JPH0197861A - ミリストイルグリシン部位を識別する抗体 - Google Patents
ミリストイルグリシン部位を識別する抗体Info
- Publication number
- JPH0197861A JPH0197861A JP25581187A JP25581187A JPH0197861A JP H0197861 A JPH0197861 A JP H0197861A JP 25581187 A JP25581187 A JP 25581187A JP 25581187 A JP25581187 A JP 25581187A JP H0197861 A JPH0197861 A JP H0197861A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- myristoylglycine
- protein
- proteins
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
近年、ある種の蛋白質リン酸化酵素（ａｄｅｎｏｓｉｎ
ｅ３’５ゝｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｌｌ）のＮ末
端グリシンがミリスチン酸と共有結合していることが発
見され［１’ｒｏｃ、 Ｗａｔｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｅｔ
。
ｅ３’５ゝｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｔｙｐｅｌｌ）のＮ末
端グリシンがミリスチン酸と共有結合していることが発
見され［１’ｒｏｃ、 Ｗａｔｔ、＾ｃａｄ、 Ｓｅｔ
。
Ｕ、Ｓ、Ａ、 Ｖｏｌ、７９ ｐ、６１２８ （１９８
２）、 Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙＶｏ１．２２ ｐ
、３７０２ ＜１９８３）］、これを端緒としてミリス
トイル化された種々の蛋白質に関する数多くの報告がな
された ［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 Ｖｏｌ、１５θｐ、
３１４ （１９８２＞、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ
、 Ｖｏｌ、２５６ ｐ、１３３４９ （１９８４）。
２）、 Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｓｔｒｙＶｏ１．２２ ｐ
、３７０２ ＜１９８３）］、これを端緒としてミリス
トイル化された種々の蛋白質に関する数多くの報告がな
された ［ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、 Ｖｏｌ、１５θｐ、
３１４ （１９８２＞、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ
、 Ｖｏｌ、２５６ ｐ、１３３４９ （１９８４）。
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｊｒ
、ｓ、＾、 Ｖｏｌ、８０ １’。
、ｓ、＾、 Ｖｏｌ、８０ １’。
３３９ （１９８３）１．さらにＮ末端グリシンのミリ
ストイル化は細胞の形質転換や成長の調節に関わるある
種の蛋白質の機能発現に重要な意味を持つという、ミリ
ストイル化の生物学的意義に関する報告もある［Ｓｃ、
１ｅｎｃｅ Ｖｏｌ、２２７ ｐ、４２７ （１９８５
）］、またレトロウィルスが関与する種々の疾患、例え
ば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人性Ｔ細胞白
血病（ＡＴＬ）とウィルス蛋白のミリストイル化との関
連も大きな注目を集めている。
ストイル化は細胞の形質転換や成長の調節に関わるある
種の蛋白質の機能発現に重要な意味を持つという、ミリ
ストイル化の生物学的意義に関する報告もある［Ｓｃ、
１ｅｎｃｅ Ｖｏｌ、２２７ ｐ、４２７ （１９８５
）］、またレトロウィルスが関与する種々の疾患、例え
ば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、成人性Ｔ細胞白
血病（ＡＴＬ）とウィルス蛋白のミリストイル化との関
連も大きな注目を集めている。
蛋白質のミリストイル化の一般的な役割については尚不
明な点も残されているが、上述したように、生体系にお
いて重要な役割を果していることは疑いない、したがっ
て、この反応を追跡することができる手段を確立すれば
、ミリストイル化の生物学的な意義をさらに明らかにし
、特に病態との関連を解明することができ、ひいては疾
患の診断・予防・治療への道を拓くものと確信される。
明な点も残されているが、上述したように、生体系にお
いて重要な役割を果していることは疑いない、したがっ
て、この反応を追跡することができる手段を確立すれば
、ミリストイル化の生物学的な意義をさらに明らかにし
、特に病態との関連を解明することができ、ひいては疾
患の診断・予防・治療への道を拓くものと確信される。
しかしながら、ミリストイル化蛋白を簡便に検出する方
法は未だ確立されていないのが現状である。
法は未だ確立されていないのが現状である。
本発明者らは、上記各報告に関連して、独自に研究を重
ねる過程において、ミリストイルグリシンをハプテンと
して抗原を調製しこれに対する抗体を作製したところ、
この抗体が特異選択的に蛋白質のミリストイルグリシ
ン部位を識別し、従って当該抗体の利用によってミリス
トイルグリシル蛋白質を簡便に検出・同定し得るという
新しい知見を得た０本発明はこの知見を基礎として完成
されたものである。
ねる過程において、ミリストイルグリシンをハプテンと
して抗原を調製しこれに対する抗体を作製したところ、
この抗体が特異選択的に蛋白質のミリストイルグリシ
ン部位を識別し、従って当該抗体の利用によってミリス
トイルグリシル蛋白質を簡便に検出・同定し得るという
新しい知見を得た０本発明はこの知見を基礎として完成
されたものである。
即ち、本発明はミリストイルグリシンとキャリアー蛋白
との複合体からなる抗原を哺乳動物に投与し生成する抗
体を採取することによって得られる蛋白質のミリストイ
ルグリシン部位を識別する抗体、及びこれを用いるミリ
ストイル化された蛋白質の検出方法に関するも−のであ
る。
との複合体からなる抗原を哺乳動物に投与し生成する抗
体を採取することによって得られる蛋白質のミリストイ
ルグリシン部位を識別する抗体、及びこれを用いるミリ
ストイル化された蛋白質の検出方法に関するも−のであ
る。
本発明によって得られる蛋白のミリストイルグリシン部
位を識別する抗体（以下、当該抗体という）は、生体系
で生じたミリストイルグリシル化蛋白の性状を解析する
に当たって、そのような蛋白な単離すための手段として
機能することができる。すなわち、例えば、当該抗体を
リガンドとするアフイニテイクロマトグラフィーを用い
て生体系からミリストイル化蛋白を選択的に分離するこ
とができる。
位を識別する抗体（以下、当該抗体という）は、生体系
で生じたミリストイルグリシル化蛋白の性状を解析する
に当たって、そのような蛋白な単離すための手段として
機能することができる。すなわち、例えば、当該抗体を
リガンドとするアフイニテイクロマトグラフィーを用い
て生体系からミリストイル化蛋白を選択的に分離するこ
とができる。
さらに、当該抗体を利用した抗原抗体反応による、微量
のミリストイルグリシル化蛋白の存在の検出、測定も可
能である。すなわち、体液中及び、組織より抽出された
試料を当該抗体を用いた免疫二重拡散法、免疫電気泳動
法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法等に供すことによ
り、それらの試料中のミリストイルグリシル化蛋白の検
出、定量を行うことができる。また、当該抗体を利用し
た免疫組織化学的手段（例えば、酵素ｔ／！Ａ識化した
当該抗体の利用）により、生体組織内のミリストイルグ
リシル化蛋白を直接検索することもできる。
のミリストイルグリシル化蛋白の存在の検出、測定も可
能である。すなわち、体液中及び、組織より抽出された
試料を当該抗体を用いた免疫二重拡散法、免疫電気泳動
法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法等に供すことによ
り、それらの試料中のミリストイルグリシル化蛋白の検
出、定量を行うことができる。また、当該抗体を利用し
た免疫組織化学的手段（例えば、酵素ｔ／！Ａ識化した
当該抗体の利用）により、生体組織内のミリストイルグ
リシル化蛋白を直接検索することもできる。
以下、本発明におけるミリストイルグリシン抗原の製造
、該抗原からの抗体の製造、並びに該抗体を用いたミリ
ストイル化蛋白質の検出法につき順次説明する。
、該抗原からの抗体の製造、並びに該抗体を用いたミリ
ストイル化蛋白質の検出法につき順次説明する。
本発明に関わるミリストイルグリシン抗原の製造におい
て、ハプテンとなるミリストイルグリシンは、公知の方
法、例えばショツテン・バウマン法 ［Ｃｈｅｍ、 Ｒ
ｅｖ、 Ｖｏｌ、５２ ｐ、２３７ （１９５３）１に
従い容易に調製することができる。即ち、例えば、ミリ
スチン酸塩化物とグリシンとを２０％のアセトニトリル
を含む０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させ
、生成物をエタノール中で再結晶化すると目的のミリス
トイルグリシンが得られる。
て、ハプテンとなるミリストイルグリシンは、公知の方
法、例えばショツテン・バウマン法 ［Ｃｈｅｍ、 Ｒ
ｅｖ、 Ｖｏｌ、５２ ｐ、２３７ （１９５３）１に
従い容易に調製することができる。即ち、例えば、ミリ
スチン酸塩化物とグリシンとを２０％のアセトニトリル
を含む０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中で反応させ
、生成物をエタノール中で再結晶化すると目的のミリス
トイルグリシンが得られる。
ミリストイルグリシンをハプテンとしこれに結合される
キャリアー蛋白としては、通常抗原の作製にあたり慣用
される天然もしくは合成の高分子蛋白質を広く使用でき
る０例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、馬血清アルブ
ミン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、ウ
サギ血清アルブミン、卵白アルブミン等の動物アルブミ
ン類、牛血清グロブリン、馬血清グロブリン、ヒト血清
グロブリン、ヒツジ血清グロブリン、ウサギ血清グロブ
リン、卵グロブリン等の動物のグロブリン類、牛チログ
ロブリン、馬チログロブリン、ヒトチログロブリン、ヒ
ツジチログロブリン、ウサギチログロブリン等の動物の
チログロブリン類、牛ヘモグロビン、馬ヘモグロビン、
ヒトヘモグロビン、ヒツジヘモグロビン、ウサギヘモグ
ロビン等の動物のヘモグロビン類、動物のヘモシアニン
類、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミ
ン酸共重合体等を挙げることができる。
キャリアー蛋白としては、通常抗原の作製にあたり慣用
される天然もしくは合成の高分子蛋白質を広く使用でき
る０例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、馬血清アルブ
ミン、ヒト血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、ウ
サギ血清アルブミン、卵白アルブミン等の動物アルブミ
ン類、牛血清グロブリン、馬血清グロブリン、ヒト血清
グロブリン、ヒツジ血清グロブリン、ウサギ血清グロブ
リン、卵グロブリン等の動物のグロブリン類、牛チログ
ロブリン、馬チログロブリン、ヒトチログロブリン、ヒ
ツジチログロブリン、ウサギチログロブリン等の動物の
チログロブリン類、牛ヘモグロビン、馬ヘモグロビン、
ヒトヘモグロビン、ヒツジヘモグロビン、ウサギヘモグ
ロビン等の動物のヘモグロビン類、動物のヘモシアニン
類、ポリリジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミ
ン酸共重合体等を挙げることができる。
上記ハプテン（ミリストイルグリシン）とキャリアー蛋
白との反応は公知の方法、例えばアミド結合法に従い実
施することができる。即ち、ミリストイルグリシンのカ
ルボン酸とキャリアー蛋白のアミノ基とをアミド結合反
応させることにより実施され、該アミド結合反応は例え
ばカルボジイミド等の脱水剤を用いた脱水縮合反応によ
り実施される。この脱水縮合反応は、適当な不活性溶媒
、例えばジメチルスルホキシド（Ｍｅ２！３０）−アセ
トニトリル（ＣＨ３ＣＮ）−水（１１２０） （３：２
：５）の混合溶媒中、０℃〜室温にて３〜１２時間で好
適に進行する。
白との反応は公知の方法、例えばアミド結合法に従い実
施することができる。即ち、ミリストイルグリシンのカ
ルボン酸とキャリアー蛋白のアミノ基とをアミド結合反
応させることにより実施され、該アミド結合反応は例え
ばカルボジイミド等の脱水剤を用いた脱水縮合反応によ
り実施される。この脱水縮合反応は、適当な不活性溶媒
、例えばジメチルスルホキシド（Ｍｅ２！３０）−アセ
トニトリル（ＣＨ３ＣＮ）−水（１１２０） （３：２
：５）の混合溶媒中、０℃〜室温にて３〜１２時間で好
適に進行する。
このようにして得られるミリストイルグリシン抗原によ
る抗体の作製は、常法に従い該抗原を哺乳動物に投与し
生体内に産生される抗体を採取する方法を採用できる。
る抗体の作製は、常法に従い該抗原を哺乳動物に投与し
生体内に産生される抗体を採取する方法を採用できる。
抗体の製造に供される噴孔動物としては特に制限はなく
例えばウサギ、モルモット、マウス、ヒツジ、ヤギ等を
例示できる。
例えばウサギ、モルモット、マウス、ヒツジ、ヤギ等を
例示できる。
抗体の産生は例えば上記抗原の所定量を生理食塩水で適
当濃度に希釈し、これにフロイントの完全アジュバント
等のアジュバントを混合し、得られる懸濁液を投与する
ことにより行われる。上記投与は皮下、筋肉、腹腔内、
静脈内、経口等好ましくは皮下、腹腔内、静脈内経路で
行われる。また、投与回数、投与量等は常法に従い適宜
に決定できる。抗体の採取は上記懸濁液の最終投与後抗
体が多量産生される時期、通常、上記最終投与の１〜２
週間経過後免疫化された動物から採血し、これを遠心分
離後血清を分離採取することにより行われる。また、上
記血清は更に塩析、吸収法、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の通常の精製手段により精製してもよい。
当濃度に希釈し、これにフロイントの完全アジュバント
等のアジュバントを混合し、得られる懸濁液を投与する
ことにより行われる。上記投与は皮下、筋肉、腹腔内、
静脈内、経口等好ましくは皮下、腹腔内、静脈内経路で
行われる。また、投与回数、投与量等は常法に従い適宜
に決定できる。抗体の採取は上記懸濁液の最終投与後抗
体が多量産生される時期、通常、上記最終投与の１〜２
週間経過後免疫化された動物から採血し、これを遠心分
離後血清を分離採取することにより行われる。また、上
記血清は更に塩析、吸収法、アフィニティークロマトグ
ラフィー等の通常の精製手段により精製してもよい。
かくして、調製された抗体は蛋白質のミリストイルグリ
シン部位を特異的に識別し得る抗体である０本発明者ら
の研究によれば、ミリストイルグリジン部位を特異的に
識別できる当該抗体の利用により、特定の蛋白質中のミ
リストイルグリシン部位を容易に検出し得ることが判明
した。従って、本発明番こよって得られる抗体の利用は
細胞の形質転換をはじめとする、蛋白質のミリストイル
化が意味する生物学的な機能、更には種々の病態と蛋白
のミリストイル化との関連を解明するに際して大きな武
器となるばかりではなく、疾患の診断や予防及び治療へ
の応用という観点から極めて価値あるものである。
シン部位を特異的に識別し得る抗体である０本発明者ら
の研究によれば、ミリストイルグリジン部位を特異的に
識別できる当該抗体の利用により、特定の蛋白質中のミ
リストイルグリシン部位を容易に検出し得ることが判明
した。従って、本発明番こよって得られる抗体の利用は
細胞の形質転換をはじめとする、蛋白質のミリストイル
化が意味する生物学的な機能、更には種々の病態と蛋白
のミリストイル化との関連を解明するに際して大きな武
器となるばかりではなく、疾患の診断や予防及び治療へ
の応用という観点から極めて価値あるものである。
以下、実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。
実施例 １
［抗原の製造例］
水、溶性のカルボジイミド５．７鳳ｇ（３０μａ＋ｏｌ
）をＮ−ミリストイルグリシン５．６ｍｇ（２０μｍｏ
ｌ）の５０χジメチルスルホキシド溶液１０ｍ１に加え
、室温で５分間反応させた０次にこの活性化されたＮ−
ミリストイルグリシンをヘモシアニン３０１ｇを溶解し
た混合溶媒Ｍｅ２ＳＯ−ＣＨｓＣＮ−１１２０（３：２
：５：） ２５ｍ１Ｇこ加え撹拌し室温で一晩反応させ
た。不溶性物質を遠心操作（１８０００Ｘｇ、 １５分
間、４℃）で除去し、上清を脱イオン水で３日間透析後
、凍結乾燥した。かくして、目的とする抗原Ｎ−ミリス
トイルグリシルヘモシアニンが得られた。Ｎ−ミリスト
イルグリシンと牛血清アルブミンの反応も同様の操作で
おこなった。
）をＮ−ミリストイルグリシン５．６ｍｇ（２０μｍｏ
ｌ）の５０χジメチルスルホキシド溶液１０ｍ１に加え
、室温で５分間反応させた０次にこの活性化されたＮ−
ミリストイルグリシンをヘモシアニン３０１ｇを溶解し
た混合溶媒Ｍｅ２ＳＯ−ＣＨｓＣＮ−１１２０（３：２
：５：） ２５ｍ１Ｇこ加え撹拌し室温で一晩反応させ
た。不溶性物質を遠心操作（１８０００Ｘｇ、 １５分
間、４℃）で除去し、上清を脱イオン水で３日間透析後
、凍結乾燥した。かくして、目的とする抗原Ｎ−ミリス
トイルグリシルヘモシアニンが得られた。Ｎ−ミリスト
イルグリシンと牛血清アルブミンの反応も同様の操作で
おこなった。
実施例 ２
［抗体の製造例］
実施例１で得たＮ−ミリストイルグリシルヘモシアニン
０．１鵬ｇを含むフロイント完全補助液懸濁液をウサギ
に投与した。最終の投与から７日後に採血し、遠心分離
して抗血清を採取して目的の抗体を得た。さらに、この
血清よりＮ−ミリストイルグリシルＢＳＡを結合したア
フィニティークロマトグラフィーによって抗体の特異精
製を行った。
０．１鵬ｇを含むフロイント完全補助液懸濁液をウサギ
に投与した。最終の投与から７日後に採血し、遠心分離
して抗血清を採取して目的の抗体を得た。さらに、この
血清よりＮ−ミリストイルグリシルＢＳＡを結合したア
フィニティークロマトグラフィーによって抗体の特異精
製を行った。
実施例 ３
く抗体の特異性試験〉
以下、抗体の特異性試験例につき詳述する。
（１）放射標識されたＮ−ミリストイルグリシル［１”
１ｌＢｓＡと当該抗体との結合によって抗体の特異性を
検討した。即ち、４０μ＋ ＜７５０００ｃｐｍ）のＮ
−ミリストイルグリシル［＋”Ｉ］ＢＳＡ、５０μ１（
１０μｇ）の当該抗体、及び種々の濃度のＮ−ミリスト
イルグリシルＢＳＡを含む３０μｌのエフェクター溶液
の混合反応液を室温で３０分間反応させた０反応終了後
、５０μｍの！Ｊｔａｐｈ＾（Ｓｔａ ｈ Ｉｏｃｏｃ
ｕｓＬＬｔｉｌ！ｊＣｏｗａｎ ５ｔｒａｉｎ Ａ）を
加えて室温で１０分間反応させた。更に１０００μＩの
バッファーを加え室温で１０分間経過後、反応液を１２
８００ Ｘｇで１分間遠心処理した。生じた、沈渣をバ
ッファーで５回洗浄後、ガンマ−カウンターで放射活性
を測定した。
１ｌＢｓＡと当該抗体との結合によって抗体の特異性を
検討した。即ち、４０μ＋ ＜７５０００ｃｐｍ）のＮ
−ミリストイルグリシル［＋”Ｉ］ＢＳＡ、５０μ１（
１０μｇ）の当該抗体、及び種々の濃度のＮ−ミリスト
イルグリシルＢＳＡを含む３０μｌのエフェクター溶液
の混合反応液を室温で３０分間反応させた０反応終了後
、５０μｍの！Ｊｔａｐｈ＾（Ｓｔａ ｈ Ｉｏｃｏｃ
ｕｓＬＬｔｉｌ！ｊＣｏｗａｎ ５ｔｒａｉｎ Ａ）を
加えて室温で１０分間反応させた。更に１０００μＩの
バッファーを加え室温で１０分間経過後、反応液を１２
８００ Ｘｇで１分間遠心処理した。生じた、沈渣をバ
ッファーで５回洗浄後、ガンマ−カウンターで放射活性
を測定した。
種々の濃度のＮ−ミリストイルグリシルＢＳＡ（非標識
）がＮ−ミリストイルグリシル［１２Ｓｉ］ＢＳＡと当
該抗体との結合（免疫沈澱法）に及ぼす阻害効果につい
て得られた結果を第１図に示す。
）がＮ−ミリストイルグリシル［１２Ｓｉ］ＢＳＡと当
該抗体との結合（免疫沈澱法）に及ぼす阻害効果につい
て得られた結果を第１図に示す。
Ｎ−ミリストイルグリシルＢＳＡ （−・−で示す）の
濃度が増加するにつれてＮ−ミリストイルグリシル［ｌ
２ＳＩ］ＢＳＡと当該抗体との結合比は減少した。
濃度が増加するにつれてＮ−ミリストイルグリシル［ｌ
２ＳＩ］ＢＳＡと当該抗体との結合比は減少した。
一方、Ｎ−ミリストイルグリシン部位を有していないコ
ントロールのＢＳＡ（−０−で示す）ではこのような阻
害効果は認められない、これらの結果は当該抗体が蛋白
のＮ−ミリストイルグリシン部位を識別していることを
強く支持する。
ントロールのＢＳＡ（−０−で示す）ではこのような阻
害効果は認められない、これらの結果は当該抗体が蛋白
のＮ−ミリストイルグリシン部位を識別していることを
強く支持する。
（２）当該抗体を結合させたアフィニティーカラムにＮ
−ミリストイルグリシルＢＳＡを通液すると、これらは
カラムに吸着し、１０ｈＭグリシンバッファーｐＨ３，
０の条件で溶出される。一方、コントロールのＢＳＡは
同条件で吸着されることなく素通りする（第２図Ａ 参
照）、また、Ｎ−ミリストイルグリシンを結合したアフ
ィニティーカラムにより抗血清から当該抗体を吸着させ
精製することもできる（第２図Ｂ 参照）。
−ミリストイルグリシルＢＳＡを通液すると、これらは
カラムに吸着し、１０ｈＭグリシンバッファーｐＨ３，
０の条件で溶出される。一方、コントロールのＢＳＡは
同条件で吸着されることなく素通りする（第２図Ａ 参
照）、また、Ｎ−ミリストイルグリシンを結合したアフ
ィニティーカラムにより抗血清から当該抗体を吸着させ
精製することもできる（第２図Ｂ 参照）。
実施例４
［当該抗体を用いたミリストイル化蛋白の検出及び分析
］ レトロウィルス感染による細胞への影響と蛋白質のミリ
ストイル化との関連を調べるモデルとして、動物レトロ
ウィルス（ラウス肉腫ウィルス；Ｒ３Ｖ）を感染させ形
質転換したトリ胎児繊維芽細胞より、当該抗体をリガン
ドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いてミ
リストイル化蛋白を検出し、該蛋白の性状を解析した。
］ レトロウィルス感染による細胞への影響と蛋白質のミリ
ストイル化との関連を調べるモデルとして、動物レトロ
ウィルス（ラウス肉腫ウィルス；Ｒ３Ｖ）を感染させ形
質転換したトリ胎児繊維芽細胞より、当該抗体をリガン
ドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いてミ
リストイル化蛋白を検出し、該蛋白の性状を解析した。
その結果、これらは感染させたウィルスに由来するｓｒ
ｃｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔに相当することが明かとな
り、さらに、これらのＮ末端アミノ酸配列を推定するこ
とができた。
ｃｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔに相当することが明かとな
り、さらに、これらのＮ末端アミノ酸配列を推定するこ
とができた。
Ｒ３Ｖを感染させ形質転換した細胞（３ＸＩＯ”個）を
リンＷＪｉＭ衝食塩水（ＰＢＳ）で速やかに５回洗浄し
た０次に細胞を凍結・融解しピペットで細砕後、遠心処
理（２７００ｘ ｇ、 ２０分）してペレットを集めた
。ベレットを０．１χのトリトンＸ−１００を含むＰＢ
Ｓ中で超音波処理して可溶化し、これを遠心処理（１５
００ｘｇ、 １５分）して上清を得た。この上清につい
てクロロホルム・メタノール （２：１）の混合溶媒で
脱脂後、ヒドロキシルアミンを伴用させて酸素あるいは
イオウ原子に脂肪酸がアシル化した蛋白を除去した。引
き続き３日間ＰＢＳで透析後、当該抗体を結合させたア
フィニティーカラムに通液した。吸着した蛋白質は １
００ｍ１４グリシンバツフアーｐＨ３，０で溶出するこ
とができ、 引続き脱イオン水で３日間透析した。
リンＷＪｉＭ衝食塩水（ＰＢＳ）で速やかに５回洗浄し
た０次に細胞を凍結・融解しピペットで細砕後、遠心処
理（２７００ｘ ｇ、 ２０分）してペレットを集めた
。ベレットを０．１χのトリトンＸ−１００を含むＰＢ
Ｓ中で超音波処理して可溶化し、これを遠心処理（１５
００ｘｇ、 １５分）して上清を得た。この上清につい
てクロロホルム・メタノール （２：１）の混合溶媒で
脱脂後、ヒドロキシルアミンを伴用させて酸素あるいは
イオウ原子に脂肪酸がアシル化した蛋白を除去した。引
き続き３日間ＰＢＳで透析後、当該抗体を結合させたア
フィニティーカラムに通液した。吸着した蛋白質は １
００ｍ１４グリシンバツフアーｐＨ３，０で溶出するこ
とができ、 引続き脱イオン水で３日間透析した。
かくして得られた蛋白について５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びイムノトラ
ンスブロッティングアッセイをほどこすと各々６０に、
５５）［及びイムノトランスブロッティングにおいて
はこれに加えて２８にの分子量を有する蛋白が検出され
た。これらの結果により６（ＩＫ蛋白は細胞に感染させ
たウィルスに由来するｓｒｃ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ
即ちｐ６０ｓ′Ｃに相当し、５５及び２１１１に蛋白は
ｐ （、Ｑ ＠ ｒ Ｏの分解生成物が検出されている
ことが明らかになった。（第３図参照） 検出された蛋白をトリプシン消化し、このうちＮ−ミリ
ストイルグリシルペプチドに関して、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、更にこれらの
アミノ酸配列を推定したところｓｒｃ ｇｅｎｅ ｐｒ
ｏｄｕｃｔ、 ｐ６０”Ｃの既知のアミノ末端部分の配
列に一致する結果が得られた。
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びイムノトラ
ンスブロッティングアッセイをほどこすと各々６０に、
５５）［及びイムノトランスブロッティングにおいて
はこれに加えて２８にの分子量を有する蛋白が検出され
た。これらの結果により６（ＩＫ蛋白は細胞に感染させ
たウィルスに由来するｓｒｃ ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔ
即ちｐ６０ｓ′Ｃに相当し、５５及び２１１１に蛋白は
ｐ （、Ｑ ＠ ｒ Ｏの分解生成物が検出されている
ことが明らかになった。（第３図参照） 検出された蛋白をトリプシン消化し、このうちＮ−ミリ
ストイルグリシルペプチドに関して、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、更にこれらの
アミノ酸配列を推定したところｓｒｃ ｇｅｎｅ ｐｒ
ｏｄｕｃｔ、 ｐ６０”Ｃの既知のアミノ末端部分の配
列に一致する結果が得られた。
上記のごとく、当該抗体の利用は細胞成分がらのミリス
トイル化蛋白を選択的にしかも容易に分離することを可
能とし、該蛋白の性状解析を行うのに極めて有用である
。
トイル化蛋白を選択的にしかも容易に分離することを可
能とし、該蛋白の性状解析を行うのに極めて有用である
。
第１図は本発明により得られる抗体の特異性を示すもの
であり、第２図は当該抗体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーの結果を示す、また第３図は当該抗体を
用いて検出した蛋白の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果
を示す。
であり、第２図は当該抗体を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーの結果を示す、また第３図は当該抗体を
用いて検出した蛋白の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果
を示す。
Claims (1)
- （１）ミリストイルグリシンとキャリアー蛋白との複合
体からなる抗原を哺乳動物に投与し、生成する抗体を採
取することによって得られる蛋白のミリストイルグリシ
ン部位を識別する抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62255811A JP2524505B2 (ja) | 1987-10-10 | 1987-10-10 | ミリストイルグリシン部位を識別する抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62255811A JP2524505B2 (ja) | 1987-10-10 | 1987-10-10 | ミリストイルグリシン部位を識別する抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0197861A true JPH0197861A (ja) | 1989-04-17 |
| JP2524505B2 JP2524505B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=17283953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62255811A Expired - Lifetime JP2524505B2 (ja) | 1987-10-10 | 1987-10-10 | ミリストイルグリシン部位を識別する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2524505B2 (ja) |
-
1987
- 1987-10-10 JP JP62255811A patent/JP2524505B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2524505B2 (ja) | 1996-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bennich et al. | Structure and function of human immunoglobulin E | |
| EP0005271A2 (en) | Method and kit for enzyme immunoassay of biological substances | |
| JPS61172064A (ja) | 変性されたタンパク質分析物、とくにＨｂ Ａ↓１ｃの免疫アツセイ、およびそれに対する抗体 | |
| JPH03103163A (ja) | 食品劣化防止剤 | |
| JPH03504975A (ja) | 異種官能性細胞免疫剤、それを含有するワクチン及びその使用方法 | |
| JPS63126496A (ja) | プロコラ−ゲン・ペプチド（３型）特異抗血清の製法 | |
| JPS59119264A (ja) | 非酵素的にグルコシル化された蛋白質及び蛋白質フラグメントの測定用免疫試験方法、それに用いる試薬系、試験キツト、試験具及び抗体並びにそれに関連した免疫原 | |
| US4264571A (en) | Radioimmunoassay of thymosin α1 | |
| JPS5928864B2 (ja) | バルビツ−ル酸抗原およびそれに対して特異な抗体 | |
| Lenkei et al. | Methods for detection of anti-albumin autoantibodies in hepatic diseases | |
| JPH09222428A (ja) | 検量体が、サンドイツチ免疫アツセイで用いられる抗体の一つに対する抗体及び被検体の配列からなる、該アツセイにおいて使用するための合成検量体の調製方法 | |
| EP0313156B1 (en) | Snrnp-a antigen and fragments thereof | |
| RU2141969C1 (ru) | Антигенные пептиды, способ обнаружения выделяемых опухолями частиц | |
| CN101466732B (zh) | Iv型胶原样免疫反应性多肽 | |
| JP2875226B2 (ja) | 原発性胆汁肝硬変自己抗原 | |
| JP2524505B2 (ja) | ミリストイルグリシン部位を識別する抗体 | |
| JPH083486B2 (ja) | 体液中の基底膜コラーゲンの測定法及び基底膜コラーゲン―ドメインｎｃ１に対する抗体の検出法 | |
| EP0308242B1 (en) | Agglutination assay | |
| Causey et al. | Detection of low affinity interactions between peptides and heat shock proteins by chemiluminescence of enhanced avidity reactions (CLEAR) | |
| JPH0748071B2 (ja) | ｈＡＮＰ抗体及びｈＡＮＰの免疫学的測定法 | |
| JPS6311626B2 (ja) | ||
| EP0357637B1 (en) | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use | |
| JPH02503033A (ja) | インビトロ診断法およびそのために有用な手段 | |
| EP0446797B1 (de) | Synthetische Peptide, die Sequenzen aus Faktor VIIa enthalten und deren Verwendung | |
| KR920010224B1 (ko) | 응집반응 측정법 |