JPH10511845A - 細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法に関し、ここで前記方法は、（ａ）所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体を含む組換えベクターを用意し、（ｂ）段階（ａ）の組換えベクターにより、内部及び外部細胞膜を有する細菌の細胞を形質転換し、（ｃ）前記DNA 挿入体の発現、及び所望のタンパク質の融合された細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で、前記段階（ｂ）の形質転換された細胞を培養し、そして（ｄ）前記培地からその得られるタンパク質を回収することを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法 発明の分野 本発明は、細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法、並びに前記 タンパク質をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体及び組換えベクターに 関する。 発明の背景 内部及び外部の両細胞膜を有する原核生物、たとえばグラム陰性細菌は、周囲 培地中に細胞からタンパク質を分泌するのはまれである。細胞質中に残存しない そのようなタンパク質は通常、細胞質膜を通してペルプラズム空間に送られるが 、しかし外部細胞膜を通しては送られない。しかしながら、つい最近、グラム陰 性細菌から真に分泌されるタンパク質の例が見出されている。 すなわち、リソバクター・エンザイモゲネス（Lysobacter enzymogenes）は、 アルカリホスファターゼ（S．Au など.，J ．Bacteriol．173(15)，1991，4551-4 557p を参照のこと）及びα−溶菌プロテアーゼを分泌する。Ｅ．コリにおいて α−溶菌プロテアーゼを発現する試みは、細胞内における及び細胞外培地におけ る酵素の製造をもたらした（J．L．Silen など.，J ．Bacteriol．171(3)，1989 ，1320-1325pを参照のこと）。 同様に、アクロモバクター・ライチカス(Achromobacter lyticus)は、細胞外 プロテアーゼを生成し、この一次構造はS．Tsunasawaなど.，J ．Biol．Chem．26 4 (7)，1989，3832-3839p から明白である。Ａ．ライチカス プロテアーゼＩを コードする遺伝子がＥ．コ リにおいてクローン化され、ここで酵素が培養培地中に分泌されるよりもむしろ ペリプラズムに輸送されている（T．Oharaなど.，J ．Biol．Chem．264(34)，198 9，20625-20631 を参照のこと）。 発明の要約 細胞からタンパク質を容易に転移しない異種宿主細菌からタンパク質の細胞外 生成を得ることが可能であることが見出された。そのような細胞外生成は、一定 の細菌の細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部により達成される 。 従って、本発明は、内部及び外部細胞膜を供えた細菌において細胞外タンパク 質を製造するための方法に関し、ここでこの方法は、 （ａ）所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能的に 連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプ ロテアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌細胞 外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで 成るDNA 構造体を含む組換えベクターを用意し、 （ｂ）段階（ａ）の組換えベクターにより、内部及び外部細胞膜を供えた細菌 の細胞を形質転換し、 （ｃ）前記DNA 挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された細菌性細胞 外プロテアーゼプロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で、前記 段階（ｂ）の形質転換された細胞を培養し、そして （ｄ）前記培地からその得られるタンパク質を回収する、 ことを含んで成る。 本発明において、用語“内部及び外部細胞膜を供えた細菌”とは、細胞の細胞 質を取り囲む内部膜又は細胞質膜、及び外部膜、並び に、内部膜と外部膜との間のペリプラズム空間を有する細胞を示すことを意図さ れる。ほんどのそのような生物においては、外部膜を通してのタンパク質の分泌 はまれであるが、内部膜を通してペリプラズム空間への発現された遺伝子生成物 のトランスロケーションを可能にする機構（シグナル配列を含む）が存在する。 用語“異種”とは、宿主細胞に適用される場合、その宿主細胞が自然において、 注目のタンパク質を生成しない細胞であることを示すことを意図される。 用語“プレプロペプチド”とは、シグナルペプチド（プレペプチド）、及び生 成されるべきタンパク質の前駆体形上に存在する１又は複数のペプチド配列から 構成されるペプチドを示すことを意図される。プレプロペプチドの一部（又はフ ラグメント）が本発明の方法に使用される場合、それは、対象のタンパク質の細 胞外生成をもたらす十分に長いプレプロペプチドの能力を保持するのに十分な長 さであるべきである。 用語“細菌性細胞外プロテアーゼ”とは、細菌において生産され、そして細菌 細胞から分泌されるタンパク質分解性酵素を示すことを意図する。適切な細菌性 細胞外プロテアーゼの例は、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バ チルスメタロプロテアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼ、たとえばズブチリ シンである。 用語“作用可能的に連結された”とは、プレプロペプチドをコードするDNA 配 列が、所望のタンパク質をコードするDNA 配列と一緒に転写されることを示すこ とを意図される。 本発明の方法により製造されるタンパク質は、プレプロペプチドに対してもし くは宿主細胞に対して、又はその両者に対して同種性又は異種性であってよい。 すなわち、注目のタンパク質をコードするDNA 配列の先に、該タンパク質を天然 において生産しない宿主細 菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA 配列に連結されたプレプ ロペプチドをコードするDNA 配列が存在することは認識され得る。他方、注目の タンパク質をコードするDNA 配列の先に、天然において前記タンパク質を生産す る宿主細菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA 配列に天然にお いて連結されていないプレプロペプチドをコードするDNA 配列が存在し得る。さ らに、注目のタンパク質をコードするDNA 配列の先に、天然において該タンパク 質を生成しない宿主細菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA 配 列に天然において連結されていないプレプロペプチドをコードするDNA 配列が存 在し得る。 用語“漏出”とは、本発明により製造されるタンパク質が、分泌、すなわち内 部及び外部細胞膜を通してのトランスロケーションにより、又はペリプラズム空 間へのタンパク質の輸送、続く外部膜の溶解により、細胞から輸送されることを 示すことを意図する。外部膜の溶解は、完全でも又は部分的でもあり得、又は本 発明により製造されるタンパク質は、ペリプラズム空間へのタンパク質の輸送及 びそれに続く外部細胞膜を通しての開放により細胞から輸送される。 もう１つの観点においては、本発明は、内部及び外部細胞膜を供えた細菌にお いて細胞外タンパク質を生成するための方法に関し、この方法においては、内部 及び外部細胞膜を供え、所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれ に作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バ チルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選 択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードす るDNA 配列を含んで成るDNA 構造体を含む組換えベクターにより形質転換された 細菌が、前記DNA 挿入体の発現、及び所 望するタンパク質に融合される細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチドの培養培 地中への漏出を可能にする条件下で培養され、そして得られるタンパク質が培地 から回収される。 さらなる観点において、本発明は、所望のタンパク質をコードするDNA 配列の 先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテ アーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから 成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一 部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体を含む組換え発現ベクターに関 する。前記ベクターは、上記発明の方法による適切な宿主微生物の形質転換のた めに有用である。 さらなる観点においては、本発明は、所望のタンパク質をコードするDNA 配列 の先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロ テアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼか ら成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその 一部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体に関する。前記DNA 構造体は 、上記に示されるように、組換えベクター中に適切に挿入され得る。 発明の詳細な記載 アクロモバクター・ライチカスのゲノムにおいては、Ａ．ライチカスプロテア ーゼＩをコードする遺伝子が 653個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする 。これは、20個のアミノ酸のシグナル（又はプレ）ペプチド、185個のアミノ酸 のＮ−末端プロペプチド、活性プロテアーゼである 268個のアミノ酸のコアタン パク質、及び 180個のアミノ酸のＣ−末端プロペプチドを図11に示されるように 含む（T．Oharaなど.，J ．Biol．Chem．264，1989，20625-20630p を参照のこと ）。 本発明の好ましい態様においては、DNA 構造体は、プレペプチド、及びＡ．ラ イチカスプロテアーゼＩの 185個のアミノ酸のＮ−末端プロペプチド（但し、18 0個のアミノ酸のＣ−末端プロペプチドではない）をコードするDNA 配列を含ん で成る。所望のタンパク質の細胞外生成を得ながら、Ｃ−末端プロペプチドを削 除することが、驚くべきことに可能であることが見出された。Ｃ−末端プロペプ チドの削除は、たとえば、Ｃ−末端プロペプチドが存在する場合に得られる異種 生成物よりも、より容易に精製することができる同種細胞外生成物の形成をもた らす。DNA 構造体はさらに、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの少なくとも一部を コードするDNA 配列、たとえば宿主細胞からの所望のタンパク質の輸送を促進す ることが見出された配列を含んで成ることができる。そのようなDNA 配列が構造 体に包含される場合、それは十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタ ンパク質をコードすることができる。プロテアーゼは、活性形で存在することが でき、又はそれは、たとえばプロテアーゼのＣ−末端での１又は複数のアミノ酸 の欠失により、又は触媒試験のアミノ酸の１又は複数のアミノ酸の置換(His 57 ，Asp 113 及びSer 194)により不活性化され得る。たとえば、Ser 194 がAla に より適切に置換され得る。 所望のタンパク質の例は、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質、グ ルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経路インヒビター、アプロチ ニン、トリプシン、インスリン又はインスリン前駆体又は類似体、又は酵素、た とえばリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼなどである。 所望のタンパク質をコードする本発明のDNA 構造体は、ゲノム又 はcDNA起原のものであり、たとえばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そし て標準的技法に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダ イゼーションにより、ポリペプチドのすべて又は一部をコードするDNA 配列をス クリーニングすることによって得られる（Sambrookなど.,前記を参照のこと）。 所望のタンパク質をコードする本発明のDNA 構造体はまた、確立された標準技 法、たとえばBeaucage and Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，1859-1 869により記載されるホスホアミジット法、又はMatthes など.,EMBO Journal 3( 1984)，801-805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミ ジット法によれば、オリゴヌクレオチドが、たとえば自動DNA 合成機により合成 され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクターにおいてクロ ーン化される。 さらに、DNA 構造体は、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びcDNA 、又は混合されたゲノム及びcDNA起原のものであり、標準技法に従って、合成、 ゲノム又はcDNA起原のフラグメント（適切な場合）、すなわち完全な核酸構造体 の種々の部分に対応するフラグメントを連結することによって調製され得る。 DNA 構造体はまた、たとえばPCR Protocols，1990，Academic Press，San Die go，California，USA に記載されるように、特定のプライマーを用いてのポリメ ラーゼ鎖反応により調製され得る。たとえば、プレプロペプチドをコードするDN A 配列は、そのプレプロペプチドが由来する種の染色体DNA のPCR 増幅により調 製され得ることが認識され得る。同様に、所望のタンパク質をコードするDNA 配 列は、前記タンパク質が由来する種からの染色体DNA のPCR 増幅により、又はた とえば、上記のようにしてオリゴヌクレオチドによりゲノム又はcDNAライブラリ ーをスクリーンすることにより調製され 得る。 本発明のDNA 構造体が挿入される組換えベクターは、組換えDNA 法に便利にゆ だねられ得るいづれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、 それが導入される宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは自律的に複 製するベクター、すなわち染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプ ラスミドであり得、ここで前記複製は染色体複製には無関係である。他方、ベク ターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそ れが組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。 ベクターは好ましくは、所望のタンパク質をコードするDNA 配列がDNA の転写 のために必要とされる追加のセグメントに作用可能的に連結されている発現ベク ターである。一般的に、発現ベクターはプラスミドもしくはウィルスDNA に由来 し、又は両者の要素を含むことができる。用語“作用可能的に連結された”とは 、セグメントが、それらの意図された目的のために正しく機能し、たとえば転写 がプロモーターにより開始され、そしてタンパク質をコードするDNA 配列を通し て進行するよう配置されることを意味する。 プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA 配列であり得、そして宿主細胞に対して同様性又は異種性であるタンパク質をコ ードする遺伝子に由来することができる。プロモーターは、好ましくは、誘導可 能なプロモーターであり、そしてより特定には、プロモーターからの発現が非誘 導条件下でリプレッサーにより止められ得るプロモーターであり得る。誘導可能 なプロモーターの例は、ファージλＰ_R又はＰ_Lプロモーター、又はＥ．コリlac ，trp又はtac プロモーターを包含する。 ベクターはまた、選択マーカー、すなわち、その生産物たとえば 薬物、たとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン又はクロラムフ ェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含むことができる。 所望のタンパク質をコードするDNA 配列、プロモーター及びプレプロ配列をそ れぞれ連結し、そして複製のための必要な情報を含む適切なベクター中にそれら を挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sa mbrookなど.，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USAを参照のこと）。 本発明のDNA 構造体又は組換えベクターが導入される細菌宿主細胞は、所望の タンパク質を細胞外的に生成することができるいづれかの細胞であり、そしてグ ラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ又はプソイドモナス属(Pseudomonas)を包含す る。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換により、又はコンピテント細胞 を用いることにより、それ自体既知の手段でもたらされ得る（Sambrookなど.,前 記 を参照のこと）。 細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ない づれかの従来の培地、たとえば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る 。適切な培地は、市販されており、又は公開されたレセピーに従って調製され得 る（たとえば、American Type Cultur Collection のカタログに従って）。次に 、細胞により生成されるタンパク質は、従来の方法、たとえば遠心分離又は濾過 により培地から宿主細胞を分離し、その上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩 、たとえば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、問題のタンパク質のタイプに依 存して、種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィ ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものに より精製する ことによって、培養培地から回収され得る。 本発明の方法の段階（ｄ）で回収されたタンパク質は、前駆体形で存在し、す なわちそれは、所望のタンパク質に融合されたプロペプチドを含んで成るポリペ プチドとして回収される。この場合、前駆体は続いて、特に、当業界において知 られている酵素処理方法により成熟処理にかけられ得る。成熟のために使用され る酵素は通常、それが所望する切断部位でアミノ酸残基に対して特異的であるよ うに選択される。そのような酵素の例は、トリプシン、フサリウム・オキシスポ ラム（Fusarium oxysporum）（WO89/6270）に由来するトリプシン様プロテアー ゼ、クロストリパイン（W．M．Mitchellなど.，Methods Enzymol ．19，1970，63 5p）、マウス顎下腺プロテアーゼ（M．Levyなど.，Methods Enzymol ．19，1970 ，672p）、血液凝固カスケードのトロンビン又は他のタンパク質分解性酵素（た とえば第Xa因子）、ウシエンテロキナーゼ、スタフィロコーカス・アウレウス（ Staphylococcus aureus）V8 プロテアーゼ、又はバチルス・リケニホルミス（Ba cillus licheniformis）Glu/Asp −特異的セリンプロテアーゼである。適切な切 断部位が前駆体ポリペプチドに存在しない場合、それは、たとえば所望のアミノ 酸残基を特定する１又は複数のコドンを導入するために前駆体をコードするDNA 配列の特定部位突然変異誘発により供給され得る。 本発明は次の例によりさらに例示されるが、それらは本発明を限定するもので はない。 例１． アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子の公開され た配列（Oharaなど.，(1989)，J．Biol．Chem．264，20625-20631）に基づいて 、PCR 反応において鋳型としてアクロモバクター・ライチカスＭ497 −１染色体 DNA を用いる場合、初めの 半分、後の半分、又は完全な遺伝子のいづれかを増幅するために、PCR プライマ ーが合成された。 染色体DNA を、Kamelendu Nath(Nucleic Acids Res．18(21)，1990，6442p)の 方法に従って、50mlの出発体積の一晩のLB培養物を伴って、アクロモバクター・ ライチカスＭ−497 −１から調製した。 遺伝子のフラグメントを、下記２種のプライマーを用いて増幅した： （遺伝子のシグナル配列コード部分にPstＩ部位を導入する） （成熟酵素をコードする領域の中間部分にKpmＩ部位を導入する） 反応混合物： 10μｌの10×PCR 緩衝液 ８μｌの2.5mM のdNTP 10μｌの10ｐモル／μｌのプライマーMHJ783 10μｌの10ｐモル／μｌのプライマーMHJ782 0.5μｇのＡ．ライチカスＭ497−１ DNA 59.5μｌの水 0.5μｌのTaq ポリメラーゼ（95℃で添加される） 反応は次の条件下で30回のサイクルで実施された： 反応混合物５μｌを１％アガロースゲル上で展開し、そして正しいサイズ(997 bp)のバンドを観察した。 DNA を、プロテアーゼ遺伝子について予想されるように、AscＩ ，NotＩ，SalＩ及び XhoＩにより消化した。 反応混合物50μｌを、PstＩ及びKpnＩにより消化し、アガロースゲルから単離 し、そして同じ酵素により消化されたpUC19（C．Yanisch-Perronなど.，Gene 33 ，1985，103-119p）中に連結した。その連結混合物を用いてＥ．コリ 803−９を 形質転換し、そしてプラスミドを調製した。 この態様においては、遺伝子の最初の半分が増幅された。これを、プライマー の端に導入された PstＩ及び AspＩ部位を用いてpUC19 中にクローン化した。配 列決定は、それがクローン化された正しいDNA であることを示し、そしてそのフ ラグメントをα−³²Ｐ−dATPと共にランダムヘキサマーのプライマーを用いて標 識し、そこで、サザンハイブリダイゼーションが、種々の制限エンドヌクレアー ゼにより切断されたＡ．ライチカス染色体DNA に対して行なわれた。これは、遺 伝子が約 2.1kbの SphＩ− NcoＩフラグメント上に位置していることを示した。 ライブラリーを、約2100bpの大きさの SphＩ− NcoＩ消化されたＡ．ライチカ スDNA から製造し、そして SphＩ− NcoＩ消化されたpSX54（pUC18（Yanisch-Pe rronなど.,前記）由来のクローニングベクター）中にクローン化した。６個のプ レート上の約10,000個のコロニーを、Whatman 540 アッシュレスフィルター上に 持ち上げ、そして上記プローブと65℃でハイブリダイズせしめた(Sambrookなど ．(1989)，Molecular Cloning，Cold Harbor Laboratory Press)。フィルターを 同じ温度で洗浄し、そしてＸ線フィルム上に配置した。照射の後、約１％のコロ ニーが陽性であることがわかった。25のコロニーを再単離し、そしてプラスミド を調製した。それらを PstＩ及びEcoRＩにより切断し、そして３個は予測される 制限パターンを有することがわかった。それらの１つ（pSX494、図１）を、Nco Ｉにより消化し、クレノウポリマラーゼ及び４種のdNTPによりフィルアウトし、 そして SphＩにより消化した。2.1kbのバンドをアガロースゲルから単離し、脱 リン酸化された SphＩ− SmaＩ消化のpUC19 中に連結し、pSX512を生ぜしめた（ 図２）。そのプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110 lacl^qを形質転換した（Ｅ． コリW3110 は初期単離物であり、そしてＫ−12株のための先祖ストックとして広 範に使用されて来た（B．Bachman，Bacteriol ．Rev．36，1972）。本発明に使用 されるW3110 株が、Rlacからの発現をより完全に止めるLac リプレッサーを過剰 生成するためにlacl^qにされた）。得られる株は、IPTG又はラクトースのいづれ かにより誘導される場合、Ｚ−lys(ベンゾイル−リシル−pNA)を加水分解するこ とが示された。ウェスターンブロット分析（WAKO Co.から入手できる AchapＩに 対して生ぜしめられた抗体による）は、誘導された株が既知の酵素に比較される ほど大きなタンパク質を生成したことを示した。 例２． 新規DNA 構造体を製造し、ここでコード領域の３’端を欠失しており、これは 、得られるタンパク質が元のＡ．ライチカス株において切断されるＣ−末端拡張 部を欠いていることを意味する。２つのUGA 停止コドン及びHindIII部位を、成 熟酵素をコードする遺伝子の部分が終結する部位でＡ．ライチカス遺伝における PCRにより導入した。このHindIII部位を続いて、クレノウポリメラーゼによりフ ィルアウトし、そしてpSX512上のAsp 7181部位（また、フィルアウトされている ）に連結し、pSX547をもたらした（図３）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリ W3110 lacl^qを形質転換し、そして200μｇ／mlのアンピシリンを含むLP−プレー ト上にプレートした(J．H．Miller(1972)，Experiments in Molecular Genetics ，Cold Spring Harbor Laboratory)。 得られる株を、0.4％のラクトースを含む液体LB培地において26℃で44時間、 増殖し、この後、培養物を遠心分離し、そして上清液をベンゾイル−リシル−pN A によりリルシ−エンドペプチダーゼ活性について試験した。この結果は陽性で あり、そしてウェスターンブロット分析（上記を参照のこと）は、この株から生 成される酵素が市販の製品(AchapＩ)と正確に同じ大きさを有したことを示した 。酵素はまた、同じ比活性を有することが示された。 例３． ヒュミコルス・インソレンス(Humicols insolens)リパーゼ遺伝子がサビナー ゼ(ズブチリシン309)シグナル配列に融合されている構造体を製造し、そしてそ の発現はキシラーゼによる制御にあった。 pSX92(WO89/06279)を、HindIIIにより切断し、クレノウポリマラーゼ（ヌクレ オチド）によりブラント末端化し、そして次に、ClaＩにより切断した。大きな フラグメントを単離した（Ａ）。pHLL（EP305,216、図３及び４を参照のこと） をBamHＩにより切断し、上記のようにしてブラント末端化し、そして次に、XhoI Iにより切断した。リパーゼ遺伝子の成熟部分を含むフラグメントを単離した（B ，818bp）。 Ａ及びＢを、成熟リパーゼの最初の４個のアミノ酸に融合されるサビナーゼシ グナルにおける最後の５個のアミノ酸をコードする合成リンカーにより一緒に連 結した（図４ａ）。上方鎖における最後のＡは、リパーゼ遺伝子における XhoII 部位を BglII部位に変化せしめる： 得られるプラスミドpSX167を PmeＩ及びBamHＩにより切断し、そしてサビナー ゼ−リパーゼ融合体及びBSターミネーターを含むフラグメントを単離した（1769 bp）。このフラグメントを、HincII- BamHＩ切断のpUC19（Yanish-Perronなど． (1985)GENE33，103-119）中に連結し、pSX578を生ぜしめた（図４ｂ）。 Ａ．ライチカスプロテアーゼ遺伝子のプレプロー部分を、Hortonなど．(1989) GENE77，61-68に記載されるPCR 技法“オーバーラップ拡張によるスプライシン グ”を用いてリパーゼに融合した。 Ａ．ライチカスプロテアーゼＩプレプロー成熟Ｈ．インソレンスリパーゼ融合 のためのプライマー： ２種のPCR 生成物を製造した：鋳型としてpSX547を用いてMHJ3799/MHJ3852 及 び鋳型としてpSX578を用いてMHJ3829/MHJ3800 を製造した。それらの２種の生成 物を混合し、変性し、そして連結されたPCR 生成物を、プライマーとしてMHJ379 9 及びMHJ3800 を用いて製造した。これを AscＩ及び BstＸＩにより切断し、そ してpSX579の構成に使用した（図４ｃ）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3 110 lacl^qを形質転換し、そしてその株を例２に記載されるようにして培養した 。 例４． Ｂ．サブチリス(B．subtilis)サビナーゼ遺伝子(ズブチリシン309)のプレプロ ー部分を、次のプライマーを用いて、上記と同じ手段によりリパーゼ遺伝子の成 熟部分に融合した： PCR 生成物を、それらのプライマー及び鋳型としてのpSX92 を用いて製造した （MHJ3790 は、サビナーゼ開始コドンの前のリボソーム結合部位で正確にHindII I部位を導入する）。これを上記からのMHJ3829/MHJ3800 生成物と共に混合し、 変性し、そして連結された生成物を、プライマーとしてMHJ3790 及びMHJ3800 を 用いて製造した。これをHindIII及び BstＸＩにより切断し、そしてpSX580の構 成に使用した（図４ｂ）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110 lacl^qを形 質転換し、そしてその株を例２に記載のようにして培養した。 例５．Ａ．ライチカスプロテアーゼプレプロ−領域に融合されるグルカゴン様ペプチド ＩのＥ．コリにおける発現 Ａ．ライチカスアルカリプロテアーゼ(AchapＩ)に融合されるグルカゴン様ペ プチドＩ(GLP−１)のための発現ベクターの構成は、図５〜６に概略されている 。プロテアーゼシグナルペプチド、及びプロー領域における最初の29個のアミノ 酸をコードするオリゴヌクレオチドリンカーは、次の配列を有する： Ｅ．コリにおける最良のコドン使用のために最適化されるリンカー配列を、Cl aＩ及び SalＩにより切断された可変性ベクターpHD414（WO92/16634に記載され ている）中にサブクローン化した。アミノ酸30−185 からのプロー領域のＣ−末 端部分を、 及びオリゴヌクレオチドリンカー： によるPCR プライミングのためにpSX512（図２）を用いて、SalＩ−BamHＩ切断 されたpUC19 中にサブクローン化した。 位置185 で、リシン残基がアルギニンにより置換されている。Ａ^*を2591にお いてＣの代わりに導入し、BspE１部位を創造する。 図６に示される発現ベクターは、lac プロモーターを含むpUC19である。Tet プロモーターのために、また適合されるHindIII− ClaＩリンカーを、pBR322か らの ClaＩ−BamHＩスペーサーフラグメントを用いて、pUC19 中にサブクローン 化した。前記リンカーは次の通りである： プロモーター及びリンカーを、pHW1163 におけるAchapＩプレプロー領域に連 結し、ここでGLP−１遺伝子が、遺伝子（DK 1440/93に記載されるようにして合 成的に調製された）のモノマー及びテトラマーにそれぞれ対応する、250bp及び 550bpのBamHＩ−EcoRＶフラグメントとして挿入されている。得られる発現プラ スミドpHW1166 及びpHW1167 を用いて、Ｅ．コリW3110 lacl^qを形質転換し、そ して GLP−１発現を、特異的抗体を用いて、ウェスターンブロット分析により上 清液から測定した。処理された及び処理されていない物質を上清液において検出 した。 例６．切断により不活性化されたＡ．ライチカスプロテアーゼプレ−プロ−コア領域に 融合された GLP−１のＥ．コリにおける発現 コア領域は、切断により不活性化され得る成熟酵素をコードする。これを、図 ７に示されるような２種の手段で行なわれた。下記 BsgＩ−BamHＩリンカー： を用いて、60個のＣ−末端アミノ酸のコア領域を欠失せしめ、そして図10に示さ れるようにして、触媒三回対称軸における、セリンを包含する12個のアミノ酸の 追加の欠失を行なう。 下記 PstＩ−BamHＩリンカー： を用いて、45個のＣ−末端アミノ酸のコア領域を欠失せしめ、生来 のコアに見出されるすべての３個の硫黄架橋の創造の可能性を残す。 前記リンカーを、前記のようにして、SalＩ−部位から開始する AchapＩ遺伝 子のほとんどに連結し、pHW1158 及びpHW1159 を創造した。それから、プロモー ター、すなわちモノマー及びテトラマーとしての AchapＩ遺伝子及び GLP−１遺 伝子のＮ−末端部分を付加する方法は、図８に示される。それは、プレプロー構 成のために図６に記載されるのと同じパターンに従う。発現プラスミド pHW1168 −1171を、例５に記載されるようにして分析した。処理された及び処理されてい ない物質が培養上清液に検出された。 例７．突然変異誘発により不活性化されたＡ．ライチカスプロテアーゼプレプロ−コア 領域に融合される GLP−１のＥ．コリにおける発現 欠失を伴わない突然変異は、コア領域の折りたたみに関して天然の情況を模倣 し、そして生成物の触媒をさらに妨げる最良の手段である。本発明者は、鋳型と してpSX512及び次のプライマーを用いて、PCR フラグメントをＣ−末端に導入す ることによって活性セリン残基をアラニンに変異誘発するよう選択した： 前記方法は図９に示される。GLP−１モノマーを含む得られるプラスミドpHW11 72 及び GLP−１テトラマーを含むpHW1173 を、他の構造と共に記載のようにし て分析した。処理された及び処理されていない物質を、培養上清液において検出 した。例５〜７のすべての構成は、図10に要約されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造する ための方法であって、 （ａ）所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連 結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロ テアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌細胞外 プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで成 るDNA 構造体を含む組換えベクターを用意し、 （ｂ）段階（ａ）の組換えベクターにより、内部及び外部細胞膜を有する細菌 の細胞を形質転換し、 （ｃ）前記DNA 挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された細菌性細胞 外プロテアーゼプロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で、前記 段階（ｂ）の形質転換された細胞を培養し、そして （ｄ）前記培地からその得られるタンパク質を回収することを含んで成る。 ２．前記所望するタンパク質に融合される細菌性細胞外プロテアーゼプロペプ チドが、分泌、すなわち前記内部及び外部細胞膜の両者を通してのトランスロケ ーションにより細胞から輸送される請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記所望のタンパク質に融合された細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチ ドが、ペリプラズム空間への前記タンパク質の輸送、続く外部膜の溶解により細 胞から輸送される請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記外部膜の溶解が部分的溶解である請求の範囲第３項記載 の方法。 ５．前記所望のタンパク質に融合された細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチ ドが、ペリプラズム空間への前記タンパク質の輸送、続く外部細胞膜からの開放 により前記細胞から輸送される請求の範囲第１項記載の方法。 ６．前記DNA 構造体がＡ．ライチカスプロテアーゼＩのプロペプチド及びＮ− 末端プロペプチドをコードするが、しかしＣ−末端プロペプチドはコードしない DNA 配列を含んで成る請求の範囲第１〜５のいづれか１項記載の方法。 ７．前記DNA 構造体が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの少なくとも一部をコ ードするDNA 配列をさらに含んで成る請求の範囲第６項記載の方法。 ８．前記DNA 構造体が、十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタン パク質をコードするDNA 配列を含んで成る請求の範囲第７項記載の方法。 ９．前記Ａ．ライチカスプロテアーゼＩが活性形で存在する請求の範囲第８項 記載の方法。 10．前記Ａ．ライチカスプロテアーゼＩが不活性形で存在する請求の範囲第９ 項記載の方法。 11．前記所望のタンパク質をコードするDNA 配列が、Ａ．ライチカスプロテア ーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経 路インヒビター、アプロチニン、トリプシン又はインスリン、又はインスリン前 駆体又は類似体をコードする請求の範囲第１，２，３，４又は５のいづれか１項 記載の方法。 12．前記細菌がグラム陰性細菌である請求の範囲第１，２，３，４又は５のい づれか１項記載の方法。 13．前記グラム陰性細菌がＥ．コリである請求の範囲第12項記載 の方法。 14．前記細胞外生成されたタンパク質が成熟過程にゆだねられる請求の範囲第 １，２，３，４又は５のいづれか１項記載の方法。 15．所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連結 された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテ アーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞 外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで 成るDNA 構造体を含む組換え発現ベクター。 16．前記DNA 構造体がＡ．ライチカスプロテアーゼＩのプロペプチド及びＮ− 末端プロペプチドをコードするが、しかしＣ−末端プロペプチドはコードしない DNA 配列を含んで成る請求の範囲第15項記載のベクター。 17．前記DNA 構造体が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの少なくとも一部をコ ードするDNA 配列をさらに含んで成る請求の範囲第16項記載のベクター。 18．前記DNA 構造体が、十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタン パク質をコードするDNA 配列を含んで成る請求の範囲第17項記載のベクター。 19．前記所望のタンパク質をコードするDNA 配列が、Ａ．ライチカスプロテア ーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経 路インヒビター、アプロチニン、トリプシンもしくはインスリン、又はインスリ ン前駆体又は類似体をコードする請求の範囲第15項記載のベクター。 20．所望のタンパク質をコードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連結 された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテ アーゼ、及びバチルスセリンプロテアー ゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又は その一部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体。 21．Ａ．ライチカスプロテアーゼＩのプロペプチド及びＮ末端−プロペプチド をコードするが、しかしＣ−末端プロペプチドはコードしないDNA 配列を含んで 成る請求の範囲第20項記載のDNA 構造体。 22．Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの少なくとも一部をコードするDNA 配列を さらに含んで成る請求の範囲第21項記載のDNA 構造体。 23．十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質をコードする DNA 配列を含んで成る請求の範囲第22項記載のDNA 構造体。 24．前記所望のタンパク質をコードするDNA 配列が、Ａ．ライチカスプロテア ーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経 路インヒビター、アプロチニン、トリプシン又はインスリン、又はインスリン前 駆体又は類似体をコードする請求の範囲第20項記載のDNA 構造体。 25．内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するた めの方法であって、内部及び外部細胞膜を有する細菌が、所望のタンパク質をコ ードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連結された、アクロモバクター・ ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリン プロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペ プチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体を含む組換え ベクターにより形質転換され、前記DNA 挿入体の発現、及び所望するタンパク質 に融合される細菌性細胞外プロテアーゼ プロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で培養され、そして得ら れるタンパク質が前記培地から回収されることを含んで成る方法。 26．内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するた めの方法であって、内部及び外部細胞膜を有する細菌が、所望のタンパク質をコ ードするDNA 配列の先に且つそれに作用可能に連結された、アクロモバクター・ ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリン プロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペ プチド又はその一部をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構造体を含む組換え ベクターにより形質転換され、前記DNA 挿入体の発現、及び所望するタンパク質 に融合される細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチドの、分泌、すなわち前記内 部及び外部細胞膜を通してのトランスロケーションによる、又はペリプラズム空 間へのタンパク質の輸送、続く外部膜の一部の溶解又は外部膜からの開放による 細胞からの輸送を通して培養培地中への漏出を可能にする条件下で培養し、そし て得られるタンパク質が前記培地から回収されることを含んで成る方法。