JPH0198486A - クロ−ン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はクローン化プレプロ−ヒト血清アルブミン遺伝
子およびヒト血清アルブミン遺伝子、それらの遺伝子を
含むプラスミド、プラスミドにより形質転換された微生
物、およびその微生物を用いたプレプロ−ヒト血清アル
ブミンの製造方法に関する。

（従来の技術） ヒト血清アルブミン（時々、以下でＩＳＡと呼称する）
は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中
で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負
う。また、血液を介して各種の小分子を結合し、輸送す
ることができる。

ＩＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例え
ば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それに
より外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために
、通常はＩＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や
胎児性赤芽球症に罹っている患者にも血清アルブミンに
よる治療を必要とすることがある。

今日では、ＩＳＡは採取した血液の分画からの副産物と
して主に作られている。この欠点は費用と血液の供給量
が大幅に変わりうるということである。また、血液は肝
炎ウィルスのように好ましくない物質を含んでいること
がある。従って、ＩＳＡの代替の原料を開発することが
有益となろう。

冬型性がヒト血清アルブミンで知られている。

蛋白電気泳動法は２０以上のＩＳＡの遺伝子の異型体を
示している（ウェイトカンプ（Ｗｅｉ　ｔｋａｍｐ）ら
、アニュアル・オブ・ヒユーマン・ジェネティクス・ロ
ンドン（Ａｎｎ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｌｏｎｄ
ｏｎ）　３６＋３８１−３９１（１９７３））。これら
の異型体のアミノ酸配列は未だ比較されておらず、ヒト
での分布状態もわかっていない。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明の目的は微生物中でヒト血清アルブミン
を産生ずることにある。さらに本発明の目的は経済的に
ＩＳＡを産生ずることにある。また、本発明の目的は他
の血清蛋白に応用できるクローン化手法を開発すること
にある。

（問題点を解決するための手段） 本発明により、新規のヒト血清アルブミン遺伝子はクロ
ーン化され、遺伝子の微生物発現が説明される。完全長
Ｈ３Ａ遺伝子のヌクレオチド配列および、その遺伝子に
よって特定化されたポリペプチドのアミノ酸配列も本文
中で報告される。

ＩＳＡを産生ずる微生物を提供する手法は、以下の段階
に分けることができ、それらは本文中で充分に開示され
ている。すなわち、（１）Ｈ３ＡｍＲＮＡの回収と単離
、（２）ｍＲＮＡを鋳型として用い、相補的ＤＮＡ　（
ｃＤＮＡ）のインビトロでの合成、（３）適当なクロー
ニング・ベクターへのｃＤＮＡの挿入および、そのクロ
ーニング・ベクターによる微生物細胞の形質転換、（４
）クローン化した遺伝子の回収および単離である。

本文中に開示した手法で完全長クローン化Ｈ３ＡｃＤＮ
Ａの単離ができる。

有核細胞遺伝子は細胞核の染色体ＤＮＡ中に含まれる。

この染色体ＤＮＡは染色Ｎ　（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）と
呼ばれる小型の核蛋白複合体中に存在する。有核細胞染
色体ＤＮＡはコード化配列〔エクソン（ｅｘｏｎ）　）
中に介在する配列〔イントロン（１ｎ−ｔｒｏｎ）　）
を含む。これは細胞中では正しく発現しない。このため
に、特定の蛋白質の隣接コード化ブロックを産生ずる好
ましい方法は伝達ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の使用を必要とす
る。伝達ＲＮＡは、イントロンなしで目的の遺伝子に相
応するりボヌクレオチド配列を有し、遺伝子により特定
される蛋白質を産生ずる有核細胞から都合良く回収する
ことができる。

ヒト血清アルブミンｍＲＮＡはヒト肝細胞から使用でき
る程の量を回収することができる。肝細胞により産出さ
れたＨ３ＡｍＲＮＡはＨ３Ａ遺伝子の二本鎖の一つに対
し相補的であり、本文中で後述するように相補的ＤＮＡ
　（ｃＤＮＡ）の合成の鋳型として用いられうる。ｃＤ
ＮＡの合成のためにｍＲＮＡを効果的に用いるには、細
胞から比較的純粋な形で都合良く回収する。マツカント
リス（ＭｃＣａｎｄｌ　１ｓｓ）ら、メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）７９．５１（１９８１）により記述された
グアニジンチオシアネート／グアニジン塩酸塩抽出法は
、Ｈ３ＡｍＲＮＡを回収、精製するために、都合良く用
いられる。ＲＮＡは本質的にはＤＮＡはど安定ではなく
、特に、細胞中に存在するりボヌクレアーゼ類による分
解を受ける。従って、ｍＲＮＡ回収法は一般に、存在す
るりボヌクレアーゼ頻をす早く不活化する手段を用いる
。

一般に、全ＲＮＡの回収はりボヌクレアーゼー不活化物
質の存在下に細胞を破壊することで始まる。細胞破壊は
熔解剤に細胞を接触処理すること、凍結／融解、あるい
は、機械的破壊により、好ましくは、それらの組み合わ
せにより、なされうる。

グアニジンチオシアネートと還元剤、例えば、メルカプ
トエタノールの混合物は、リボヌクレアーゼ不活化剤と
して有効に機能することが見出されている（マツカント
リス（ＭｃＣａｎｄ　ｌ　１ｓｓ）　ら、前述）。

細胞破壊後、固体状の細胞片は例えば、遠心分離により
除去される。そして、ＲＮＡは得られた清澄液から沈澱
させる。沈澱は公知の技術、例えば、混合水−アルコー
ル（例えば、エタノール）を沈澱を生じる程の量を溶液
に加えることによりなされる。その後、ＲＮＡはグアニ
ジン塩酸塩溶液中に再懸濁し、２回連続してエタノール
で沈澱させる。この時点でＲＮＡは高品質化され、蛋白
質やＤＮＡを含まない。

次の段階は、全沈澱ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離である
。ヒト血清アルブミンｍＲＮＡはポリアデニル化され、
それ故、オリゴデオキシチミジレート（、ｔｌＪゴｄＴ
）セルロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー
により非アデニル化ＲＮＡから容易に分離することがで
きる（アビプ、エイチ（Ａｖｉｖ、ｆ（）ら、プロシー
デインゲス　オブナショナル　アカデミ−オブ　サイエ
ンス　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）６９＋１４０８（１９７２
）　；マツカントリス（ＭｃＣａｎｄｉｔｓｓ）　　ら
、前述）。全ＲＮＡは約０．５　Ｍ塩化す１−ＩＪウム
含有溶液でカラムにアプライさせる。これらの条件下で
のみ、ポリＡ″ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースと結合し
、塩不含溶液でカラムを洗浄することにより特異的に溶
出することができる。

ＨＳＡｍＲＮＡ用の調整物を増やすために、ボＩＪ　Ａ
″ＲＮＡは蔗糖密度勾配遠心分離で大きさにより分画さ
れうる。種々の密度勾配画分中のＲＮＡ活性は、網状赤
血球リゼート（ｌｙｓａＬｅ）中でインビトロでの翻訳
（ペルハム、エイチ（Ｐｅｌｈａｍ。

Ｈ，）　ら、ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　バイオ
ケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、　）
　６７、２４７（１９７６）により、あるいは、蛋白生
成物の電気泳動分析（ラエムリ、ニー（Ｌａｅｍｍｌｉ
、　Ｕ、）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７．６８
０（１９７０））により確かめることができる。

一旦、Ｈ３Ａの大きさの蛋白質を合成できるボＩＪＡ″
ＲＮＡが単離できれば、ｃＤＮＡ合成用の鋳型を提供で
きる。この手法は、本来の染色体遺伝子のコード化配列
と同一の核酸塩基対配列を有する二本鎖ＤＮＡを酵素的
に構築することを含む。

ｃＤＮＡは有核細胞遺伝子中に存在しうるコード化領域
内に非情報切片（イントロン）を含んでいない。こうし
て究極的には原核細胞系中で転写され、翻訳される。

Ｈ３ＡｃＤＮＡの合成は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■のクリノウ・フラグメント、および、Ｓ１ヌクレ
アーゼという酵素を用いる（カシアン、デイ−（Ｋａｃ
ｉａｎ、　Ｄ、）　ら、プロシーデインゲス　オブ　ナ
ショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　ニーニスニー
（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７３．２１９０１９７６）　ｉマツカ
ントリス、アール（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ、　Ｒ，）ら
、メソッズ　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９．６０１（１９８
１））。逆転写酵素はｍＲＮＡ鋳型上でデオキシヌクレ
オシド三リン酸からＤＮＡの一本鎖の合成を触媒する。

ｍＲＮＡのポリｒ　（Ａ）テール（ｔａｉｌ）は、約１
２〜１８個のヌクレオチドのオリゴ（ｄ　Ｔ）がｃＤＮ
Ａ合成用プライマーとして用いられることを許す。放射
活性標識されたデオキシヌクレオシド三リン酸の使用は
合成反応のモニターを容易にする。一般に、α３Ｚｐ含
有デオキシヌクレオシド三リン酸はこの目的のために有
利に用いられうる。ｃＤＮＡ合成は一般的に、緩衝液中
でｍＲＮＡ、デオキシヌクレオシド三リン酸、オリゴ（
ｄＴ）および、逆転写酵素を組み合わせることにより処
理される。この溶液は、高温、例えば４０〜５０”Ｃで
、ｃＤＮＡ複写をするのに充分な時間、例えば、約５〜
２０分間インキュベートされる。反応条件は根本的には
カシアン、デイ−・エル（Ｋａｃｉａｎ、　Ｄ、　Ｌ、
ら前述）、により記述された通りである。インキュベー
ション後、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（以
下、Ｎａｚ・ＥＤＴＡ）を溶液に添加し、溶液はフェノ
ール：クロロホルム（容積比１：１）で抽出される。

水相はゲル濾過クロマトグラフィーで有利に精製され、
溶出液中のｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体はアルコールで沈
澱される。

ｍＲＮＡはｃＤＮＡの存在下、希薄水酸化ナトリウム（
約０．１Ｍ）で、高温（例、約６０〜８０℃）、約１５
〜３０分間、特異的に加水分解される。アルカリ性溶液
による中和とアルコール沈澱が、−末鎖ｃＤＮＡ複製物
をもたらす。

−末鎖ｃＤＮＡ複製物は５′−ポリ　（ｄＴ）テールと
重複化ＤＮＡの小切片をもたらす３′末端ヘアピン構造
をもつことが示された（エフストラチアディス、エイ　
（Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ、　Ａ、）　　ら、゛セル
（Ｃｅ１１）、　７．　２７９（１９７６））　、この
３′ヘアピン構造は相補的ＤＮＡ鎖合成用のプライマー
として働きうる。この相補的鎖の合成は、デオキシヌク
レオシド三リン酸を含む反応混合物中でＤＮＡポリメラ
ーゼ■のクリノウ・フラグメント（クリノウ。

エイチ（Ｋｌｅｎｏ町Ｉ１．）ら、ヨーロピアン　ジャ
ーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｅｕｒ、ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、）、η、３７Ｈ１９７１））を用いてなさ
れる。この手法により回収した重複化ｃＤＮＡは３′ル
ープを有し、結果的に一本鎖ｃＤＮＡ複製物の３′ヘア
ピン構造をもたらす。この３′ループは基本的にはマン
カントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ）ら、メソソズ　イ
ン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）譲、６０１　（１９８１）の手法を用
いて、酵素Ｓ１ヌクレアーゼでの分解により開裂する。

Ｓｌヌクレアーゼ分解産物はフェノール−クロロホルム
で抽出し、水相からアルコールで結果的にｃＤＮＡを沈
澱させる。

ヒト血清アルブミン遺伝子に相応する完全な（ｉ　ｎ　
ｔａｃ　ｔ）二本鎖ＤＮＡ　（約２０００塩基対）は例
えば、マンカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ、前述、
５１頁）の手法を用いて、蔗糖密度勾配遠心分離により
単離されうる。蔗糖密度勾配中のＤＮＡの大きさを測定
するために、密度勾配画分の部分標品をポリアクリルア
ミドゲル中で分子量マーカーと共に電気泳動する。得ら
れたゲルはまず、マーカーを視覚化するために臭化エチ
ジウムで染色した後、放射性ｃＤＮＡを検出するために
オートラジオグラフィーを行う。１０００塩基対以上の
ＤＮＡ分子を含む密度勾配の両分をプールし、ＤＮＡを
エタノールで沈澱する。

増殖と選択のため、上述のように調整した二本鎖ｃＤＮ
Ａ遺伝子は、−船釣に適当な宿主細胞を形質転換するた
めに用いる適当なりローニングベクターに挿入される。

適当なりローニングベクターは種々のプラスミドおよび
ファージを含むが、ごの場合、プラスミドが好ましい。

クローニングベクターを選択するためのＷＪＪは、その
大きさ、宿主細胞中での複製する能力、選択できる遺伝
子の存在、そして遺伝子の挿入部位の存在がある。

大きさに関して、ベクターは、大遺伝子の挿入ができる
ように、大量の細胞の栄養分およびエネルギーを好まざ
る巨大分子の生成に向けないように、比較的小さいこと
が有利である。ベクターはまた、遺伝子挿入後の機能を
維持する完全なレプリコンを含む。このレプリコンは好
ましくは、プラスミド複製の所要態様（例えば、細胞光
たり単回複写の複数複写、あるいは、細胞光たり制御可
能な複写数）を制御する。１つ以上の表現型の特性（好
ましくは抗生物質耐性）を特定する遺伝子は形質転換体
の選択を容易にする。その挿入部位は有利には制限エン
ドヌクレアーゼ用の独自の制限部位である。これらの基
準の全てに適合するクローニングベクターはプラスミド
ｐＢＲ３２２である。

ｃＤＮＡはホモポリメリック・テーリング法によりこの
プラスミドへ都合良く挿入される。ホモポリマー・テー
ルは末端デオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼの
存在下、適当なデオキシヌクレオシド三リン酸を用いた
反応により、ヒト血清アルブミン二本鎖ｃＤＮＡ遺伝子
の３′−水Ｂｇに付加される。プラスミドは適当なエン
ドヌクレアーゼを用いた分解により開裂され、相補的ホ
モポリマー・テールは開裂したプラスミドの３′−水酸
基に、ホモポリメリック・テーリング法を用いて付加さ
れる。至適反応条件は二本鎖ｃＤＮＡにｄＣ残基を付加
すること（マソカンドリス２アール（ＭｃＣａｎｄｌｉ
ｓｓ、　Ｒ，）ら、６０１頁、前述：ロイコウドハリー
、アール（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ、　Ｒ，）ら、ヌ
クレイ・ツク　アシソズ　リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　３，１０］　（１９７
６）および、Ｐｓｔ　Ｉ処理したｐＢＲ３２２にｄＧ残
基を付加すること（マエダ、ニス（Ｍａｅｄａ＋　Ｓ、
）、メソッズ　インエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）７９゜６０７　（１９
８１））だと記載がある。しかし、好ましい態様は３′
末端に対するｄＸＴＰの過剰モル比は３０００から５０
００の範囲である。反応の進行は鎖長が約１５になるま
でモニターされる。テール化ｃＤＮＡおよびプラスミド
は、例えばフェノール抽出後のアルコール沈澱により回
収される。

二本のＤＮＡのホモポリメリック末端は相補的であり、
適当な条件下でアニール（ａｎｎｅａｌ）　シ、Ｈ５Ａ
遺伝子を含む組換えプラスミドを生ずる（マエダ、ニス
（Ｍａｅｄａ、　Ｓ、）、メソッズ　インエンザイモロ
ジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
７９゜６１１　（１９８１））。

イー・コリ　（［Ｅ、ｃｏｌｉ　　大腸菌）の好ましい
菌株は基本的にはレーデルベルグ＜Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ
）法、ジャーナル　オブ　バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｔ−ｏ１ｏｇｙＨ１９，１０７２（１９７４）
を用いて、この組換えプラスミドにより形質転換され、
無制限に維持される。

一般的に、数百数千のクローンがこれらの手法により産
生され、例えば、ラット血清アルブミンｃＤＮＡを用い
てＨ３ＡＩ伝子の存在をスクリーンする。ヒト由来ｃＤ
ＮＡと８５％の相同性を有するニック・トランスレート
化した（マニアティス、ティー　（Ｍａｎｉａｔｔｓ、
　Ｔ、）　ら、プロシーデインゲス　オブ　ナショナル
　アカデミ−オブ　サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ［ＩＳＡ　７２
．３９６１　（１９７５））ラット由来ｃＤＮＡはニト
ロセルロース　フィルターに付したプラスミＦＣＤＮＡ
にハイブリッド化させるために用いられる（グルンステ
イン、エム（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、）ら、プロシ
ーデインゲス　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンス　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ−ｔ’　ｌ
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　）　７２．３９６１　
（１９７５）　；サザン。

イー・エム（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ε０Ｍ、）、ジャーナ
ル　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｂｉｏｌ、）、９８、５０３　（１９７５））。こ
の手法において、各々のコロニー由来（あるいはコロニ
ー群由来）のＤＮＡはニトロセルロース・フィルターの
不連続なソーンに固定され、変質する。代わりに、ＤＮ
Ａは、フィルターに固定する前にゲル中で電気永動する
こともできる。放射活性標識したラット由来ｃＤＮＡの
溶液は、ハイブリッド条件下に処理される。

非ハイブリッド化ラット由来ｃＤＮＡはフィルタ−から
洗い流され、ラット由来ｃＤＮＡがハイブリッド化され
たＤＮＡを含むコロニーはオートラジオグラフィーで同
定される。一つの陽性のクローンは同定されたが、ＤＮ
Ａ配列決定により不完全なＨ５ＡＣＤＮＡであることが
判った。このＨ５ＡｃＤＮＡ部分は、クローンの完全な
バンク（ｂａｎｋ）を再スクリーンするためにニック・
トランスレート化（ｎｉｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）
された。こうして９０の陽性ハイブリダイゼーション・
シグナル（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ
）が得られた。

陽性クローンを適当な成長培地で培養し、プラスミドＤ
ＮＡを抽出するために大量の細胞を得る。

プラスミドＤＮＡを通常の技術（例えば、細胞破壊によ
り抽出した後、フェノール抽出およびアルコール沈りを
行う。プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡは例えば、
電気泳動法あるいは塩化セシウム平衡遠心法により分離
される。塩基対約１５００〜２０００の挿入部を含むプ
ラスミドＤＮＡがさらなる特徴付けのために選択される
。

クローン化遺伝子はプラスミドＤＮＡから切り取られた
後、配列分析により特徴付けられる（サンガー・エフ（
Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、）　　ら、プロシーデインゲス　
オプ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス　ニー
ニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　５ｃ
ｉＵＳＡ　７４．５４６３　（１９７７）　　；マキサ
ム、ニー（Ｍａｘａｍ。

Ａ、）ら、プロシーデインゲス　オブ　ナショナルアカ
デミ−オブ　サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）７４，５６
０　（１９７７））。

これらの手法により、プレプロ−Ｈ３Ａクローンは単離
されている。このプレプロ−Ｈ３Ａｉｆｔ伝子を含むプ
ラスミドで形質転換したイー・コリ（大腸菌）ＨＢＩＯ
Ｉ培養はイリノイ州ペオリアにある米国農務省北部調査
研究所（ｔｈｅ　Ｕ、Ｓ。

Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃ
ｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒいにＮＲＲＬＮＯ，Ｂ−１５７
８４として寄託されている。特徴的なこのＨＳＡ遺伝子
挿入部の部分制限地図は、図面の第１図で示され、第２
図は非コード化およびコード化領域の５′から３′の連
鎖とともに、その遺伝子により特定化されたアミノ酸配
列を示す。

単離した遺伝子は“テール部”を欠如した２０５０塩基
対からなる。その遺伝子は５′末端（塩基対１−３１）
および３′末端（塩基対１８５８−２０１５）に非コー
ド化領域を有する。コード化領域の５′末端（３２−１
０３塩基対）は２４のアミノ酸リーダー（ｌｅａｄｅｒ
）　　（すなわち、１８のアミノ酸“ブレ”配列、その
後位に６のアミノ酸“プロ”配列）を含み、完全な（ｍ
ａ　Ｌｕｒｅ）ヒト血清アルブミン蛋白は塩基対１０４
番目から１８５８番目までの領域により特定化される。

第２図および本文中他の所で用いたように、略号は以下
の標準的な意味を有する。

Ａ　　：デオキシアデニル Ｔ　　：デオキシチミジル Ｇ　　：デオキシグアニル Ｃ：デオキシシトシル Ｇｌｙニゲリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｌｅｕ　：ロイシン １１ｅ：イソロイシン Ｓｅｔ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｐｈｅ　：フェニルアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｔｒｐ：）リプトファン Ｃｙｓニジスティン Ｍｅｔ：メチオニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｌｙｓ：リジン Ａｒｇ：アルギニン Ｈｉｓ　：ヒスチジン Ｐｒｏニブロリン Ｇｌｎ：グルタミン Ａｓｎ：アスパラギン 遺伝子コードの縮重のために、遺伝子の核酸配列は実質
的に変化しうろことは明らかであろう。例えば、遺伝子
の一部あるいは全部を化学的に合成して、第２図になし
たものとは異なる核酸配列を与えることができる。しか
し、特定のコドン−アミノ酸の指定が観察されれば、ア
ミノ酸配列は保持されよう。ヒト血清アルブミン遺伝子
の核酸配列と蛋白のアミノ酸配列を確立したが、本発明
の遺伝子は特定の核酸配列に限定されず、遺伝子コード
により認められる全ての変化を含む。

本発明は、Ｈ５Ａ遺伝子を含む組換えＤＮＡの宿主菌と
して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　　を使って記述した。

しかし、分子生物学の当業者は、例えばシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のような他のダラム陰性菌
、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のようなダラム陽性菌
、酵母とカビ類のようなより高等な単細胞生物、そして
咄乳動物細胞も、Ｈ３Ａ遺伝子のクローニング及び／又
は発現のために使用できることを理解するだろう。

本発明は、さらに次の実施例によって説明するが、本発
明は、これらに限定されるものでない。

実施例　ｌ 、　゛からのＨ３ＡｍＲＮＡの＼ 伝令ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）は、１０才の偶然の犠牲者か
ら採取された大肝臓組織より単離した。ｍＲＮＡ試料へ
のりボヌクレアーゼの夾雑を防ぐために処理工程中格別
の注意を払った。これらの処置には、新規な滅菌実験用
ガラス器具を使用し、可能であればジエチルピロカーボ
ネートで溶液を処理し、好ましければついでオートクレ
ーピング（圧熱滅菌）をなし、できれば試料を低温に保
ち、試料と皮膚との接触を避けるため手袋を使用した。

凍結人肝Ｆｉ１組織（１０，５グラム）を、ビルチス（
Ｖｉｒｔｉｓ）ホモゲナイザーをつかって２１０ｍ１の
溶解液（４Ｍ　　グアニジン　チオシアネート１０．１
Ｍ）リス−Ｈ（１，ｐＨ７，５１０゜ＩＭ　　２−メル
カプトエタノール）で、均質化した。細胞片は、ソーパ
ル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　Ｇ　Ｓ　Ａローターで、１０分
間、４℃、８７５０ｒｐｍで、遠心分離しペレット化し
た。上清を、新しい遠心管に移した。上清に、０．０４
容量の１Ｍ酢酸と０．　５容量の９５％エタノールを加
えた。−２０℃で２時間後、混合物を７５０Ｏｒｐｍ、
１０分、４℃で遠心分離した。得られたペレットは、５
０ｍ１洗浄液（６Ｍグアニジン　ヒドロクロライド／１
０ｍＭ　　Ｎａｚ　　・ＥＤＴＡ、ｐＨ７，０／１０ｍ
Ｍジチオスレイトール）中に再：懸濁した。５５００ｒ
ｐｍ、１０分の遠心分離でペレット化した微細粒子片と
上清を、新しい遠心管に移した。上清にＯｌ。

４容量の１Ｍ酢酸と０．　５容量の９５％エタノールを
加えた。−２０℃で２時間後、混合物を、７２００　ｒ
ｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットは、２０ｍｌ洗
浄液で再懸濁し、０．０４容量のＩＭ＃酸と０．５容量
の９５％エタノールを添加した。

混合物は、−２０℃で１２時間保たれ、次いでソーハル
（Ｓｏｒｖａｌ　１）　Ｓ　Ｓ　　３４０−ターで４０
℃１０分間８０００ｒｐｍで遠心分離をした。ペレット
は、１５ｍ１滅菌蒸留水（ｄＨ２０）に再懸濁し、クロ
ロホルム：ブタノール（４：　１）の等量で抽出した。

水相を、新しい管に移し、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナ
トリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加した。

−２０℃で２．５時間後、ＲＮＡを、遠心分離でペレッ
ト化した。ペレットは、２ｍＩ！！滅菌蒸留水に再懸濁
した。総量１９゜２■のＲＮＡを回収した。

次いでｍＲＮＡをオリゴ（ｄ　Ｔ）　　・セルロース・
アフィニティー・クロマトグラフィー法（アビブ（Ａｖ
ｉｖ）ら：前述およびマツカントリス（ＭｃＣａｎｄｌ
ｉｓｓ）ら：前述）により全ＲＮＡから分離した。

５グラムのオリゴ（ｄ　Ｔ）　　・セルロースのカラム
を１カラム容量のＯ，１Ｍ水酸化ナトリウムで洗浄し、
存在する全てのりボヌクレアーゼを変性させた。次いで
高温緩衝液で平衡化した（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７，４１０，５Ｍ　　ＮａＣ１１０，５％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ））。

上記’１ｍｌ蒸留水に溶解させた全ＲＮＡ試料を１分間
７０℃で加熱した。次いで氷で室温まで冷やし、次に０
．１容量の５Ｍ　　ＮａＣ１，０，０４ｍ１ｌの０．５
Ｍトリス−ＨＣｌ１　　ｐＨ７，５及び０゜１ｍｌの１
０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をＲＮＡに添加
した。次いで、８ｍｌの高温緩衝液をＲＮＡに添加した
。そして溶液は、約１０ドロツプ／分の流速でカラムに
充填した。この溶液をカラムに通過させた後、非結合Ｒ
ＮＡは高温緩衝液でカラムから洗浄・溶出させた。両分
（各１／　２　ｍ　ｌ　）を採取し、各画分の２６０ｎ
ｍの吸光度（Ａ　ｚｈｏ）を分光計で測定した。カラム
は、Ａ２、。の値が０．０５以下に落ちるまで洗浄した
。

好ましくないＲＮＡを、さらに低温濃度の緩衝液（１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐｌ＋７．４１０．２ＭＮａＣＪ
１０．１％５ＤＳ）でカラムから洗浄した。両分は、Ａ
ｚ６゜が０．０５に落ちるまで上記のようにして採取し
た。

次に、ｍＲＮＡを、溶出緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７，４／１ｍＭ　　ＥＤＴＡｌｏ。

１％５ＤＳ）でカラムから溶出した。１ｒｒ１画分を、
Ａｚ６゜が、０．０５より低くなるまで採取した。最初
の１５の両分（ＯＤｚｂｏ値が、最も高い）が、プール
され、そしてｍ、　ＲＮ　Ａは、０．１容量の２．４Ｍ
酢酸ナトリウムと２．５容量の９５％エタノールを添加
して沈澱させ、１２時間、−２０°Ｃにおいた。次いで
？容出したｍＲＮＡを、遠心分離でペレット化し、８０
０μβの溶出緩衝液中に再懸濁した。再懸濁化したペレ
ットを７０°Ｃで９０秒間加熱した後、氷で冷し、０．
１容量の５Ｍ　　ＮａＣ１と０．０５容量の１０％ＳＤ
Ｓを添加した。

次いで上記で調製した溶出ｍＲＮＡを、さらに２つ目の
オリゴ（ｄＴ）　　・セルロース・カラムに通過させて
精製した。０．１グラム　オリゴ（ｄＴ）・セルロース
を充填したカラムを水酸化ナトリウムで洗浄し、次いで
前述の高塩濃度緩衝液で洗浄した。ＲＮＡをカラムクロ
マトグラフィーにかけ、高温緩衝液、低温緩衝液、そし
て溶出緩衝液で、最初のカラムと同様に両分を採取した
。溶出緩衝液の工程で得られたピーク画分を集め、そし
て２度精製ｍ　ＲＮ　Ａを前記と同様に沈澱化させペレ
ット化した。

次いで、ｍＲＮＡは１２ｍβシュークロース勾配で粒子
径分画をした（マンカントリス（ＭｃＣａｎｄｌｉｓｓ
）ら、メソッド　イン　エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）＋７９＋　ｐｐ、　
５６−５８）。５〜２０％のシュークロース勾配が、勾
配緩衝液（０，０２Ｍ酢酸ナトリウム、　ｐＨ５，６）
中に調整され、３時間４℃で冷した。ｍＲＮＡの１００
μｇを１００μｌの勾配緩衝液で、再懸濁し、２分間８
０℃で加熱した。水浴で急冷し、次いで勾配の上端部に
装填した。第２の５〜２０％勾配、分子量マーカーとし
てイー・コリの１６Ｓと２３ＳｒＲＮＡ（総量１０１０
０ｃｒを装填した。２つの勾配は、ベックマンＳＷ４０
ローターで、３８゜０００ｒｐｍ　１２．　５時間４℃
の条件下遠心分離した。次いで約０．５ｍｌの両分を採
取して、Ａ４４．（１を測定したく画分＃１は勾配管の
最下端部から採取されたものである。）。Ａ２６Ｏのピ
ークは、第３図に示すようにグループＡからＦの６つの
両分に分けられた。各々のグループの画分をプールし、
０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量の９
５％エタノールでｍＲＮＡを沈澱させた。

ＩＳＡで、推定されるサイズの蛋白質をコードするｍＲ
ＮＡを含む両分のグループは、３５ｓ−メチオニンで補
足されたウサギの網状赤血球リゼート（Ｉｙｓａｔｅ）
キット（ベセスダ調査研究所から提供され、製造元マニ
ュアルに準じて使った）によってインビトロでの翻訳で
同定された。各々の両分グループの反応混合物は、１２
．５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上での電気泳動
によって検出される放射活性標識蛍白質へのｍＲＮＡの
翻訳をするために必要な組成物を含んでおり、フルオロ
グラフィーに供された。

フルオログラムは、両分グループＢとＣの翻訳産物中に
ＩＳＡ　（６８，０００ダルトン）と推定される大きさ
の顕著な蛋白質バンドを示した。グループＢは、好まし
くない低分子量域中の蛋白質産物を非常に低い比率で含
有しており、そのためグループＢ中のｍＲＮＡは、ｃＤ
ＮＡの合成のための鋳型として使うために選別された。

実施例　２ Ｈ３Ａ　　ｃＤＮＡＯ入Ｊ 一般に、ＣＤＮＡの合成は、マツカントリス（ＭｃＣａ
ｎｄｌ　１ｓｓ）らの方法〔メソッズ　イン　エンザイ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ）、　７９．　ＰＰ、６０１−６０７　（１９８１）
　）を使った。放射活性標識デオキシヌクレオチドの利
用は、合成のモニタリング及び各工程における生産物の
計算を可能にする。

ｃＤＮＡの最初の鎖は、次の組成物のようにプライマー
としてオリゴ−ｄＴを使い、ｍＲＮＡを鋳型として合成
した。

くあらかじめ混合し、水中に保持した〉０．５　　Ｍ　
　ｌ−リス−Ｈ（１，ｐＨ８，３２０μ！１．４　　Ｍ
　　ＭＣＩ　　　　　　　　　　　　１０μｌＯ，２５
Ｍ　　Ｍ　ｇ　Ｃ！ｌ　ｚ　　　　　　　　　　　８μ
ｌＯ，０５Ｍ　　ｄＡＴＰ、　　ｐＨ７，ｏ　　　　　
　２μβ０．０５Ｍ　　ＴＴＰ、　　　ｐＨ７，ｏ　　
　　　　２μβ０．０５Ｍ　　ｄＣＴＰ、　　ｐＨ７，
０２μ１０．０５Ｍ　　ｄＧＴＰ、　　ｐｏｙ、ｏ　　
　　　　２μ１０．０１Ｍ　　ジチオスレイトール　　
　　　４μ！滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　４
５μｌ水溶性標識、α”Ｐ−ｄＣＴＰ　（１０μＣｉ／
μβ〕ｆ互 １００μｌ くさらに次の組成物を加えた〉 オリゴ（ｄ　Ｔ）　＋ｚ−＋＊　（２５０＃　ｇ／ｍ　
ｊり　２０　μｍアクチノマインシＤ　（５００μｇ　
／　ｍ　’！　＋水溶性）１６μ！ １０　μｌ　ｍＲＮＡ、“Ｂ”画分　　　　　　２０１
！滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　３７μｌ※Ａ
ＭＶ逆転写酵素（１６Ｕ／μｌ）７　ｐ　１聡　　量＝
　　　　　　　　　　　２００μｌ※アビアン・ミニロ
ブラストシス・ウィルス（八ｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌ
ａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ／ＡＭＶ）逆転写酵素は、
−８０℃に保たれているので、しばらくの間溶解してか
ら最後の添加物として加える。

反応混合物を、水中に５分間保ち、そして２μｌが移さ
れ、ｄＣＴＰの特異活性を決定するためにＡＳＣシンチ
レーション液中で計数した。反応混合物は、次いで４６
℃で１０分間インキニーベートした。２０μｌの０．２
Ｍ　　ＥＤＴＡ　　ｐｕｓ。

Ｏを加え反応を停止させ、そして次に混合物をフェノー
ル：クロロホルム（１：　１）の等容量で抽出処理した
。

０．１４容量の８０％グリセロールを添加し、サンプル
を０．７Ｘ１７ｃｍのセファデックスＧ−１００カラム
でクラマドグラフィーにかけた。

−旦サンプルをカラムにかけた後、ｃ１００緩衝液（１
０ｍＭ　　）リス−ＨＣＣｐＨ８，Ｏ／１ｍ、Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ／１００ｍＭ　　ＮａＣ１）をカラムに展開させ
、そして５滴（約２７５μｌ）の画−分を採取した。放
射活性画分は、チェレンコフ計数（“Ｃｅｒｅｎｋｏｖ
　ｃｏｕｎｔｅｄ″）した。そして分当りのカウントが
ピークとなるｃＤＮＡ画分をプールした。ｍ　ＲＮ　Ａ
　／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ハイブリッドは、Ｏ０■容量の
２．４Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量の９５％エタノ・
−ルを添加し、３０分間ドライアイス／エタノール浴中
に置き、次いで２０分間４℃。

１０．０００ｒｐｍで遠心分離することによってペレッ
ト化し沈澱を得た。ペレットは３００μｌの０．　１Ｍ
水酸化ナトリウム溶液中に再懸濁し、７０℃２０分間加
熱してＲＮＡを加水分解した。−末鎖ｃＤＮＡはそのま
ま残した。３０μβのＬＭ　　ＨＣｌ１を加え溶液を中
性にした。ＤＮＡは、５ＭｇｔＲＮＡ、１／１０容量の
２．４Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５容量の９５％エタ
ノールを加え、１０分間ドライアイス・エタノール浴に
置き、そして４℃で１０分間マイクロフユージ（ｍｉｃ
ｒｏｆｕｇｅ）中に遠心することによって沈澱させた。

ペレットは、次の混合液中で再懸濁した。

４０μｉｔ　　　Ｏ，５Ｍ　　　ＫｚＳＯ４ｐｌ＋７．
４８μＺ　　　０．２５Ｍ　　　ＭｇＣ１゜２μ１０．
１Ｍ　　　ジチオスレイトール１μｌ　　　Ｏ，０５Ｍ
　　　ｄＡＴＰ、　　　　ｐＨ７，０１μｍ　　　０．
０５Ｍ　　　ｄＣＴＰ、　　　　ｐＨ７，０１μｍ　　
　０．０５Ｍ　　　ｄＧＴＰ、　　　ｐＨ７，０１μｆ
　　　Ｏ，０５Ｍ　　　ＴＴＰ、　　　　ｐＨ７，０１
２４μＮ　　滅菌蒸留水 １７８μ１ 次に、２２μｌのＤＮＡポリメラーゼ■クリノウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）フラグメント（５μ／μｌ、ベーリンガー・
マンハイムからの提供）を加えた。

次いで反応混合物は、１２時間１５℃の水浴中でインキ
ュベートした。２０μβの０．２μｌ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　
ｐｌ＋　８　、　０を反応停止のために加えた。

混合物は、フェノール：クロロホルム（１：　１）の等
容量で抽出処理した。０．１４容量のグリセロールを水
相に加えた。

サンプル、これは今や二本′ＭｃＤＮＡを含んでいる、
をセファデックスＧ１００カラムにかけ、ピークｃＤＮ
Ａ画分をプールし、前記と同様に沈澱させた。二本鎖Ｄ
ＮＡは、前述のように３′“ヘアピン・ループをもち、
それは次のように８１ヌクレアーゼで除去された。ペレ
ットは、７２μｌの滅菌蒸留水中に再懸濁した。ついで
、１８ｔｔｌの５倍希釈したＳ１緩衝液（ＩＭ　　Ｎａ
（１１０，２５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４，５１５ｍＭＺ
ｎ５ｏ４　／２．５％グリセロール）が加えられた。

酵素混合物は、Ｓ１ヌクレア一ゼ２０μｇ／μｍ）２．
５μ１（５０単位）を４７．５μｌ　Ｓｌ緩衝液に加え
て調製した。次いで酵素混合物の１０μｌを、９０μｌ
のＤＮＡ？容？夜にカロえ、３７°Ｃ２０分間インキュ
ベートした。２０μｍ０．２μｌＤＴＡ　　Ｎａの添加
で反応を止め、そして反応混合物をフェノール：クロロ
ホルム（１：　１）の等容量で抽出処理した。水相は、
５−２５％シュークロース勾配にかけ、３８．００Ｏｒ
ｐｍ　１７．　５時間５℃の条件で超遠心分離処理をし
た。

１ｍｌの両分を採取し、′チェレンコフ（Ｃｅ−ｒｅｎ
ｋｏｖ）計数”にかけた。画分１−６．　７−９゜そし
て１０−１２の３つのプールを採取した。画分＃１は、
勾配の最下端部から採取された両分であった。ＤＮＡは
、０．１容量の２．４Ｍ酢酸ナトリウム、１−２μｇの
ｔＲＮＡ、そして２．５容量の９５％エタノールを各々
のプールに加え、そして−２０℃に一装置いて沈澱させ
た。ＤＮＡは、４℃３０分間２５　Ｋの条件で遠心し、
ペレット化した。わずかにペレットを脱水した後、各々
のプールから得られたＤＮＡを脱水した後、各々のプー
ルから得られたＤＮＡは２００μβの蒸留水中に再懸濁
し、再びエタノールと酢酸ナトリウムで沈澱させた。ペ
レットは、２２μｌ蒸留水に再懸濁し、マイクロフユー
ジ（ｍｔｃｒｏｆｕｇｅ）中で５分間遠心し、不溶性物
質をペレット化した。各々ｃＤＮＡを含む上清２μｌを
６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ分析し
た。ゲルのオートラジオグラフィーは、画分１−６のプ
ール中のＤＮＡは平均サイズが１１００ｂｐ　　（塩基
対）を有し、２ｏｏｂｐ域のＤＮＡを含むことを示した
。そして、このプールは、マンカントリス（ＭｃＣａｎ
ｄｌ　１ｓｓ）ら、前述６０１とその次の頁）に記述さ
れた一般的なホモポリメリックテーリング（ｈｏｍｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ）法によるｃＤＮＡ
の３′末端　へのポリＣテール（ｔａｉｌｓ）の付加の
ために利用した。このためにｄＣＴＰを５０００モル過
剰用いるのが良い結果をうろことを見い出した。

反応混合物は次の通りである。

２０μｌ　　　ｃＤＮＡ（約４３ｎｇ）−３ＨｄＣＴＰ
　（６４５μｍｏ＋、凍結乾燥）２．４μＮ　　１０倍
希釈したＴｄＴ緩衝液※１．６μｌ　蒸留水 ２４．０μｌ ※１０ＸＴｄＴ緩衝液＝１．４Ｍカコジルカリウム１０
．３Ｍ）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，０／１０ｍＭＣｏ　Ｃ
Ｉｌｚ　／　１　ｍＭ　　ＤＴＴ反応混合物は、３７℃
で２分間インキュベートされ、２μｌを計数に使用する
ため採取した。次いで２μｌ　（６，６６単位）のＰ−
Ｌバイオ・ケミカルズのターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼを加え、そして３７℃でのイン
キュベーションを５分間続けた。３ＨｄＣＴＰの取り込
みによる計数は、ｃＤＮＡの３′末端は長さが平均１４
ヌクレオチドの“ポリＣテール”を担持することを示し
た。８０μｉＴ、Ｅ、＋７１衝液（１０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｃ１，ｐＨ７，６／１ｍＭＥＤＴＡ）をＤＮＡに加えて
、溶液を、フェノール：クロロホルム（１：１）の等容
量で抽出した。

さらに有機相は、１００μ！蒸留水で再処理し、２つの
水相を混合した。

次いでＣテール化二末鎖ｃＤＮＡは、制限エンドヌクレ
アーゼ旦↓ｔＩで直線化され、次いでホモボリメリンク
・テーリング法によって“Ｇ−テール化”されたプラス
ミドｐＢＲ３３２ＤＮＡに対してアニール化される。相
補的な一本ｔＡＣとＧの“テール”はアニール化され、
Ｐｓ±１部位に挿入されたｃＤＮＡを有する組換えプラ
スミドを得た。

２００μ７！ｃＤＮＡ、　Ｃ−テール化（３９，２ｎｇ
）１０．５μＩ！　　ｐＢＲ３２２−Ｐｓｔ　Ｉ　、　
Ｇ−テール化（３０２ｎｇ） ９３μｍ　　１０倍希釈したアニーリング緩衝液※ ６２６．５μ！　蒸留水 ９３０μ！ 反応混合物を、７０℃の別の水浴中におき、ついで水浴
を、３７℃の部屋に移し、−夜かけて、徐々に３７℃に
冷やした。ついで室温に移し、そこで水浴は、数時間を
かけて３０℃に冷やした。

さらに反応混合物を、４℃に貯蔵した。

※（１０×アニーリング緩衝液＝１．　５ＭＮａ（１！
／１００ｍＭ　　トリス−塩酸。

ｐＨ７，５／１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ） Ｅ、Ｃｏ１１　　ＨＢＩＯＩ細胞は、既知の塩化カルシ
ウム処理法によって形質転換のために適合化された。適
合化ＨＢＩＯＩ細胞の２００μｌアリコート（ａｌｉｑ
ｕｏｔ）　２つをアニーリング反応混合物の４０μｌと
各々混合し、水中に２０分間装いた。

次いで、４２℃で２分間の加温処理を行った。

２．８ｍｌのルリアプロス（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）
を各々の管に加え、３７℃で１時間インキュベートした
。

これらの管の中にある物は、０．７％寒寒天添加ソリア
ブロス含む管ヘアリコートされ（１／２ｍｌアリコート
）、次いで２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むル
リアブロスー寒天板上に注入された。そして、コロニー
が表われるまで３７℃でインキュベートした。　（ｃＤ
ＮＡの挿入の有無にかかわらず）ｐＢＲ３２２によって
形質転換された細胞のみが、テトラサイクリ・プレート
上で生育できる。約２５００の形質転換コロニーがブレ
ート上で生育した。

実施例　３ ろ全　Ｈ３Ａ　　ｃＤＮＡの　− 形質転換体は、最初、ラットの血清アルブミン（Ｒ３Ａ
）ｃＤＮＡ断片でスクリーンされた。

Ｒ３ＡｃＤＮＡ断片は２０００ｐｂのＲ３ＡｃＤＮＡ挿
入を含むｐＢＲ３２２プラスミドから得られた。この組
み換えプラスミドは、プロシーデインゲス　オブ　ナシ
ョナル　アカデミ−オブ　サイエンス　ニーニスニー（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

」）、ユ凱４３７０　（１９７９）に記述されたプラス
ミドｐ　ｒＡｆ　ｂ　Ｉと似ているが、これより長いｃ
ＤＮＡ挿入物を担持している。

１４８０ｂｐラツト血清アルブミン（Ｒ３Ａ）断片は、
制限エンドヌクレアーゼ旦土±ＥＩ［でＲ３ＡｃＤＮＡ
を担持するプラスミドを消化することによって分離され
た（本実施例で使用したすべての制服エンドヌクレアー
ゼは、製造元の説明書に記載の方法によって使用した）
。

次いで断片は、“ニックトランスレーション”法（マニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　
７２　：３９６１　（１９７５）によってα１Ｚｐで放
射活性ラベルした。

約８０の個々の形質転換体の１０ｍｊ！！カルチャー　
（ｃｕｌｔｕｒｅ）を生育させ、そしてプラスミドＤＮ
Ａを既知のプラスミド“ミニ−プレツブ法”によって分
離した。部分精製プラスミドＤＮＡは、０．８％アガロ
ースゲル上で電気泳動にかけられた。ＤＮＡは、“サチ
ンブロッティング法（サザン、イー・エム（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、）ジャーナルオブ　モレキュー　
バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ）
　９８．５０３　（１９７５）を使ってゲルからニトロ
セルロース・フィルターに移された。

ニトロセルロース・フィルターは、プレハイブリダイゼ
ーション溶液（５０％ホルムアミド１５倍希釈したＳＳ
Ｃ※／　０　、　０５　Ｍ　　Ｎ　ａ　３Ｐ　Ｏｓ　。

ｐＨ６，５１５倍希釈したＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｔ
ｏｃｋ※／１００、ｃｚｇ／ｍ１サケ精子ＤＮＡ）中に
、４２℃で２時間浸した。該フィルターをハイブリダイ
ゼーション溶液（５０％ホルムアミド／１０％　デキス
トラン硫酸／ＳＳＣの５倍希釈溶液／２０ｍＭＮ　ａ　
、Ｐ　Ｏ，、ｐＨ６、５／Ｉ　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ
　５ｔｏｃｋ１５０μｌ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中に浸
した。

上記のようにニックトランスレーションにより調製され
た１４８０ｂｐのＲ３Ａ断片を１００℃、５分間加熱し
、次いで水浴で急冷し、このプローブを？合液１ｍｌ当
たり２ＸｌＯ’　ｃｐｍのプローブとなるまでハイブリ
ダイゼーション溶液に添加した。

次いでフィルターを、４２℃１８時間ハイブリダイゼー
ション溶液中でインキュベートし、次いで２倍希釈した
ＳＳＣで２度、Ｏ，ｌＸ５ＳＣで１度室温で洗浄した。

フィルターのオートラジオグラフィーは、すべてプラス
ミドＤＮＡに対して、プローブの特異的なハイブリダイ
ゼーションを表わした。

※５０　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｔｏｃｋ＝　１％
ポリビニルピロリドン／１％フィコール／１％ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ） ※ＳＳＣ＝１５０ｍＭ　　ＮａＣ４／１５ｍＭクエン酸
ナトリウム、クエン酸でｐＨ６，１３に８用型 それ故、いくつかのサザン・プロット・フィルターは、
６５°Ｃから８０°Ｃの種々の温度で２倍希釈したＳＳ
Ｃで洗浄された。６５゛Ｃで洗浄されたフィルター上の
一つのプラスミドからのＤ　Ｎ　Ａは、プローブと強く
ハイブリダイゼーションしていた。

ＤＮＡのシーケンシングは、６Ｃ３と呼ばれる“陽性”
クローンが、部分長ヒト血清アルブミンクローンである
ことを示した。プラスミドＤＮＡは、６Ｃ３のカルチ＋
　　　（Ｃｕｌｔｕｒｅ）　　から分離され、制限エン
ドヌクレアーゼエ」」」で消化された。

得られたＨ３ＡｃＤＮＡ断片の一つで約４７５ｂｐの長
さのものが単離され、プローブとして使うため“ニック
・トランスレート”された。

約２５００クローンの全バンク（ｂａｎｋ）について、
グルンステイン（Ｇｒｕｎｓ　ｔｅｉｎ）ら、前述のハ
イブリダイゼーション法の変法を使って、このプローブ
によってスクリーンされた。

形質転換コロニーは、０．２％グルコースと２５μｇ　
／　ｍ　ｌテトラサイタリン　加　ルクアプロス（Ｌｕ
ｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）を含む９６穴マイクロタイタープ
レート上の分離ウェルヘプレートから別々に摘出した。

そして３７℃で一夜インキユベートした。４８コの金属
プロング（ｐｒｏｎｇ）を有する転換装置を使って、各
々の培地中のサンプルを２つのルリアブロス（Ｌｕｒｉ
ａ　ｂｒｏｔｈ）／寒天／テトラサイクリン・プレート
に移したが、１つは前もってニトロセルロース・フィル
ターでおおわれたプレートである。そして３７℃で２日
間インキュベートした。次いでフィルターは、次の溶液
の一つ中に浸されたワットマンろ紙上で連続的に置かれ
た。

０．５Ｍ　水酸化ナトリウム；１Ｍトリス、　ｐＨ７，
４；１Ｍトリス、ｐＨ７，４；２倍希釈したＳＳＣ；　
９０％エタノール、および９０％エタノール（この順で
、溶液当り７分間） 次いでニトロセルロース・フィルターを、８０℃で２時
間真空中で加熱した。

プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーショ
ン法は、３度室温で洗浄することを除いて上述の方法に
準じた。９０の陽性ハイブリダイゼーション・シグナル
がオートラジオグラフィーで検知された。“陽性クロー
ン”を、さらに制限酵素分析法（例えばＰｓｔｌ消化）
及び上記の“サザン・プロット”のハイブリダイゼーシ
ョン法で分析した。

完全長Ｈ３ＡｃＤＮＡをもつクローンは、ＤＮＡシーケ
ンシングによって同定・確認された。このＨ３ＡｃＤＮ
Ａ挿入物を含む組み換えプラスミドは、ｐＧＸ４０１と
名付けられ、それは第４図に示した。Ｈ３ＡｃＤＮＡの
部分制限酵素地図を第１図に示し、第２図は、クローン
化遺伝子のＤＮＡ配列（５’−３’鎖）と、それを特定
するアミノ酸配列を示した。

ｐＧＸ４０１で形質転換されたＥ、ｃｏｌｔＨＢＩＯＩ
のサンプルは、受付けＮＲＲＬＮＯ，Ｂ−１５７８４と
して、イリノイ州ベオリアの米国農務省北部調査研究所
（ｔｈｅ　Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ａｇ−ｒｉ
ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ
　Ｒｅ５ａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本文中に記載された手法によって単離された
完全長（ｆｕｌｌ　−ｌｅｎｇｔｈ）　ＨＳ　Ａ　ｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａクローンの部分制限地図を示す。 第２図（ａ）、第２図（ｂ）および第２図（ｃ）は同図
（ａ）　、　（ｂ）　、　（ｃ）の順に完全長Ｈ３Ａｃ
ＤＨＡの非コード化およびコード化領域の５′から３′
の連鎖のＤＮＡ配列とともに、ＤＮＡ配列によって特定
されたアミノ酸配列を示す。 第３図はｍＲＮＡの蔗糖密度勾配画分のＡ　２６゜曲線
（ｐｌｏｆｉｌｅ）を示す。Ｂグループ画分はＨＳ　Ａ
ｃＤＮＡを合成する際に鋳型として使用された。 第４図はｐＧＸ４０１．すなわち完全長Ｈ３ＡｃＤＮＡ
挿入部を含む組換えプラスミドを示す。 ただし、５’Ｐｓｔ１部位は再生させなかった。 第５図（ａ）は、ｍＲＮＡから直接的にヒト血清アルブ
ミン遺伝子のヌクレチオド配列を決定した時の５′端か
ら９５〜１０２番目のアミノ酸に対応する塩基配列を示
した図であり、ｐＧＸ４０１に組み込まれたヒト肝ＩＩ
（ＨＬ８）のヒト血清アルブミン遺伝子の場合であり、
第５図（ｂ）は、他の異なる二人の肝臓（ＨＬ３３およ
びＨＬ３９）の場合である。 二ョ市市９番妊綽ぢ Ｑｌ（Ｊ　　−ＩＥ−１ｕ’＋ｈ　　Ｌｌｌ（Ｊ　　＝
＋ａ　　ｕ＜　　ｏｅ　　ｕｅ■＜　−ヒ　トじ　−＜
−り　　二Ｕ　日Ｕ　飄く＜リ　〉Ｑ　リド　−Ｕ　リ
リ　９く　〜リ　−日菰暑　竺ご　丑　５乏　８６　！
冒　、賎ε８（ＪＥ’　　ｌ−Ｉ＜　　ＵＥ＠　　じＵ
　〜Ｕ　０じ　＝リ　くく肺肺ボ肝肘市肋９ 市秤コ輿針涯韮脣畦 市３ヨ■訴肝球弘朴 ＝ご　片冗　！乏　：て　ビご　田ミ　ニ号　芸とＬＱ
Ｅ−１＜ＣＤ　　リリ　リ０　くリ　−リ　Ｈく　山Ｅ
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図（ｂ） ＨＬ３３　　　　　　ＨＬ３９ Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＧ　Ａ′Ｔ　Ｃ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下のデオキシリボヌクレオチドおよびアミノ酸配
   列を含むヒト血清アルブミン遺伝 子。 【遺伝子配列があります】 ここで５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まり、各
   々の三塩基連鎖はコードするアミノ酸を示している。又
   、略号は以下の一般的な意味を有する。 Ａ：デオキシアデニル Ｔ：デオキシチミジル Ｇ：デオキシグアニル Ｃ：デオキシシトシル Ｘ：Ａ、Ｔ、ＣあるいはＧ Ｙ：ＴあるいはＣ Ｚ：ＹがＣの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ ＹがＴの時はＡあるいはＧ Ｈ：Ａ、Ｔ、あるいはＣ Ｑ：ＴあるいはＡ Ｒ：ＱがＴの時はＣ ＱがＡの時はＧ Ｓ：ＱがＴの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ ＱがＡの時はＴあるいはＣ Ｍ：ＡあるいはＧ Ｌ：ＡあるいはＣ Ｎ：ＬがＡの時はＡあるいはＧ ＬがＣの時はＡ、Ｔ、ＣあるいはＧ Ｇｌｙ：グリシン Ａｌａ：アラニン Ｖａｌ：バリン Ｌｅｕ：ロイシン Ｉｌｅ：イソロイシン Ｓｅｒ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン Ｐｈｅ：フェニルアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｔｒｐ：トリプトファン Ｃｙｓ：システイン Ｍｅｔ：メチオニン Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ｌｙｓ：リジン Ａｒｇ：アルギニン Ｈｉｓ：ヒスチジン Ｐｒｏ：プロリン Ｇｌｎ：グルタミン Ａｓｎ：アスパラギン ２、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
   請求の範囲第１項に記載のヒト血清アルブミン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 ３、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含むプレプ
   ロ−ヒト血清アルブミン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
   々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
   、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
   。 ４、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
   請求の範囲第３項に記載のプレプロ−ヒト血清アルブミ
   ン遺伝子。 【遺伝子配列があります】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 ５、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含む、特許
   請求の範囲第３項に記載のプレプロ−ヒト血清アルブミ
   ン遺伝子。 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 ６、原核あるいは有核生物中で複製する能力を有し、以
   下のヒト血清アルブミン又はプレプロ−ヒト血清アルブ
   ミンをコードするデオキシリボヌクレオチド配列を担持
   するプラスミド。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシ リボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
   ボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
   々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
   、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
   。 ７、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含むヒト血
   清アルブミン遺伝子又はプレプロ−ヒト血清アルブミン
   遺伝子を担持する特記請求の範囲第６項に記載のプラス
   ミド。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリボヌクレオ
   チド配列： 【遺伝子配列があります。】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
   ボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又は、 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 ８、原核あるいは有核生物中で複製する能力を有し、以
   下のヒト血清アルブミン又はプレプロ−ヒト血清アルブ
   ミンをコードするデオキシリボヌクレオチド配列を担持
   するプラスミドによって形質転換された微生物。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシ リボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
   ボヌクリオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
   々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
   、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
   。 ９、以下のデオキシリボヌクレオチド配列を含むヒト血
   清アルブミン遺伝子又はプレプロ−ヒト血清アルブミン
   遺伝子を担持するプラスミドによって形質転換された特
   許請求の範囲第８項に記載の微生物。 ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリボヌクレオ
   チド配列： 【遺伝子配列があります。】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオキシリ
   ボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 又は、 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 １０、微生物がエスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   ）属コリ（Ｃｏｌｉ）種である特許請求の範囲第８項又
   は第９項に記載の微生物。 １１、微生物がＮＲＲＬＮｏ．Ｂ１５７８４（ｐＧＸ４
   ０１）と実質的に同等である特許請求の範囲第１０項に
   記載の微生物。 １２、吸収性の炭素、窒素および必須ミネラル源、成長
   因子を含む水性栄養培地で、プレプロ−ヒト血清アルブ
   ミンを産生する条件下で、微生物中で複製することがで
   き、かつ以下のプレプロ−ヒト血清アルブミンをコード
   するデオキシリボヌクレオチド配列を有するプラスミド
   によって形質転換された微生物を培養すること、および
   、そのようにして産生されたプレプロ−ヒト血清アルブ
   ミンを回収することを含む、実質的に純粋なプレプロ−
   ヒト血清アルブミンを産生する方法。 プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードす るデオキシリボヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります。】 ここで、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まる各
   々の三塩基連鎖がコードするアミノ酸を示している。又
   、略号は特許請求の範囲第１項において定義されている
   。 １３、プレプロ−ヒト血清アルブミンをコードするデオ
   キシリボヌクレオチド配列が、以下である特許請求の範
   囲第１２項に記載の方法。 【遺伝子配列があります。】 又は、 【遺伝子配列があります。】 ただし、５′から３′の連鎖はアミノ末端から始まるこ
   とを示し、略号は特許請求の範囲第１項において定義さ
   れている。 １４、微生物がエスケリチア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   ）属コリ（Ｃｏｌｉ）種である特許請求の範囲第１２項
   又は第１３項に記載の方法。 １５、微生物がＮＲＲＬＮｏ．Ｂ１５７８４（ｐＧＸ４
   ０１）と実質的に同等である特許請求の範囲第１４項に
   記載の方法。