JPH02103204A - ヒアルロン酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒアルロン酸含有液からヒアルロン酸を精製
する方法に関する。ヒアルロン酸は化粧品の保湿剤の他
、眼科、整形外科、皮膚科等で医薬品としての用途が開
かれてきている。

〔従来の技術と解決すべき腺題〕

従来、ヒアルロン酸は、動物組織、例えは、工業規模で
は、ニワトリのトサカ等からの抽出法により製造されて
いるが、夾雑物としてコンドロイチン硫酸が混入したり
、組織内に含まれるヒアルロニダーゼなどによって低分
子量化されやすい、従って高分子で高純度に精製された
ものは、コスト高になる。

これら問題点を解決するため、近年醗酵法によりヒアル
ロン酸を製造することが行なわれている。

ヒアルロン酸がストレゾトコッカス属のある群のバクテ
リアにより生産されることは、古くから知られ、多くの
報告がある（ジエーーー　ウールコック（Ｊ、Ｂ、　Ｗ
ｏｏｌｃｃｃｋ　）　、ジャーナル・オシ・ジエネラル
マイクロバイオロジイ　８５　３７２−３７５　１９７
６）。

醗酵法によって製造されるヒアルロン酸は、抽出法に比
べ、一定の原料で、一定の方法で製造されるため、製品
の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は
太きい。

しかしながら、醗酵液には、高分子化合物が不純物とし
て存在し、それらを分離除去して高純度の製品を得る方
法が検討されてきた。

例えば、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウ
ム塩とヒアルロン酸とのアダクトを形成させ不純物を分
離し、さらに７ＥＩリジルのようなケイ酸マグネシウム
のカラムに不純物を吸着させる方法（公表特許昭６２−
５０１４７１号公報）がある。

また、マクロレテイキュラー型アニオン交換樹脂を用い
て、醗酵液から発熱性物質、蛋白質等を除去するヒアル
ロン酸の精製法が開示され【いる（特開昭６３−１２２
９３号公報）。

本発明者らも、ヒアルロン酸を高純度に精製する方法に
ついて検討し、ヒアルロン酸含有液をアルミナに接触さ
せる方法について提案した（特願昭６３−１４４７２８
号）。

ヒアルロン酸を医薬品として用いるには発熱性物質、蛋
白質、核酸、金属不純物等の少ない高純度のヒアルロン
酸を製造しなければならない。

しかしながら、上にあげた方法では、発熱性物質、蛋白
質、核酸等はある程度除去効果を有すが、金属不純物の
除去は、不充分である。即ち、精製不充分なヒアルロン
酸中には、マグネシウム、カルシウム、ケイ素、鉄のよ
うな金属不純物が検出され、従来の方法では、これらの
除去効果が少な法では、これらの金属不純物の除去効果
も大きいが、アルミナ由来のアルミニウムが混入する可
能性がある。

従って医薬品としても使用できる金属不純物の少ない、
高品質の製品を得る方法の開発が待たれていた。

本発明は、簡便かつ高品質にヒアルロン酸を精製する方
法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、金属不純物を含まない高純度のヒアルロン酸
を精製する方法について種々検討した結果、ヒアルロン
酸含有液をシリカゲルに接触させることにより、ヒアル
ロン酸に含まれる鉄、アルミニウム等の金属不純物が吸
着除去されること見出し、本発明を完成するに到った。

また、ヒアルロン酸含有液をあらかじめアルミナと接触
させたのち、シリカゲルと接触させることｋより、発熱
性物質、蛋白質、核酸、金属不純物等を含まない高純度
のヒアルロン酸に精製できることが明らかｋなった。

本発明は、 １、　ヒアルロン酸含有液をシリカゲルに接触すせるこ
とを特徴とするヒアルロン酸の精製方法及び ２、　ヒアルロン酸含有液が、あらかじめアルミナに接
触させたものである請求項１記載のヒアルロン酸の精製
方法である。

本発明で用いるシリカゲルは、ケイ酸ソーダを無機酸で
分解し、凝固したものを水洗し、不純物を除去した後、
乾燥することによって製造されるが、必ずしもこの製造
方法にとられれるものではない。

シリカゲルは、−数的な脱湿乾燥用、ガス・空気の幹燥
剤、有機溶剤の脱水用、一般精製用等の種々の用途に使
用されている。その用途に応じて、形、粒径、細孔径、
表面積、スラリーの−の異なるグレードのものが市販さ
れている。本発明において、使用するシリカゲルは、そ
のような物性で制限されるものではない。

しかしながら、粒径は３０−２００μが好ましい。粒径
が６０μより小さいと、シリカゲルの除去操作等の操作
性がわるくなり、カラムに充填してクロマト処理を行な
うことも目づまり等の点で難しくなる、２００μを越え
ると、金属不純物の除去効果がわるくなる。

また使用するシリカゲルは、金属不純物の含量が少なく
、その溶出も少ないグレードが好ましい。

本発明で使用するヒアルロン酸含有液は動物組織から抽
出したものでも、又醗酵法で製造したものでも使用する
ことはできるが工業的に安価に、高品質な製品を安定に
製造するためには醗酵法で展進したものが望ましい。

醗酵法によるヒアルロン酸はストレゾトコツカろ属等の
バクテリアを使用して既知の方法で得ることができる。

醗酵法で使用する菌株は、自然界から分離されるストレ
ゾトコツカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物
、または、特開昭６３−１２３３９２号公報に記したス
トレプトコッカス・エキＦＭ−１００（微工研菌寄第９
０２７号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産
する変異株が好ましい。

そのようなヒアルロン酸生産能を有する微生物をグルコ
ース、シュークロース等の炭素源、ヘフトン、ポリペプ
トン、酵母エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩等を用
いた培地中で好気的に培養して得られる培養液をヒアル
ロン酸が肌１〜５ｇ／ｌ濃度になるように希釈後、既知
の方法、例えば遠心分離による除菌、濾過による除菌、
凝集剤による除菌、カーボン、セライト等による除菌な
どの方法で除菌した液を使用することが望ましい。

さらに透析処理による低分子化合物の除去、精密濾過処
理による水不溶微粒子の除去またヒアルロン酸含有液に
アルコール、アセトン、ジオキサンなどの水溶性有機溶
剤を添加してヒアルロン酸を析出分離後、再度０．１〜
５ｇ／ｌ濃度にヒアルロン酸な溶解する操作等を行なっ
た液を使用することができる。

医薬品として使用できるヒアルロン酸を製造する場合に
は、上記の処理を行なった後、アルミナ処理を行なうの
が望ましい。

本発明で用いられるアルミナはいわゆる酸化アルミニウ
ムで、一般的には水酸化アルミニウムを高温度で脱水、
焼成して製造されるが、必ずしもこの製造方法にとられ
れるものではない。

アルミナはその粒径により、微粒（１０μ以下）、普通
校（４０−６０μ）、粗粒（７０μ以上）に分類される
。市販のアルミナはそのアルミナ含量あるいは含有不純
物量により、一般的なアルミナ純分約９０チ〜９９チの
グレードのものに対し、純度９９．９９％以上の高純度
アルミナと称されるもの、またアルミナ中の酸化ナトリ
ウム含量が通常の０．３−０．４　％　Ｋ対し、０．１
％以下に精製したローソーダアルミナと称されるものが
ある。また表面積が１ｇにつき５０５０−４Ｏ０と大き
く、吸着能力が高い活性アルミナがあるが、本発明にお
いて使用するアルミナは上記に制限されるものではない
。

α、β、γの鉱物形態及びハニカム体、顆粒、球状等の
粒の形状に関しても、いずれのものも本発明において使
用することができる。

ヒアルロン酸含有液のアルミナ処理を行うに当り、水溶
液の−は３〜１０特に６〜９、温度は０〜４０℃、ヒア
ルロン酸の濃度は０．１〜５！ｌ／１特に０．５〜２９
／ｌがよい。

アルミナ処理の方法としては、ヒアルロン酸含有液に粉
状又は粒状のアルミナを添加して、バッチ式で攪拌する
方法と、充填塔等に粒状又は成型したアルミナを充填後
、ヒアルロン酸含有液を通液処理する方法、またその組
合せや反復も可能であるが、通常は、処理条件の選択に
より、１回の処理で充分である。

バッチ式に比べて、充填塔方式の方が効果的であるが、
アルミナを充填塔等に充填してヒアルロン酸含有液を処
理する場合は、使用するアルミナの粒径に応じて、充填
塔の層高、ヒアルロン酸含有液の線速を考慮しなければ
ならない。従って、処理スピードは、カラムの目詰り及
び処理効率を考慮してｓ　ｖ　＝　０．１〜２が好まし
い。

ヒアルロン酸含有液をシリカゲルで処理するに当りヒア
ルロン酸溶液の−は３−１２、温度は〇−４０℃、ヒア
ルロン酸の濃度は０．１〜５ｇ／ｌアルロン酸の分解が
起こったり、粘度の上昇が起り操作性が悪くなるし、−
が１２を越えた場合も、ヒアルロン酸の分解が問題とな
る。

温度も４０℃を越えると、ヒアルロン酸が分解し、分子
量が低下する。

ヒアルロン酸の濃度は０．１ｇ／ＩＩ未満では、処理効
率に劣り、５９／ｌを越えると粘度が高くなり、操作が
難しくなる。

本発明の処理方法としては、ヒアルロン酸含有液に、シ
リカゲルを添加して、バッチ式で攪拌する方法と充填塔
に充填後、ヒアルロン酸含有液を通液処理する方法、ま
たその組合せや反復も可能であるが、充填塔を用いる方
法が好ましく、処理回数も条件の選択により、１回の処
理で充分である。

シリカゲルを充填塔に充填して、ヒアルロン酸含有液を
処理する場合には、シリカゲルの粒径やヒアルロン酸の
濃度等により、充填塔の層高、ヒアルロン酸含有液の線
速を考慮しなければならないが、処理スピードは８　Ｖ
　＝　０．１〜３が好ましい。

ヒアルロン酸量に対するシリカゲルの使用量は、ヒアル
ロン酸中の金属不純物の含量に応じて、決定する必要が
あるが通常ヒアルロン酸１ｇを精製する場合、シリカゲ
ルは、１０ｇ−３００，９必要である。

ヒアルロン酸含有液をアルミナやシリカゲルで処理する
に当り、ヒアルロン酸含有液中に、水と混合する有機溶
剤を溶解すると、処理効果が向上する場合がある。

水と混合する有機溶剤としては、メタノール、エタノー
ルなどのアルコール類やアセトンが挙げられ、これらを
５〜５０チ濃度に溶解する。

５％未満では、効果が少なく、５０％を越えると、液の
粘度が高くなり、またヒアルロン酸が析出する場合があ
る。

シリカゲルで処理を行なったヒアルロン酸含有液は、必
要ならば、−調整や孔径０．２〜１μのメリ、乾燥品と
することができる。

〔実施例〕

次に参考例及び本発明の実施例な示す。

参考例 ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研１寄
第９０２７号）を用いて培養した培養液１５１を純水で
５０１に希釈しくヒアルロン酸濃度１．１０ｇ／ｌ）、
遠心分離、ホローファイバー型限外ろ過を行ない、菌体
と培地成分を除いた。

このヒアルロン酸含有液５００　Ｉｌｔに食塩１５ｇを
溶解、ＰＨ７に調節後、エタノール７５０成で析出、エ
タノール１００Ｍで洗浄を行い、４０°Ｃで真空乾燥し
、０．４９９のヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結
果を表１に示す。

実施例１ 参考例１で得られる菌体と培地成分を除いたヒアルロン
酸含有液５００ｗＬｔを内径５傭、高さ３０□□□のガ
ラスカラムに和光紬薬社製クロマト用活性アルミナ（３
００メツシユ）を１５０１１Ｌｔ充填し、純水テ充分洗
浄後、５ｖ＝０．３（４５ｍ／時）で通液した。カラム
通過液を、同じカラムに１和光紬薬社製シリカｒル　ワ
コーデルＱ−５０を１５０１充填し、８Ｖ＝０．６（９
０＋ｚ／時）で通液した。

このカラム通過液５００ＷＬｔを集め、食塩１５ｇを加
え、ｐ＃（７に調節後、エタノール７５０ｖで析出、エ
タノール１００１で洗浄を行い、４０℃で真空乾燥し、
０．４０．９のヒアルロン酸ナトリウムを得た。分析結
果を表１に示す。

比較例１ 実施例１で、アルミナカラム通過液５００１１Ｌｔを、
シリカゲル処理なせずに、同様の操作を行ない、ヒアル
ロン酸ナトリウ０，４７　、Ｐを得た。

分析結果を表１に示す。

実施例２ 実施例１の菌体と培地成分を除いたヒアルロン酸含有液
５００ｍ／に、０．１５Ｍの塩化ナトリウム中の塩化セ
チルピリジニウム１０チ溶液２５ｒｎｔを添加し、沈殿
を遠心分離により集め、１００Ｎの実施例２で、シリカ
ゲルカラム処理を行なわない以外は、同様の操作を行な
った。得られた０、６９ｇのヒアルロン酸す）　ＩＪウ
ムを分析した結果な表６％食塩水５０ＤＵに溶解した。

この溶液を２０Ｅｌの、６０−１００メツシユの７０リ
ジルを充填したカラム（直径１．５ｃｍ）にＳＶ：１で
通液した。

この溶液を、分画分子量１０万のホローファイバーを用
いて脱塩処理した後、和光紬薬社製シリカデルワコーデ
ルＱ−５０を１５０縦充填したカラムに、Ｓ　Ｖ＝０．
６　（９０ｍｔ７時）で通液シタ。

このカラム通過液ｓ　ｏ　ｏ　ｍｔを集め、食塩１５ｇ
を加え、ｐＨ７に調節後エタノール７５ＣＩＩＩＬｔで
析出、エタノール１００計で洗浄を行い、４０°Ｃで真
空乾燥し、０．３８　ｇのヒアルロン酸ナトリウムを得
た。分析結果を表２に示す。

比較例２ 実施例６ 実施例１の菌体と培地成分を除いたヒアルロン酸含有液
４００成に、１００ｍｚのエタノールを添加してｓｏｏ
ｍｚとした後、同様にアルミナ処理、シリカゲル処理を
行なった。この処理液にＩＦＭの食塩を添加した後、０
．２ミクロン孔径のメンブレンフィルターで精密ろ過を
行ない、７５ＯＮのエタノールで析出、１００ｍ１のエ
タノールで洗浄して、４０℃で真空乾燥した。得られた
ヒアルロン酸ナトリウムは０．３７　ｇであった。この
ヒアルロン酸ナトリウムの分析結果は、次のとおりであ
勾、た。

蛋白質量 核酸 発熱性物質 金属不純物 アルミニウム カルシウム マグネシウム 鉄 ケイ素 ｌｐｐｍ以下 　　ｐｐｍ 検出せず 検出せず 検出せず 検出せず 検出せず ５．１Ｐ９為 測定法 １）蛋白質含量：精製ヒアルロン酸を、０．Ｉ　Ｎ水酸
化ナトリウムに溶解し、ロー ソー法にて行なった。

２）杉　　酸　　二０．１％ヒアルロン酸ナトリウム溶
液の２６０　ｎｍにおける吸光度 を測定した。

６）発熱性物質：生化学工業社製トキシカラーシステム
により比１色分析すること により行なった。

４）金属不純物：発光分析によった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、高品質なヒアルロン酸を簡便な方法で
製造することができる。またこの方法で得られたヒアル
ロン酸は、医薬方面の用途が期待される、 特許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒアルロン酸含有液をシリカゲルに接触させること
   を特徴とするヒアルロン酸の精製方法。 ２、ヒアルロン酸含有液が、あらかじめアルミナに接触
   させたものである請求項１、記載のヒアルロン酸の精製
   方法。