫨過器はピーェスティーェム（ミリ
ポ−ル）〔内ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）〕に指定する
。１００の‘の緩衝液を濃縮ゥレアーゼ溶液に添加し、
濃縮手順を繰返して最終容積３ないし１０肌となるよう
にする。

このウレアーゼ溶液を緩衝液により稀釈して１２０の‘
としてアルミナ緩衝液混合物に添加する。

全容積は約３００の‘である。混合物を３び分間０ない
し５℃で櫨拝し、ウレァーゼの上澄み液を第一試料と同
様に調製した第二のアルミナ試料に移す。できたウレア
ーゼの混合物を３０分間０ないし５℃で燈拝してｐＨ３
．８の０．０２モル酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液により
ｐＨ８．１からｐＨ５．０に調整する。次に混合物を約
３ないし４時間以上０なし、し５℃で礎拝する。この期
間中にウレアーゼはその場で重合を行ない、できたポリ
ウレアーゼは固定化され、アルミナ支持体の中又は上に
捕捉されて生物学的活性な複合物を形成する。この期間
の終りにおける上澄み液のｐＨは５．２である。合成物
の半分を除去し５×１０‐３モルＥＤＴＡを含有する２
×１０‐３モルのトリスマレィン酸塩緩衝液（ｐＨ６．
４）の１そで洗路する。

複合物の初期活性度は３９２Ｕ．／ｃｃであり、洗糠段
階で使用したトリスマレィン酸塩緩衝液中に１０ケ月貯
蔵の後は約５８Ｕ．／ｃｃである。複合物の他の半分を
更に１６時間０なし、し５℃において前記のように反応
させ、次に前記のように洗液する。この複合物の初期活
性度は３９Ｕ．／ｃｃである。これは固定化したウレア
ーゼは多くの応用に適当ではあるが、活性度はウレァ−
ゼを更に重合させると減少する傾向にあることを示すも
のである。例４ １０一３モルＨＣ１、１モルＮａＣＩの５の‘を例１な
し、し例３に使用したものと同型の−４０〜十５０メッ
シュアルミナ粒子の充填された液体クロマトグラフィー
カラム中に注入する。

カラムは直径約１インチ、高さ２０インチであり、溶媒
は１０‐３モルのトリスマレィン酸塩ＥＤＴＡ緩衝液（
ｐＨ８．６）である。ウレアーゼ（マイルス・サーヴア
ツク、バッチ１１）１１／２９を１２の‘の蒸留水中に
溶解する。

このウレアーゼ溶液に１０ムーの０．１モル３一メルカ
プトェタノールを添加する。１／２時間燈拝した後、溶
液を１００００夕で１１５分間遠心分離する。

５羽の上澄み液を上記カラムに注入し、クロマトグラフ
的に精製する。

ピークの画分を回収し一緒に混合した。ＨＣＩ−ＮａＣ
Ｉ溶液による再生を含めた手順を追加５泌の上澄み液に
より繰返す。併合したウレアーゼ画分を冷蔵器中一晩０
ないし５℃で貯蔵する。例１なし、し例３に使用したよ
うな型の−５０〜十６０メッシュＮ２０３粒子６０夕を
５その蒸留水で洗練する。

次に該アルミナを真空にしたフラスコ中に４８分間置き
、その間５００の【のトリスマレィン酸塩ＥＤＴＡ緩衝
液（１０‐３モル、ｐＨ８．８）と接触させる。５−１
０分毎にフラスコをゆるやかに凝拝する。

上澄み液をアルミナから捨て去り、このアルミナ、２０
０机【のトリスマレイン酸塩２．５×１０‐３モルの緩
衝液（ｐＨ８．３）及び４８０の‘の併合したウレアー
ゼ画分を一緒に混合する。この混合物を約３び分間縄拝
し、ＰＨを１５０のＺの０．０２モル酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）および７．１のとの１規定Ｈ
ＣＩにより４．６に調整する。ウレアーゼ溶液はこの処
理の後外観上白色に変化する。次にできた混合物を２時
間０なし、し５℃で樽拝し、残留混合物の櫨梓を０ない
し５℃で継続する。

３／４のアルミナを除去し、約１その２×１０‐３モル
のトリスマレィン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗総し、こ
の緩衝液中に貯蔵する。

この複合物の初期活性度は分析の結果３０７Ｕ．／ｃｃ
であり、緩衝液中４ケ月貯蔵の後は１６４Ｕ．／ｃｃで
ある。残余アルミナを追加的に２加持間０なし、し５℃
で反応させてウレアーゼを更に重合させ、次に約１その
トリスマレィン酸塩緩衝液で洗総し、この緩衝液中に貯
蔵する。できた複合物の初期活性度は２４１Ｕ．／ｃｃ
である。例５ 本例は２００の‘の２．５×１０‐３モル、ｐＨ８．６
のトリスマレィン酸塩緩衝液に３６９の【のクロマトグ
ラフ的に精製したウレアーゼを加えてなる反応混合物と
いうこと以外は例４と同様である。

混合後のｐＨは８．８であり、２００の上以上の０．２
モル酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）をｐＨ
５．０に調整するのに使用し、０なし、し５℃において
２時間燈拝して反応させる。この期間中にウレアーゼが
その場で重合を行ない、できたポリウレアーゼが固定化
されてアルミナ支持体の中又は上に捕捉され生物学的活
性な複合物を形成する。生じたアルミナ／ウレアーゼの
複合物を１．５×１０‐３モルのトリスマレィン酸塩及
び１０‐３モルのＥＤＴＡを含む緩衝液４３０のひこよ
りｐＨ７．５で洗糠し、次に２その蒸留水で洗練する。

この複合物の初期活性度を分析すると、２３３Ｕ．／ｃ
ｃアルミナである。トリスマレィン酸塩緩衝液中０なし
・し５℃において３ケ月貯蔵後は活性度は３９Ｕ．／ｃ
ｃとなる。例６ 本例は次の除外例を除いて例４と同様である。

ウレァーゼ溶液の遠心分離から得られる上澄み液をクロ
マトグラフカラムに注入する以前に０．２仏の櫨過器を
通して櫨過する。僅か３０夕のアルミナ（一４０〜十５
０メッシュ）を使用し、真空下４０泌のトリスＥＤＴＡ
緩衝液（ｐＨ８．＆１０‐３モル）により洗糠する。ウ
レアーゼをアルミナと１／幼時間混合した後アルミナ１
／３と上澄み液の１／３をｐＨ８．８において分離し、
さらに２時間にわたって一緒に混合する。

残りの２／３のアルミナウレアーゼ溶液を２０の‘の０
．１モル酢酸の滴下により滴定してｐＨ５．０とし、０
なＬ・し５℃で２時間反応させてウレアーゼをその場で
重合させる。両アルミナ試料を約１その１０‐３モルの
トリスＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）で洗糠する。最後に両ア
ルミナ試料を洗液緩衝溶液中０ないし５℃で貯蔵する。
ｐＨ５．０で反応した試料は初期活性度１５３Ｕ．／ｃ
ｃを有するが、一方ｐＨ８．８で反応した他方の試料は
初期活性度９６Ｕ．／ｃｃを有する。この緩衝液中８日
間貯蔵した後はｐＨ５で反応した試料の活性度は１５１
Ｕ．／ｃｃであるが、一方他方の試料は活性度４９Ｕ．
／ｃｃを有する。例７ 本試料は６０夕のアルミナを使用し、ウレアーゼ溶液を
１５ムーの０．２モルの８ーメルカプトェタ／ール溶液
で処理する以外はｐＨ５．０における例５と同様に調製
する。

初期活性度は１７７Ｕ．／ｃｃであり、貯蔵３日後の活
性度は２２９Ｕ．／ｃｃである。１ケ月の貯蔵後は活性
度は２５１Ｕ．／ｃｃである。

重合したゥレアーゼ複合物は米国特許第３９２６７３４
号明細書におけるように尿素分析において長期間繰返し
使用するのに通しており、９６５のＢＵＮ決定がこの技
術によって数ケ月の期間にわたり損失と効果を損うこと
なく行なわれる。

例８前記のように２個の各１０夕の多孔性アルミナの試
料（一８０〜１００メッシュ）を１その脱イオン蒸留水
で洗総し、１４０ｑｏで終夜乾燥する。

馬の肝臓アルコール・デヒドロゲナーゼの溶液を２１６
の９（４００Ｕ）を５０の‘の１ぴモルのリン酸塩緩衝
液（冊７．５）中に溶解することにより調製する。該酵
素はシグマ・ケミカル・カンパニーからのものであり、
絹番号５や−８２２０である。２５私のこの酵素溶液を
各１０夕の洗総アルミナ試料に加える。

一方の試料は１規定ＨＣＩによりｐＨ４．８に調整する
が、他方の試料はｐＨ７．５に維持し、両試料を約５℃
で３時間振溢して何等かの重合反応が促進できるように
する。最後に両アルミナ試料を１その０．１モルのＩＪ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で洗練する。該アルミナ酵
素複合物を次にＮＡＤのＮＡＤＨ２への転換を測定する
ことにより活性アルコール・デヒドロゲナーゼの分析を
する。（ヴアレー・ビー・ェル及びホッホ・ェフ著プロ
ッシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オプ・サィャンシズ、第４１巻、第３２刀頁、１９５
５年参照）。アリコートを分析方法中に３硯砂、１分、
２分、３分及び５分で測定する。アルミナ酵素複合物を
０．２ムの猿過器により３４仇ｍで吸収度を測定する以
前にアリコートから除去する。ＰＨ７．５における試料
の初期活性度は０．４５Ｕ．／ｃｃＡ１２０３であるが
、一方ｐＨ４．８における試料の初期活性度は０．０４
５Ｕ．／ｃｃＡ１２０３であった。１２日後に試料を緩
衝液（約２００のＺ）で洗練し、再分析する。

ｐＨ７．５の試料の活性度は０．０２７Ｕ．／増ＡＩ２
０３であり、一方ｐＨ４．８の試料では０．０５４Ｕ．
／私である。例９ 前記同様節寸法−８０〜十１００の２個のアルミナ試料
（各１０夕）を５００肌の蒸留水で洗修する。

シユードモナス・フルオレツセンスからのヒスチダーゼ
の溶液を０．３夕を１００机‘の２×１０‐３モルのリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ９．２）中に溶解して調製する。該
酵素はワージングトン・バイオケミカル・コーポレーシ
ョンより記号番号ＨＩＳ一坪Ａとして得られ、活性度９
７Ｕ．／雌を有する。酵素溶液５０地を各アルミナ試料
に添加する。一つの溶液アルミナ混合物を１規定ＨＣＩ
を使用してｐＨ５．０に調整し、他の試料はｐＨ９．２
に維持する。両試料を２時間約５℃で振渇して何等かの
重合反応を促進させるようにし、その後１その０．１モ
ルのピロリン酸塩緩衝液によりｐＨ９．２で洗液する。
試料をテーバー及びメーラーの方法により分析する（Ｔ
ａめｒａｎｄＭｅｈｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｌｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ロ，（ＣｏｌｏＷｃｋ
，Ｓ．Ｐ．ａｎｄＫａｐｌａｎ，Ｎ．０．ｅｄｓ．）、
ｐｇ，２２８、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎ
ｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９５５）。２７７ｍｍに
おける分光光度計的測定中にアルミナの除去を例８記載
のように行う。

ｐＨ５における試料の活性度は４２Ｕ．／泌Ｎ２０３で
あり、一方ＨＺ９．２における試料は１０Ｕ．／私Ｎ２
０３である。例１０前記のように各５夕のアルミナ試料
（一８０〜十１００メッシュ）を５００の上の蒸留水で
洗糠し、１４０００で終夜乾燥する。

１０の９のＬーアミ／酸オキシダーゼを２０の‘の１０
‐３モルのトリス一日ＣＩ緩衝液（ｐＨ７．８）中に溶
解する。

酵素の活性度はワージングトン・バイオケミカル・コー
ポレーションより得られる記号番号ＬＡＯ次Ａ同様約３
単位／のｏである。できた酵素溶液の１０ｗ‘を各アル
ミナ試料に添加する。

一つの混合物を１規定ＨＣＩにより斑４．８に調整し、
他は斑７．８に維持する。両試料を５℃で３時間振浸し
て何等かの重合反応が促進できるようにする。次に酵素
アルミナ複合物を５００の‘の０．２モルのトリス一日
ＣＩ（ｐＨ７．８）で洗糠する。カーチ・ジー他著ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ−、第２４
３巻、第２３０６頁（１９６８）記載のように酵素電極
（ＹＳＩＭｏｄｅｌ５３．０Ｋｙ袋ｎＭｏｎｉｔｏｒ）
を使用し分析を実施する。母７．８における試料の活性
度は１．３１Ｕ．／の【山２０３であり、一方ｐＨ４．
８における試料のそれは３．５３Ｕ．／泌ＡＩ２０３で
ある。例１１ １１／２夕のウレアーゼ（マイルス、バッチ１１）を５
０の‘の０．５モルのＮａＣＩ中に溶解する。

この溶液に０．０３泌の０．２モルの８一メルカプトヱ
タノールを添加する。溶液を１１／２時間縄拝してウレ
アーゼを溶解する。室温で１時間燈洋の後できたウレア
ーゼ溶液を１００００夕で３０分間遠心分離する。上記
方法を行なう一方６０夕の例１のような多孔性アルミナ
（一４０〜十５０メッシュ）を２その蒸留水で洗糠する
。アルミナを５００の‘のトリス−ＥＤＴＡ（１０‐３
モル、ｐＨ８．８）緩衝液中で濃伴し、１．虫時間真空
操作する。

緩衝液を捨てアルミナをウレアーゼ溶液に加え、１／幼
時間縄拝する。できた混合物を二、一滴の０．１ＮａＯ
Ｈで滴定してｐＨＩＯ．０にする。滴定した混合物を室
温で３時間振糧して重合反応が促進するようにする。次
に混合物を０．１規定ＨＣＩで滴定して斑６．０にする
。できたアルミナ／固定化ウレアーゼの複合物を１×１
０‐３モルのＥＤＴＡを含有しｐＨ６．０を有する０．
１モルＮａＣ１２〆で洗膝し、次に柵７．５の１×１０
‐３モルのトリスーＥＤＴＡ５００の‘で洗糠する。次
に固定したウレアーゼを１×１０‐３モルのトリスーＥ
ＤＴＡでｐＨ７．５のもの中に貯蔵し分析する。

分析の結果はアルミナｃｃ当り９５■単位のウレアーゼ
活性度があることを示した。米国特許第３９２６７３４
号明細書におけるように尿素分析に２日間使用の後も活
性度の損失は探知されない。

以上本発明を詳細に説明したが、本発明の構成の別の具
体例を要約すれば次のようである。‘１’前記特許請求
の範囲１に記載の方法の生成物。（２１ 前記特許請求
の範囲２に記載の方法の生成物。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白質を支持体上に固定化して生物学的に活性な複
   合物を形成するにあたり、蛋白質として、１モル当りの
   シスチンアミノ酸残基数の１／２とシステインアミノ酸
   残基数との合計が１４以上のものを選び、該蛋白質の水
   溶液を、寸法的に安定であり、該蛋白質の保持に充分な
   表面をもち、そして該蛋白質に対して不動態である、多
   孔性不活性支持体に接触させて含浸し、該蛋白質をこの
   支持体表面上に収着して蛋白質／支持体複合物を形成し
   、該蛋白質の重合を容易にするｐＨおよび該蛋白質を重
   合させるのに充分な温度に充分な時間、この複合物を維
   持して蛋白質を支持体上にその場で固定化する。 ことを特徴とする蛋白質の固定化方法。 ２ 蛋白質として酵素を使う、前項１に記載の方法。 ３ ｐＨを約３．０ないし約６．５の範囲とする、前項
   ２に記載の方法。 ４ ｐＨを約９．５ないし約１１の範囲とする、前項２
   に記載の方法。 ５ 不活性支持体として耐火性酸化物粉末を使う、前項
   ２に記載の方法。 ６ 支持体として耐火性酸化物粉末の圧密化および焼結
   により形成した多孔性マトリツクスを使う、前項２に記
   載の方法。 ７ 支持体として繊維の形のものを使う、前項２に記載
   の方法。 ８ 支持体を酵素の水性溶液中に浸漬することによつて
   、酵素を支持体に含浸させる、前項２に記載の方法。 ９ 酵素としてウレアーゼを使う、前項に記載の方法。 １０ 支持体上にウレアーゼを固定化するにあたり、支
   持体をウレアーゼの水性溶液と接触させ、ウレアーゼの
   重合を容易にするｐＨおよびウレアーゼを重合させるの
   に充分な温度に充分な時間、ウレアーゼを維持してウレ
   アーゼを支持体上にその場で固定化することを特徴とす
   る前項１に記載の方法。 １１ 支持体として多孔性酸化アルミニウム粉末を使う
   、前項１０に記載の方法。 １２ 重合温度が約５０℃以下である前項１０に記載の
   方法。 １３ 重合に要する時間が約５０時間以下である前項１
   ０に記載の方法。 １４ ｐＨが約４．５−約６である前項１０に記載の方
   法。 １５ 重合温度が約０℃−約２０℃である前項１０に記
   載の方法。