JPH02100685A - ポリペプチド分泌発現ベクター，該ベクターで形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプチドの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はポリペプチド菌体外分泌発現用ベクタ、該ベク
ターで形質転換した微生物及び該微生物によるポリペプ
チドの製造に関する。

〔従来の技術〕 遺伝子工学技術を用いて、インターフェロン、成長ホル
モン等を始めとする比較的高分子の様々なポリペプチド
を大腸菌、枯草菌、酵母等の宿主細胞の利用により製造
する方法はすでに確立されている。また、α−ネオエン
ドルフィン、ソマトスタチン等の比較的低分子のポリペ
プチドを製造するためには、雑種蛋白法〔公開特許公報
昭５４−９２６９６号〕、すなわち目的ポリペプチドを
大腸菌蛋白質との雑種蛋白質（融合蛋白質と同意）とし
て生産する方法、を用いることにより可能となってきて
いる。

しかしながら、高分子ポリペプチドを生産する場合と比
較して低分子ポリペプチドにおける遺伝子工学的な生産
技術は、それらに含まれる有用物質の多様さにもかかわ
らず、提供されている方法が限られている。すなわち、
従来は大腸菌プラスミド上に存在するβ−ラクタマーゼ
、アルカリ性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
等の蛋白質をコードする遺伝子のＣ末端付近に、α−ネ
オエンドルフィン、ソマトスタチン等の有用なポリペプ
チドに対応する遺伝子を組み込んで、大腸菌を形質転換
させ増殖させた後、その大腸菌から、これら有用なポリ
ペプチドを含む融合蛋白質を得、それから目的とするポ
リペプチドを分離回収する方法が主に行なわれている。

この場合、β−ラクタマーゼ、アルカリ性フォスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の蛋白質の生成及びその
生成物の特性については、それぞれ一長一短があって、
必ずしもこれらの遺伝子を含むプラスミドによって形質
転換した大腸菌から、これらの有用なポリペプチドが高
い収量で効率よく得られるとは限らなかった。

例えば、β−ラクタマーゼの遺伝子の近傍に有用なポリ
ペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ場合は、一般
に蛋白質の生成量が少ない。また、アルカリ性フォスフ
ァターゼの近傍に組み込んだ場合は、本酵素が低すン酸
倍地でのみ誘導されるので、菌の生育が悪くなり、単位
培養容量当りの目的ポリペプチドの収量が低（なる。一
方、βガラクトシダーゼの遺伝子の近傍に組み込んだ場
合は、その融合蛋白が乳糖やイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド等によって、富栄養培地で誘導さ
れるため単位培養容量当りの収量も高くなるが、得られ
た融合蛋白中のβ−ガラクトシダーゼ中のメチオニン残
基は２３個もあるので、臭化シアンで切断した時ペプチ
ドセグメントの数が非常に多くなり、精製が困難である
。またこれらいずれの場合においても、生成した融合蛋
白質は菌体内画分（ペリプラズム、及び細胞質両分）に
局在し、目的ポリペプチドの種類によっては菌体内に不
活性型のインクルージヨンボディを形成したり、また宿
主菌プロテアーゼにより分解され活性を失うこともある
。さらに、その融合蛋白質の精製に際しては、菌体破壊
時に大量に混入してくる大腸菌菌体成分の除去が必要と
なり、精製ステップが煩雑で収量が極めて低くなること
が多かった。

しかし、目的ポリペプチドが菌体外分泌性蛋白質、例え
ば好アルカリ性バチルスＮα１７０株由来のペニシリナ
ーゼ、との融合蛋白質として大腸菌の菌体外に産生され
、引き続いて目的ポリペプドが、容易に分離されるなら
ば、しかもペニシリナーゼ中のメチオニン残基は２個し
かないので、目的ポリペプチドとの分離も容易であり、
上記の問題点を解決できるものと思われる。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明の目的は、より容易に比較的低分子の有用
ポリペプチドを得ることができる方法を提供することに
ある。また本発明は、該方法実施のための新しいベクタ
ーおよび該ベクターを保有する微生物を提供することに
ある。

本発明者らは、好アルカリ性バチルスＮα１７０株ペニ
シリナーゼのＣ末端アミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列
を改良し制限酵素認識部位を挿入し、新たに菌体外分泌
発現用ベクターを造成した。そして該ベクターにインシ
ュリンＢ鎖の遺伝情報をになう合成りＮＡを挿入し、こ
れを大腸菌に導入後その培養濾液からペニシリナーゼ融
合蛋白質を精製し、さらに酵素処理あるいは化学処理に
より、インシュリンＢ鎖を工業的有利に取得することに
成功し本発明を完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とを直
接連結させて目的ポリペプチドをペニシリナーゼ融合蛋
白質として菌体外に分泌発現させるための、ペニシリナ
ーゼをコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とす
るポリペプチド分泌発現ベクターに関する。

さらに本発明は、ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
基配列と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
とが直接連結されてなる融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とするベクターに関す
る。

さらに本発明は、ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
基配列と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
とが直接連結されてなる融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を含むベクターで形質転換された微生物
に関する。

さらに本発明は、ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
基配列と目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
とが直接連結されてなる融合ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列を含むベクターで形質転換された微生物
を培養して菌体外に分泌される融合蛋白質を採取するこ
とを特徴とするポリペプチドの製造法に関する。

以下本発明の詳細な説明する。

ペニシリナーゼの遺伝子情報を担うＤＮＡは、好アルカ
リ性バチルスＮα１７０株から単離精製する。

既に報告したように、本ペニシリナーゼの遺伝子はベク
ターｐＭＢ９を用いて４．５ｋｂＥｃｏＲＩ断片あるい
は２．４　ｋｂｌ＋ｉｎｄ　Ｉ［［断片として大腸菌に
クローニングされた。得られた組換え体プラスミドをそ
れぞれｐＥＡＰｌおよびｐＥＡＰ２と命名し、これらの
プラスミドを含む大腸菌において発現したペニシリナー
ゼが、菌体外に生産されるという現象を見い出した（Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、、　１５６，９４９−９５１（
１９８３）；Ｅｕｒ、Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏ
　ｔｅｃｈｎｏｌ、、１８，３３９−３４３（１９８３
））　−遺伝子組換え技術を用いて有用蛋白質を生産す
る場合、最も重要なこととし°ζ、菌体外に生産物を分
泌させるということがある。その理由としては、生産量
を上げるということ、また異種遺伝子産物を生物学的機
能を持った分子として生産するために分泌させることが
必要な場合もあると考えられる。一般に、分泌される蛋
白質の種類はそれほど多くなく、したがって精製工程が
簡単で工業的にみても大きなコストダウンにつながると
考えられる。しかしながら、遺伝子組換えに最もよく利
用されている大腸菌は、まったくといってよいほど生産
物を菌体外に分泌しない。大腸菌のようなダラム陰性細
菌は、生産物をよく菌体外に分泌することで知られてい
る枯草菌等のグラム陽性細菌と比べて、その表層構造が
異なっている。すなわち枯草菌等では、細胞の表層が細
胞質膜とペプチドグリカン層どの二層構造を有している
のに対し、大腸菌等ではそれら二層の外側に更に外膜を
もち三層構造を有している。その結果、大腸菌では生産
物が分泌性蛋白質であっても外膜に阻まれ細胞質膜と外
膜との間の隙間（ペリプラズム空間）に溜り、菌体外に
分泌されることはない。本発明者らが見いだした大腸菌
に於けるペニシリナーゼの菌体外分泌系の開発は、上記
の問題点を解決し有用蛋白質の菌体外生産のための宿主
として大腸菌を利用できる可能性を示したものである。

本発明者らは、上記ペニシリナーゼの特性に着ロし、該
ペニシリナーゼを利用して、目的とする外来蛋白質をペ
ニシリナーゼとの融合ポリペプチドとして大腸菌内で生
産させるときには、外来蛋白質をペニシリナーゼ融合蛋
白質として菌体外に分泌生産でき、その後酵素的または
化学的処理により目的ポリペプチドを容易に入手し得る
との着想から鋭意研究を重ねた。その結果、実際に大腸
菌内に導入することによって、目的ポリベプチドをペニ
シリナーゼ融合ポリベプチドとして菌体外に分泌させ得
る新しいベクター（プラスミド）及び該ベクターのため
のポリペブチド分泌発現用ベクターの構築に成功すると
共に、このベクターの利用による目的ポリペプチドの製
造に成功した。

本発明のポリペプチド分泌発現用ベクターは、目的ポリ
ベプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を直接連結できる
ように設計されたべニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
基配列を保有している。従って該ベクターには、そのペ
ニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列に直接目的ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を連結させるこ
とができ、かくして得られる発現ベクターは、これを大
腸菌に導入して形質転換させることにより、該大腸菌の
培養によって菌体外に目的ポリペプチドをペニシリナー
ゼ融合ポリペブチドとして分泌生産させることができる
。

以下、本発明ベクターの製造技術につき詳述する。

本発明ベクターの必須構成要件とするペニシリナーゼを
コードするＤＮＡ塩基配列は、好アルカリ性バチルスＮ
α１７０株由来のそれを利用することが出来る。該ペニ
シリナーゼは、下記式（１）に示すアミノ酸配列を有し
ている。

ｕＬｅｕＧ　ｌ　ｙＴｈ　ｒＴｈｒＧ　ｌ　ｎＰｈｅＶ
ａ　ｌｓｅｒＴｈ　ｒ　Ｉ　ｌｅｓｅｒｓｅｒＶａ　Ｉ
Ｇ　１　ｎＡ１ａＳｅｒＧ　１ｎＬｙｓ　Ｖａ　ＩＧ　
ｌｕＧ　Ｉｎ　Ｉ　１ｅＶａ　Ｉ　Ｉ　１ｅＬｙｓＡ　
ｓｎＧ　ｌ　ｕＴｈｒＧ　ｌｙＴｈｒＩ１ｅＳｅｒＩ　
ＩｅＳｅｒＧ１ｎＬｅｕＡｓｎＬｙｓＡｓｎＶａＩＴｒ
ｐＶａｌＨｉｓＴｈｒＧ１ｕＬｅｕＧ１ｙＴｙｒＰｈｅ
ＡｓｎＧ１ｙＧｌｕＡ１ａＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｓｎＧ
１ｙＬｅｕＶａ　ＩＬｅｕＡｓｎ　Ｔｈ　ｒＳｅｒＬｙ
ｓＧ　１　ｙＬｅｕＶａ　ｌ　ＬｅｕＶａ　ＩＡ　ｓ　
ｐＳｅｒＳｅｒＴｒｐＡ　ｓｐＡｓｎＬｙｓＬｅｕＴｈ
ｒＬｙｓＧ　１　ｕＬｅｕ　Ｉ　１ｅＧ　ｌ　ｕＭｅ　
ｔＶａ　ＩＧ　１ｕＬｙｓ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＧ　Ｉｎ　
Ｌｙｓ　ＡｒｇＶａ　ＩＴｈｒＡｓｐＶａ　Ｉ　Ｉ　ｌ
ｅ　Ｉ　１ｅＴｈｒＨ　ｉｓＡ　ｌａ　ＨｉｓＡ　１ａ
Ａｓ　ｐＡｒｇ　Ｉ　１ｅＧ　Ｉ　ｙＧ　ｌｙ　Ｉ　１
ｅＴｈｒＡ　ｌａＬｅｕＬｙｓＧ　１ｕＡｒｇＧ　ｌｙ
Ｉ１ｅＬｙｓ　Ａ　ｌａＨ　ｉｓｓｅｒＴｈｒＡ　１　
ａＬｅｕＴｈｒＡ　ＩａＧ　１ｕＬｅｕＡ　１ａＬｙｓ
ＬｙｓＳｅｒＧｌｙＴｙｒＧ１ｕＧ１ｕＰｒｏＬｅｕＧ
１ｙＡｓｐＬｅｕＧ１ｎＴｈｒＶａ　ｌＴｈｒＡｓｎＬ
ｅｕＬｙｓＰｈｅＧｌｙＡｓｎＴｈｒＬｙｓＶａＩＧ１
ｕＴｈｒＰｈｅＴｙｒＰｒｏＧＩｙＬｙｓＧ　ＩｙＨ　
ｉｓＴｈ　ｒＧ　１ｕＡｓ　ｐＡｓｎ　Ｉ　１　ｅＶａ
　Ｉ　Ｖａ　ＩＴｒｐＬｅｕＰｒｏＧ　ｌｎＴｙｒＧＩ
ｎＩ　ＩｅＬｅｕＡ１ａＧＩｙＧ１ｙＣｙｓＬｅｕＶａ
ｌＬｙｓｓｅｒＡ１ａＧ１ｕＡ１ａＬｙｓＡｓｎＬｅｕ
ＧｌｙＡｓｎＶａＩＡ１ａＡｓｐＡ　ＩａＴｙｒＶａ　
ＩＡｓｎＧｌｕＴｒｐＳｅｒＴｈｒＳｅｒ　Ｉ　１ｅＧ
　１　ｕＡｓ　ｎＭｅ　ｔＬｅｕＬｙｓ　ＡｒｇＴｙｒ
ＡｒｇＡｓｎ　Ｉ　ＩｅＡｓｎ　ＬｅｕＶａ　ＩＶａ　
ＩＰｒｏＧ　１ｙＨ　ｉｓＧ　ｌ　ｙＬｙｓＶａ　ＩＧ
　ｌｙＡｓ　ｐＬｙｓＧ　１ｙＬｅｕＬｅｕ　Ｌただし
、−１“−３０の番号の付いたアミノ酸は、分泌の際切
断されるシグナルペプチドに相当する。

また、該ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列は
、下記式（２）に示されたものである。

ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＣＧＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧ
ＴＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴ八ＣＴＡＧＧ
ＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＣＧＡＴＴ
ＴＣＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣ八八ＡＡＧＧ
ＴＡＧＡＧＣＡＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡ
ＧＡＣＧＧＧＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＧ
ＴＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＧＴＴＣＡＴＡ
ＣＧＧＡＧＴＴＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡ
ＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＧＧＴＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＴＡＧＴＡＣ
ＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＣＡＡ
ＡＴＴＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＴＧ
ＧＴＡＧＡＡＡＡＧ　Ａ　ＡＡ　ＴＴＴＣＡＧＡ　ＡＧ
ＣＧＣＧＴＡ　Ａ　ＣＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＡ　ＴＴ　
Ａ　ＣＡ　ＣＡ　ＴＧＣＧＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡ　
ＡＴＴＧＧＣＧＧＡ　Ａ　ＴＡＡＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡ
　ＡＧＡ　Ａ　ＡＧＡＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴ
ＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＧＣＡＧＡＡＣＴＡＧ
ＣＡＡＡＧＡＡＡ　ＡＧＴＧＧＡＴＡＴＧＡ　Ａ　ＧＡ
　ＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＧ　ＡＴＴＴＡＣＡ　Ａ　ＡＣ
Ａ　ＧＴＴＡＣＧＡ八ＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡ
ＴＡＣＡＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＣＧＴＴＣＴＡＴＣＣＡ
ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡ
ＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＣＣＡＣＡＡＴ八ＴＣＡ
ＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＧＴＡ
ＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧ
ＧＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＴＡＡＡ
ＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴ
ＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡ
ＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＡＡ
ＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡ
ＣＡＴＡＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡ　　（２
）また本発明ベクターに保有されるペニシリナーゼをコ
ードするＤＮＡ塩基配列は、上記の如き具体的ＤＮＡ塩
基配列を基本として、その３′側付近、即ちこれに目的
ポリペプチドが連結される側付近、好ましくはその１０
塩基以内に、またはこれにさらに１０塩基以内のＤＮＡ
配列を付加してこの付加部分に、制限酵素認識配列を含
ませるものとする。

これは上記ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列
と、目的ポリベプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とを
直接連結するために必須のものである。しかしてこの制
限酵素認識配列を認識する酵素としては、公知の制限酵
素のいずれでもよいが、好ましくは５塩基以上の塩基配
列を認識するものがよく、この酵素に応じて上記３′側
付近のＤＮＡ塩基配列は、任意に変化させることが出来
る。

例えば、上記ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配
列の３′側にＡＧＡＴＣＴの６塩基配列を連結させれば
、本６塩基配列はＢｇｌＩＩにより認識され切断される
。従ってこれを、ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
基配列と目的ポリペプチドとの連結点として用いるとき
には、本６塩基配列の３′側に例えばウロキナーゼ等の
特異性が高い蛋白質分解酵素が認識するアミノ酸配列に
対応するＤＮＡ塩基配列、または、臭化シアン等の化学
物質が特異的に認識するアミノ酸に対応するＤＮＡ塩基
配列を介し目的ポリペプチドのＤＮＡ塩基配列を連結す
ることが出来る。ただし、ウロキナーゼ等や臭化シアン
等の認識アミノ酸配列に対応するＤＮＡ塩基配列を付加
する理由は、精製されたべニシリナーゼ融合蛋白質から
目的ポリベプチドを単離するときにこれらの酵素や化学
物質を使うからである。

従って、本発明ベクターの構成要素とするペニシリナー
ゼをコードするＤＮＡ塩基配列の具体例は、上記した６
塩基配列を付加させた下記式（３）に示すＤＮＡ塩基配
列を有するものである。

ＡＴＧＡＡＡ八八ＧＡＡＴＡＣＧＴＴＧＴＴＡ八八ＡＧ
ＴＡＧＧＡＴＴＡＴＧＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＧＧ
ＡＡＣ八八ＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＣＧＡＴＴ
ＴＣＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＡＡＡＧＧ
ＴＡＧＡＧＣ八八ＡＴＡＧＴＡＡＴＣ八八八八八ＴＧＡ
ＧＡＣＧＧＧＡＡＣＣＡＴＴＴＣＡＡＴＡＴＣＴＣＡＧ
ＴＴＡＡＡＣＡＡＧ八八ＴＧＴＡＴＧＧＧＴＴＣＡＴＡ
ＣＧＧＡＧＴＴＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＡ
ＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＧＧＴＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＴＡＡＴＡＣＴＴＣＴＡＡＡＧＧＧＣＴＡＧＴＡＣ
ＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＴＡＡＣＡＡ
ＡＴＴＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＴＧ
ＧＴＡＧＡＡＡ八ＧＡ八八ＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＧＣＧ
ＴＡＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＴＴＡＴＴＡＣＡＣＡＴＧＣ
ＧＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧ八八ＴＡ
ＡＣＡＧＣＧＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣ八ＴＴＡ
ＡＡＧＣＧＣＡＴＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＧＣ
ＡＧＡＡＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡ八八ＧＴＧＧＡＴＡＴ
ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＴＴＴＡＣ八八Ａ
ＣＡＧＴＴＡＣＧＡ八ＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴＧＧＣＡＡ
ＴＡＣ八八ＡＡＧＴＡＧＡ八八ＣＧＴＴＣＴＡＴＣＣＡ
ＧＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡ
ＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣＡ
ＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＴＡＧＴＡ
ＡＡＡＴＣＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧ
ＧＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＴＡＡＡ
ＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＴＧＡＧＡＡＴ
ＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡ
ＡＴＴＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＡＡ
ＡＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴ本発
明における上記ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基
配列またはこれを含む塩基配列は、従来公知の各種の方
法、例えばこれを含有する微生物、それから単離された
プラスミド等、好ましくは、例えばｐＥＡＰ８２等から
制限酵素等を利用して切断単離する方法、そのＤＮＡ塩
基配列に従い化学合成する方法、これらの方法の組み合
わせ等により容易に製造することができる。また上記ペ
ニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と目的ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ塩基配列との連結ないし結合
手段も、従来公知の各種方法、例えばＴ４ＤＮＡリガー
ゼ等を用いる酵素反応等に従うことができる。

上記のごとくして得られるペニシリナーゼをコードする
ＤＮＡ塩基配列を含む本発明ベクターは、該ＤＮＡ塩基
配列を、ｐＭＢ９プラスミドのｋｉｌ遺伝子領域を好ア
ルカリ性バチルスＮｏ．　１７０株ＤＮＡ由来のプロモ
ーター（Ｅｘプロモーター）の下流領域に含むことを特
徴とする菌体外分泌ベクター〔公開特許公報昭６２−２
９９８２３に組み込むことにより得られる。このＤＮＡ
塩基配列の組み込みのために好適な起源ベクターの例と
しては、上記したプラスミドｐＥＡＰ８２を例示できる
。

上記起源ベクターへのべニシリナーゼをコードするＤＮ
Ａ塩基配列の導入操作は、従来よりこの種外来遺伝子を
ベクターに組み込む際に用いられているこれらの操作に
従うことができる。その例としては前述した通りである
。

また上記の如くして得られる本発明のペニシリナーゼを
コードするＤＮＡ塩基配列を含むポリペプチド分泌発現
用ベクターは、これを実際に宿主細胞に導入して目的ポ
リペプチドを菌体外に分泌発現させるためには、これに
目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を更に導
入しなければならないことは勿論のこと、他にプロモー
ターリボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結
因子等の転写調節因子や翻訳調節因子等を含んでいなけ
ればならない。これらの各因子は、既に起源ベクターに
含まれている場合があり、この場合には該起源ベクター
、例えばｐＥＡＰ８２由来のペニシリナーゼの調節因子
等をそのまま用いることができる。これに限定されるこ
となく、従来公知の他の微生物またはウィルス由来の各
種ＤＮＡに含まれているこれらの調節因子を用いること
もできる。その例としては、例えば大腸菌ラクトースオ
ペロン、トリプトファンオペロン、λファージのＰＬ等
のプロモーター、βガラクトシダーゼのＳＤ配列等のり
ボゾーム結合部位、大腸菌のｒｒｎＢ、λファージのｔ
Ｌｌ等の転写終結因子等を例示できる。また翻訳停止シ
グナルとしては、ＴＡＡ。

ＴＡＧ及びＴＧＡの３通りの塩基配列を利用できる。更
に上記調節因子は、これらを含むＤＮＡより常法に従い
取り出した後、必要なものを適当なベクターに通常の方
法に従い導入することもできる。

特に好ましい上記調節因子と、ペニシリナーゼとを保存
する本発明ベクターの一具体例としては、ｐＥＡＰ８２
を起源ベクターとして構築されたｐＥＡＰ８５を例示で
きる。このプラスミドｐＥＡＰ８５は、ペニシリナーゼ
のプロモーター及びリボゾーム結合部位に続いてペニシ
リナーゼのシグナルペプチド及び成熟蛋白質をコードす
るＤＮＡ塩基配列を有し、この塩基配列の３′末端にＢ
ｇｌＩＩの制限酵素認識配列を有するものである。そし
てその更に下流に、ｒｒｎＢ由来の転写終結因子を含む
ものである。その特性は、その製造概略操作と共に第１
図に示した通りである。第１図より、ｐＥＡＰ８５は図
示された制限酵素開裂地図により特徴付けられる。また
ＰＦ　ｐ　ＥＡ　Ｐ　８５の大きさは、１６０％アガロ
ースゲル電気泳動による測定の結果、約５．１ｋｂであ
る。このプラスミドｐＥＡＰ８５を保有する大腸菌ＨＢ
ＩＯＩは、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
に（ＨＢ　１０１（ｐＥＡＰ８５））なる表示で、微工
研菌寄第１０２６６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２６６）と
して寄託されている。

上記各種の調節因子を含み、且つペニシリナーゼをコー
ドするＤＮＡ塩基配列と、これに例えばウロキナーゼ等
の特異性が高い蛋白質分解酵素が認識するアミノ酸配列
に対応するＤＮＡ塩基配列、または、臭化シアン等の化
学物質が特異的に認識するアミノ酸に対応するＤＮＡ塩
基配列を介し連結された目的ポリペプチドをコードする
ＤＮＡ塩基配列とを有する本発明のポリペプチド分泌発
現ベクターは、上記した本発明ベクターと同様にして構
築され、本発明はペニシリナーゼ融合蛋白質としてポリ
ペプチドを菌体外に分泌発現させるベクターをも提供す
るものである。

上記ポリペプチドの例としては、例えばインシュリン、
カルシトニン、表皮細胞増殖促進因子、ソマトスタチン
、ＧＩＰ、Ｒ−ＭＳＡ、サイモシンβ４、成長ホルモン
放出因子等のホルモン及び成長因子類を例示できる。こ
れらの各種ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列は
、それらの起源とする細胞等から通常の方法に従い抽出
単離してもよく、これらポリペプチドのアミノ酸配列に
従い化学合成することもできる。

これらのポリペプチドのＤＮＡ塩基配列と、ペニシリナ
ーゼのＤＮＡ塩基配列との連結は、例えばペニシリナー
ゼのＤＮＡ塩基配列を保有する本発明のポリペプチド分
泌発現ベクターに、これらのポリペプチドのＤＮＡ塩基
配列を、前述した方法に従い制限酵素を用いる酵素反応
及び例えばＴ４リガーゼを用いる酵素反応を利用して導
入することにより実施できる。また、予め上記ポリペプ
チドとペニシリナーゼとの融合ポリペプチドのＤＮＡ塩
基配列を化学合成した後、このＤＮＡ塩基配列を、前記
ペニシリナーゼのＤＮＡ塩基配列の導入と同様にして、
菌体外分泌ベクターに導入することによっても行なうこ
とができる。

かくして融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列
を保有する本発明のポリペプチド分泌発現ベクターを得
ることができる。これは、上記融合ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ塩基配列の前にプロモーター及びリボゾー
ム結合部位を有し、且つ上記塩基配列を構成する目的ポ
リペプチドのＤＮＡ塩基配列の直後に翻訳停止シグナル
を有しており、適当な宿主細胞に導入することにより、
該細胞を形質転換してポリペプチド分泌発現型とするこ
とができる。

上記ポリペプチド分泌発現ベクターの好ましい具体例と
しては、ｐ　８５　ｈ　０８及びｐ　８５　ｈ　０９を
例示できる。これらのプラスミドの内でｐ　８５　ｈ　
０８は、ペニシリナーゼのプロモーター及びリボゾーム
結合部位、ペニシリナーゼのシグナルペプチド及び成熟
蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列を有し、特異性が高
い蛋白質分解酵素、ここではウロキナーゼ、が認識する
アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）に対応するＤ
ＮＡ塩基配列、インシュリンＢ鎖（目的ポリペプチド）
のＤＮＡ塩基配列及びその翻訳停止シグナルが正確にこ
の順序で配列されたＤＮＡ塩基配列を有している。その
配列は、後記実施例において第３表として示した通りで
ある。このプラスミドｐ　８５ｈ０８を保有する大腸菌
ＨＢＩＯＩは、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に（ＨＢ　１０１　（ｐ８５ｈ０８）　）なる表示
で、微工研菌寄第１０２６４号（ｐｇＲ？１ｐ−１０２
６４）として寄託されている。

またｐ　８５　ｈ　０９は、ペニシリナーゼのプロモー
ター及びリボゾーム結合部位、ペニシリナーゼのシグナ
ルペプチド及び成熟蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列
を有している点においてｐ　８５　ｈ　０８と共通する
が、ペニシリナーゼとインシュリンＢ鎖（目的ポリペプ
チド）のＤＮＡ塩基配列との連結点に化学物質、ここで
は臭化シアンが特異的に認識するアミノ酸（Ｍｅｔ）に
対応するＤＮＡ塩基配列を有している点に特徴がある。

その配列は、後記実施例において第５表として示した通
りである。

このプラスミドｐ　８５　ｈ　０９を保有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に（ＨＢ　１０１　（ｐ８５ｈ０９）　）なる表示で
、微工研菌寄第１０２６５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２６
５）として寄託されている。

本発明のポリペプチド分泌発現ベクターの宿主細胞への
導入は、公知の各種方法によって行なうことができ、用
いられる宿主細胞としての大腸菌の株は特に限定はない
。これらの内で特に大腸菌に１２株由来のＨ８１０１株
は好ましい。

上記宿主細胞へのベクターの導入方法としての具体例と
しては、例えば宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含む
水溶液中で処理し、該溶液中にベクターを添加する方法
（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１１９．１０７２（１
９７４）　）を例示できる。

上記のようにして本発明ベクターを導入して形質転換し
た細胞を培養するときには、細胞内で前駆体型の融合ポ
リペプチドが生産され、続いてペリプラズムに成熟融合
ポリペプチドが蓄積し、更に培養を続けることによって
本融合ポリペプチドが菌体外に分泌生産される。即ち、
まず、ベクター中の融合ポリペプチドをコードする遺伝
子から、ベクター中の転写調節因子並びに宿主細胞中の
諸因子の作用でｍＲＮＡが生産される。次いで、ｍＲＮ
Ａから翻訳調節因子並びに宿主細胞中の諸因子の作用で
前駆体型融合ポリペプチドが生産される。更にここで生
産される前駆体は、シグナルペプチドの作用により、ペ
リプラズムに分泌され、同時にシグナルペプチダーゼの
作用により、前駆体からシグナルペプチドが切り離され
成熟融合ポリペプチドとなる。更にベクター中に存在す
るｋｉｌ遺伝子がＥｘジブロモーにより活性化され、そ
の結果、大腸菌外膜の透過性が増大化し、ペリプラズム
に蓄積されていた成熟融合ポリペプチドが菌体外に分泌
生産される。

かくして分泌生産されたペニシリナーゼ融合ポリペプチ
ドは、ペニシリナーゼ活性を有しており本活性を指標に
容易に分離精製することができる。

この分離精製操作としては、例えば培養上清を透析後イ
オン交換クロマトグラフィーにかける方法を採用するこ
とができる。精製されたペニシリナーゼ融合ポリペプチ
ドは、更にウロキナーゼあるいは臭化シアンによって分
解され、目的ポリペプチドは高速液体クロマトグラフィ
ー等によって容易に回収することができる。

以下本発明を実施例により更に詳しく説明する。

実施例１　ペニシリナーゼ融合ポリペプチド分泌発現用
ベクターｐＥＡＰ８５の構築 ■　菌体外分泌ベクターｐＥＡＰ８２（村上ら、投稿中
〕２μｇを制限酵素旧ｎｃＩＩ　（東洋紡社製、ＨＮＣ
−２０２）で部分分解後、５′末端がリン酸化されてい
るＢａｍｔｌ　［リンカ−（東洋紡社製、ＢＡＨ−８０
１）１μｇを混ぜ、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製、２０１１Ａ）を用い、１６°Ｃ１１昼夜
連結反応を行った。次にこの反応液を大腸菌ＨＢＩＯＩ
コンピテントセル２００μｌに混合し、０°Ｃ下で１時
間静置する。更に、４２°Ｃ１７０秒間加温し、形質転
換を行った。得られた形質転換体を３　ｍｌのし一ブロ
スに植菌し、３７°Ｃ下で３時間培養後培養液を２０μ
ｇ　／　ｍＱのクロラムフェニコール（シグマ社製、Ｃ
−０３７８）を含むＬＢ寒天平板に塗抹し、クロラムフ
ェニコール耐性を示すコロニーを選択した。選択された
コロニーからｐＥＡＰ８２においてペニシリナーゼ遺伝
子の下流に存在した旧ｎｃＩＩサイトがＢａｍＨＩサイ
トに変換したプラスミドを含む形質転換株を得た。

本形質転換株からプラスミドをアルカリ−３ＤＳ法によ
り調整し、このプラスミドをｐＥＡＰ８３とした。

■　また一方、ｐＥＡＰ８２１ｏμｇを制限酵素ＣＩａ
Ｉ（宝酒造社製、１０３４Ｂ）とＥｃｏＲＩＩ　（ニノ
ボンジーン社製、３１５−００８８２）とにより完全分
解後、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、エ
チジウムプロミド染色後、約５０塩基対からなるＣ１ａ
Ｉ−ＥｃｏＲＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を切り出し、抽出し
た。

■　ペニシリナーゼのＣ末端アミノ酸配列に対応するＤ
ＮＡ塩基配列及び８ｇｌｌｌサイト、翻訳停止シグナル
を含むオリゴヌクレオチド合成のために、以下の塩基配
列を有する４種のオリゴヌクレオチドのそれぞれをＡＢ
Ｔ社製、自動ＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂのシステム
を利用して合成した。

＜ｂ　　（５’）　　ＣＣＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＡＡＡ
ＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＡＣＴＴＴＴＡＣ
ＡＴＡＣＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＣ
（３”）＜２＞　　（５’）　　ＴＴＡＡＧＡＡＡＣＴ
ＧＣＡＧＡ八八ＴＡＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣへへＡＴＧＡ
ＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＧ（３′）＜３＞　　（
５’）　　ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＣＴ
ＣＡＴＴＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡ
ＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＡＡ　（３”）
＜４＞　　（５’）　　ＴＡ八へへＣＣＡＡＴＧＴＡＴ
ＧＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＣＣＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣ
ＴＴＴＣＣＣＧＴＧ八へ３′）上記オリゴヌクレオチド
の５′端をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東
洋紡社製、ＰＮＫ−１０４）を用いてリン酸化した。

■　上記■で得たプラスミドｐＥＡＰ８３の１０μｇを
、制限酵素Ｃ１ａｌとＢａｍＨＩ（東洋紡社製、ＲＡＭ
−１０４）とで完全分解し、１．０％アガロースゲル電
気泳動を行い、エチジウムプロミド染色後、約４゜２５
キロ塩基対のＤＮＡ断片を切り出し、ＤＮＡセル（第一
化学社製、ＤＮＡ−０００１）を用いて、本断片を電気
的に回収した。

■　上記■で得たＤＮＡ断片と上記■で調整したリン酸
化オリゴヌクレオチドのそれぞれ約１μｇを合わせて、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結合反応させ、次の第１表に示
す１６３塩基対からなるｐ　１０７１０７Ｃ１ａｌ−Ｂ
ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を得た。

（本頁以下余白） 第１表 ＣＩａＩ Ｃ１ａＩ−ＥｃｏＲＩＩ断片 ■　上記■で得たＤＮＡ断片と、上記■で得たｐ１０７
ＤＮＡ断片それぞれ１μｇを合わせてＴ４ＤＮＡリガー
ゼにて結合反応させた。反応終了後、大腸菌８８１０１
株を形質転換し、得られたクロラムフェニコール耐性で
且つアンピシリン耐性を示す形質転換株からプラスミド
を単離し、ペニシリナーゼ構造遺伝子のＣ末端側に相当
するＤＮＡ塩基配列にＢｇｌＩＩサイトをもつプラスミ
ドｐＥＡＰ８４を得た。

■　一方、ｒｒｎＢ転写終結因子を含むプラスミドｐＫ
Ｋ２２３−３（ファルマシア社製、２７−４９３５−０
１）　１０μｇを制限酵素Ｈｔｎｃ１１で切断し、上記
■で行なったときと同様の操作で、ＢａｍＨＩリンカ−
を結合させた。次ぎにこれを制限酵素ＰｓｔＩ　（東洋
紡社製、ＰＳＴ−１０７）とＢａｍＨＩとで完全分解さ
せ、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、０．
７５キロ塩基対のｒｒｎＢ転写終結因子を含むＰｓｔｌ
−ＢａｍＨＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を切り出し抽出した。

■　上記■で得たプラスミドｐＥＡＰ８４　１μｇをＰ
ｓｔＩとＢａｍＨとで切断後、上記■で得たｒｒｎＢ転
写終結因子を含む０．７５キロ塩基対のＰｓｔｌ−Ｂａ
ｍＨＩＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結
合反応させた。反応終了後、大腸菌Ｈ８１０１株を形質
転換し、得られたクロラムフェニコール耐性で且つアン
ピシリン耐性を示す形質転換株からプラスミドを単離し
、ペニシリナーゼ構造遺伝子の下流側に０．７５キロ塩
基対のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡ断片が挿入された
プラスミドｐＥＡＰ８５を得た。

一連の操作の概略は第１図に示す通りである。

得られたｐＥＡＰ８５は、１．０％アガロースゲル電気
泳動の結果、５．１キロ塩基対の大きさを有しており、
そのＤＮＡ塩基配列をＭ１３法（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、　Ｉｎ　Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍ
ｐ０８ｉｕｍｏｎ　？Ｉａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：
　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ＋　　Ｉ）ｐ、
１４３−１５３．Ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙＡ、　　Ｗａｌ
ｔｏｎ、　　（１９８１）　　八ｍｓｔｅｒｄａｍ：　
　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、）　　により分析した結果、期待
通りにＤＮＡ塩基配列が挿入されていることが確認され
た。

該ｐＥＡＰ８５は、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に（ＨＢ　１０１（ｐ　ＥＡ　Ｐ８５））なる
表示で、微工研菌寄第１０２６６号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１
０２６６）として寄託されている。

実施例２　ペニシリナーゼーインシュリンＢ鎮融合ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ塩 基配列を有する分泌発現ベクターの構 築 （Ａ）ウロキナーゼ認識アミノ酸配列を介してペニシリ
ナーゼとインシュリンＢ鎖とがつながった融合ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ塩基配列を有する分泌発現ベク
ターｐ　８５　ｈ　０８の構築■　インシュリンＢ鎖の
塩基配列は、広瀬と板倉の総説〔ファルマシア・レビュ
ーＮｏ、　３　、　ｐｐ、４９５７　（１９８０））を
参考にして、まずインシュリンＢ鎖をコードするＤＮＡ
塩基配列の前に、制限酵素認識部位及びウロキナーゼ認
識アミノ酸配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−＾ｒｇ）をコードす
るＤＮＡ塩基配列を付加し、またその後に、終止コドン
及び制限酵素認識部位を付加してなるオリゴヌクレオチ
ド合成のために、以下の塩基配列を有する４種のオリゴ
ヌクレオチドのそれぞれをＡＢＩ社製、自動ＤＮＡ合成
装置モデル３８０Ｂのシステムを利用して合成した。

＜５＞　　（５’）　　ＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＧＴ
ＴＴＣＧＴＣ八八ＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴ
へへＣＡＣＣＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣ（３
”）＜６＞　　（５’）　　ＣＴＴＧＴＴＴＧＣＧＧＴ
ＧＡＡＣＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＴＣＣＴＡ
ＡＧＡＣＴＴＡＡＴＡＡ　（３”）＜７＞　　（５’）
　　ＧＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＴＣＴＴＡＧＧＡＧＴＧ
ＴＡＧＡＡＧ八八ＡＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＧＣＡＡＡ
ＣＡＡＧＧＴＡＣＡＡＧＧＣＴ　　（３’）＜８＞　　
（５’）　　ＴＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣ
ＡＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧＡＡＡＣＧＡＣＣ
ＴＴＣＡ　　（　３”）上記オリゴヌクレオチド〈６〉
及び〈８〉の５′端をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（東洋紡社製、ｐＮＫ−ｘｏ４）を用いてリン酸
化し、〈５〉から〈８〉までのそれぞれ約１μｇを合わ
せて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結合反応させ、次の第２
表に示す１１０塩基対からなるＵＫＩＮ−ＢＢｇｌＩ［
ＤＮＡ断片を得た。

第２表　ＵＫＩＮ−Ｂ ■　実施例１で得たｐＥＡＰ８５の１μｇを制限酵第３
表　＞Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｄｅ　［Ｕｎｉｖｅｒｓａ
ｌ］ｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＴｈｒＴｈｒＧＩｎＰｈｅ
ＶａｌＳｅｒＴｈｒｌｌｅＳｅｒＳｅ八ｓｎＧＩｕＴｈ
ｒＧＩｙＴｈｒＩＩｅＳｅｒＩ１ｅＳｅｒＧｌｎＬｅｕ
ＡｓｎＬｙｓＡｓｎＶａｌＴｒｐＶａｌ｝ｌｉｓＴｈｒ
ＧｌｕＬｅｕＧ１ｙＴｙｒＰｈｅＡｓｎＧｌｙＧｌｕＡ
ＩａＶａｌＰｒｏＳｅｒＡｓｎＧ１ｙＬｅｕＶａｌＬｅ
ｕＡｓｎＴｈｒＳｅｒＬｙｓＧｌｙＬｅｕＶａＩＬｅｕ
Ｖａ　ｌＡｓｐＳｅｒＳｅｒＴｒｐＡｓｐＡｓｎＬｙｓ
ＬｅｕＴｈｒＬｙｓＧ１ｕＬｅｕＩＩｅＧｌｕＭｅｔＶ
ａｌＧ１ｕＬｙｓＬｙｓＰｈｅＧｌｎＬｙ素ＢｇｌｌＩ
で切断し、上記■で得たＵＫＩＮ−ＢＢｇｌｌｌ［　Ｎ
　Ａ断片１μｇと混ぜＴ４ＤＮＡリガーゼにて結合反応
させた。反応終了後、大腸菌ＨＢＩＯＩ株を形質転換し
、得られたクロラムフェニコール耐性で且つアンビシリ
ン耐性を示す形質転換株からプラスミドを単離し、Ｂｇ
ｌｌＩサイトにＵＫＩＮ−Ｂ断片が正方向で挿入された
（ペニシリナーゼの遺伝子の方向と同じ方向にインシュ
リンＢ鎖の遺伝子がつながっている）プラスミドｐ　８
５　ｈ　０８を得た。本操作の概略は、第２図に示す通
りである。

なお、挿入断片の方向性の確認は、ＤＮＡ塩基配列を決
定することにより行なった。その結果、該ＤＮＡ塩基配
列は、下記第３表の通りでありｐ　８４　ｈ　０８がペ
ニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と、ウロキナ
ーゼ認識アミノ酸配列及びインシュリンＢ鎖コードする
ＤＮＡ塩基配列とが正確にこの順序で配列されているこ
とが確認された。また第３表には、ＤＮＡ塩基配列に対
応するアミノ酸配列も併記する。

ＣＧＡＡＴＴＧＧＣＧＧＡＡＴＡＡＣＡＧＣＧＴＴＧＡ
ＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＴＴＡ＾ｒｇＩ１ｅＧｌｙＧ
１ｙＩｌｅＴｈｒＡ１ａＬｅｕＬｙｓＧ１ｕＡｒｇＧｌ
ｙｌｌｅＬｙｓＡ１ａＨｉｓＳｅｒＴｈｒＡ１ａＬｅｕ
ＴｈｒＡｌａＧ１ｕＬｅｕＡ１ａＬｙｓＬｙｓＳｅｒＧ
ｌｙＴｙｒＧＩｕＧＩｕＰｒｏＬｅｕＧ１ｙＡｓｐＬｅ
ｕＧ１ｎＴｈｒＶａｌＴｈｒＡｓｎＬｅｕＬｙｓＰｈｅ
ＧＩｙＡｓｎＴｈｒＬｙｓＶａｌ．ＧｌｕＴｈｒＰｈｅ
ＴｙｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧｌｙＨｉｓＴｈｒＧ１ｕＡ
ｓｐＡｓｎｌ　１ｅＶａｌＶａｌＴｒｐＬｅｕＰｒｏＧ
ＩｎＴｙｒＧＩｎｌ１ｅＬｅｕＡｌａＧ１ｙＧ１ｙＣｙ
ｓＬｅｕＶａｌＬｙｓＳｅｒＡ１ａＧ１ｕＡｌａＬｙｓ
ＡｓｎＬｅｕＧｌｙＡｓｎＶａｌＡ１ａＡｓｐＡＩａＴ
ｙｒＶａｌＡｓｎＧ１ｕＴｒｐＳｅｒＴｈｒＳｅｒｒ　
ｌｅＧ１ｕＡｓｎＭｅｔＬｅｕＬｙｓＡｒｇＴｙｒＡｒ
ｇＡｓｎＩ１ｅＡｓｎＬｅｕＶａｌＶａｌＰｒｏＧＩｙ
ＨｉｓＧｌｙＬｙｓＶａｌＧ１ｙＡｓｐＬｙｓＧｌｙＬ
ｅｕＬｅｕＬｅｕｌｌｉｓＴｈｒＬｅｕＡ該ｐ　８５　
ｈ　０８は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所に（ＨＢ　１０１　（ｐ８５ｈ０８）　）なる表示で
、微工研菌寄第１０２６４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０２６
４）として寄託されている。

（Ｂ）臭化シアン認識アミノ酸配列を介してペニシリナ
ーゼとインシュリンＢ鎖とがつながった融合ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ塩基配列を有する分泌発現ベクタ
ーｐ　８５　ｈ　０９の構築■　インシュリンＢ鎖をコ
ードするＤＮＡ塩基配列の前に、制限酵素認識部位及び
臭化シアン認識アミノ酸配列（Ｍｅｔ）をコードするＤ
ＮＡ塩基配列を付加し、またその後に、終止コドン及び
制限酵素認識部位を付加してなるオリゴヌクレオチド合
成のために、新たに以下の塩基配列を有する２種のオリ
ゴヌクレオチドのそれぞれをＡＢ１社製、自動ＤＮＡ合
成装置モデル３８０Ｂのシステムを利用して合成した。

＜９＞　　（５’）　　ＧＡＴＣＴＡＴＧＴＴＣＧＴＣ
ＡＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＴＣＡＣＣ
ＴＣＧＴＴＧＡＡＧＣＣＴＴＧＴＡＣ（３’）＜１０＞
　　（５’）　　ＴＣＡＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＡＡＣＣ
ＡＣＡ八八ＧＧＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧＡＡＣへへＡ
　（３’） 上記オリゴヌクレオチド〈６〉及び〈１０〉の５′端を
それぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製、
ＰＮＫ−１０４）を用いてリン酸化し、＜９〉。

＜５＞、　＜７＞及び〈１０〉のそれぞれ約１μｇを合
わせて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結合反応させ、次の第
４表に示す１０４塩基対からなるＢＲＩＮ−Ｂ　　Ｂｇ
ｌｒＩ　ＤＮＡ断片を得た。

第４表　ＢＲＩＮ−Ｂ ＜／＞ 第５表　＞Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｄｅ　［Ｕｎｉｖｅｒ
ｓａｌ］■　実施例１で得たｐＥＡＰ８５の１μｇを制
限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、上記■で得たＢＲＩＮ−Ｂ
ＢｇｌＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１μｇと混ぜＴ４ＤＮＡリ
ガーゼにて結合反応させた。反応終了後、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、上記（Ａ）■に記載しである方法
と同様の方法によりプラスミドｐ８５ｈ０９を得た。本
操作の概略は、第３図に示す通りである。

なお、挿入断片の方向性の確認は、ＤＮＡ塩基配列を決
定することにより行なった。その結果、該ＤＮＡ塩基配
列は、下記第５表の通りでありＰ　８４　ｈ　Ｑ９がペ
ニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と、臭化シア
ン認識アミノ酸及びインシュリンＢ鎖コードするＤＮＡ
塩基配列とが正確にこの順序で配列されていることが確
認された。また第５表には、ＤＮＡ塩基配列に対応する
アミノ酸配列も併記する。

ｅｒＬｅｕＬｅｕＧＩｙＴｈｒＴｈｒＧｌｎＰｈｅＶａ
ＩＳｅｒＴｈｒｌｌｅＳｅｒＳｅＡｓｎＧＩｕＴｈｒＧ
ｌｙＴｈｒｌｌｅＳｅｒｌｌｅＳｅｒＧｌｎＬｅｕＡｓ
ｎＬｙｓＡｓｎＶａｌＴｒｐＶａｌＨｉｓＴｈｒＧｌｕ
ＬｅｕＧｌｙＴｙｒＰｈｅＡｓｎＧｌｙＧｌｕＡ　１ａ
Ｖａ　１Ｐｒ０８ｅｒＡｓｎＧ　ＩｙＬｅｕＶａ　ＩＬ
ｅｕＡｓｎＴｈｒＳｅｒＬｙｓｓＡｒｇＶａｌＴｈｒＡ
ｓｐＶａ１１１ｅｌｌｅＴｈｒＨｉｓＡ１ａＨｉｓＡ１
ａＡｓｐ該ｐ　８５　ｈ　０９は、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に（ＨＢ　１０１　（ｐ８５ｈ
０９）　〕なる表示で、微工研菌寄第１０２６５号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１０２６５）として寄託されている。

実施例３　　ｐ　８５　ｈ　０８及びｐ　８５　ｈ　０
９を保有する大腸菌によるペニシリナーゼ融合インシュ リンＢ鎖の菌体外への分泌発現 （八）発現の分布 ■　実施例２で得られたプラスミドｐ　８５　ｈ　０８
及びｐ　８５　ｈ　０９を含む大腸菌Ｈ８１０１株をそ
れぞれ０．２％のグリセリンの含まれたし一ブロス培地
１０　ｍｌに植菌し、３７°Ｃにて２４時間振盪培養し
た。培養終了後、８０００ｒｐｍにて１０分間遠心沈澱
し得られた培養上清を菌体外画分とした。

■　上記■で得られた沈澱菌体を５　ｍｌの生理食塩水
で洗い再び遠心沈澱により菌体を回収した。

次に菌体を５　ｍｌの２５％蔗糖（１ｍＭＥＤＴＡ含有
）にて懸濁し、室温にて１０分間振盪した後、８０００
ｒｐｍにて１０分間遠心沈澱した。上滑を捨てた後、得
られた菌体に０°Ｃに冷やしである蒸留水５成を一気に
いれ、０°Ｃにて１０分間振盪した。

次に１１００００ｒｐにて１０分間遠心沈澱後し、得ら
れた上清をペリプラズム画分とした〔オスモティ・ンク
ショ・ツク法、Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、Ｊ、
八ｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１
．　、１８．３３９（１９８３）　）。

■　上記■で得られた沈澱を、５　ｍｌの５０ｍＭリン
酸緩衝液ｐＨ７，０にて懸濁し、超音波菌体破壊装置（
トミー精工社製、モデル−ＵＲ２００Ｐ）にて０°Ｃｌ
２Ｏキロヘルツ、１分間の超音波処理を行なった。その
後、１００１００００ｒｐ分間の遠心沈澱を行ない、得
られた上清を菌体内画分とした。

■　上記■■■で得られたそれぞれの両分について、ペ
ニシリナーゼの活性を測定した。ペニシリナーゼの活性
は、沢井らによって開発された方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ、Ａｇｅｎｔｓ、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、＋　１３＋
９１０（１９７８）　）に準じて行なった。得られたそ
れぞれの両分のペニシリナーゼ活性測定値から、それぞ
れの両分に含まれるペニシリナーゼ融合蛋白質の量を以
下に示すそれぞれの融合蛋白質の比活性から求めた。ｐ
　８５　ｈ　０８を含む大腸菌から得られた、ウロキナ
ーゼ認識配列を介してペニシリナーゼとインシュリンＢ
鎖とが融合している融合蛋白質（以下、ＰＥＮＨＯ３と
する）の比活性は、４６０ユニット／ｍｇ蛋白質であり
、ｐ　８５　ｈ　０９を含む大腸菌から得られた、臭化
シアン認識配列を介してペニシリナーゼとインシュリン
Ｂ鎖とが融合している融合蛋白質（以下、ＰＥＮＨＯ９
とする）の比活性は、３９０ユニット／ｍｇ蛋白質であ
る。

第６表にこれらの結果をまとめた。

（本頁以下余白） ｐ８５ｈ０８　　　　１２．８　　　　　０．２　　　
　　３．０ｐ８５ｈ０９　　　　　６．９　　　　　０
．８　　　　　３．８ただし、数字は培地１リットル当
りの■数を現わしている。

上記第６表より、本発明により提供されたポリペプチド
分泌発現ベクターｐ　８５　ｈ　０８及びｐ８５ｈ０９
から発現した、それぞれのペニシリナーゼ融合インシュ
リンＢ鎖、ＰＥＮＨＯ３及びＰＥＮＩ！０９は、菌体外
画分にそれぞれ約８０％及び６０％分泌生産されている
ことが確認された。

（Ｂ）融合蛋白質の精製と分析 ■　実施例２で得られたプラスミドｐ　８５　ｈ　０８
及びｐ　８５　ｈ　０９を含む大腸菌８８１０１株をそ
れぞれ０．２％のグリセリンの含まれたＬ−ブロス培地
１００雇に植菌し、３７゛Ｃにて１晩前培養を行なった
。

前項ｔｊ　液をクロラムフェニコール２０μｇ　／　ｍ
ｌを含む同培地１．５リツトルに対して５％植菌後、３
７°Ｃで２４時間振盪培養を行なった。培養終了後、８
０００ｒｐｍにて３０分間遠心沈澱し得られた培養上清
を蒸留水に対し１晩透析した。次に、これをｐＨ７，５
に調整し５０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡化しであるＣＭ
セルロファイン（ファルマシア社製）カラム（２，５ｃ
ｍ　Ｘ　３０ｃｍ）にのせ、同緩衝液にて十分洗浄の後
ＮａＣ１のＯＭから０．５　Ｍまでの直線グラデイエン
ド法により溶出させた。溶出された各フラクションから
、２８０ｎｍの蛋白質に特異的な吸収を測定し、また同
時にペニシリナーゼの活性も測定した。

その結果、単一のピークが得られた（第４図）。

第４図はＰＥＮＨＯ３のＣＭセルロファイン力ラムに於
けるパターンを示したものであるが、ＰＥＮＨＯ９の場
合も殆ど同じパターンであった。

以上のペニシリナーゼ融合蛋白質の精製を第７表にまと
めた。

［ＰＥＮ）１０８］ 透析後 Ｍ セルロファイン ［ＰＥＮＩ＋０９］ 透析後 Ｍ セＩＬＤファイン １５７０　　　５５．５　　　２１０３　　　　３７．
９１３．０　　　２．３１　　　１１３９　　　４９３
．０１６００　　　５Ｂ、２　　　１５８４　　　　２
７．２１０．０　　　１．４９　　　　５８５　　　３
９３．１５４．２ ３６．９ ■　上記■で得られたペニシリナーゼ融合インシュリン
Ｂ鎖、Ｐ　Ｅ　Ｎ　１１０８及びＰＥＮＩ（０９は、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、単一に精
製されていることが確認された。そこで、精製されたこ
れらの融合蛋白質についてアミノ酸分析を行なった結果
、ＤＮＡ塩基配列（第３表及び第５表）から予想された
それぞれのアミノ酸分析値と完全に一敗した。

（Ｃ）精製されたペニシリナーゼ融合インシュリンＢ鎖
からのインシュリンＢ鎖の分離 ■　プラスミドｐ　８４　ｈ　０８を含む大腸菌８８１
０１株の培養濾液から精製された融合蛋白質ＰＩＥＮＨ
Ｏ８の１　ｍｇを、０．１％ＳＤＳ存在下、沸騰水浴中
で加温し冷却後ウロキナーゼ０．０２ｍｇを加えて３７
°Ｃで２４時間消化した。消化後、ＡＢＩ社製、高速液
体クロマトグラフィ装置モデル１３〇へのシステムを利
用して、逆相液体クロマトカラム（ＡＢＩ社製、ＲＰ−
３００，４００４１９）にかけ、融合蛋白質から分離さ
れたインシュリンＢｔ）￥２０μｇを分取した。

■　プラスミドｐ　８４　ｈ　０９を含む大腸菌８８１
０１株の培養濾液から精製された融合蛋白質ＰＥＮＩ＋
０９の１　ｍｇを、７０％蟻酸に溶解し臭化シアン１０
０■を加えて室温で２４時間反応させた。反応後、減圧
下で濃縮し４ＮＮａＯＨで中和後上記■と同様に、液体
クロマトグラフィにかけＰＥＮＨＯ９から分離されたイ
ンシュリンＢ鎖３０μｇを分取した。

■　上記■及び■で得られた目的ポリペプチド（インシ
ュリンＢ鎖）について、アミノ酸分析を行なった結果、
ヒト由来インシュリンＢ　１１のアミノ酸分析値と完全
に一致する事が確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は起源ベクターｐＥＡＰ８２からｐＥＡＰ８３を
得、更に合成りＮＡフラグメントｐ１０７を挿入するこ
とによりｐＥＡＰ８４を得、次にｐＫＫ２２３３−３か
ら切り出した０、７５キロ塩基対からなるｒｒｎＢ転写
終結因子を含むＤＮＡフラグメントをｐＥＡＰ８４のＢ
ａｍＨＩ−Ｐｓｔｌサイトに組換えることにより本発明
ポリペプチド分泌発現用ベクターｐＥＡＰ８５を得る工
程、及びこれにより得られるｐＥＡＰ８５の特徴を示す
図である。図中Ｅｘ−には、菌体外分泌に関与する遺伝
子領域を示している。 第２図は、ｐＥＡＰ８５に合成りＮＡ“’ＵＫＩＮ−Ｂ
″を挿入し、本発明のポリペプチド分泌発現ベクターｐ
　８５　ｈ　０８を得る工程及び得られるベクター　ｐ
８５　ｈ　０８の特性を示す図である。図中白抜きの部
分は、インシュリンＢ鎖の遺伝子を示す。 第３図は、ｐＥＡＰ８５に合成りＮＡ“ＢＲＩＮ−Ｂ”
を挿入し、本発明のポリペプチド分泌発現ベクターｐ　
８５　ｈ　０９を得る工程及び得られるベクター　Ｐ　
８５　ｈ　０９の特性を示す図である。第２図と同様に
白抜きの部分は、インシュリンＢ鎖の遺伝子を示す。 第４図は、Ｐ　Ｅ　Ｎ　ＨＯ８を精製する際のＣＭ−セ
ルロファイン力ラムの流出パターンを示したものである
。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）好アルカリ性バチルス由来のペニシリナーゼをコ
   ードするＤＮＡ塩基配列と目的ポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ塩基配列とをウロキナーゼ等の特異性が高い蛋
   白質分解酵素が認識するアミノ酸配列に対応するＤＮＡ
   塩基配列、または、臭化シアン等の化学物質が特異的に
   認識するアミノ酸に対応するＤＮＡ塩基配列を介し連結
   させて目的ポリペプチドをペニシリナーゼ融合蛋白質と
   して菌体外に分泌発現後分離させるための、好アルカリ
   性バチルス由来のペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩
   基配列、当該ペニシリナーゼに由来するプロモーター、
   リボゾーム結合部位及びｒｒｎＢリボゾームＲＮＡ由来
   の転写終結因子を含むことを特徴とするポリペプチド分
   泌発現ベクター。
2. （２）ｐＥＡＰ８５である請求項１記載のベクター。
3. （３）ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と目
   的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とがウロキ
   ナーゼ等の特異性が高い蛋白質分解酵素が認識するアミ
   ノ酸配列に対応するＤＮＡ塩基配列、または、臭化シア
   ン等の化学物質が特異的に認識するアミノ酸に対応する
   ＤＮＡ塩基配列を介し連結されてなる融合ポリペプチド
   をコードするＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請
   求項１〜２のいずれかに記載のベクター。
4. （４）目的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列が
   インシュリンＢ鎖をコードするものである請求項３記載
   のベクター。
5. （５）ｐ８５ｈ０８である請求項３記載のベクター。
6. （６）ｐ８５ｈ０９である請求項３記載のベクター。
7. （７）ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と目
   的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とがウロキ
   ナーゼ等の特異性が高い蛋白質分解酵素が認識するアミ
   ノ酸配列に対応するＤＮＡ塩基配列、または、臭化シア
   ン等の化学物質が特異的に認識するアミノ酸に対応する
   ＤＮＡ塩基配列を介し連結されてなる融合ポリペプチド
   をコードするＤＮＡ塩基配列を含むベクターで形質転換
   された微生物。
8. （８）大腸菌である請求項７記載のベクター。
9. （９）ペニシリナーゼをコードするＤＮＡ塩基配列と目
   的ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列とが直接連
   結されてなる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ塩基
   配列を含むベクターで形質転換された微生物を培養して
   菌体外に分泌される融合蛋白質を採取し、次いで目的ポ
   リペプチドを分離することを特徴とするポリペプチドの
   製造法。