JPH02104297A - キナーゼ類の安定化された試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はキナーゼ類が溶液中で安定化された試薬組成物
に関するものであり、更に詳しくは酸化酵素を含有する
液状試薬組成物中のキナーゼ類が長期に安定化された試
薬組成物に関するものである。

〔従来技術〕

キナーゼ類の安定化方法としては従来より数々の方法が
開発されている。例えば、タレアチンキナーゼ（以下、
ＣＫと言う）測定用試薬においてＮ−アセチルシスティ
ン（以下、ＮＡＣと言う）と、ＮＡＣ以外のＳＨ基含有
化合物とを含有させる方法（特開昭６１−２８９９００
　）　、ＣＫの安定化方法としてシスチン等のジスルフ
ィドやチオスルホネートと反応させてＣＫをジスルフィ
ド変性させて安定化する方法（特開昭６２−１１８８８
７　）　、酢酸キナーゼ（以下、ＡＫと言う）の安定化
方法として低分子チオール化合物を添加する方法（特開
昭６２−１３０６８７　）等がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

キナーゼ類はその活性中心にスルフヒドリル（ＳＨ）基
を持つ酵素であるためチオール化合物を添加すれば安定
効果が期待されるが、例えば中性脂肪測定に使用するグ
リセロールキナーゼ（以下、ＧＫと言う）の安定化には
通常この後に使用されるグリセロール−３−リン酸オキ
シダーゼ（以下、ＧＰＯと言う）の反応を阻害するため
に使用できない（特開昭５９−２１３９０公報１ページ
右カラム）。

又、チオール化合物は還元剤として働くため、例えば１
１□０□の測定のための呈色反応に影響を与えるので使
用できないとされていた（特開昭６２−１１８８８７公
報３ページ左上刃ラム）。事実、上記に述べたチオール
化合物を各種のキナーゼの安定化方法に使用する方法は
すべて測定系に酸化酵素による反応を含まない、いわゆ
る紫外部吸収測定に関するものである。

キナーゼ類の安定化方法としてチオール化合物が効果が
あることは明白であるが、測定の精度、感度の面からも
、酸化酵素系での呈色反応を使用する測定にも使用でき
、かつキナーゼ類の溶液での長期の安定化をも達成する
方法の開発が望まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らはキナーゼ類の？８液中での安定化効果もあ
り、かつ酸化酵素の反応を阻害しないキナーゼ類の安定
化方法を検討したところ、意外にも従来、酸化酵素系で
は使用不可能であるとされていたチオール化合物を特定
の濃度条件で溶液に存在させることに依って、上記の目
的を達成することを見いだし本発明を完成した。

即ち、本発明はキナーゼ類を含有する試薬溶液組成物に
おいて、特定の濃度にチオール化合物を含有させたこと
を特徴とするキナーゼ類の安定化した試薬組成物に関す
る。以下に詳細に説明する。

対象とするキナーゼ類とは、アデノシンニリン酸（以下
、ＡＴＰと言う）の末端リン酸の適当な受容体への転移
反応を触媒する酵素であり、ＧＫ。

ＣＫ、ＡＫ、　　ピルベートキナーゼ（以下、ＰＫと言
う）、ミオキナーゼ（以下、ＭＫと言う）等が挙げられ
る。これらのキナーゼ類はしｎ未検査用試薬として重要
で、各種生体成分の測定キラ１に配合されるものである
。また、配合するチオール化合物とは脂肪族炭化水素化
合物の水素原子をＳＨ基で置換した化合物でいわゆるＳ
　Ｈ化合物と言われるものである。ＮＡＣ、システィン
、グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、ジチオ
スレイトール、ジチオエリスレイトール、メルカプトエ
タノール等が代表的に挙げられるが、これらは単独で又
は組み合わせて用いられる。これらの中でもＮＡＣが安
定性の面で好適に使用される。使用する緩衝液としては
通常ｂ＝床検査で用いられるものが使用でき、そのｐＨ
は使用される他の試薬や酵素に依って規定されるが、好
ましくは通常６〜１０である。又、チオール化合物の使
用量はキナーゼ類の安定化効果を確保しつつ、酸化酵素
反応や、生成した過酸化水素の定量に影響を及ぼさない
程度の濃度で有れば良いが、通常０．０１〜０．５ｍＭ
程度である。但し、最適濃度は対象とするキナーゼによ
り変化する。又、本発明による安定化されたキナーゼ含
有溶液には必要により防腐剤などが添加されても良い。

本発明を中性脂肪の測定を代表例として具体的に説明す
る。試料中の中性脂肪はリポプロティンリパーゼなどに
依って加水分解される。生成したグリセロールにＡＴＰ
とＭ　ｇ　２−との存在下でＧＫを作用させ、アデノシ
ンニリン酸（以下、ＡＤＰと言う）とグリセロール−３
−リン酸を生成させる。ついで生成したグリセロール−
３−リン酸にＧＰＯを作用させると過酸化水素が生成す
る。生成した過酸化水素をパーオキシダーゼなどを用い
て呈色反応を行い、試料中の中性脂肪を定量する。

本反応においてＧＫの安定剤としてＮＡＣの濃度は０．
０２〜０．５　ｍ、Ｍで効果があり、１ｍＭ以上ではＧ
ＰＯの反応以後の呈色反応を■害する（跋脹與上及び第
１図を参照）。

尚、本発明に使用されるキナーゼ類として、例えばＧＫ
の活性測定は以下のように行った。

試薬Ａ：ＡＴＰを３　ｍｇ／ｄとなるように０．２Ｍの
グリシン・ヒドラジン緩衝液（ｐＨ９，８）に溶解する
。

試薬Ｂ　：　ＮＡＤ”を１　ｍｇ／、ｄとナルヨうニ０
．２Ｍ（７）グリシン・ヒドラジン緩衝液（ｐＨ９，８
）に溶解する。

試薬Ｃ：グリセロール０．９２ｍｇ／ｍｆとなるように
０゜２Ｍのグリシン・ヒドラジン緩衝ン夜（ｐｉ（９，
８）に？８解する。

試薬Ｄ：グリセロールー３−リン酸デヒドロゲナーゼ（
ヘーリンガー社製）　約１７０ｕ／　ｍｇ試薬Ａを１ｄ
、試薬Ｂを１　ｔｒｄｌ、試薬Ｃを１戚及び試薬Ｄ−ｔ
−０．０２ｍｆｆ１加え、試料０．１　ｄを添加して、
２５°Ｃで３４０ｎｍの吸光度の増加を測定する。

又、ＰＫの活性測定は、０．０５Ｍのイミダゾール緩衝
液（ｐＨ７，１）２．５ｍ、０．１Ｍの硫酸マグネシウ
ム及び０．４Ｍの塩化カリウムを含有する溶液にホスホ
エノールピルビン酸を１０．５ｍＭとなるように溶解し
た試液０　、１５　ｍｌ、９４ｍＭのＡＤＰ溶液０．１
５ｍＮ、１４ｍＭのＮＡＤＨ溶液０．０５ｄ及びラクテ
ートデヒドロゲナーゼ（バーリンガ−類、２５００ｕ／
ｒｎｌ）０．０１　ｍｌを混合したのち、試料０．０５
ｍを添加して、２５°Ｃで３４０ｎ＋ｎの吸光度の減少
を測定する。

更に、ＭＫの活性測定はＡＴＰ１５．１■、アデノシン
−リン酸１０　、２　ｍｇ　、ホスホエノールピルベー
ト６．３■、ＮＡＤＨ４ｍｇ、塩化マグネシウム５０．
８ｍｇ、塩化カリウム１８６．４　ｍｇをトリエタノー
ルアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解して１００
　ｄとした反応液３　ｍｆｌにＰＫ−ＬＤＨ懸濁液（ベ
ーリンガー社製）を０．０２ｄ加えたのち、試料１００
μｌを添加して、３７°Ｃで３４０ｎｍの吸光度の減少
を測定する。

以下に、試験例、実施例で本発明を更に明確にするが、
本発明はこれらによって限定されるものではない。

実施例Ｉ　　ＧＫ溶液のＮＡＣの配合量による安定性の
比較 ０．０５ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６，３）にＧＫ（天野
製薬製）を０．７ｕ／Ｉｎ１になるように溶解し、防腐
剤としてデヒドロ酢酸を０．１％加え、更にＮＡＣを０
．０１ｍＭ〜０．５ｍＭと変化させて含有させた溶液を
４°Ｃ及び３０°Ｃに放置し、ＧＫの残存量を測定した
。４°Ｃの結果を第１表に示し、３０°Ｃの結果を第２
表に示す。尚、表中の単位は試験開始時を１００％とし
て示す。

（以下余白） 第　　１　　表 （以下余白） 第２表 第１表及び第２表より、ＧＫの安定化にはＮＡＣは４°
Ｃの条件においては０．０２ｍＭ以上の濃度で効果が認
められ、３０°Ｃの条件では０．０５ｍＭ以上の濃度で
あればその安定化効果は著しいことが判る。

実施例２　　ＰＫ溶液のＮＡＣの配合量による安定性の
比較 ０．０５ＭのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）にＰＫ（
シグマ社製）を３．２ｕ／ｒｄになるように溶解し、防
腐剤としてデヒドロ酢酸を０．１％加え、更にＮＡＣを
０．０１ｍＭ　〜０．０５ｍＭと変化させて含有させた
溶液を４°Ｃ及び３０°Ｃに放置し、ＰＫの残存量を測
定した。４°Ｃの結果を第３表に示し、３０°Ｃの結果
を第４表に示す。尚、表中の単位は試験開始時を１００
％として示す。

第３表 （以下余白） 第　　４　　表 第３表及び第４表より、ＰＫの安定化にはＮＡＣは４°
Ｃの条件においては０．０１ｍＭ以上の濃度で効果が認
められ、３０″Ｃの条件では０　、０３ｍＭ以上の濃度
であればその安定化効果は著しいことが判る。

３１１例３　　ＭＫ温溶液ＮＡＣの配合量による安定性
の比較 ０．０５ＭのＰＩｒ３ＥＳ緩衝液（ｐ　Ｈ７，０）にＭ
Ｋ（シグマ社製）を０．８１ｕ／ｍｌになるように溶解
し、防腐剤としてデヒドロ酢酸を０．１％加え、更にＮ
ＡＣを０．０１ｍＭ　〜０．０５ｍＭと変化させて含有
させた溶液を４°Ｃ及び３０°Ｃに放置し、ＭＫの残存
量を測定した。４°Ｃの結果を第５表に示し、３０°Ｃ
の結果を第６表に示す。尚、表中の単位は試験開始時を
１００％として示す。

第５表 第６表 第５表及び第６表より、ＭＫの安定化にはＮＡＣは４°
Ｃ１３０°Ｃのどちらの条件においても０．０１ｍＭ以
上の濃度で効果が認めらた。

実施例４　　ＧＫ溶液のシスティンの配合量による安定
性の比較 １−例」−においてＮＡＣＯ代わりにシスティンを使用
し、同様にして安定性を測定した。その結果、実施例１
と同様にＧＫの安定化にはシスティンは４°Ｃの条件に
おいては０．０２ｍＭ以上の濃度で効果が認められ、３
０°Ｃの条件では０　、０５ｍＭ以上の濃度であればそ
の安定化効果は著しいことが判った。

実施例５ＰＫ？８液のチオグリコール酸ナトリウムの配
合量による安定性の比較 ２においてＮＡＣの代わりにチオグリコール酸ナトリウ
ムを使用し、同様にして安定性を測定した。その結果、
ｉと同様にＰＫの安定化にはチオグリコール酸ナトリウ
ムは４°Ｃの条件においては０．０１ｍＭ以上の濃度で
効果が認められ、３０°Ｃの条件では０．０３ｍＭ以上
の濃度であればその安定化効果は著しいことが判った。

実施例６　　ＭＫ温溶液グルタチオンの配合量による安
定性の比較 大籐桝主においてＮＡＣの代わりにグルタチオンを使用
し、同様にして安定性を測定した。その結果、ｉと同様
にＭＫの安定化にはグルタチオンは４°Ｃ１３０°Ｃの
どちらの条件においても０．０１ｍＭ以上の濃度で効果
が認めらた。

試験例Ｉ　　ＮＡＣの中性脂肪測定に及ぼす影響試薬Ａ
の組成（１００蔵中） ＭＥＳ　　　　　　　　　　　１．０７　　　ｇ水酸化
ナトリウム　　　　　１９０　　■塩化マグネシウム　
　　　　５３　　ｍｇ塩化カルシウム　　　　　３６．
７　　ｍｇＡＴＰ　　　　　　　　　　Ｏ，１８ｇＤ　
Ａ　ＯＳ　　　　　　　　　　　２５　　■トリトンＸ
−１００８０ｍｇ リポプロティンリパーゼ　２６６００　　単位ＧＫ　　
　　　　　　　　　　６７　　単位試薬Ｂの組成（１０
０ｄ中） ＭＥＳ　　　　　　　　　　　１．０７　　　ｇ水酸化
ナトリウム　　　　　　４９　　■塩化マグネシウム　
　　　　　５３　　■塩化カルシウム　　　　　３６．
７　　■４−アミノアンチピリン　５９．５　　単位Ｃ
Ｐ　ＯＬ６．００　　単位 パーオキシダーゼ　　　　　８００　　単位試薬ＡにＮ
ＡＣを各々０．０１〜１．０ｍＭとなるように加えた溶
液４００　μ！に標準血清〔コンセーラ「日永ＪＩＳ（
日永製薬製）を４０μ２加え、３７°Ｃで５分間反応さ
せたのち、試薬Ｂを１００μ！加え直ちに６００ｎｍの
吸光度を測定した。その結果を第１図に示す。第１図か
らも明らかなようにＮＡＣが０．５ｍＭ以上含有される
ときは、吸光度の増加が抑制される。即ちＮＡＣがＧＰ
Ｏの酸化反応やパーオキシダーゼの反応を阻害すること
が判る。

試験例２　グルタチオンの濃度によるピルビン酸オキシ
ダーゼを用いた反応に及ぼす影 響 グルタチオンを各々０．０１〜１　、０ｍＭとなるよう
に加えた、ＤＡＯ３を２５ｍｇ／　ｄｌｌ含有するＰＩ
ＦＥＳ緩衝液（ｐ１１７．０）４００μ！に２０μｌの
ピルビン酸オキシダーゼ（シグマ社製）を加え、更に１
Ｍのピルビン酸溶液を５０μ！加え、３７°Ｃで５分間
反応させ、試験例１で使用した試薬Ｂを１００μｌ加え
て直ちに６００ｎｍの吸光度を測定した。その結果、試
験例１と同様にグルタチオンが０．５ｍＭ以上含有され
るときは、吸光度の増加が抑制される。

裏隻拠工　ＮＡＣ配合の中性脂肪測定用試薬の長期安定
性 試験例１の試薬ＡにＮＡＣを０．０５ｍＭとなるように
配合した溶液と、試薬Ａを４°Ｃに保存してその安定性
を比較した。測定は試験例１と同様に行い試薬Ｂは測定
の都度調製し、試薬Ｂの反応時間を５分間と設定して、
直ちに６００ｎｍの吸光度を測定した。その結果を第２
図に示す。第２図からも明らかなようにＮＡＣを含有す
る試薬Ａは長期の安定性が得られ、更に酸化酵素の反応
も阻害しないことが判明した。

〔発明の効果〕

従来はチオール化合物をキナーゼ類の安定化に使用する
には、反応系は酵素を用いた酸化反応を含まない、即ち
、紫外部吸収を測定する方法にのみに限られていたもの
が、本発明により長期に安定な酸化酵素を利用する液状
の臨床試薬組成物が提供できるようになる。

【図面の簡単な説明】

第１図のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは各々践塑口４：お
けるＮＡＣの含有量力ＯｍＭ、０．０１ｍＭ。 ０．０５ｍＭ、Ｏ，１ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭの時
の吸光度の変化を示すものである。第２図はｆｉの結果
を示すものであり、−〇−はＮＡＣ配合の試薬への結果
を示し、−・−は試薬Ａのみの結果を示す。 特許出願人　　天野製薬株式会社 吸　九　度 ＝ 第　　２　　〆 掃過日数（ヨ） 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６３年特許願第２５５６５５号 ２、発明の名称 キナーゼ類の安定化された試薬組成物 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号平成１年１
月３１日（発送口） ５、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄 ６、補正の内容 明細書の１８頁の５行〜８行に「第１図の・・・・示す
ものである。ｊとあるをｒ第１図は試験例１の吸光度の
変化を示すものであり、図中でａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及び
ｆは各＃ＮＡＣの含有量がＯｍＭ、　０．０１ｍＭ、　
０．０５＋ｎＭ、　０．１ｍＭ、　０．５ｍＭ及び１１
の時の吸光度の変化を示す。」と補正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）キナーゼ類を含有し、反応系に過酸化水素の発生
   を伴い、該過酸化水素をパーオキシダーゼを使用して測
   定し、試料中の成分を測定する方法に使用する試薬組成
   物であって、実質的に測定を阻害せず、キナーゼ類の安
   定性を増大する量のチオール化合物が配合された試薬組
   成物。