JPH05508183A - ヒアルロン酸の精製方法および眼科用の純粋なヒアルロン酸の分画 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸の精製方法および眼科用の純粋なヒアルロン酸の分画発明の背景お よび分野 本発明は、高純度のヒアルロン酸の分画およびその塩を製造するための新規な方 法に関する。さらに、本発明は、該方法によって得られ、特定の範囲内の平均分 子量を有するヒアルロン酸の特定の分画およびその塩（特に、ナトリウム塩）を 包含するものである。

ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）として知られてい る一群の生物学的巨大分子の典型的かつ重要な代表例である。ＨＡはを椎生物の 全ての結合組織中に同一の分子構造を伴って存在する生物学的ポリマーであり、 そこでＨＡは、その局所レベルが損傷の際の組織修復、栄養および緊張ど厳密に 関係しているという意味において、構造的および生物学的役割を演じている。こ れら生物学的物質の生理学的役割についての総説は、Ｐｈｙｓ、　Ｒｅｖ、に記 載されている［Ｃｏｍｐｅｒ　Ｗ、Ｄ、、　Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｔ、Ｃ，：結合組 織多糖の生理学的機能：　Ｐｈｙｓ、　Ｒｅｖ、　５８．　（１）。

２５５−３１５．１９７８１゜ＨＡの化学的−物理的性質は、分子量が最大ｓ、 　ｏ　ｏ　ｏ、　ｏ　ｏ　。

ダルトンまで変化する長い非分岐型の分子鎖を形成する、交互にポリマー化され た糖の生物ポリマー（Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチルグリフサミン）のも のである［Ｍｅｙｅｒ　Ｋ　ヒアルロン酸の化学構造：　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃｅ ｅｄ、　１７．１０７５．１９５８　；　Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｔ、　Ｃ，：細胞内 マトリックスの化学および分子生物学：　７０３−７３２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、、　１９７０：。この生物ポリマーの水溶液中での挙動が 、ある種の生物学的液体（滑液や硝子体液など）に典型的な特定の粘稠性（粘弾 性と称される）を担保する（ここでは、ＨＡは０．１２〜０．２４％の濃度で存 在する）［Ｂａ１ａｚｓ　Ｅ、Ａら：ヒアルロン酸ならびに硝子体液および水性 体液の置換・Ｍｏｄ、Ｐｒｏｂｌ、０ｐｈｔｈａ１．１０゜３−２１．１９７２ ］。また、ヒト由来の水性体液は、１．１４ｍｅｇ／ｇの平均濃度でＨＡを含有 していることがわかっている［Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｕ、Ｂ、Ｇ、　：ヒト水性体液 中のヒアルロン酸ト：　Ａｒｃｈ、ＯＰＭｈａｌｍｏｌ、　１０１．１２９−１ ３（１，１９８３）。

一連の公表された証拠が蓄積されており、外性ＨＡの局所供給が、極めて多種の 結合および上皮組織の病理学的症状において異なった治療的および保護的な利点 を有していることが示されている。これらは、例えば次のものである。

・非治癒皮膚潰瘍における損傷を受けた組織の再生：・関節結合組織の関節退化 ； ・眼科手術。

手術中に損傷を受ける゛危険にさらされる組織を被覆しうるというＨＡの粘弾性 によって付与される可能性が特に有用である。ＨＡを使用した全ての外科医によ れば、損傷を与える偶発的な接触にさらされることが最も多い角膜などの組織上 に外性ＨＡの粘稠な眉が存在すると、保護的な影響力が発揮され、これが手術の 成功裏の結果の極めて大きな部分を与える。

角膜上の外性ＨＡによって発揮される組織修復に対する促進作用および保護効果 は、実験動物［Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄら：ウサギの眼内水晶体移植時のヒアルロン酸 ナトリウムの使用：　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　８．　（６）、 　５８−６１．１９７７：　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ、ら：ウサギの自己角膜移植時の ヒアルロン酸ナトリウムの使用：　Ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１ １．　（１）＋１９−２１．１９８０　；　Ｇｒａｕｅ　Ｅ、Ｌ、ら：角膜内皮 に対するヒアルロン酸ナトリウムの保護作用：　Ｅｘｐ、　Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、　 ３１．１１９−１２７．１９８０　；　０ｚａｋｉ　Ｌ、ら：角膜内皮上のＨｅ ａｌｏｎ被覆した眼内水晶体の保護作用：　Ｆｏｌｉａ　Ｏｐｈｔｈａｌａｏｌ ｏｇｉｃａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　３２．１３０１−１３０５＋１９８１］、およ びヒト［Ｎｏｒｍ　ｌ１１．　：角膜および結膜の手術前の保護：　Ａｃｔａ　 Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ　５９．５８７−５９４．１９８１　；　Ｐｏ １ａｃｋ　Ｆ、Ｍ、ら：角膜移植およびＩＯＬ移植時のヒアルロン酸ナトリウム （Ｈｅａｌｏｎ）　：　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　８８．４２５−４３１． １９８１］の両方において示されている。

治療に、例えば上記した治療において使用される精製されたヒアルロン酸および 高純度の特定分画を製造するために、いくつかの方法が知られている。

有機体原料（例えば、メントリの冠）の抽出によって直接得られる全ヒアルロン 酸の分子分画は、広範囲に変化しうる分子量を有している（例えば、全ヒアルロ ン酸の分子量の約９０％〜８０％から０．２％まで、好ましくは５％〜０．２％ の範囲）。これら分画は、全ヒアルロン酸から、加水分解または酸化または酵素 化学試薬または物理的方法（例えば、機械的もしくは照射）により得ることがで きる。

従って、多くの場合、これら精製方法において原始抽出物が生成する［例えば、 「美容品および化粧品」（イタリア版Ｎｏ、５／８４．８−１７頁）中のＢａ１ ａｚｓらの論文を参照］。得られた分子分画の分離および精製は既知の方法によ り行われている。

例えば、米国特許Ｎｏ、　４．１４１．９７３には、少なくとも７５０，０００ ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸を製造するための方法が記載されている 。このヒアルロン酸は、それらの特に高い純度および炎症作用がないことから、 目の手術に使用しうるちのである。この方法は、出発物質からＨＡナトリウム塩 を抽出し、使用した動物器官に由来する血液残留物を除去し、ごうして得た抽出 物の脱タンパク質化を行ない、炎症性不純物を除去し、この生成物を水溶液中に おいて滅菌剤で処理し、そして有機溶媒を用いて水溶液からヒアルロン酸の塩を 沈澱させることからなる。血液残留物はエタノールで除去し、ナトリウム塩の形 態にあるＨＡ（これが出発物質中に見い出される形態である）は水で抽出し、脱 タンパク質化は希酸による処理どクロロホルムによる加水分解された部分の同時 抽出によって（または、タンパク質加水分解酵素を用いて）行ない、有害な炎症 性物質はｐＨ６〜７でのクロロホルムによる抽出によって除去し、そして滅菌は 塩化セチルピリジニウムによる処理によって行なう。この方法によると、得られ る唯一のヒアルロン酸分画は、この特許において１．５８６，０００タルトンの 分子量を有すると具体的に記載されている分画である。その化学的、物理的およ び生物学的性質に基づくと、このヒアルロン酸の分子分画は、商標ｒＨＥＡＬＯ Ｎｊで知られている市販製品に一致するようである。

分子の限外濾過などの新しい技術が開発されている。この精製手段によると、分 子量範囲の上限または下限の分子量を有するＨＡ分画を排除することかできる。

例えば、ＥＰ○特許Ｎｏ、　０１２３８５７２（１９９０年７月２５日認可）に は、２５０，０ＯＣ）−３５０，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロ ン酸ナトリウムの分画を得るための方法が記載されている。この方法は、有機体 原料の抽出とそれに続くパパインによる酵素膜タンパク質化によって直接得た生 成物を３０．　ＯＯＯの分子カットオフを有する膜（即ち、３０，０００を越え る分子量を有する分画だけを捕捉する膜）による２回の分子限外濾過を用いる。

この分画操作は炎症性の２次作用のない生成物を得るのに重要であると考えられ るが、その理由は、このような作用の原因となる分画が低分子量（例えば、約３ ０，０００ダルトン）分画であるためである。２００，０００の排除限界を有す る膜（即ち、２００，０００ダルトンを越える分子量を有する分画を捕捉する１ ＩＩ）を用いてさらに分子濾過を行なった後には、得られた濾過された生成物は ５０，０００〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する分画（この特許で はＨＹＡＬＡＳＴ　ＩＮＥと称されている）であり、一方、膜上に残った部分は ５００，０００〜７３０，０００の平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム 分画（この分画はＨＹＡＬＥＣＴＩＮと称されて本発明は、高純度かつ特定の分 子量範囲を有するヒアルロン酸の分画を製造するための別法を提供するものであ る。この分画は眼科手術において興味ある適用性を有している。即ち、この生成 物は極めて許容性が高く、炎症性ではなく、そして手術後の合併症を引き起こす ことがない。さらに、この生成物は、手術後の合併症（特に、高すぎる眼圧なと ）を引き起こすことなく手術後にそのまま残しておくことができるという大きな 利点を与え、従って、現在までの慣例であったその除去中の取扱いに関係した危 険を減少させる。ナトリウム塩の形態にあるこの純粋なヒアルロン酸の新規な分 画を、以下の記述においてはｒＨＡ−ＩＪの名称本発明の発見によれば、全ヒア ルロン酸またはそれらの塩（特に、ナトリウム塩などのアルカリ塩）を精製する 方法において、そのような酸または塩を特定の型の４級アンモニウム塩に変換す る操作を有利に介在させることができる。この塩化は、精製工程のいずれかの段 階で行なうことができる。これら４級アンモニウム塩はある種の有機溶媒（非プ ロトン性溶媒なとてあり、特にＮ−メチルピロリドンなど）に容易に溶解するの で、このような溶媒を用いて該塩を水相から抽出することができ、従って、従来 技術に記載されている方法と比較すると特別かつ追加の精製法を与える（工程の 最後に得られる生成物の純度に影響するのが明らかな操作）。４級アンモニウム 塩へのヒアルロン成分の変換は、例えば、他の塩（特に、ＮａＣ１など）を含む ナトリウム塩の水溶液を、４級水酸化アンモニウム（例えば、水酸化テトラブチ ルアンモニウム）でスルホン酸樹脂を処理することにより得られる４級アンモニ ウム塩基で塩化された形態の巨大分子スルホン酸イオン交換物質（例えば、テト ラブチルアンモニウム塩の形管て調製されたＤＯＷＥＸＭ−１５樹脂）を含むカ ラムまたは反応器を用いて処理することにより行なうことができる。アンモニウ ム塩が溶出液中に通過し、イオン交換物質により水で完全に溶離する。この水性 抽出物を蒸発乾固させ、多糖のアンモニウム塩からなる残留物を上記溶媒のいず れかに溶解し、次いで不溶性の固体部分を濾過する。

従って、本発明の方法は、そのより一般的な態様においては、ヒアルロン酸また はその分子分画のいずれかまたはそれらの塩のいずれかを、低級（Ｃ１−Ｓ）脂 肪族ヒドロカルビル置換基を有する対応する４級アンモニウム塩に変換すること によって酸または酸分画またはそれらの塩を精製することを特徴とする。

第２に、本方法は、ヒアルロン酸またはその分子分画のいずれかの４級アンモニ ウム塩を、そのような塩を溶解することができる有機溶媒中に集めること、濾過 した溶液から金属塩の形態のヒアルロン酸またはその分子分画を回収すること、 および所望により、このようにして得た塩を、例えば自体既知の方法でさらに精 製することを特徴とする。

即ち、本発明は、動物器官および全抽出物から多糖を抽出する方法において（こ こで、本発明の精製法は、分子分画の分断および分離を行なう操作を含む工程の 任意の適切な段階で行なうことができる）、そのような分画をさらに加工する際 に、ならびに、既に単離した分画（純粋または不純、新規または既知）をさらに 精製する際に、ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を利用することに関する。

先に記述したように、ヒアルロン多糖の変換は精製工程の任意の適切な段階で行 なうことができ、当業者なら、選択した種々の既知工程の特定の組合せによって 決まる基準に従ってそれぞれの特定の場合に選択することができるであろう。

これらの通常かつ既知の工程には、基本的に、および一般的に言って次の工程が 含まれる。

（１）予め細断およびホモジナイズした動物器官からの多糖の抽出（そのナトリ ウム塩の状態であるのが一般的かつ普通である）・通常、これは水と混合しうる 有機溶媒（例えば、エタノールまたはアセトンなどの脂肪族アルコールまたは低 級Ｃ１−、脂肪族ケトン）を用いて行なう：（２）適当な溶媒による抽出、また は緩衝剤（例えば、塩酸システィン−リン酸）の存在下でのタンパク質加水分解 酵素（例えば、パパイン、ペプシン、トリプシンまたはプロナーゼ）による（１ ）で得た抽出物の水溶液の消化によるタンパク質物質の除去； （３）（１）または（２）に従って得た抽出物の透析。

（４）既知の殺菌剤（例えば、塩化ナトリウム溶液中の塩化セチルピリジニウム ）による上記段階のいずれかで得た溶液の滅菌　通常、この操作は数回繰返す； （５）異なる分子Ｉを有するヒアルロン多糖分画またはそれぞれの塩の分離、ま たは所望ではない分画の除去（例えば、限界域分子量を有する分画、即ち指定し た分子量範囲から離れすぎている分画の除去）：この操作は分子の限外濾過によ って行なうのが好ましい（例えば、既知の方法で）：（６）適当な有機溶媒（例 えば、アルコール）を用いる沈澱による水溶液からの精製分画またはそれぞれの 塩（例えば、ナトリウム塩）の単離。

これら工程の順序、そして恐らくは、従来技術で既に使用されている他の工程ま たは当分野の専門家によって設計された池の工程の順序も大きく変化することが できる。本発明の特徴的な工程、即ち、４級アンモニウムイオンの塩化は、最大 の技術的効果が期待されるときに任意かつ好都合に挿入することができる。

多糖成分のアンモニウム塩は、このような塩を溶解しうる上記の溶媒（例えば、 具体的に後記する溶媒）を用いてイオン交換樹脂から直接数ることができるが、 このアンモニウム塩を最初は水で抽出し、蒸発乾固させるのが好ましい。このよ うにして単離したアンモニウム塩を上記の溶媒中に集め、次いでこの溶液を濾過 する。

本発明の方法を実施する１つの具体的な方法は、上記順序の上記操作の組合せの 工程（２）と（３）の間に挿入を行なうことによって得られる。既知の精製方法 および本発明の特徴的な工程（即ち、ヒアルロン酸の金属塩の４級アンモニウム 塩への変換）はさておき、本発明の別の具体的な態様によれば鉄イオンのキレー ト化試薬を好ましくは上記の抽出工程（１）において使用することが可能である 。実際のところ、最初のヒアルロン酸抽出物中に常に存在する鉄イオン（使用し た動物器官の血液残留物に由来する）が多糖鎖の脱ポリマー化過程の原因である ことが知られている。金属イオンの除去は比較的高分子量のヒアルロン分画を得 る際に極めて有用であることかわかっており、これをキレート化によって行なう ことができる。この方法を採用することによって、高分子量のヒアルロン酸また はその塩を得ることが恐らくは可能であるだけではな（、上記の鉄イオンが全く 存在しないが故に水溶液中で安定な特に純粋な生成物を得ることも可能である。

従って、本発明の好ましい目的は、ヒアルロン酸および／またはその塩のいずれ かを含む動物器官を鉄イオンのキレート化剤の存在下に水と混合しつる有機溶媒 で抽出し、もはや鉄イオンが存在しなくなるまでこの操作を繰返し、これら洗液 の予め乾燥した残留物をタンパク質加水分解試薬と適当な緩衝液の存在下の水性 溶媒中に集め、この溶液（全での固体残留物を予め除去しておく）を低級（Ｃ， 、）脂肪族基との４級アンモニウム塩の１つの形態にある巨大分子スルホン酸樹 脂からなるイオン交換器に通すことを特徴とする方法からなる。次いで、このイ オン交換器から得た溶出液を乾燥し、ヒアルロン酸およびその分画の４級アンモ ニウム塩を溶解しうる有機溶媒中に溶解する。次いで、この有機溶液にノλロゲ ン化ナトリウム（塩化ナトリウムまたは臭化ナトリウムなと）の水溶液を添加す ることによってアンモニウム塩をナトリウム塩に転換する。次いで、このように して得たナトリウム塩の水溶液を水と混合しえない有機溶媒で抽出し、所望によ り、透析を繰返す。次いで、得られた溶液を殺菌剤で処理し、所望により、殺菌 後に得られた溶液を巨大分子濾過にかけてもよい。次いで、所望ではないヒアル ロン多糖分画の全てを捨て、ヒアルロン酸ナトリウムの所望の分画を自体既知の 方法で単離する。

本発明に従って４級アンモニウム塩を溶解するために用いる溶媒は、非プロトン 性溶媒、例えばＮ−アルキルピロリドン、特にＮ−メチルピロリドン、ジアルキ ルスルホキシド、ジアルキルカルボキシアミド、例えば低級（Ｃ，、）ジアルキ ルスルホキシド、特にジメチルスルホキシド、および低級（Ｃ、、）脂肪族酸の 低級（Ｃ、−ａ）ジアルキルアミド、例えばジメチルもしくはジエチルホルムア ミドまたはジメチルもしくはジアセチルアセトアミドである。

イオン交換樹脂を調製するために使用され、従って本発明の特徴的なヒアルロン 酸アンモニウム塩を調製するために使用されるテトラアルキルアンモニウム塩基 は低級脂肪族基を有する塩基、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアルキル を有する塩基である。テトラブチルアンモニウムイオンで塩化された樹脂を用い るのが最も好ましい。

ヒアルロン酸、その分子分画およびその塩の抽出、精製および単離の工程に用い る上記の組合せにおいて、特に本発明の好ましい方法を構成する上記組合せにお いて、以下の試薬を用いるのが好ましい。

（ａ）動物器官からなる出発原料の抽出用として：エタノールまたはアセトン。

（ｂ）鉄イオンのキレート化剤として：１．ｔｏ−フェナントロリンまたはジメ チル誘導体。

（ｃ）タンパク質加水分解試薬として：既に挙げたちの：（ｄ）　４　級アンモ ニウム塩の溶媒として二Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルスルホキノド： （ｅ）アンモニウム塩の有機溶液から得たナトリウム塩の水性抽出物の精製用の 溶媒として、塩化メチレン、酢酸二チル：（ｆ）殺菌剤として　リン酸緩衝剤の 存在下の塩化セチルピリジニウム；（ｇ）恐らくは限外濾過の後に、精製された 水溶液からナトリウム塩を沈澱させるための有機溶媒　エタノール。

上記の工程において、一層純粋な最終産物を成功裏に得る際にさらに使用しうる 変法を導入することもてきる。例えば、上記した種類の殺菌剤「即ち、複素環式 核を有し、長鎖のアルキル（例えば、セチル）を含む４級アンモニウム塩、例え ば先に挙げた塩化セチルピリジニウム〕の使用は、ヒアルロン酸ナトリウムの溶 液にこれらを添加するとヒアルロン酸のイオンとて対応するアンモニウム塩を生 成するので、同時に精製工程として作用することができる。これらの塩は水溶液 中で沈澱し、従ってこの処理は、その後の再沈澱の繰返しと沈澱の洗浄および次 いで行なうＮａＣ１溶液中への溶解によって、超精製された生成物を単離するた めのヒアルロン酸ナトリウムの溶液を得ることを可能にする。これらの生成物は 眼科手術の際に使用するのに特に適している。

分子の限外濾過は自体既知の方法で行なう。即ち、例えば２００，０００以上の 比較的高い分子量を有する分画を捕捉する膜を使用し、所望により、この分離し た分画を濾過した生成物および膜の両方から回収することができる。本発明の方 法を実施する際の特に重要な方法は、低分子量のヒアルロン分画を排除する分子 限外濾過と上記の化学的な精製操作を組合せることである。このような分画は、 上記のＥＰＯ特許Ｎｏ、　０１３８５７２（１９９０年７月２５日認可）に記載 されている分画について報告されているように、治療用の産物における炎症作用 の開始の原因であることが認められている。

従って、本発明の別の好ましい目的は、精製操作の細部の組合せに関するもので あり、所望の部分において、分子限外濾過を行なって低分子量分子分画、特に３ ０．０００以下の分子量を有する分画を排除する上記方法である。この方法によ り、より正確には例示の実施例１および２に記載した詳細に従うことにより、治 療学的な見地から極めて有用であり、かつ最初に言及したようにＨＡ−１の名称 を有する、ヒアルロン酸ナトリウムの分画が得られる。これを眼科手術に用いる のが特に重要である。

眼科手術の際の生成物の使用 文献に記載されており、眼の手術への使用が推奨されているヒアルロン酸は、絶 対的な完全性の基準を満たさない。その理由は、高すぎる分子量の、従って高す ぎる粘度の炎症性物質および成分の両残留物または痕跡物が存在するために、そ れらヒアルロン酸を手術（例えば、白内障の手術）の後にその場所に残すことが できないためである。さらに、これらは先に言及したように望ましくない危険な 眼圧の上昇を引き起こすことがある。

手術中に前眼房に導入した外性のＨＡは、手術後の眼内圧にネガティブな作用を 発揮することがなく、また、眼内環境において炎症性の結果を誘発しないはずで ある。この前者の悪い作用は、極めて粘度の高い非常に高分子量のＨＡを使用し た後に、文献に繰返し記載されていた［Ｂｉｎｋｈｏｒｓｔ　Ｃ，Ｄ：　眼内水 晶体手術にＨｅａＩｏｎを使用した後の炎症および眼内圧：　Ａｍ、　Ｉｎｔｒ ａ−Ｏｃｕｌａｒ　Ｉｍｐｌａｎｔ、　Ｓｏｃ、　、　６＋　（４）＋　３４０ −３４１．１９８０；　Ｐａｐｅ　Ｌ、Ｇ、　：　Ｈｅａｌｏｎを用いる水晶体 移植のカプセル内およびカプセル外法：　Ａｍ、　Ｉｎｔｒａ−Ｏｃｕｌａｒ　 Ｉｍｐｌａｎｔ、Ｓｏｃ、、　６．　（４）、　３４２−３４３．１９８０：　 Ｐａ５ｓ潤@ｌｉ、ｓ。

ら°Ｉ（ｅａｌｏｎを用いる白内障手術の後の眼内圧：＾ＲＶＯａｂｓｔｒａｃ ｔｓ、１０．１０：４５．１９８１；　Ｐｅｒｃｉｖａｌ　Ｐ、　：　Ｂｏｂｅ ｒｇ　Ａｎｓ水晶体とヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎｉｄ）を用いる実 験ゴｒａｎｓ、０ｐｈｔｈａ１．Ｓｏｃ、ＵＫ、　１０２．（２）、　２９４− ２９７．１９８２；　１１ｃＲａｅ　Ｓ、Ｍ、ら：角膜内皮および眼内圧に及ぼ すヒアルロン酸ナトリウム、硫酸フンドロイチンおよびメチルセルロースの作用 ：　Ａｎｎ、　Ｊ、　ＯＰｈｔｈａｌｍｏｌ、　９５．３３２−３４１．１９８ ３コ。

この経験により、手術後に生理学的食塩水ですすぐことによって物質を除去する ことが推奨される結果になった。Ｂｅｒｓｏｌら［Ｂｅｒｓｏｎ　Ｆ、Ｇ、ら： 摘出したヒトの目のヒアルロン酸ナトリウムによる水流の遮断：　Ａａ＋、　Ｊ 、　０１）Ｍｈａｌａｏｌ、　９５．６８８−８７２゜１９８３］は、死後摘出 したヒトの目においてこの望ましくない現象の機序を研究し、導入した物質の極 めて高い粘度による、前眼房における生理学的な排水の促進の機械的遮断が基本 的な原因であることを示唆した。

Ｂａ１ａｚｓの米国特許（Ｎｏ、　４．１４１．９７３　：第１３欄を参照）に 記載されている１、５８６゜０００の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム分 画は、その表示された物理化学的および生物学的性質に鑑みると、市販されてい る最良の眼用製品のようである。これはｒＨｅａｌｏｎＪの名称で知られている ものであり、上記の不都合を免れているものではない。即ち、その分子量は本質 的に高すぎ、従って、ある種の目の手術用には不適切な粘度を有している。

上記の特許において消炎作用を測定するために用いられている試験は良好なデー タを５えているが、Ｉ（ｅａｌｏｎは眼圧の上昇などの手術後の合併症を引き起 こすので、例えば白内障の手術などの後にその場所に残すことができない。

Ｄａｌｅ　Ｐ、　Ｄｅ　Ｗｏｒｅの米国特許Ｎｏ、４，９２０．１０４１０４（ Ｃｈｅｗ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、　Ａｃｔｏｎ、　lａ ｓｓ、に譲渡）には、４５．０００〜６４．０ＯＯｃＳｔの運動粘度を有し、１ ，０００゜０００〜２．０００．　ＯＯＯダルトンの範囲の平均分子量を有する ヒアルロン酸ナトリウムを含有する、生理学的食塩溶液中のヒアルロン酸ナトリ ウムの粘弾溶液が記載され、特許請求されている。この産物も目の手術に使用す ることが挙げられており、手術後の副作用が少ないことから、特に手術後の眼圧 の上昇か抑制されることから、他の調製物よりもさらに有利に使用することがで きると記載されている。

しかし、この特許の表１はこの産物をそのまま残したときに手術後の眼圧の上昇 か存在することを示（７ており、第４欄の表２および３かられかるように、この 産物も王、術後に除去しなければならない。

眼科において使用するための別のヒアルロン酸ナトリウム分画か欧州特許Ｎ００ １３８５７２に記載されているか、これは５００，０００〜７３０，０００タル トンの平均分子量を有している（ＨＹＡＬＥＣＴ　Ｉ　Ｎ）。これは球内液の置 換用に好都合に用いることかでき、また、白内障や眼移植などの目の手術にも使 用される。しかし、手術後に除去することなく、手術中の前眼房内の正しい間隙 を保つことかでき、硝子体の反応に釣り合うことかでき、眼内構造に対して有効 な保護作用を持つことかできるさらに大きな粘弾性を有する産物が必要とされて いた。我々か調べたところによると、文献に記載され、上記した目の手術に使用 される高分子量の産物は常に手術後に除去しなければならなかった。本発明の利 点は、抽出溶液に鉄イオンのキレート化剤を添加し、こうして低分子量の分画に 脱ポリマー化することを妨げること（こよって得られる、生物に残存させること を不可能にする分画または不純物を含まない、比較的高分子量のヒアルロン酸ナ トリウムの分画を得るために元の方法に工夫が加えられたことにある。従って、 本発明の新規な分画ＨＡ−１は当分野において新規であり、大きな進歩を示すも のである。

実施例１および２に記載した方法によって得ることができる本発明の分画「ＨＡ −１」は次の性質を有している。

ｕａ　：　Ｕ　ｂｂｅｌｈｏｄｅ吊下げ水平粘度計を用いてｐＨ７，０の０．１ ５Ｍ　ＮａＣ１中にて２５℃で測定したときに、１４５〜２１ｄｌ／ｇの範囲の 固有粘度数。この値は、７５０．０００Ｄ〜１，２３０．０００Ｄ（好ましくは 、９２５，０００〜１，２３０゜０００Ｄ）の範囲の平均分子量に対応する。

タンパク質素量：Ｌｏｗｒｙ試験［Ｌｏｗｒｙ　Ｊ、ら：フォリン・フェノール 試薬によるタンパク質の測定：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９３．２６ ５−２７５．１９５１］で測定したときに、アルブミンで表して０．２％を越え ないタンパク質含量。

Ｕ、ｔ〜・１％（ｗ／ｖ）水溶液で測定したときに、１．ＯＡ、Ｕを越えない２ ５７ｎｍおよび２８０ｎｍのＵ、Ｖ、吸収。

動的粘度：ｐＨ７，０の０．１５Ｍ　ＮａＣ１中の１％（Ｗ／Ｖ）溶液の動的粘 度が、２０′Ｃの温度でＬＪ、　Ｓ、　Ｐｈａｒｉａｃｏｐｉａ　ＸＸ［１版（ ９１１）の１６１９頁に記載されているような回転粘度計を用いて、規定された 剪断速度で以下の限界を越えない剪断速度　動的粘Ｖ　（ｍ　Ｐ　ａ、　ｓ、２ ０°Ｃ）ｌ　Ｓ　１　２００００＋ａＰａ、ｓを越えない１０　Ｓ　１　２００ ０ｍＰａ、ｓを越えない１００　ｓ　１　１０００ｍＰａ、ｓを越えない３５０ 　ｓ　１　５００ｉＰａ、ｓを越えない碓醸仇」賭布Ｐ−炙麺　適当な寮、照物 質を用いて、誘導結合したプラズマの装置（１，Ｃ，Ｐ、）で測定したときに、 イオウとして領０７％を越えない含量。

銖　原子吸収または１．Ｃ，Ｐ法によって測定したときに、ｌｏｐｐｍを越えな い鉄含量。

安定性　固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表した ときに、自然放置および熱滅菌した分画ＨＡ−１の生理学的ｐＨの緩衝化等張溶 液の安定性が、以下の限界を越えない・初期値の９７％（２５°Ｃで６力月保存 ）：・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）：・初期値の８０％（１２１ ℃で１６分間滅菌）。

・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。

（以下、余白） 本発明のヒアルロン酸分画ＨＡ−１の優れた性質を以下の実験により示すことか できる サルにおけるＨＡ−１分画の眼内許容性目的 この試験は、ＨＡ−１を眼の硝子体へ注射した後のサルにおける眼の許容性を評 価するために行なった。

６匹の若年成体雌性カニクイザル［マカク属ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ　ｆ ａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］を本実験のために使用した。これらは健康であり、 検出可能な眼の病変はなかった。

眼の手術に用いられる粘弾性の生成物の眼許容性の実験に最も良い種であると考 えられるため、霊長類を本実験のために選択した。

眼許容性実験に以前用いていたヨザルは現在絶滅の危機に瀕した種であり法的な 保護を受けているため、カニクイザルを選択した。

２、実験群および関連の処置・ 群の指定および投与量 以下の計画に従ってサルを１度処置した・注射部位 動物番号　投与量（ｍｌ）　右目　左目１　０．５　食塩水　ＨＡ−１ ２０，５・ＨＡ−１食塩水 ３　０．５　食塩水　ＨＡ−１ ４０，５ＨＡ−１食塩水 ５　０．５　食塩水　ＨＡ−１ ６０，５８Ａ−１食塩水 ３、焦命物の調製おより没箋。

手術の日にベンドパルビタールナトリウムを追加した塩酸ケタミンでサルを麻酔 した。次いで局所用の１０％トロビカミド（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ、Ａｌｃｏｎ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で瞳孔を散大させた。虹彩、結膜、付属器および前 方部分をス’Ｊ　ｌ）−ランプ生体顕微鏡で検査し、後方部分を倒像検眼鏡で検 査した。０．５％ポビドンヨードおよび滅菌食塩水で２度洗浄して洗い流すこと により眼瞼周囲の皮膚を手術のために準備した。滅菌布および眼瞼鏡を設置し、 小歯鉗子で眼球を安定させた。

鋭利なおよび鈍い切開により、上縁から約１０ｍの部分を上縁に平行して、約１ ０１０−ｌ５の長さで、縁を基部とする結膜支弁を開いた。結膜およびテノン嚢 を通って上強膜までこの切開を行った。縁へ前方に切開することにより支弁を調 製し、毛様体軸を覆っている、下に横たわる強膜を露出した。縁から約５〜６ｎ ＋ｍを約３ｍｍ間隔の傷で、７−Ｑ　Ｖ　１ｃｙｒｌ（Ｅ　ｔｈｉｃｏｎ）の強 膜内さし縫い縫合をした。

２５−ゲージの針を用いてＱ、５ｍｌの硝子液を吸引しく２匹の動物においては ０゜４ＩＩＩだけ吸引し得た）、硝子体を等量のＨＡ　１　（１２ｍｇ／ａＸ） または滅菌食塩水で置換した。漏出を防ぐためにさし縫い縫合をしつかり締めて 結膜支弁を戻した。

抗生物質の軟膏を局所的に塗った。投与の前および投与約４８時間後に血球計を 用いて、吸引した硝子体について硝子体細胞のカウントを行った。

４、観察および記録 手術の約４８時間後に、動物を麻酔して眼内部の検査を行った。既述のように麻 酔、散大および検査を行った。問題の眼がＨＡ−１を注射されたものか対照物質 を注射されたものかについては盲検法により検査を行った。以下の眼の評価スケ ールのための１１記号で示されるように眼のノＺラメ−ターを等吸付けた。

結膜の浮帽、充血および分泌物： 角膜の洋種、ヘム、細胞および発赤。

＋２＝中度 ＋３＝重度または大規模 硝子体の透明度： ０＝透明 ｌ＝かすかな濁り一基底部が見える ２＝中度の濁り一基底部がわずかに見える３＝濁り一赤い基底部の像 ４＝濁り一灰色の基底部の像 ５＝基底部が見えない 既述のようにポビドンヨード溶液を用いて吸引のために眼を調製した。眼瞼鏡を 設置し、眼球を小歯持針器で安定させた。硝子体（０，ｊ＝０．２ｍ１）を、上 側類四分円の縁から６１を結膜および強膜を通して直接吸引した。元の手術部位 を避けるように注意した。血球計を用いて炎症性細胞をカウントした。局所用の 抗生物質軟膏を再び塗った。

結果 結果（表１）は、対照物質（食塩水）に比較した場合にＨＡ−１が非常に良く許 容され、顕著な眼の炎症を生じなかったことを示している。

食塩水群の２匹の動物は軽度の水性細胞の浸潤および発赤を示した。対照の硝子 体の白色細胞数はｍ＠’当たり１０〜６０細胞の範囲にあった。ＨＡ−１を注射 したある眼においては、軽度の水性細胞の浸潤および発赤が示された。硝子体白 色細胞数は試験筒においてｆｆ１１１’当たりＯ〜３０細胞の範囲にあった。

ＬＥ ０　０／６０／６　０／６　０／６　０／６０／６０／６　０／６　０／６　０ （１／６）；ｌ０ＷＢＣ−少数のＷＢＣ （１／６）；１０　ＷＢＣ− 多数のＲＢＣ （１／６）；　ＯＷＢＣ− 少数のＲＢＣ（３／６） ４８　０／６０／６　０／６　０／６　０／６＋１／６＋１／８　０／６　０／ ６　０（２／６）；２０ＷＢＣ（２／６）；１０　ＷＢＣ （１／６）；ｔｏ　ｗｉ３ｃｍ 少数のＲＢＣ（１／６） ＬＥ ０　０／６０／６　０／６　０／６　０／６０／６０／６　０／６　０／６　０ （２／６）；０ＷＢＣ−少数のＲＢＣ （２／６）；１０　ＷＢＣ− 多数のＲＢＣ（２／６） ４８　０／６０／６　０／６　０／６　０／６＋２／６＋２／６　［１／６　［ １／６　０−５−１０−１５−３０−６０　ＷＢＣ不 ＲＥ＝右目（０，５１１１１の食塩水を注射）ＬＥ−左目（０，５＋ａｌのＨＹ ＡＬＯＦＴＩ　Ｌを注射）ＷＢＣ−白血球 ＲＢＣ＝赤血球 本各々のサルに対する単一の値 従って、食塩水の対照に比較して、ＨＡ−１は硝子体内置換の後の眼組轍により 非常に良く許容されることが結論付けられる。

後眼房眼内水晶体移植を伴う水晶体嚢性白内障摘出のための手術におし）てＨｅ ａＩｏｎとＨＡ−１の効力を評価するための臨床実験を以下に示す。

貝−煎 以降に記載する実験により、２つの臨床実験における白内障摘出および眼内水晶 体移植において主たる市販品である粘弾性物質（Ｈｅａｌｏｎ）に比較したＨＡ −１の効力および安全性を評価した。第一の臨床実験において、同じ実験条件（ 両方とも手術後に吸引）でＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎを試験した。第二の実験 は、特に手術後の眼内圧および内皮細胞数の上昇に関するＨＡ−１の安全性（こ 焦点を当てたこの第二の実験（両粘弾性物質を手術後に吸引した第一の実験とは 異なる）１こおいてＨＡ−１は、眼から吸引したＨｅａｌｏｎとは異なり、手術 が終了した時点で除両実験のための計画は、無作為化、並行群、覆面の観察者（ 別々の研究者力（追跡調査を行った）、後眼房眼内水晶体移植を伴う水晶体嚢性 白内障摘出にお↓するＨ　ｅａｌｏｎに対するＨＡ−１の評価により行った。各 実験ζこお０て、老人性白内障の一次診断を受けた患者および１８歳以上のもの を適格であるとした。

具体的には以下の通りである゛ ・第一実験において、２１７名の患者を集め、約３　＋　１（ＨＡ−１：４徹者 １６１名、Ｈｅａｌｏｎ　：患者５６名）の比に従い無作為化を行った。

両粘弾性物質を手術後に吸引した。

実験期間は、手術前の評価、手術の進行および手術直後の追跡調査期間を含んだ 。本実験において、眼内圧を手術後３時間および手術の１．７および３０日後に 追跡調査で測定した。

・第二臨床実験（こおいて９１名の患者を集め、約ｌ：１の比１こ従（λＨＡ− １（４５）またはＨｅａｌｏｎ（４６）に無作為化した。

本実験において、第一実験と同様に吸引したＨｅａｌｏｎとは異なり、ＨＡ、− １は手術後に吸引しなかった。

実験期間（およびＨＡ−１に対する関連の実験物質）は第一実験で既述したもの と同じである。

本実験において、手術後の眼内圧を手術の１．３．６よび９時間後（第一実験よ りも頻繁）および手術の１．７．３０およびさらに９０日後の追跡調査で測定し た。本実験には始点および手術の９０日後の顕微鏡観察も含めた。

２、データの分析および統計学的方法・中央および処置群の比較可能性（α＝Ｏ ，ｌＯ）および安全性および効力（α−０゜０５）を評価するために統計学的分 析を行った。フィッシャーの完全検定、を−検定、記述統計値を用いてデータを 評価した。

合計３０８名の患者について実験を行った。それらを以下に示す。

第一実験　第二実験 ＨＡ　−Ｉ　Ｈｅａｌｏｎ　合計　ＨＡ−Ｉ　Ｈｅａｌｏｎ　合計始点　１５８ 　５６　２１４　４１　４６　８７１日　１５８　５６　２１４　４１　４６　 ８７７日　１５８　５６　２１４　３９　４５　８４３０日　＋５７　５４　２ １１　４１　４４　８５９０日　−４２４３８５ はとんどの人口統計学的、医療または白内障の特性に関して、各実験における２ つの処置群の間にはいかなる実質的な差異もなかった。

４　壬閏： 調製および方法、後眼房眼内水晶体移植を行う、併発症を伴わない老人性／成人 水晶体嚢性白内障摘出に対する研究者の標準的な手術法により手術を行った。

手術前（予防的）薬物療法、麻酔および他の手術中の投薬は研究者の標準的な方 法に従い行ったが、眼用抗高血圧薬の使用はしなかった。切開前の眼内圧はホー ナン（Ｈｏｎａｎ）眼内圧降下器、”５ｕｐｅｒ　Ｐｉｎｋｙ”または手による 圧力を用いてできるだけ低下させた。粘弾性物質（ＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎ ）を以降に記載するように用いた。

第二臨床実験において用いられるＨＡ−１をその場所に入れたままにしておく以 外は、薬物を手術後に除去した。

手術の進行を容易にし、眼組織を保護するなどのためにＨＡ〜１およびＨｅａｌ ｏｎの両方を後眼房に挿入した。具体的には次の通りである二第−実験： ・用いたＨＡ−１の平均ｊｌ（１２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．５６８１１１１）は 用いたＨｅａｌｏｎの量（１０Ｉ１ｇ／ｍｌの濃度で領４３９）よりも顕著に多 かったが、その差はわずかＯ９・用いた粘弾性物質の平均量には有意差はなかっ た二本実験において平均量は０゜９５７（ＨＡ−１）および０　、８３３　（Ｈ ｅａｌｏｎ）であった。

５、評価。

手術前、手術中および手術後に以下の試験を実施した：ａ）手術前の評価、例え ば以下の事項を評価した。

・視力（最も良く現れる）、眼圧測定、ｙｌ変測定法（角膜の厚さについて）お よびスリ・ｌトランプおよび検眼鏡検査による発見・顕微鏡観察（第二実験のみ ）：　１０の選択された中央の角膜の位置で顕微鏡観察により内皮細胞をカウン トした。各々のカウントを適当な因子により調整し、１平方ミリメートル当たり の細胞数を得、平均して１平方ミリメーター当たりの典型的な細胞数を得た。

ｂ）手術後の評価、例えば： ・眼内圧（眼圧測定による）を以下の時点で計測した。

・手術後３時間（第一実験） ・手術後１−３−６−９時間（第二実験）・検眼鏡およびスリ、トランプによる 検査、厚度測定、眼圧測定、顕微鏡観察（この最後のものは内皮細胞カウントの ため第二実験についてのみ行った）および視力の測定（追跡調査で）を以下の時 点で実施した：・第一実験においては１−７−３０日 ・第二実験においてはｌ−７−３０−９０日両臨床実験における各処置群の大き な割合において粘弾性物質は水晶体移植を容易にするものと評価された。

２、手術後の合併症： ２ａ）第−臨床実験 表２かられかるように： ・最も高い合併症の百分率（全患者の７９％）は手術と１日日の間に発生し、一 方でより少ない割合が７日および３０日に報告された。

・手術後１８目に合併症を患っているＨｅａｌｏｎで処置した患者の割合（１４ ，３％）は、ＨＡ−１で処置した患者の割合（５７％）より２．５倍高かった。

この差異は統計学的に有意である（フィッシャーの両側完全検定によりｐ＝０゜ ０７９ｙ）。７日および３０日における差異は統計学的に有意ではなかった（フ イノ／ヤーの両側完全検定によりｐ＞０．６）。

合併症には、眼内圧の３０ｍｍＨｇまたはそれ以上への上昇（７／１５８＝ＨＡ −１処置患者の４．４％、５／　５６　＝Ｈｅａｌｏｎ処置患者の８．９％）お よび角膜７＄騰、虹彩炎、結膜炎、前房出血、黄斑浮腫、創傷の漏出、毛様体炎 膜および結膜下出何が含まれた。

手術前および手術後（３時間および１−７−３０日）に得られた眼圧測定による データをまとめた表３かられかるように。

・処置群間で平均眼内圧におけるいかなる有意な差異も生じなかった：しかし、 Ｈｅａｌｏｎ処置患者は３時間および１日でより大きな平均眼内圧の上昇があり 、１日ではＨＡ−１処置患者より有意に大きな眼内圧の標準偏差を有した。

スリットランプ、厚度測定（角膜の厚さに対する）および検眼鏡検査により２つ の群の間にいかなる差異も現れなかった。

２ｂ）第二臨床実験 ・ＨＡ−１処置患者（２８，６％）よりもわずかに高い割合のＨｅａｌｏｎ処置 患者（３７０％）について、手術後の合併症が報告された（表４）。

合併症には、眼内圧の上昇（５／４２＝ＨＡ−１処置患者の１１．９％、１１／ 　４６　＝　Ｈｅａｌｏｎ処置患者の２３．９％）および前房出血、創傷の漏出 、硝子体出血、後置混濁化、脈絡膜剥離、虹彩萎縮および黄斑浮腫が含まれる。

・始点または１日から９０日までのどの時点においても、平均眼内圧または眼内 圧の変化性のいずれについても２つの処置群は統計学的に差異がなかった（表５ ）。手術後最初の９時間で、Ｈｅａｌｏｎ（眼から除去）およびＨＡ−１（その まま残存）が標準偏差に関して主に異なる手術後の眼内圧分布を生じたことが明 らかである。Ｈｅａｌｏｎ処置患者は手術１時間後により大きな標準偏差および 有意に高い平均値を有し、ＨＡ−１処置患者は手術の６時間および９時間後に比 較的大きいがご（わずかに有意な標準偏差を有していた。手術の１時間後に、Ｈ ｅａｌｏｎ処置患者の２２．７％およびＨＡ−１処置患者の１０％が２１ａ＋ａ Ｈｇまたはそれ以上の眼内圧を有していた。手術の６時間および９時間後に、Ｈ Ａ−１処置患者の大きな割合（６時間で７３．２％および９時間で６５．０％） およびＨｅａ１ｏｎ処置患者（６時間で６８．２％および９時間で７１゜４％） が２１１ＩＩＩＨｇまたはそれ以上の圧力値を有していた。

・第一実験で報告された観察に関して２群間に他のいかなる差異も示されなかっ た。同様に、顕微鏡観察（内皮細胞カウント）によっていかなる有意な差異も示 されなかった（表６）。

３　Ｍ的な結果。

視力の評価により、２つの粘弾性物質の効力は匹敵することが示された。具体的 には。

・第一臨床実験： ３０日で視力が２０／４０に達したＨ　ｅａｌｏｎ処置患者（７７８％）および ＨＡ−１処置患者（８４７％）の割合の間に有意差はなかった。

・第二臨床実験・ ３０日で視力が２０／４０またはそれ以上に達したＨ　ｅａｌｏｎ処置患者（７ ３，９％）およびＨＡ−１処置患者（７１４％）の割合の間に有意差はなかった 。９０日でその割合はほとんど同一となった。

ＨＡ−１患者　Ｈｅａｌｏｎ患者　患者合計Ｎ＝１５８　Ｎ＝５６　Ｎ＝２１４ Ｎ（％）　Ｎ（％）　Ｎ（％） １日 無　１４９（９４，３）　４８（８５，７）　１９７（９２，１）有＊　９（５ ，７）　８（１４，３）　１７（７，９）７日 無　１５３（９８，ｌ）　５５（９８，２）　２０８（９８，１）有　３（１， ９）　１（１，８）　４（１，９）３０日 無　１５４（９８，１）　５２（９６，３）　２０６（９７，６）有意に高かっ た（フィ、／ヤーの両側完全検定によりｐ＝０．０７９）。

処置群　Ｎ　平均　標準偏差 合計　２１３　１６．６７１　３．５９８ＨＡ−１１５７１６，６８２３，７４ ，７Ｈｅａｌｏｎ　５６　１６．６４３　３．１７６３時間眼内圧 合計　１７６　１８．０７７　７．７６０ＨＡ−１１２９１８，０２７７，４１ ７Ｈｅａｌｏｎ　４７　１８．２１３　８．７１８１日 合計　２１２　１９．１４６　７．４９７ＨＡ−１１５７１８，５８０６，８６ ５＊Ｈｅａｌｏｎ　５５　２０．３２７　８．４５３ヱ旦 合計　２００　１４．４３１　３．９７９ＨＡ−１１４８１４，４６８４，１４ ７Ｈｅａｌｏｎ　５２　１４．３２７　３．４９１３０日 合計　２０７　１５．００２　３．７３０ＨＡ−１１５４１４，９３２３，７４ ４Ｈｅａｌｏｎ　５３　１５．２０８　３．７１８＊２処置群の１日の標準偏差 は有意差があった（Ｆ−検定によりｐ＝０、０５０８）。

ＨＡ−１患者　Ｈｅａｌｏｎ患者　患者合計Ｎ＝４２　Ｎ＝４６　Ｎ＝８８ Ｎ（％）　Ｎ（％）　Ｎ（％） 手術後の合併症 無　３０（７１，４）　２９（６３，０）　５９（６７，０）有　１．２（２８ ，６）　１７（３７，０）　２９（３３，０）合計　８５　２２８３．１　４５ １．２４ＨＡ−１４０２２３４，６４３３，７２Ｈｅａｌｏｎ　４５　２３２６ ．１　４６６．８６９０日 合計　８０　２１５８．１　５０５．７３ＨＡ−１３９２０６８，２５８５，５ ２本明細書中に記載された２つの臨床実験の結果により、白内障摘出および眼内 水晶体移植におけるＨＡ−１の使用の有用な効力が示されている。特に、Ｈｌ− １は良く許容されることが示された。事実、この生成物により惹起される手術後 の合併症は、手術後に物質の除去を行うというく第一臨床実験で記載したように ）同じ実験条件で試験したＨｅａｌｏｎよりも少ない（約２．５倍少ない）。手 術後の合併症のうち、眼内圧の上昇は特に考慮すべきである。

両実験において、ＨＡ−１で処置した患者およびＨｅａｌｏｎで処置した患者の 手術後の経過が眼内圧に関して差異かあったことに注目すべきである。ＨＡ−１ およびＨｅａｌｏｎの両方を手術後に除去した第一実験において、ＨＡ−１処置 患者に比較して、Ｈｅａｌｏｎ処置患者のより高い割合で１日日に２１ａｍＨｇ 以上の眼内圧の上昇が示された。Ｈｅａｌｏｎとは異なり手術後にＨＡ−１が除 去されなかった第二実験において、ＨＡ−１の手術後の眼内圧特性は同等であっ た。

従って、２つの粘弾性生成物のいくつかの側面は同等であったが、手術後の合併 症に関してこれらは異なることか結論付けられる。眼から除去されたＨＡ−１よ りも眼から除去されたＨｅａｌｏｎは眼内圧のより大きな上昇と関連しているよ うであり、その場所に残されたＨＡ−１は手術後に除去されたＨｅａｌｏｎに匹 敵する手術後の眼内圧特性を示す。

これらの結果に基づき、手術後の合併症を誘導することな（ＨＡ−１をその場所 に残しうろことに注目することが重要である。この可能性は、以下の有用な利点 を提供する。

１　手術後にこの産物を抜取る工程が割愛されるので手術を簡単にする。

２、操作による、即ち吸引中の合併症の危険を減少させる。このような危険の例 は、手術過程に基づく外傷およびその対応する結果である。

また、本発明は活性成分として、ナトリウム塩の形態のヒアルロン酸の新規な分 子分画ＨＡ−１を含有する医薬調製物（特に、中性ｐｔ−ｔの食塩水溶液の形態 にある）に関する。選択されるＨＡ−１の濃度は、所望の粘度、例えば約３００ ｍＰａ　。

ｘｓ（３５０ｓ−１で）および約１０，０００ｍＰａ　ｘ　ｓ（１ｓ−１で）の 粘度が得られる濃度である。

さらに、本発明は、目の手術、特に白内障の手術または水晶体移植において新規 なヒアルロン酸ナトリウム分画ＨＡ−１を使用することに関する。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例Ｉ　ＨＡ−１分画を得るための操作および分画の特徴付はメントリの冠（ 新鮮または凍結晶）（３０００ｇ）をひき内機で細かく刻み、次いで機械的ホモ ジナイザーで注意深くホモジナイズする。得られたペーストを、０゜１％（Ｖ／ Ｖ）の特定の鉄キレート化剤を含む無水アセトンまたはエタノール（１０容量） を入れたガラス容器に移す。

１．１０−フェナントロリン（Ｃ，Ａ、Ｒ，Ｎ、６６−７１−７）またはそのジ メチル誘導体が有用なキレート化剤の例である。ガラス容器と特定の鉄キレート 化剤は、ヒアルロン酸のナトリウム塩の脱ポリマー化過程を避けるために用いる （この過程は、他の方法によると、鋼鉄製容器または血液残留物に由来する鉄イ オンによって引き起こされることがある）。

鉄イオンが完全に抽出されるまでメントリの冠を処理する［装置の対照、最大吸 収波長での１０１１セル中のアセトンまたはエタノール相におけるコンプレック ス鉄キレート化剤の吸光度（１，１０−フェナントロリンの場合には５１０ｎ＋ ａ；０゜００５Ａ、Ｕ　を越えない）１゜ 同容量の無水アセトンまたはエタノールを用いてさらに洗浄操作を行なって残留 する全てのキレート化剤を除去する。この処理は、以下の試験ｒＡＪの結果がネ ガティブになるまで行なう。

試験「Ａ」　：アセトンまたはエタノールの相（５ｍｌ）を中（らいの窒素流に よって蒸発させる。この残留物を水（５ａ＋１）に溶解し、キレート化剤の最大 吸収の波長で吸光度を測定する。

吸光度が０．１Ａ、Ｕ以下であるときにこの試験はネガティブであるとみなされ る。

最終的な反応生成物を５０　ｒｐｍの速度で６時間撹拌し、１２時間分離させ、 次いで溶媒を吸い上げ、これを廃棄した。

この抽出過程は、廃棄される溶媒が適切な水分レベルに到達するまで繰り返す（ Ｋａｒｔ−Ｆｉｓｃｈｅｒ法）０ 次いで、得られた物質を遠心し、適切な温度で５〜８時間、真空乾燥する。この 過程の収雪は乾燥粉末が約５００〜６００ｇである。

次いで、この乾燥粉末（３００ｇ）を、乾燥粉末に対して２０・０．０１〜２０ １の比を与える量の塩酸ンステインを用い、リン酸緩衝剤の緩衝化水性媒体によ り、適当なタンパク質加水分解試薬（パパイン、ペプシン、トリプシンまたはプ ロナーゼ）（０，２ｇ）による酵素消化過程に付す。次いで、この混合物を６０ 〜６５°Ｃの一定温度で２４時間、６０　ｒｐｍで撹拌する。Ｃｅ１ｉｔｅＲ（ ６０ｇ）を加えて全体を２５°Ｃまて冷却し、撹拌をさらに１時間続ける。

透明な液体が得られるまで得られた混合物を濾過する。

蒸留水で２脂ｇ／ｍｌまで希釈した上記の水溶液を、水酸化テトラブチルアンモ ニウムで処理することによりテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ＋）形態で得ら れる巨大分子イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ　Ｍ−１５を充填したカラムに導入する 。

カラムから溶出した溶液を蒸発させ、乾燥残留物を適当な容量のＮ−メチルピロ リドン（または、ジメチルスルホキシド）に溶解して２　ｍｇｌ鋼ｌの濃度にス ル。

得られた溶液を濾過し、４℃まで冷却し、水（等容りを加える。次いで、塩化メ チレンを用いて３回の洗浄工程を行ない、それぞれについて低い方の相を捨てる 。次いで、高い方の相を臭化ナトリウム（ＮａＢｒはヒアルロン酸に対して３： １のモル比で用いる）を用いて４℃で処理し、この水溶液をエタノール（３容量 ）の添加によって沈澱させ、この沈澱をエタノールで数回洗浄する。

この沈澱を水に溶解し、得られた溶液を透析にかける。塩化ナトリウムを加える ことによってこの溶液をＯ，ＩＭにし、温度を５０℃にする。６０ｇ／分で生成 物を撹拌しながら、塩化セチルピリジニウム（４５ｇ）を加える。この混合物を ６０分間撹拌し、次いでＣｅｌｉｔｅ”（５０ｇ）を加える。撹拌を続けると生 成物の温度が２５°Ｃまで下がり、生成した沈澱を遠心によって集める。このよ うにして得た沈澱を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．０１Ｍ塩化 ナトリウム溶液（５Ｌ）に懸濁させる。これを５０℃でさらに６０分間撹拌する 。温度を２５℃まで低下させ、沈澱を遠心する。

次いで、この洗浄過程を３回繰返し、最後にこの沈澱を、０．０５％塩化セチル ピリジニウムを含む０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液（３Ｌ）を入れた容器中に集 める。これを６０ｇ／分で６０分間撹拌し、２５℃の一定温度に２時間保った。

この上清を遠心によって除去する。

この過程を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．１Ｍ塩化ナトリウム 溶液を用いて数回繰返す。この混合物を遠心し、その上清を捨てる。この沈澱を 、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．３０Ｍ塩化ナトリウム溶液に分 散させる（３：ｌ）。

この混合物を撹拌し、沈澱と透明液の両方を集める。沈澱に対する抽出をさらに ３回繰返す［それぞれに同じ水溶液（０，５Ｌ）を用いるコ。

残留した沈澱を取り、透明な液体を１つの容器に集める。この液体の温度を、撹 拌しながら５０℃まで上昇させる。次いで、この液体を塩化ナトリウムで０゜２ ３Ｍにする。塩化セチルピリジニウム（Ｉｇ）を加え、撹拌を１２時間維持する 。

この混合物を２５℃まで冷却し、次いで、最初はＣｅ１ｉｔｅ”パックで続いて フィルター（１ｕ）で濾過する。

次いで、得られた溶液を３０，０００の分子排除限界を有する膜による分子限外 濾過に付し、０．３３Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加しながら元の容量の３倍を限 外濾過する。塩化ナトリウム溶液の添加を中断し、液体の容量を元の容量の１／ ４まで減少させる。

このようにして濃縮した溶液を、９５％エタノール（３容Ｎ）を用いて２５°Ｃ の温度で撹拌（６０ｇ／分ルながら沈澱させる。この沈澱を遠心して集め、その 上清を捨てる。この沈澱を０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液（ＩＬ）に溶解し、９５ ％エタノール（３容量）を用いてこの沈澱操作を繰返す。

この沈澱を集め、そして、最初は７５％エタノール（３回）で、次いで無水エタ ノール（３回）で、３番目には無水アセトン（３回）で洗浄する。

コノヨウニシテ得た生成物（ＨＡ−１分画）は、７５０，０ＯＯＤ〜１，２３０ ゜０００Ｄ（好マシくハ、９２５，０００〜１，２３０，０００）の範囲の平均 分子量を有する。

このヒアルロン酸の収率は、元の新鮮な組職の０．６％に等しい。

上記の方法によって得られる最終産物は次の性質を膏している・・什ヱ薄：　１ ，０００，０ＯＯＤニ ー　［ｆｆ１−任枯廉■：　ｕ　ｂｂｅｌｈｏｄｅ吊下げ水平粘度計を用いてｐ Ｈ７，０の０．１５ＭＮａＣ１中にて２５℃で測定したときに、１４５〜２１ｄ ｌ／ｇの範囲の値、この値は、７５０．０ＯＯＤ　〜１．２３０．０００Ｄ（好 ましくは、９２５．０００〜１．２３０゜０００　Ｄ）の範囲の平均分子量に対 応する。

・９２４又算違１：　Ｌｏｗｒｙ試験［Ｌｏｗｒｙ　Ｊら　フォリン・フェノー ル試薬によるタンパク質の測定：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、　１９３． ２６５−２７５．１９５１１で測定したときに、アルブミンで表して０２％を越 λない値。

・Ｕ、Ｖ吸光遺：１％（ｗ／ｖ）水溶液で測定したときに、１．ＯＡ、ＩＪ、を 越えない２５７ｎｍおよび２８０ｎ１１１での値。

の温度でＵ、　Ｓ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ　ＸＸ１１版（９１１）の１６１ ９頁に記載されているような回転粘度計を用いて、規定された剪断速度で以下の 限界を越えない：剪断速度　動的粘度（ｍＰａ、ｓ、２０°Ｃ）Ｉ　Ｓ　１　２ ００００ｍＰａ、ｓを越えない１０　ｓ−１２０００ｓＰａ、ｓを越えない１０ ０　ｓ−１１０００ｍＰａ、ｓを越えない３５０　ｓ　ｌ　５００ｓＰａ、ｓを 越えない・硫酸化されたムコ多糖含量　適当な参照物質を用いて、誘導結合した プラズマの装置（１，Ｃ，Ｐ、）で測定したときに、イオウとして０．０７％を 越えない値：・Ｍａｔ・原子吸収または１．Ｃ，Ｐ法によって測定したときに、 １０ｐｐｍを越えない値。

鉄ａｍ＋＝ついて、ＨＡ−１分画と市販品から入手した他のヒアルロン酸ナトＩ Ｊウム塩の溶液の間で比較試験を行なった。

得られた結果（表７）は明らかに異なった鉄含量を示している：　ＨＡ−１分画 は他の産物の鉄含量よりもはるかに低い鉄含量を有している。

表ヱＨＡ−１と他の産物の鉄含量（ｐｐｍ）ＨＡ−１試料Ａ　試料Ｂ　試料Ｃ 鉄（ｐｐｍ）　＜１０　１３０　１２０　４０・試料ＡはＳＯＤＩＣＨＩＭ（ロ ット１５４）に対応・試料ＢはＢＩＯＣＨＥＭＯ（ロット５４２）に対応・試料 ＣはＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　ＧＥＮＥＲＡＬ（ロットＢ−２５）に対応・ 鉄イオン含量は約０．５ｇの物質について測定した（白金るつぼ中で燃焼させ、 その残留物をＯ，ＩＭＨＮ○３に再溶解した）。

・因！件　固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表し たときに、自然放置および熱滅菌した分画ＨＡ−１の生理学的ｐＨの等張緩衝溶 液の安定性が、以下の限界を越えない：・初期値の９７％（２５°Ｃで６力月保 存）；・初期値の７５％（１１８°Ｃで３２分間滅菌）：・初期値の８０％（１ ２１°Ｃで１６分間滅菌）。

・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。

ＨＡ−１の生理学的ｐｉ−＋の等張緩衝溶液と市販品から入手した類似のヒアル ロン酸溶液の間で比較試験を行なって、次の条件での安定性を測定した：・自然 放置く室温で６力月保存）； ・種々の条件での熱滅菌。

医薬用の原料および記載した目的に信頼できることが既に証明されている装置を 用いた。

具体的には、これらは次の通りである：・以下の性質を有する無色のガラス製バ イアル：・ガラス：タイブー１の硼ケイ酸ガラス（Ｐｈ、Ｅｕｒ、　１１版）； ・最小ガラス厚み：０．９０ｍｍ； ・最大ガラス厚み：１．ＯＯ＋ｕ＋； ・以下の性質を有するハロゲン化ブチルゴムで調製された栓：・エラストマーの 種類、クロロブチル。

・不活性充填剤：カオリン： ・顔料二二酸化チタンおよびカーボンブラック：・加硫剤：酸化亜鉛： ・放出性：　Ｐｈ、　Ｅｕｒ、　ｌ　１版Ｖ１．２．３．１に準じる：・アルミ ニウム製の取りはがし密閉； ・注射用水（Ｐｈ、　Ｅｕｒ、　Ｉ　１版に準じる）。

使用した試薬は分析グレードのものであった。

滅菌には、Ｆ　ｅｄｅｇａｒｉオートクレーブ（Ｆ　ＯＦ　５　Ｓ　ｕｐｅｒｓ ｐｅｃｔｒａ型）を用いた。

固有粘度数は、吊下げ水平Ｕ　ｂｂｅｌｈｏｄｅ型粘度計を用い、ｐＨ７，０の ０．１５ＭＮａＣ１中、２５℃で測定した。

対応する平均分子量は、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式によって計算した［１． 　Ｍａｒｋ：　Ｚ、　Ｅｌｅｋｔｒｏｃｈｅｍｉｅ　４０．　４９９．　１９３ ４：　Ｒ，Ｈｏｕ＋ｙｉｎｋ：　Ｊ、Ｐｒａｋｔ、Ｃｈｅｍ、　１５７．　１５ ．　１９S０コ。

平均分子量の値は、脱ポリマー化の傾向をより適切に評価するために最初の値の 百分率（％）で表した。得られた結果（表８および表９）がら、Ｈｌ−１は、Ｈ Ａ−１よりも有意に高い鉄含量を有する参照試料（表７を参照）よりも大きな安 定性（少なくとも２倍大きい）を有していることがわかる。

固有粘度数（ｄｌ／ｇ）　分子量の変化（％）ＨＡ−１２０，９２０，８２０， ５１００９９，４９７，５Ａ　１０，４　１０．１　９．６　ｔｏｏ　９６．２ 　８９．９Ｂ　９．７　９．２　８．８　１００　９３．２　８７．８固有粘度 数（ｄｌ／ｇ）　分子量の変化（％）試料　開始時　１　ｃ、ＩＩ　ｃ、ＩＩＩ 　ｃ、開始時　１　ｃ、ＩＩ　ｃ、ＩＩＩ　ｃ。

ＨＡ−１２０，９１７，２１８，３１９，９１００７７，１１１１３，８９３， ７Ａ　Ｉｏ、４　６．２　６．６　７，２　１００　５０．２　５４，５　６１ ．２Ｂ　９．７　６．３　６．７　７．３　１００　５６．２　６１．１　６ｇ 、５Ｃ１５，５１０，９１１，５１２，６１００６２，５６７，２７５，９上記 の表８および表９において、試料Ａ％ＢおよびＣは鉄含量の測定に用いたものと 同じであり、Ｏ，ＯＯ２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）中の０．９％ｈ／　ｖ） 　Ｎ　ａＣ１溶液中の約１０＋ｇ／■１のそれぞれの産物の溶液を次の試験に付 した：（ａ）自然放置゛室温（２５°Ｃ）の暗所で６カ月間保存し、３力月毎に チェックする（表８を参照）。

（ｂ）以下の条件によりオートクレーブで滅菌し、それぞれの条件の開始時と終 了時にチェックする： ・１１８℃で３２分間（Ｉｃと表示）；・１２１°Ｃで１６分間（ＩＩ　ｃ、と 表示）：・１２４°Ｃで８分間（ＩＩＩ　ｃ、と表示）。

実施例２　ＨＡ−１分画を得るための操作および分画の特徴付はメントリの冠（ 新鮮または凍結晶）（３０００ｇ）をひき内機で細かく刻み、次いで機械的ホモ ジナイザーで注意深くホモジナイズする。得られたペーストを、０゜１％（Ｖ／ Ｖ）の特定の鉄キレート化剤を含む９５％エタノール（４容量）を入れたガラス 容器中で処理する。

１．１０−７エナントロリン（Ｃ，Ａ、Ｒ，Ｎ、６６−７１−７）またはそのジ メチル誘導体が有用なキレート化剤の例である。

ガラス容器と特定の鉄キレート化剤は、ヒアルロン酸のナトリウム塩の脱ポリマ ー化過程を避けるために用いる（他の方法によると、この過程が、鋼鉄製容器ま たは血液残留物に由来する鉄イオンによって引き起こされることがある）。

鉄イオンが完全に抽出されるまでメントリの冠を処理する［装置の対照、最大吸 収波長での１ｃｍセル中のアセトンまたはエタノール相におけるコンプレックス 鉄キレート化剤の吸光度（１，１０−フェナントロリンの場合には５１０ｎｍ； ０００５Ａ、Ｕ　を越えない）１゜ 同容量の無水アセトンまたはエタノールを用いてさらに洗浄操作を行なって残留 する全てのキレート化剤を除去する。この処理は、以下の試験ｒＡＪの結果がネ ガティブになるまで行なう。

試験「Ａ」　、アセトンまたはエタノールの相（５ｍｌ）を中（らいの窒素流に よって蒸発させる。この残留物を水（Ｅ＋＋１）に溶解し、キレート化剤の最大 吸収の波長で吸光度を測定する。

吸光度がＱ、ｌＡ、Ｕ、以下であるときにこの試験はネガティブであるとみなさ れる。

最終的な反応生成物を５０　ｒｐｍの速度で６時間撹拌し、１２時間分離させ、 次いで溶媒を吸い上げ、これを廃棄した。

この抽出過程は、廃棄される溶媒が適切な水分レベルに到達するまで繰り返す（ Ｋａｒｔ−Ｆｉｓｃｈｅｒ法）。

次いで、得られた物質を遠心し、適切な温度で少な（とも８時間、真空乾燥する 。この過程の収量は乾燥粉末が約５００〜６００ｇである。

次いで、この乾燥粉末（３００ｇ）を、乾燥粉末に対して２０：０．０１〜２０ ゛１の比を与える量の塩酸システィンを用い、リン酸緩衝剤の緩衝化水性媒体に より、適当なタンパク質加水分解試薬（パパイン、ペプシン、トリプシンまたは プロナーゼ）（０，２ｇ）による酵素消化過程に付す。次いで、この混合物を６ ０〜６５°Ｃの一定温度で２４時間、６０ｒｐ＠で撹拌する。反応終了時にＣｅ １ｉｔｅ”（６０ｇ）を加え、全体をさらに１時間撹拌する。得られた混合物を 、透明な液体が得られるまで濾過する。

塩化セチルピリジニウム（４５ｇ）を、６０ｒｐｍで撹拌しながら加える。この 混合物を６０分間撹拌し、次いでＣｅ１ｉｔｅ”（５０ｇ）を加える。

このようにして生成させた沈澱を遠心によって集め、０．０５％セチルピリジニ ウムを含む０．ＯＬＭ　ＮａＣ１溶液（５Ｌ）に懸濁させる。

これを５０’Ｃで６０分間撹拌し、次いで温度を２５℃にし、沈澱を遠心する。

この洗浄工程を３回繰返す。この沈澱を、０５％塩化セチルピリジニウムを含む ０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液（３Ｌ）を入れた容器中に集める。

これを６０ｒｐｍで６０分間撹拌し、２５°Ｃの一定温度に２時間保った。透明 な上相を遠心して除去する。

この工程を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．１Ｍ塩化ナト１ノウ ム溶液を用いて２回繰返す。この混合物を遠心し、その上清を捨てる。この沈澱 を、００５％塩化セチルピリジニウムを含む０．３０Ｍ塩化ナトリウム溶液（３ Ｌ）ｉこ分散させる。

この混合物を撹拌し、沈澱と透明液の両方を集める。同じ水溶液（１，５Ｌ）を 用いて沈澱を２回抽出する。

透明な液体を１つの容器に集め、３０，０００ダルトンの分子排除カットオフを 有する膜による分子限外濾過に付し、最初の容量の１／３まで濃縮する。

この濃縮した溶液を、テトラブチルアンモニウム（Ｔ　Ｂ　Ａ　”）の形態で得 られるＤｏｗｅｘ”　Ｍ　１５イオン交換巨大分子樹脂で処理し、−晩撹拌する 。

この懸濁液に、７０／　３０　（ｖ／ｖ）のＮ　Ｍ　Ｐ　−Ｈ！Ｏ比が得られる までＮ−メチルピロリドン（適当な１１）を加える。次いで、この混合物を濾過 し、樹脂を除去する。

次いで、ＮａＣ１（適当なりをこの溶液に加え、ＩＭＮａＯＨによりｐＨ＞７． ５にする。次いで、この溶液を塩化メチレン（ＣＨ、Ｃ１，）で２回洗浄し、そ れぞれにおいて下の方の相を捨てる。上の方の相を、９５％エタノール（３容量 ）を用（１て２５°Ｃの温度および６０　ｒｐｍで撹拌しながら沈澱させる。

この沈澱を遠心して集め、上相を捨てる。

この沈澱を集め、最初は７５％エタノールで、次いで無水エタノールで、そして 最後にアセトンで洗浄する。

次いて、この洗浄した生成物を２５℃の温度で少なくとも２０時間、真空乾燥す る。この乾燥した生成物を、〉１■ｇ／ｍｌの溶液が得られるよう１こ逆浸透（ こよって水に溶解する。適切量の塩化ナトリウムを加えて０．１〜０．４のモル 濃度を得、次いでこの溶液を１ＭＮａＯＨでアルカリ性にする。次（哩、この溶 液を滅菌フィルターで濾過する。

この溶液を、９５％エタノール（３容ＩＩ）を用いて２５°Ｃの温度で撹拌（６ ０ｒｐｍ）しながら沈澱させる。

この沈澱を遠心して集め、上相を捨てる。

この沈澱を集め、最初は７５％エタノールで、次いで無水エタノールで、そして 最後にアセトンで洗浄する。

この洗浄した生成物を２５°Ｃの温度で少なくとも５０時間、真空乾燥する。

このようにして製造した生成物は、１，１８０．０００の分子量を有する。

医薬調製物の例 以下に例を挙げて、分画ＨＡ−１の可能性ある治療用医薬調製物を説明する。

これらは説明のためだけに挙げるものである。

製剤↓：２＋１１のアンプル それぞれのアンプルは次の成分を含有する。

ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ　−１）　２４．０＋＋＋ｇ−塩基性リン酸ナ トリウム・２ＨｅＯ０，１ｍｇ二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ，０１，２ｍ ｇ塩化ナトリウム　１７．０＋ａｇ 注射用の水（この量まで）　２．０＠１暫剋λ：滅菌され既に充填された１、１ ｍｌの注射器それぞれの注射器は次の成分を含有する。

ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　２０．０　ｍｇ塩化ナトリウム　９゜ ３５０ｍｇ −塩基性リン酸ナトリウム・２　Ｈｔ○　０．０５５ｍｇ二塩基性二塩酸ナトリ ウム・１２　Ｈｔ　Ｏ０、６６０ｍｇ注射用の水（この量まで）　１．１　ｍｌ 粒剤３　：　０．２ｍｔの１回用量の容器それぞれの容器は次の成分を含有する ：ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　４００．０ａｇ塩化ナトリウム　４ ４０．０ｍｇ −塩基性リン酸ナトリウム・２　Ｈｔｏ　５　、０　ｍｇ二二塩性性リン酸ナト リウム１２　ＨｔＯ６０、Ｏｍｇｇ射用の水（この量まで）　１００．０ｍｌ製 剤４：０．２ｍｌの１回用量の容器 それぞれの容器は次の成分を含有する：ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１） 　２００．０ｍｇ塩化ナトリウム　６７０．０＋ｇ 塩化カリウム　２５０．０ＩＩ＋ｇ −塩基性リン酸ナトリウム・２　ＨｔＯ５，０＠ｇ二塩基性リン酸ナトリウム・ １２Ｈ，０６０，０ｍｇ注射用の水（この量まで）　１００．０ｍｌ鼾剋支：５ ｍｌのファルコン それぞれのファルコンは次の成分を含有する：ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ 　−１）　２００．０ｍｇ塩化ナトリウム　６７０．０ｍｇ 塩化カリウム　２５０．０ｍｇ −塩基性リン酸ナトリウム・２ＨｙＯ５，Ｏｍｇ二塩基性リン酸ナトリウム・１ ２Ｈ，０６０，０ｇ＋ｇエチル−マーキュリチオサリチル酸ナトリウム　５．０ ｍｇ注射用の水（この量まで）　１００．０ｍｌここまでに本発明を説明したが 、これを多くの方法で変化させうろことは明らかであろう。このような変法は本 発明の思想および範囲から逸脱するものとみなすべきではなく、当業者に自明で あるこのような変化の全ては以下の請求の範囲内に含まれるものとする。

要　約　書 非炎症性であり、かつ眼科手術にお０て手術後の合併症力く回避される高純度の ヒアルロン酸分画が開示されて（＼る。ざら（こ、ヒアルロン酸を女寸応する４ 級アンモニウム塩に変換し、精製過程の後ζここの４級アンモニウム塩をヒアル ロン酸のナトリウム塩に再変換することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法力 く開示されている。

国際調査報告　、、ｒＴＩＣ口◎５／１ｌｌｌＱｃ＋、　、、　ＰＣＴ／ＥＰ　 ９２１００８６１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．７５０，０００Ｄ〜１，２３０，０００Ｄの範囲の平均分子量を有し、以下 の性質を有するヒアルロン酸分画またはその塩：（ａ）Ｕｂｂｅｌｈｏｄｅ吊下 げ水平粘度計を用いてｐＨ７．０の０．１５ＭＮａＣｌ中にて２５℃で測定した ときに、固有粘度数が１４．５〜２１ｄｌ／ｇの範囲内であること； （ｂ）タンパク質含量がアルブミンで表して０．２％を越えないこと；（ｃ）１ ％（ｗ／ｖ）水溶液で測定したときに、２５７ｎｍおよび２８０ｎｍのＵ．Ｖ． 吸収が１．０Ａ．Ｕ．を越えないこと； （ｄ）２０℃の温度で回転粘度計を用い、規定された剪断速度で、ｐＨ７．０の ０．１５ＭＮａＣｌ中の１％（ｗ／ｖ）溶液の動的粘度が以下の限界を越えない こと；剪断速度　動的粘度（ｍＰａ．ｓ、２０℃）１ｓ−１　２００００ｍＰａ ．ｓを越えない１０ｓ−１　２０００ｍＰａ．ｓを越えない１００ｓ−１　１０ ００ｍＰａ．ｓを越えない３５０ｓ−１　５００ｍＰａ．ｓを越えない（ｅ）硫 酸化ムコ多糖含量がイオウとして０．０７％を越えないこと；（ｆ）鉄含量が１ ０ｐｐｍを越えないこと；および（ｇ）固有粘度数の評価によって測定して対応 する平均分子量の減少で表したときに、自然放置および熱滅菌した分画の生理学 的ｐＨの等張緩衝溶液の安定性が、以下の限界を越えないこと； ・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；・初期値の７５％（１１８℃で３２ 分間滅菌）；・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；・初期値の９０％ （１２４℃で８分間滅菌）。
2. ２．平均分子量が９２５，０００〜１，２３０，０００である請求項１に記載の ヒアルロン酸分画。
3. ３．（ａ）ヒアルロン酸またはその塩を対応する４級アンモニウム塩に変換し； （ｂ）該対応する４級アンモニウム塩を、そのようなアンモニウム塩を溶解する ことができる有機溶媒に溶解し；そして（ｃ）この溶液を濾過し、ハロゲン化ナ トリウムで処理してヒアルロン酸をナトリウム塩の形態で回収する； ことからなるヒアルロン酸またはその塩の精製方法。
4. ４．ヒアルロン酸の塩の水溶液を４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交 換物質に吸収させることによって４級アンモニウム塩を形成させる請求項３に記 載の方法。
5. ５．イオン交換物質が４級アンモニウム形態にあるＤＯＷＥＸ１５交換物質であ る請求項４に記載の方法。
6. ６．ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を溶解させるために使用する有機溶媒が 非プロトン性有機溶媒である請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
7. ７．非プロトン性溶媒が低級ジアルキルスルホキシドまたはジアルキルカルボキ シアミドである請求項６に記載の方法。
8. ８．非プロトン性溶媒がジメチルスルホキシドまたはＮ−メチルピロリドンであ る請求項７に記載の方法。
9. ９．ヒアルロン酸の塩がナトリウム塩である請求項２〜８のいずれかに記載の方 法。
10. １０．ヒアルロン酸のアンモニウム塩の対応するナトリウム塩への変換が、有機 溶媒中のヒアルロン酸のアンモニウム塩の溶液に臭化ナトリウムを添加すること によって行われる請求項９に記載の方法。
11. １１．（ａ）動物器官に由来するヒアルロン酸を鉄キレート化剤の存在下に第１ の有機溶媒で抽出して鉄イオンを実質的に含まないヒアルロン酸含有抽出物を得 ；（ｂ）該ヒアルロン酸含有抽出物をタンパク質加水分解試薬で処理し；（ｃ） 該処理したヒアルロン酸含有抽出物を４級アンモニウム塩の形態にある酸イオン 交換物質と接触させ； （ｄ）該イオン交換物質からの抽出物を、ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を 溶解することができる第２の有機溶媒に溶解し；（ｅ）工程（ｄ）の混合物をハ ロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を対応するナ トリウム塩に変換し；そして（ｆ）ヒアルロン酸の所望のナトリウム塩を単離す る；ことからなるヒアルロン酸分画の製造方法。
12. １２．ヒアルロン酸のナトリウム塩の水溶液を分子濾過に付してヒアルロン酸の ナトリウム塩の所望の分子量分画を得る請求項１０に記載の方法。
13. １３．ヒアルロン酸含有抽出物を分子濾過に付してヒアルロン酸の所望の分子量 分画を得る請求項１２に記載の方法。
14. １４．酸イオン交換物質が４級アンモニウム塩の形態にあるスルホン酸樹脂であ る請求項１２または１３に記載の方法。
15. １５．４級アンモニウム塩が最大６炭素原子のアルキル基を有するテトラアルキ ルアンモニウム塩である請求項１４に記載の方法。
16. １６．テトラアルキルアンモニウム塩がテトラブチルアンモニウム塩である請求 項１５に記載の方法。
17. １７．第１の有機溶媒がエタノールまたはアセトンであり、鉄キレート化剤が１ ，１０−フェナントロリンである請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. １８．ナトリウム塩が殺菌剤で処理される請求項１１〜１７のいずれかに記載の 方法。
19. １９．殺菌剤が塩化セチルピリジニウムである請求項１２に記載の方法。
20. ２０．ヒアルロン酸のナトリウム塩を、３０，０００Ｄの分子排除限界を有する 膜による分子濾過に付す請求項１２または１３に記載の方法。
21. ２１．（ａ）メンドリの冠に由来する有機体原料を、アセトンまたはエタノール からなり、さらにフェナントロリンまたはそのジメチル誘導体を含む抽出溶媒で 抽出して鉄イオンを実質的に含まない抽出物を得；（ｂ）該抽出物を、パパイン 、ペプシン、トリプシン、プロナーゼおよび塩酸システインからなる群から選ば れるタンパク質加水分解試薬で処理し；（ｃ）該処理した抽出物を、テトラブチ ルアンモニウム塩の形態のスルホン酸樹脂を充填したカラムと接触させ； （ｄ）該カラムを溶離してヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩を含む溶 液を得； （ｅ）該溶液を乾燥してヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩からなる残 留物を得； （ｆ）該残留物を非プロトン性溶媒に溶解し；（ｇ）工程（ｆ）の溶液を濾過し ； （ｈ）工程（ｇ）の溶液を塩化メチレンで洗浄し；（ｉ）工程（ｈ）の溶液をハ ロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸ナトリウムを得； （ｊ）該ヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させ；（ｋ）該沈澱を水に溶解し、この 溶液を透析に付し；（ｌ）該透析した溶液を処理してヒアルロン酸ナトリウムを 沈澱させ；（ｍ）該沈澱を３０，０００Ｄの分子排除限界を有する膜による分子 濾過に付して、７５０，０００〜１，２３０，０００の分子量を有するヒアルロ ン酸のナトリウム塩を含む溶液を得る； ことからなるヒアルロン酸ナトリウム分画の製造方法。
22. ２２．請求項２１の方法によって製造したヒアルロン酸ナトリウム分画。
23. ２３．請求項１に記載のヒアルロン酸分画を活性成分として含有する医薬調製物 。
24. ２４．眼科手術において使用するための請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
25. ２５．眼科学の分野で使用するための請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
26. ２６．白内障の手術または眼水晶体移植において使用するための請求項１に記載 のヒアルロン酸分画。