JPH02103A - 新規リポソーム及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は新規ホスファチジル含有リポソーム及びその製
造方法に関する。

［従来技術及びその課題］ 例えばホスホリピド（リン脂質）などの両親媒性化合物
は２つの物理化学的に異なる部分、即ち疎水部、言い換
えれば撥水部と親水部、言い換えれば水溶性部とからな
る。疎水部の例としては、ホスファチジルグリセロール
の脂肪酸のアルキル鎖を挙げることができ、また親水性
部の例としては、そのホスホグリセロール部分を挙げる
ことができる。適当な両親媒性化合物を水に分散すると
、直径が約１００〜１０．０００人の、顕微鏡的小胞、
即ちリボソームが瞬時に形成する。リボソーム壁は両親
媒性化合物が形成する二重層膜からなる。この二重層膜
では、両親媒性の親水性ヘッドが外方に伸長している。

即ち、該ヘッドはリボソームに閉じ込められ、かつこれ
を取り囲む水性相に接触するが、疎水部は壁構造中内方
に伸長する。

リボソームはそのタイプによって異なるクラスに分けら
れる。即ち、ひとつのクラスは単一の脂質二重層のみか
らなる単薄層（ｕｎｉ−１ａｍｅｌ　１ａｒ）リボソー
ムからなる。また、第２のクラスは幾つかの脂質二重層
からなる多重薄層が形成する。この単薄層リボソームは
さらに小さな単薄層すポソーム即ち小胞（ＳＵＶ）及び
大きな単薄層すポソーム即ち小胞（ＬＵＶ）に分けられ
る。

これら異なるリボソームに共通していえる事実は、周囲
のリボソーム膜構造への水溶性化合物浸透性が悪いこと
である。薬剤への使用という点からみれば、ＳＵＶ及び
ＬＵＶリボソームが最も重要である。リボソームを使用
して、薬剤をカプセル化し、これを投与した場合幾つか
の利点がある。リボソームはカプセル中の薬効物質の細
胞への浸透を促進する。リボソームの使用によって、治
療部分を患部にのみに絞ることができ、従って、身体の
他の部分における毒性反応を避けることができる。また
、薬効物質の放出を遅らせることも可能であり、そして
非毒性の有効な全身レヴエルが達成でき、従って薬剤中
毒を避けることができる。リボソームによって、感受性
薬剤の失活をしばしば防ぐことができる。

リボソームを製造し、かつ均一な径分布を得るために各
種の方法が開発されている。代表的には、場合によって
はカプセル化する物質を含み、かつｐＨが自然ｐＨ値に
近いか、又はこれの値に緩衝した水性媒体に壁材料とし
て使用するリン脂質を分散することによってリボソーム
を調製している。適当な分散方法は超音波処理である。

薬剤用リボソームを調製するさい、両親性化合物として
リン脂質を使用することに主にその注意が向けられてい
る。リン脂質は有機体又は生体にとって自然な化合物で
あり、従って異物反応をもたらさない。典型的なこのよ
うなリン脂質はホスファチジン酸、レシチン（ホスファ
チジルコリン）及びセファチン（ホスファチジルセリン
）である。また、ホスファチジルグリセロール類もリボ
ソームの調製にしばしば使用されている。リボソームの
安定性からみて重要な事実は、酸性リン脂質が膜の一部
を形成し、そしてこの時に形成したリボソームの表面が
負の実効電荷になる結果、リボソームの相互反発が生じ
ることである。このため、一方ではリボソーム小胞の凝
集を防止でき、また他方ではその融着、即ち膜構造の融
着を防止できる。

リボソームを調製するための代表的なリン脂質組成物は
、例えばレシチン、ホスファチジルグリセロール及びコ
レステロール’ｉ−例工ば６０：１０：３０のモル比（
％）で含有することができる。リボソームの調製に通常
使用されているホスファチジルグリセロールは、グリセ
ロールこうせいのｓｎ−２−炭素原子だけでなく、極性
グリセロール末端部位にもり、Ｄ−立体配置を有してい
る。従来、ホスファチジルグリセロールはホスホリパー
ゼＤ−酵素を使用する、所謂トランス−ホスファチジル
化によってレシチンから調製されている。ところが、ト
ランス−ホスファチジル化反応によって、極性末端グリ
セロール部位に対してラセミ関係を示す生成物が形成す
る。

即ち、リボソームの調製に使用するために得たホスファ
チジルグリセロール混合物は１′−及び３′−形の両者
だけでなく、ある程度は２′−形のものを含んでいる。

また、トランス−ホスファチジル化時には、抗原化合物
であるカルジオビリンが若干形成するが、この化合物が
存在すると、リボソームは極めて有害なものになる。

［課題を解決する手段及び作用］ ところが、リボソームの製造にホスファチジルグリセロ
ールの１′−異性体を使用することによって、上記の問
題が著しく改善されることを見いだした。即ち、物理化
学的特性において１′−異性体と３′−異性体は実質的
に異なることを発見したのである。１′−異性体に比較
して、３′−異性体から得たリボソームは、その立体化
学的構造の理由から、遥かに強固に表面にＮａ’イオン
を結合し、従って、リボソーム表面の負の電荷を中和す
る。この結果、Ｎａ”イオンが存在している場合には、
１′−異性体から得た対応する分散体に比較して、３′
−異性体を含むリボソーム分散体は実質的にその結晶性
が強くなる。従って、分散体に望ましくない凝集が生じ
る共に、リボソームが融着する。即ち、代表的なホスフ
ァチジルグリセロールの３′異性体から得たリボソーム
分散体の保存安定性は僅か数日間であるが、１′−異性
体と３′−異性体の１：ｌ混合物のそれは数週間で、１
′−異性体単体から得たそれは数月間である。

Ｎａ”イオンはすべての生体に共通である。これらは細
胞外流体の主要カチオンであり、イオン・浸透バランス
に対する影響において主要な決定的な働きを示す。従っ
て、ナトリウムイオンを強固に結合するホスファチジル
グリセロールの３′−異性体を、例えば製剤のリボソー
ムキャリヤとして投与するならば、生体のイオンバラン
スに悪影響を与えることがある。一方、本発明に従って
製剤のキャリヤとしてホスファチジルグリセロールの１
′−異性体を使用することによって、Ｎａ゛イオン結合
脂質の生体中への移行を避けることができる。

さらに、１′−異性体のみが自然に存在している。３′
−異性体は、生体系が自動的に適合する自然物質では全
く有り得ない。例えリボソームが、ホスファチジルグリ
セロールの主要部分を１′−異性体が形成し、そして残
りの部分を３′−異性体が形成した混合物を含んでいる
場合でも、３′−異性体は、その遅い代謝により生体に
蓄積し、生体に悪影響を与えると考えられる。

つまり、本発明はその第１態様において、壁材料がホス
ファチジルグリセロールの特異的異性体、即ちホスファ
チジル−ｓｎ−１’グリセロール−異性体からなるリボ
ソームに関する。また、第２態様においては、ｓｎ−３
−ホスファチジル−ｓｎ−１’−グリセロール異性体を
水性媒体中に分散し、形成したリポソームを回収するこ
とを特徴とする新規リボソームの製造方法に関する。

本発明に使用するｓｎ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１
’　−グリセロールは次の一般式に特徴がある。

ＨＯ−Ｃ−Ｈ ２Ｃ−ＯＨ 但し、Ｒ，及びＲ，は、その合計炭素原子数が少なくと
も１６である条件で、炭素原子数が約４〜２４の直鎖ア
ルキル基、アルカノイル基またはアルケノイル基を示し
、そしてＭはＨ，ＮＨ，、Ｎａ”、Ｋｏ、Ｃａ　”又は
Ｍｇｏｏを示す。

好ましくは、Ｒ，及びＲ２は同じであって、０〜３個の
二重結合を含む直鎖中に１２〜１８個の炭素原子を含む
。また、好ましくは、これらはテトラデカンの残基即ち
ミリスチン酸、ヘキサデカンの残基即ちバルミチン酸又
はオクタデカンの残基即ちオレイン酸を示す。

本発明に使用するのに好適な化合物を以下に列記する。

１．２−シミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフ
ァチジル−ｓｎ−１’−グリセロール（１’−ＤＭＰＧ
）； １．２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファ
チジル−ｓｎ−１’−グリセロール（Ｖ−ＤＯＰＧ）　
。

１．２−ジパルミトイル＝ｓｎ−グリセロー３＝ホスフ
ァチジル−ｓｎ−１’−グリセロール（１’−ＤＰＰＧ
）；及び ■−バルミトイルー２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスファチジル−ｓｎ−１’　−グリセロール（１
’　−ＰＯＰＧ）　、及び　これらの混合物。

、ｌ明に従って使用するｓｎ−３−ホスファチジル−ｓ
ｎ−１’−グリセロール（１’−ｐ。

ＰＧ）は市販されている（例えば、フィンランド、ヘル
シンキのＫＳＶ−ＣｈｅｍｉｃａＩｓ　　　Ｏｙ）　　
。

本発明によれば、例えば、ｓｎ−３−ホスファチジル−
ｓｎ−１’−グリセロールが可溶な適当な有機溶剤、例
えばハロゲン化脂肪族、脂環式又は芳香族溶剤、アルコ
ール、エステル又はエーテル、例えばクロロホルム又は
ジクロロメタンにｓｎ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１
’−グリセロールを溶解する。ことによって製造できる
。この後、有機溶剤を、例えば窒素流れや真空中で蒸発
することによって取り除けばよい。次に、好ましくは、
自然ｐＨ値に近いｐＨ値、即ち約７．０に適当な緩衝液
で予め緩衝した、あるいは緩衝する水性相に室温〜約６
０’Ｃの範囲にある、好適には約３０℃の温度で生成物
を分散する。

リボソームは瞬時に形成する。この場合、例えば超音波
処理を使用する震盪か撹拌を適用するとこの形成を促進
できる。また、他のリボソーム製造方法、例えば高圧構
過、逆相蒸発やデタージェント透析によってリボソーム
を形成してもよい。この過程で、若干の多重薄層リボソ
ームが形成するが、このものは例えば遠心分離によって
除去でき、均質な単薄層リボソーム分散体を得ることが
できる。

例えば、ホスファチジル−１′−グリセロールの濃度を
調節すると、単薄層リボソームの大きさを変えることが
でき、従って目的用途に応じて、高度の５ＵＶ−又はＬ
ＵＶ−リボソームのいずれかを含むを分散体を調製する
ことができる。また、ゲル濾過や超遠心分離などの公知
方法を使用して、ＬＵＶ−リボソームから５ＵＶ−リボ
ソームを分離することも可能である。リボソームの調製
、その径分布の特性化や定まった径分布を得ることにつ
いての全体的な研究は次の文献に纒められている。

Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｉｎ　Ｃｅ
１ｌ　ａｎｄ　ＴｉｓｓｕｅＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＪｏ
ｌｕｍｅ　７：Ｌｉｐｏｓｏｎ＋ｅｓ：　Ｆｒｏｎ　ｐ
ｈｙ−ｓｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｐｐｌｉｃａＬｉｏｎｓ、編集者
：Ｃ，Ｇ、　Ｋｎｉｇｈｔ、１９８１、Ｅｌｓｅｖｉｅ
ｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏ＋５ｅｄｉｃ
ａｌ　Ｐｒｅｓｓ社。

この文献については、参考として本開示に利用している
。

本発明によって調製したリボソームは公知方法で各種の
親油性・水溶性物質をカプセル化するのに好適なキャリ
ヤ系である。このためには、カプセル化する物質をホス
ファチジル−１′−グリセロールと混合し、混合物を水
性相に分散するか、ホスファチジル−１′−グリセロー
ルを被カプセル化物質を含む水性相に分散すればよい。

本発明のリボソームを用いれば、染料、薬剤、酵素、栄
養素やビタミンなどの各種活性成分をカプセル化するこ
とができる。特に好適な用途は、前に述べたように、薬
剤のカプセル化である。

以下、本発明を次の実施例によって説明する。

実施例１ リボソーム調製用出発物質として１，２−シミリストイ
ル−ｓｎ−グリソロ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１’
−グリセロール−アンモニウム塩（１’−ＤＭＰＧ）（
フィンランド、ヘルシンキのＫＳＶ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ　　Ｏｙ）を使用した。６５　：　２０　：　２　：
　２の割合でクロロホルム：メタノール：水：アンモニ
アを使用して、二酸化シリカ薄層クロマトグラフィーに
よって調べたところ、脂質中に不純物は認められなかっ
た。脂質濃度は亜リン酸分析によって決定した。

脂質をピペットで溶剤に加えて、窒素流れ中で溶剤を除
去し、これを真空中で一夜保持することによって脂質か
らクロロホルム又はジクロロメタン溶液を調製した。そ
の後、１ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑの最終濃度になるように２
０ｍＭトリｘ／ＨＣ（１、ｐＨ７，４、Ｑ、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ緩衝液にリン脂質を懸濁した。３０℃、窒素雰囲
気中でプランソニック（Ｂｒａｎ−ｓｏｎｉｃ）２２１
型浴超音波処理装置で水和脂質を１時間超音波処理した
。多重薄層リボソームを回収するために、分散体を３５
．０００ｇの速度で遠心分離し、単薄層リボソーム含有
上澄み液を回収し、リボソームを分離した。

同じ方法で、下記のホスファチジル−１′グリセロール
からリボソームを調製することができる。

１．２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスファチ
ジル−ｓｎ−１’−グリセロール；１．２−ジパルミト
イル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１
’−グリセロール；及び ■−バルミトイルー２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−
３−ホスファチジル−ｓｎ−１’　−グリセロール。

本発明に使用するｌ’−ＤＭＰＧと３′−ＤＭＰＧ−異
性体の物理化学的相異を明らかにするために、３’　−
ＤＭＰＧから同様な方法でリボソーム分散体を調製した
。リボソーム生成物の濃度はいずれも０．１ｍｇ／ｒｒ
ｌに調節した。凝集体の生成に対するＮａ”の限界濃度
を濁度測定法により測定した。

濁度変化を調べるために、サーモスタット制御式キュベ
ツト室を備えた島津製作所製のグラフィコード分光光度
計を使用した。３Ｍ塩溶液の少量のアリコートを加えた
。添加毎に、サンプルを混合し、塩の添加３分後、４Ｑ
ＱｎＭで吸光度を測定した。温度は１０℃であった。

添付の第１図には、塩化ナトリウム濃度の関数として、
ｌ’−ＤＭＰＤ、３’　−ＤＭＰＧ又はこれらの１：ｌ
混合物のいずれかを含むリボソームについての濁度変化
を示す。凝集限界濃度として、ΔＡ４゜。とＸ軸との交
点を使用する。この図から理解できるように、純粋なｌ
’−ＤＭＰＧの限界濃度は約５５０ｍＭで、１：１混合
物のそれはそれより若干低く、純粋な３’　−ＤＭＰＧ
のそれは３５０ｍＭと低い。また、凝集を示す曲線は１
’−ＤＭＰＧやその３′−異性体との１＝１混合物につ
いてよりも純粋な３’　−ＤＭＰＧについての方がかな
り勾配が急である。

添付第２ａ図には、ＮａＣＱ濃度の関数として濁度を示
す。第２ｂ図には、１０℃における時間の関数として濁
度を示す。これから、１′−異性体の方が３′−異性体
よりも凝集傾向が小さいことが明らかである。３′異性
体のＮａ＋に対する親和性が高いことは、ヘッド基グリ
セロール部位が僅かに異なる優位性を示したことが確認
されたことから示唆されている。

上記結果は、ＤＳＣ（差動走査熱量計）を使用する該Ｄ
ＭＰＧ異性体の塩依存相挙動を調べることによって確認
された。また、０゜１５〜１．２ＮａＣ（ｌが存在する
と、６〜１０℃の温度において僅か数日間で３’　−Ｄ
ＭＰＧの結晶質相が形成したことも見いだされた。異性
体の１＝１混合物では、結晶質相は数週間で形成するこ
と見いだされた。一方、１’−ＤＭＰＧの結晶質相の形
成には、終了するまで数月間必要であった。

上記研究により、３′−及び１’−ＤＭＰＧの小さな単
薄層のナトリウム誘導凝集はかなり異なることが確認さ
れ、ナトリウムイオンに対して特異的な３’　−ＤＭＰ
Ｇの親和性が高いことを示す。また、この研究はナトリ
ウムイオンの存在下で３′−異性体から得たリボソーム
分散体に比較して、１′−異性体から得たリボソーム異
性体分散体の方が安定性が優れていることを示している
。

【図面の簡単な説明】

第１図は濁度変化を示すグラフであり、第２ａ図はＮａ
ＣＱ濃度の関数として凝集を示すグラフであり、そして 第２ｂ図は時間の関数として濁度を示すグラフである。 特許出願人：　ケイアンドヴイ　ライセンシングオイ （ΔＡ４００） （ΔＡ４００） 手続補正書（方式） 平成１年３月２７日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 を事件の表示 昭和６５年特許願第２６９６５１号 ２、発明の名称 新規リボソーム及びその製造方法 五補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　ケイ　アンド　ケイ　ライセンシング　オイ４、
代　理　人 住所　〒１００東京都千代田区丸の内２丁目４番１号丸
ノ内ビルヂング　７５２区 補　　正　　の　　内　　容 ■１本願明細書中２第１９頁第３行「第２ａ図」および
第４行「第２ｂ図」をそれぞれ「第２図」と補正する。 ■、同書中、第２０頁第１３行「第２ａ図」および第１
５行「第２ｂ図」をそれぞ九「第２図」と補正する。 発送臼　平成１年３月７日 ６、補正の対象

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）壁構造がｓｎ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１′
   −グリセロール−異性体からなることを特徴とするホス
   ファチジル−グリセロール含有リボソーム。
2. （２）ｓｎ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１′−グリセ
   ロール−異性体が次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、Ｒ＿１及びＲ＿２は、その合計炭素原子数が少
   なくとも１６である条件で、炭素原子数が約４〜２４の
   直鎖アルキル基、アルカノイル基またはアルケノイル基
   を示し、そしてＭはＨ、ＮＨ＿４＾＋、Ｎａ＾＋、Ｋ＾
   ＋、Ｃａ＾＋＾＋又はＭｇ＾＋＾＋を示す。）で表され
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のリボソ
   ーム。
3. （３）１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−
   ホスファチジル−ｓｎ−１′−グリセロール（１′−Ｄ
   ＭＰＧ）； １，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファ
   チジル−ｓｎ−１′−グリセロール（１′−ＤＯＰＧ）
   ； １，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフ
   ァチジル−ｓｎ−１′−グリセロール（１′−ＤＰＰＧ
   ）；及び １−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−
   ３−ホスファチジル−ｓｎ−１′−グリセロール（１′
   −ＰＯＰＧ）、及びその混合物 からなる群から選択することを特徴とする特許請求の範
   囲第２項記載のリボソーム。
4. （４）ｓｎ−３−ホスファチジル−ｓｎ−１′−グリセ
   ロール−異性体を水性媒体に分散し、形成したリボソー
   ムを回収することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載のリボソームを製造する方法。
5. （５）リボソームの製造にｓｎ−３−ホスファチジル−
   ｓｎ−１′−グリセロール−異性体を使用すること。