JPH0748071B2 - ｈＡＮＰ抗体及びｈＡＮＰの免疫学的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（huma
n Atrial Natriuretic Polypeptide,以下、hANPとい
う）抗体及びhANP抗体を用いるhANPの免疫学的測定法に
関する。

［従来の技術］ ANPは、心房から分泌されて血液中を循環するホルモン
であり、生体の血圧及び体液量の調節に重要な働きをし
ていることが明らかになっている。また、ANPが単に腎
循環器系に作用するだけでなく、脳内にも存在し、神経
ペプチドとして作動する可能性を示す知見も得られてい
る。

ヒト心房（剖検組織）のANPを分離精製した結果、ヒト
心房中には分子量約3Kのα型、約6Kのβ型及び13Kのγ
型の３種のhANPが存在することが明らかにされ、それら
の構造も決定された。

α型hANP（以下、α−hANPという）は28個のアミノ酸か
らなる一本鎖のペプチドであり、分子内にＳ−Ｓ結合を
有している。α−hANPは血液中のANP主成分である。

β型hANP（以下、β−hANPという）は、α−hANPの逆平
行２量体という特異構造をもっていて、α−hANPの約1/
5の利尿、降圧及び平滑筋弛緩活性を有している。

γ型hANP（以下、γ−hANPという）は、アミノ酸126個
からなる高分子蛋白質で、そのＣ末端部分（99−126）
にα−hANP構造を有している。

ところで、従来、生理活性物質は、その活性を指標にそ
の動態を調べられてきた。ANPに限らず生理活性を指標
に測るものはすべてこれにあてはまる。（例えば、サイ
トカイン類等）。hANPの場合は、平滑筋弛緩作用などを
指標に単離、精製が行なわれてきた。しかしながら、こ
の方法は煩雑で技術的に熟練を必要とする。従って、こ
の様な欠点を改良できる方法として免疫学的測定法の開
発が必要となる。かかる測定法にはhANP抗体が必要であ
り、従来から各種のhANP抗体が知られている（例えば、
特開昭61−53299号公報中のCR−３、同61−227597号公
報中の23M−D9、同62−211555号公報、WO86−6742号公
報、特開昭64−61500号公報中のKY−ANP−１等参照）。

しかし、従来のhANP抗体には下記のような問題点があ
る。

認識部位について詳細に言及されていない。

従来はＣ末端部、リング部及びＮ末端部を個々に認識
する抗体のみで、特異性の違いにより測定値に解離が認
められていた。

そこで、生理活性を有する構造、すなわち、hANP分子内
のジスルフィド結合（構造）及びＣ末端のTyr（28）を
同時に認識する抗体が望まれている。

［発明が解決しようとする課題］ そこで、本発明者らは上記事情に鑑み、各種検討を行っ
た結果、hANP分子中の特定のアミノ酸配列にのみ特異的
に反応しうるhANP抗体を見出した。さらに、このhANP抗
体を用いることによりhANPを高感度に検出できることを
も見出して本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 上記の課題を解決すべくなされた本発明のhANP抗体は、
α−hANP分子中の少なくともTyr（28）、Cys（７）−Cy
s（23）間のジスルフィド結合及びCys（７）〜Met（1
2）を抗原として認識することを特徴とするものであ
り、また本発明のhANPの免疫学的測定法は、上記の性状
を有するhANP抗体を用いてなることを特徴とするもので
ある。

上記の構成からなる本発明において、hANP抗体は通常の
抗体産生法により調整することができ、hANP抗体を調製
するための免疫源は抗原そのもの又はハプテン抗原が用
いられる。

該抗原としてはhANP又はその断片等が挙げられる。hANP
の好ましい例はα−hANPである。α−hANPは液相による
ペプチド合成法又はPeptide Chemistry,241（1984）で
開示された方法により調製できる。また、市販品を利用
することもできる。また、hANP断片としてはα−hANP
（４−28）、同（５−28）あるいは同（７−28）等が用
いられる。

一方、ハプテン抗原の場合は、抗原をキャリアーに結合
させたものを免疫源として用いる。キャリアーは公知の
ものが用いられ、例えば、ウシ血清アルブミン、ウマ血
清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、ヒツジ血清アル
ブミン、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン類；ウ
シ血清グロブリン、ウマ血清グロブリン、ウサギ血清グ
ロブリン、ヒト血清グロブリン等の血清グロブリン類；
ウシチログロブリン、ウマチログロブリン、ウサギチロ
グロブリン、ヒトチログロブリン等のチログロブリン
類；ウシヘモグロビン、ウマヘモグロビン、ヒトヘモグ
ロビン等のヘモグロビン類；キーホールリンペットヘモ
シアニン等のヘモシアニン類などが挙げられる。

また、ハプテン抗原の調製方法は公知の手法がいずれも
用いられ、例えば、抗原とキャリアーとを結合剤を用い
て結合させる方法等が挙げられる。ここで使用される結
合剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、マロンジ
アルデヒド、スクシンジアルデヒド等のジアルデヒド
類;N,N′−ｏ−フェニルレンジマレイミド、N,N′−ｍ
−フェニレンジマレイミド等のジマレイミド類；ジシク
ロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等のカルボジ
イミド類などが挙げられる（例えば、Biochem.Biophys.
Res.Commun.,129,248−255（1984）等参照）。

本発明のhANP抗体はポリクローナル抗体又はモノクロー
ナル抗体のいずれでもよい。

ポリクローナルhANP抗体は、高度に精製したhANPを動物
に免役し、得られた血清から回収・精製することによっ
て得られる。

該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば、高度精製hANPとフロインドの完全アジュバントとの
混合乳液を作り、動物の皮内に２〜３回注射し、最終免
疫の数日後採血を行ない、室温で凝固せしめた後、４℃
で一夜放置した後、3,000rpm、20分間の遠心分離により
抗血清（hNAP抗体）が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。該抗血清の精製は、例えば、トリクロロ−
トリフルオロエタンを用いて、血清を脱脂清澄化した
後、J.Am.Chem.Soc.,62,3386（1940）,Fed.Proc.,17,11
61（1958）に記載の方法にて行なわれる。

一方、モノクローナルhANP抗体は細胞融合法により得る
ことができる。細胞融合法は自体既知の手段にて行なわ
れ、その一例は増殖性を持った細胞と目的とする抗体を
産生しているリンパ球とをポリエチレングリコールの存
在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体産生能と
を同時に兼ねそなえた細胞を製するもので、この細胞の
産生する抗体は一個の抗原決定基に対してのみ反応する
単一の抗体である。より具体的には、増殖性を持つ細胞
としてマウスミエローマ細胞を、抗体産生リンパ球とし
てhANPで免疫されたマウス脾臓細胞（Ｂ細胞）を用いて
融合させ、さらに目的とする抗体を産生している細胞を
スクリーニングして、hANPのモノクローナル抗体を得
る。

回収した抗体の精製方法は公知の手法により行なわれ
る。例えば、硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交換体に
よる処理法、ゲル濾過法、プロテインＡを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィー法等が挙げられる。

かくして得られる本発明抗体は、hANP分子中、特にα−
hANP分子中の少なくともTyr（28）、Cys（７）−Cys（2
3）間のジスルフィド結合及びCys（７）〜Met（12）の
３カ所を認識する。

従って、本発明抗体は、環状構造を形成し、Ｃ末端のTy
r（28）を有するANPと反応しうる。具体的には、α−hA
NP、Met［０］型α−hANP及びβ−hANPとは反応する。
また、α−hANP（１−28）、同（５−28）及び同（７−
28）とは反応するが、α−hANP（１−10）、同（13−2
8）、同（18−28）及び同（５−27）とは反応しない。

また、本発明抗体はIgクラスIgG、分子量15万〜16万、
等電点5.8〜7.3等の性質を有する。

本発明抗体は、心疾患又は腎不全の診断、治療効果の判
定、電解質（特にナトリウムイオン等）のモニターリン
グ等の臨床検査用試薬として用いることができる。

また、hANPの検出、精製度合の測定等の生理学用又は薬
理学用の試薬として用いることもできる。

本発明のhANPの免疫学的測定法は、前記の本発明hANP抗
体を用いて免疫学的測定法によりhANPを測定（定量又は
半定量）する方法である。かかる測定法に用いられる免
疫学的測定法としては、従来より抗原抗体反応を利用す
る免疫学的測定法として公知の手法のいずれも用いるこ
とができ、例えば、酵素免疫測定法（EIA法）、放射性
免疫測定法（RIA法）、赤血球凝集試験測定法（PHA法）
等が挙げられる。また、上記各測定法において、測定様
式として、例えば、競合法、サンドイッチ法、二抗体法
等の様々な方法が知られているが、これらのいずれの方
法も適用することができる。これらの免疫学的測定法及
びその具体的な実施方法については、例えば、石川ら編
「酵素免疫測定法」（1978年医学書院刊行）、入江編
「ラジオイムノアッセイ」（1974年講談社刊行）等に詳
細に記載されている。

より具体的に放射性免疫測定法を例にとって説明する
と、本発明の免疫学的測定法を用いるhANP定量用キット
の態様としては、 (1)hANP抗体、第二抗体（IgG抗体）、放射性物質標識α
−hANP、標準α−hANP、沈澱促進剤（Ｂ・Ｆ分離剤）及
び緩衝液よりなるhANP定量用キット； (2)hANP抗体を固定化した不溶性担体、放射性物質標識
α−hANP、標準α−hANP及び緩衝液よりなるhANP定量用
キット； 等が例示される。

上記のキットにおいて、標準α−hANPは、後述する標準
検量線を作成するために用いられるものであり、通常は
α−hANPの凍結乾燥品よりなるものである。標準α−hA
NPは緩衝液に溶解して使用され、この際、例えば、１〜
10,000pg/0.1mlとなるように４〜５濃度段階まで小分け
して標準検量線の作成に使用される。

放射性物質標識α−hANPとしては、例えば、¹²⁵I標識し
たものが好ましいものとして挙げられ、α−hANP1mmol
当り、例えば¹²⁵Iであれば100TBq以下程度の比放射活性
が適当である。放射性物質標識α−hANPは、α−hANPを
自体既知の方法、例えば、クロラミンＴ法、ラクトペル
オキシダーゼと過酸化水素水を用いるラクトペルオキシ
ダーゼ法等にて標準化することによって作製することが
できる。

上記のキットで使用される緩衝液は抗原抗体反応用のも
ので、特にpHが６〜９、塩濃度が0.01〜0.2M程度のもの
が好ましい。具体的には、例えば、0.1Mリン酸塩緩衝化
生理食塩液、pH7のものが挙げられる。

また、第二抗体はIgGに対する抗体であり、hANP抗体が
由来する同種動物のIgGに対する抗体であることが好ま
しい。更にまた、ブドウ球菌から得られるプロテインＡ
又はプロテインＧを第２抗体とともに用いることもでき
る。

沈澱促進剤はデキストラン、ポリエチレングリコール等
が例示される。好ましくは分子量1,000〜10,000程度の
ポリエチレングリコール等が挙げられる。沈澱促進剤は
第二抗体と予め混和しておいてもよい。

また、hANP抗体を固定化した不溶性担体に関し、不溶性
担体としては、セルロース、デキストラン、セファデッ
クス等の多糖類、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプ
ラスチック類、合成繊維、ガラス、セラミック等及びこ
れらの材料にアミノ基、カルボキシ基等の官能基を導入
した材料が挙げられる。これらの材料の形状は特に限定
されないが、測定操作の便宜性等からマイクロプレー
ト、マプラスチックチューブ、プラスチックボール等が
好ましい。hANP抗体の不溶性担体への固定化は常法によ
り行うことができ、例えば、吸着法、イオン結合法、共
有結合法（例えば、カルボジイミド法、グルタルアルデ
ヒド法、ブロムシアン活性化法等）などが挙げられる。

次に、本発明の免疫学測定法の一例として、第二抗体を
用いる場合の測定操作法を具体的に説明すると、まず、
被検液をhANP抗体とプレインキューベーションさせ、次
いで放射性物質標識α−hANPを遅延添加してインキュー
ベーションする。その後、第二抗体及び沈澱促進剤より
なる懸濁液を添加し、沈澱物（抗原抗体結合物）と上清
を分離し、それぞれの放射能測定を行う。以下、常法に
従い、沈澱物の放射能（Ｂ）と上清及び沈澱物の放射能
の和（Ｔ）からB/T値を求め、予め作成した標準曲線
（検量線）から被検液中のhANP含量を求める。なお、標
準曲線は、上記の方法において、被検液の代りに濃度既
知の標準α−hANP試料を用いて、同様な操作によりB/T
値を求め、hANP濃度に対してB/T値をプロットすること
により得られる。

なお、本発明のhANPの免疫学的測定法は上記の放射性免
疫測定法に限定されるものではなく、公知の免疫学的測
定法のいずれの方法にても行うことができる。例えば、
上記の放射性免疫測定法においては、抗原抗体反応を液
相にて行っているが、hANP抗体を固定化した不溶性担体
を用い、ここに被検液及び放射性物質標識α−hANPを添
加して抗原抗体反応を行い、次いで洗浄によりＢ・Ｆ分
離を行い、固相上に残存した放射性物質標識α−hANPの
放射能を測定する方法であってもよい。また、放射性物
質標識α−hANPの代りに、放射性物質標識hANP抗体を用
いるサンドイッチ法により測定を行ってもよい。さらに
は、上記の放射性物質標識α−hANP及び放射性物質標識
hANP抗体に代え、酵素標識α−hANP及び酵素標識hANP抗
体を用い、標識活性の測定法として酵素と基質との反応
度（反応量、反応速度等）を測定する酵素免疫測定法に
より測定を行ってもよい。かかる測定法に用いられる標
識酵素と基質との組み合わせとしては、例えば、ペルオ
キシダーゼと過酸化水素及びｏ−フェニレンジアミンと
の組み合わせ、β−ガラクトシダーゼとｏ−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−ガラクトシドとの組み合わせ、アルカリ
ホスファターゼとｐ−ニトロフェニルホスフェートとの
組み合わせ等が挙げられる。

なお、本発明のhANPの免疫学的測定法の対象となる検体
としては、被検者の血液が挙げられるが、これに限定さ
れるものではない。

［発明の効果］ 本発明の抗体は、環状構造を形成し、Ｃ末端のTyr（2
8）を有するANPと反応するという特徴を有する。このた
め、生体試料中のANPを測定する場合、特別な抽出操作
等を行うことなく、高感度に測定することが可能とな
る。

特に、α−hANPの測定に有用である（生体中では、α−
hANP自身、α−hANP（４−28）、同（５−28）の形をと
って活性を示すことが知られている）。また、β−hANP
の測定も可能であり、その生理学的意義の解明に有用で
ある。

［実施例］ 本発明をより詳細に説明するために実施例及び実験例を
挙げて説明するが、本発明はこれらによって何ら限定さ
れるものではない。

実施例１ 特異抗血清の作製 (1)免疫源の調製 水溶性カルボジイミド法にてハプテン抗原を調製した。
α−hANP（１−28）3.5mgとウシチログロブリン29.4mg
を2.0mlの10mMPBS（pH7.2）に溶解し、１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドの
メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩35mgを含む蒸溜水1.0m
lを加え、室温にて20時間静かに撹拌した。反応液はセ
ントリコン10を用い緩衝液交換を行った。α−hANP−ウ
シチログロブリン抱合体は除菌濾過後−20℃で保存し
た。

(2)免疫 上記(1)で得られたα−hANP−ウシチログロブリン抱合
体とH37Ra完全アジュバントとを等量混合しW/O型エマル
ジョンを調製した。免疫は日本白色種家兎の指掌部へ１
匹あたり100μｇの抗原量を皮下注射した。追加免疫
は、液状同量を背部皮内へ２週間から数ケ月間隔で行っ
た。最終投与後、数日してから採血し、以下、常法に従
って、抗血清を得た。

放射性物質標識α−hANP ラクトペルオキシダーゼ法を用いて¹²⁵I−α−hANP（〜
74TBq/mmol）を調製した。

交叉性試験 交叉反応性は、¹²⁵I−α−hANP（１−28）を用いて、α
−hANP（１−28）［ｘ］及び各種フラグメント［ｙ］の
用量反応曲線を作成し、¹²⁵I−α−hANP（１−28）との
結合率を50％阻害するｘ量とｙ量との比率［（x/y）×1
00］で算出した。

アッセイは¹²⁵I−α−hANPを遅延添加する方法で行っ
た。RIA用緩衝液で標準α−hANP（１−28）及び各種フ
ラグメントの各希釈系列を作製し、その0.1mlを、また
適宜希釈した抗α−hANP血清を0.1mlそれぞれアッセイ
チューブへ添加し４℃20時間静置した。次に約10,000cp
mの放射能を有する¹²⁵I−α−hANP（１−28）0.1mlを添
加しさらに４℃20時間静置した。Ｂ・Ｆ分離は抗家兎Ig
Gヤギ血清を含む沈澱試薬1.0mlを加え４℃15分間静置す
ることにより行い、沈澱物の放射能をガンマカウンター
にて測定した。

その結果を第１表に示す。

実施例２ 試薬の調製 (1)α−hANP抗体 実施例１に準じて調製したウサギ由来α−hANP抗血清を
用いる。

(2)標準α−hANP 精製α−hANP溶液（2560pg/ml）。

用時に緩衝液で倍率稀釈し、2560、1280、640、320、16
0、80、40、20、10pg/mlに調整する。

(3)放射性物質標識α−hANP 実施例１と同様にして調製した¹²⁵I−α−hANP（〜74TB
q/mmol）を用いた。

(4)第二抗体 組成は以下の通りである。

沈澱促進剤 PEG6000 第二抗体 ヤギ由来抗ウサギIgG抗体 (5)緩衝液 0.15M塩化ナトリウム加10mMリン酸緩衝液（pH7.0） 測定操作方法 標準α−hANP液又は被検液0.1mlとhANP抗血清0.1mlと攪
拌し、２〜８℃で20時間静置する。次いで、¹²⁵I−α−
hANP0.1mlを添加し、攪拌した後、２〜８℃で20時間静
置する。反応液に、第二抗体1.0mlを加え、攪拌した
後、２〜８℃で15分間静置する。次いで、２〜８℃、3,
0000rpmの条件下に15分間遠心分離を行い、Ｂ・Ｆ分離
を行い、沈澱物及び上清の放射能を測定し、B/T値を算
出する。標準α−hANP液の測定値から標準曲線を作成
し、該標準曲線に基き、被検液の測定値から被検液中の
hANP含量を求める。

測定結果 (1)測定感度 ゼロ濃度の標準溶液（緩衝液）における結合％の2SD下
限において感度の検討を行った結果、測定感度は10pg/m
l以下であった。

(2)健常人における血中濃度 健常人における血中hANP濃度を調べた。その結果を第２
表に示す。

フロントページの続き (72)発明者 張 宗哲 千葉県佐倉市大作１丁目８番５ 株式会社 ミドリ十字佐倉工場内 (72)発明者 近江 昭一 千葉県佐倉市大作１丁目８番５ 株式会社 ミドリ十字佐倉工場内 (72)発明者 風早 康弘 千葉県佐倉市大作１丁目８番５ 株式会社 ミドリ十字佐倉工場内 (72)発明者 林 友二郎 群馬県邑楽郡千代田町大字赤岩字くらかけ 2716―１ サントリー株式会社医薬センタ ー内 (72)発明者 寺野 由剛 大阪府三島郡島本町若山台１―１―１ サ ントリー株式会社生物医学研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−53299（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−61500（ＪＰ，Ａ) Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，218（１）, Ｐ．159−162，（1987) Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，43（９）, Ｐ．761−768，（1988) Ｋｉｍｉｓｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈ ｎ’ｆｔ，65，Ｐ．533−537，（1987)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】α型ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチ
   ド分子中の少なくともTyr（28）、Cys（７）−Cys（2
   3）間のジスルフィド結合及びCys（７）〜Met（12）を
   抗原として認識することを特徴とするヒト心房性ナトリ
   ウム利尿ポリペプチド抗体。
2. 【請求項２】請求項１記載のヒト心房性ナトリウム利尿
   ポリペプチド抗体を用いることを特徴とするヒト心房性
   ナトリウム利尿ポリペプチドの免疫学的測定法。