JPH02108971A - セルロース有機エステルフィブレット支持体を利用した免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用針！ＩＦ） 本発明は、血液、血漿、尿及びその他の液体の検体中に
ある抗原の検知のための免疫分析法に関する。特に、本
発明は、セルロース有機エステルフイブレット（ｆｉｂ
ｒｅｔｓ）と分散性カットファイバーとからなる改良支
持体を利用した免疫分析法に関する。

（従来技術） 従来各種免疫分析試験法及び装置が知られている。米国
特許節４．６２３．９０１号に記載されている試験装置
のような代表的なものは、多層構造を用いて、様々な機
能を行わせている、例えば第−層は免疫分析技術に特異
的な抗体のような粒子を捕捉するように働き、第二層は
試験装置を通過する液体の流れをコント四−ルし、第三
層は該キットの底部で液状検体用吸収剤を提供している
。しかしながら、この多層構造は、その操作工程数を増
大させ、キットの大きさを増し、さらにはそのキットを
組み立てるのに必要とされる製作工程数を多くさせる。

これらの多層体は典型的にはナイロン、ガラス、ポリエ
ステル、ポリオレフィン及びセルロースアセテートのｗ
４ｎから作られている。しかしながら、これまでセルロ
ース有機エステル類のフィブレットを分散性カットファ
イバーと一緒に用いてフィルター物質を作ったことはな
く、また特に免疫分析法に用いる支持体を作製したこと
もなかった。セルロース有機工ステル類、特にセルロー
スアセテートのフイブリツドは、タバコ用フィルター、
工業用エアーフィルター及び有機化合物用フィルターの
ような用途に適したようなもののような漸く軽い紙製品
用に使用されてきた。

（発明の開示） 本発明は、血液、血漿、尿及び他の液体の検体中の抗原
を検知するための免疫分析法を提供するものである。こ
の方法は、反応室と該反応室内の支持体（ｓｕｐｐｏｒ
ｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）とからなる装置を利用するもので
、該支持体は約５〜９５ｉＪｉ％のセルロース有機エス
テルフィブレットと約９５〜５重量％の分散性カットフ
ァイバーとの混合物（ブレンド物）からなるものである
。検体から抗原を抽出することのできろ事前に決められ
た量の抗体はその支持体に結合せられている。その方法
は検体及び試薬を支持体の上側の表面に置き、次に検体
中の抗原量を検知することからなる。かような方法は従
来の多層構造を不要にし、本発明の支持体は単一層のう
ちでそれらの機能及び工程のすべてをはなすことができ
ろ。

次に図面について簡単に説明する。

図１は１００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の走査型電子
顕微鏡写真である。

図２は５００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の走査型電子
顕微鏡写真である。

図３は、また５００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の走査
型電子類ｆｆｉ鏡写真である。

次に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明に従えばセルロース有機エステルフィブレットと
分散性カットファイバーとの混合物は免疫分析用フィル
ターに成型することができ、改良免疫分析法において用
いろことができろことが見出された。

セルロース有機エステル類は綿リンターあるいは木材パ
ルプをエステル化して得られ、代表的なものとしては１
個〜約４個の炭素原子を有するカルボン酸のエステルが
あげられるが、それに限定されろものではない。具体的
なエステル類としてはセルロースホルメート、セルロー
スアセテート、セルロースブチレート、セルロースアセ
テートブチレート、セルロースプロピオネート、セルロ
ースアセテートプロピオネト及びセルローストリアセテ
ートがあげられる。セルロースアセテートは特に有用な
セルロース有機エステルである。

用語「フイブリツド（ｆｉｂｒｅｔｓ）　Ｊは、５　ｍ
’　／　ｇ−、好ましくは約２０ｍ”７ｇ１をこえる表
面積、約２０〜２００ミクロンの長さ及び約０５〜５ミ
クロンの直径を持つ高度の表面積をもつフィブリル状の
物質を示すものとして当業者に理解されている。これら
フイブリツドのいろいろな形成法が従来知られており、
例えば、米国特許筒４．０４７．８６２号、米国特許筒
４．１９２．８３８号及び米国特許筒４．２８３．１８
６号に記載されている。

適当な分散性カットファイバーとしては、セルロース有
機エステル類、ポリエステル類、木材パルプ、ガラス、
ポリアミド類、ポリオレフィン頚及びポリベンズイミダ
ゾール類の繊維があげられる。適当なカットファイバー
の代表的なものとしてｊよ、約１ｍ’／ｇよりは小さな
表面積で、約２００ミクロンより長い繊維長及び約１〜
６０ミクロンのｔａ維当たりの直径を有するものがあげ
られろ。特に好適なカットファイバーとしてはポリエス
テルフロックがある。

該セルロース有機エステルフィブレット単独ではそのフ
イブリツドだけで作られたフィルターを通しては液体は
殆ど流れないので支持体として使用するには適当でない
。単独及びセルロース有機エステルフィブレットなしに
使用されたカットファイバーは支持体としては不完全な
もので、必要とされる多孔性構造を有していない。しか
しながら、約５〜約９５重量％の該フイブリツドと約９
５〜５重量％の該カットファイバーとを一緒に混ぜ合わ
せろ（ブレンドする）と、その結果得られた混合物は機
能的な支持体を形成するのに用いろことができる。

図１〜図３を見てみろと、それは９５重重量のガラスフ
ァイバーと５重量％のセルロースアセテートブチレート
との混合物からなる支持体の電子顕微鏡写真であるが、
その表面構造は、あらゆる方向に該フイブリツドによっ
て一緒に結合せられた該カットファイバーがｘ−ｙ−ｚ
面でランダムに配向しているものである。該フイブリツ
ドは無限な数の層を有するウェブ様でかつ複雑な多孔性
構造を与えている。肉眼で見た場合にはその支持体の表
面は実質的になめらかで、普通のフィルターペーパーよ
り比較的ざらつきが少ない。

使用した場合、そのカットファイバーは検体を吸引また
は吸収するために必要な毛細管の作用を与え、一方フイ
ブレットは必要とされるフィルター作用を与え、検体の
流速及び流れろ方向に影響を与える。このように、本発
明の支持体は典型的には多層の試咳装置構造体によって
なされていたいろいろな機能を行うことができる。

支持体は、最初に水あるいは低分子量のアルコールのよ
うな液状分散媒質中にセルロース有機エステルフィブリ
ッドを分散させろことにより製造される。任意に、その
液状媒質は界面活性剤のような分散化剤を含有すること
ができる。その液状媒質は普通７５０＋ａｊｌの分散媒
質に対し約０．５〜１．５ｇ乾燥重量のフイブリツドの
比率で含んでいる。攪拌を適宜フイブリツドを分散させ
ろために行われる。

次にカットファイバーもまた支持体の中で約９５〜５重
量％のカットファイバー濃度となるよう攪拌しながら分
散媒質に分散させる。こうしてスラリー状物を形成し、
次に分散媒質を減圧除去し、約２０％の固形物を有する
ケーキ状物を形成する。そのケーキ状物を圧縮成形型の
中に入れ、約２０．０００ｐ３電までの圧力下にウェハ
ー型ディスクのような事前に決められたかたちに成型す
る。得られた支持体を８〜１２時間空気中であるいは約
１時間７０’〜１００℃のオーブン中で乾燥して水分量
を１％より少なくなるまで乾燥する。

その支持体の表面ばフイブリツドが分散性カットファイ
バーと相互作用して形成された微細多孔構造（ｏｉｉｅ
ｒθｐｏｒｏｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をなしている。

その表面に置かれた液体の流速はその支持体の組成、特
に、分散性ファイバーに対するフイブリツドの比率及び
下の方向の毛細管の数に影響する２方向での分散ファイ
バーの配向性及びその支持体を作製する際に使用される
圧力によって決定されろような支持体の最終的な密度に
よってコントロールされている。

支持体を通る液体の流速を高めるためには、分散性ファ
イバーに対するフイブリツドの比率を減少させ、２方向
の分散性ファイバーの配向を製作工程においてその支持
体にかけられる圧力をへらすことにより大きくすること
である。その支持体の全体の密度をも減らし、ミクロン
サイズの穴を設けて、増大した流れの必要性を満たす。

その流速を下げるためには、分散性ファイバーに対する
フイブリツドの比率を大きくすると同時にその製作時の
圧力を高め、その結果最終の密度を高めることである。

下方向への流れに対する半径方向の流れの比率であると
か、試験法のうちに記載されているような後処理の洗滌
工程を効果的に行うのに大きな問題であるところの液体
の流れの様相は、分散性ファイバーに対するフイブリツ
ドの比率を選択ずろ乙とにより大そう有効にコントロー
ルしうる。

この比率を高くすると、液体を半径方向により速く流れ
るようにすると共に下方向にはより遅く流れろようにし
、そのためには分散性ファイバーに対するフイブリツド
の比率を一定の製作圧力のもとで大きくすることができ
る。別の方法としては、分散性カットファイバーに弾力
性があるのであまり好ましくはないが、ファイバーの比
率を同じに保ちながら製作圧力を大きくすることができ
る。下方向への流れを大きくし、半径方向の流れを少な
くするためには分散性ファイバーに対するフイブリツド
の比率を一定の製作圧力のもとで減らすことができろ。

次にその支持体はプラスチックあるいは他の好適で好ま
しくは高価でなく且つ容易にすてられろ物質で作られた
反応室にとりつけることができろ。たとえば、該反応室
は、試験のためその支持体上に血液、血漿または尿のよ
うな液状の検体を注ぎ込めろようくびれがつけである。

該支持体はそれに結合せられた試薬あるいは抗体に応じ
たいろいろな異なったタイプの免疫分析試験においてフ
ィルター媒体として使用することができる。特に、本発
明は、試験されるべき血液、血漿、尿またはその他の液
体の検体をその支持体の上側の表面に置き、そのような
検体を該支持体を通して流すことからなる免疫分析法に
おいて使用することができる。その検体中の抗原凰は競
合型アッセイ法及びサンドイッチ型アッセイ法のような
知られた検知法を用いて検知される。これらの方法は、
アッセイされろ検体中に含まれている抗原とその支持体
に結合されている標識抗体あるいは抗体類との同の複合
体（コンプレックス）の形成１こ基づくものである。そ
の抗体はアイソトープ、酵素あるいは螢光化合物で標識
されろことができ、それらは複合体化した標識抗原ある
いは抗体を複合体形成しなかった標識抗原あるいは抗体
から分離した後その検出あるいはその定凰分析を可能に
する。

特に、競合型アッセイにおいては、検体中の抗原は、そ
の支持体に結合した抗体の限られた結合部位を既知量の
標識抗原と競合することになる。その抗体に結合した標
識抗原の量は検体中に存在する抗原ｌに反比例している
。

サンドイッチ型アッセイにおいては、抗体はラテンクス
ミクロビ〜ズあるいは０３〜１２ミクロンの大きさのミ
クロ粒子のような固相に結合せられている。これらミク
ロビーズ担体はその支持体を通してろ過され、そのミク
ロピーズは支持体の表面の多孔構造により捕捉され、か
くして抗体はその支持体の一番上側の表面に結合せられ
ろ。アッセイされろ検体は次に抗体と接触せしめられ、
その中の抗原を抗体−抗原複合体を形成することにより
抽出する。任意のインキュベーションの後、支持体を洗
滌して、検体残渣を取り除き、次に、既知量の標識抗体
を含有する溶液と接触せしめる。標識抗体は標識してな
い抗体を介して支持体に結合した抗原と複合体を形成す
る。支持体を洗滌し、未反応標識抗体を取り除き、標識
抗体の存在を測定する。

加えてその支持体は、抗体／抗原複合体の支持体への非
特異的結合をブロックする遮蔽剤を含むことができろ。

従来知られたあるいは例えばＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　！Ｊｅｔｈｏｄｓ１０１　
（１９８７）　ｐｐ４３−５０に記載されている遮蔽剤
の例としては、インスタントドライミルク、カゼイン、
ブタ及び魚の皮から得たゼラチン、血漿アルブミン及び
その他の類似の蛋白質があげられる。これらの！！蔽剤
は、それを直接に支持体に加えたりあるいはそれを分散
媒質に加えることによりその支持体の中にとり込ませる
ことができろ。

該支持体に結合した特異抗原、特異抗体及び結合物質及
び様々な抗原検知法を用いろことにより、本発明の支持
体を用いる方法は、血液、血漿及び尿を調べて、妊娠、
ＡＩＤＳ。

肝炎、ヘルペスウィルス、薬物使用、糖尿病及び特定の
他の細菌、原虫、真菌及びウィルスに伴う抗原または抗
体のレベルを調べるために用いることができる。

具体的な試験法が次の実施例で説明されているが、それ
は本発明を説明するためのものと考えられるべきである
。このことにかかわらず本発明は実施例に具体的に詳述
したものに限定されないと理解されるべきである。

衷施男 水中に攪拌下７．５重景重量セルロースアセテートフィ
ブレットを分散させてディスクを製造した。次に９２５
重量％のポリエステルフロック　（カットファイバー）
をその水中に分散させ、セルロースアセテートブイブレ
ット／ポリエステルカットファイバー混合物を形成する
。水を減圧して除去し、ケーキ状物を作る。そのケーキ
状物を５．９ｃｍの直径及び０．３ｃｍの厚さを有する
つ工へ−型ディスクに入れ成型した。そのディスクを空
気中で１晩乾燥した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣ
Ｇ）に対するモノクローナル抗体をあらかじめ決められ
た部位のそのディスクに結合させた。ＨＣＧは妊婦の尿
中でその濃度が高くなる抗原である。０．５Ｍの濃度及
びｐＨ７，２を有し、１％のウシ血清アルブミンを含有
するリン酸塩で緩衝化された塩緩衝液をＺｏｏμ！その
ＨＣＧ部位上に滴下した。２０個の尿検体をそれぞれ２
０個のディスク上に置いたが、その検体のうち１０個は
ＨＣＧ陽性であることが知られ、他の１０個はＨＣＧ陰
性であることが知られている。次に一連の試薬を次の順
序で各ディスク上に滴下した：　５０μｌの抗ＨＣＧ血
清試薬（２％のリン酸塩緩衝化塩液）、次に４５μｌの
１．０Ｍ塩化ナトリウム液、そして次に６．５μＰの０
０１％の発色剤。ＨＣＧ陽性であることが知られていた
１０個のディスクは陽性反応し、ＨＣＧ陰性であること
が知られている１０個のディスクは陰性であった。

本発明ｌ：ｆＨＣＧの分析を実施例として用いて説明さ
れているが、他の分析法も組み立てることができるし、
その支持体は他のろ過方法と組み合わせて用いろことも
できる。

本明細書においては、その発明の好ましい具体例が開示
されており、そして用語が特定化して用いられているけ
れどもそれは単にその特許請求の範囲に示された本発明
の範囲を一般的に説明するために用いられているのであ
り、それを制限するためのものではない。

【図面の簡単な説明】

図１は１００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の繊維の形状
を示す走査型電子顕微鏡写真である。 図２は５００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の繊維の形状
を示す走査型電子＠徹鏡写真である。 図３は、また５００Ｘ倍の支持体の外部表面構造の！＆
維の形状を示す走査型電子顕微鏡写真である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試験装置が、反応室と該反応室内の支持体とを有し
   、該支持体は約５〜約９５重量％のセルロース有機エス
   テルフィブレットと約９５〜約５重量％の分散性カット
   ファイバーとの混合物からなり、該支持体には検体から
   抗原を抽出することができる抗体の事前に決められた量
   が結合せしめられ、検体を該支持体の上側の表面上に置
   き、検体中の抗原量を検知することからなる該試験装置
   を用いる血液、血漿、尿及びその他の液体の検体中の抗
   原を検知するための免疫分析法。 ２、検体を置いた後該抗原に対する標識抗体を支持体に
   添加する請求項１に記載の免疫分析法。 ３、標識抗体を添加した後該抗原に結合しない標識抗体
   をすべて支持体から洗滌して取り除く請求項２に記載の
   免疫分析法。 ４、該セルロース有機エステルがセルロースホルメート
   、セルロースアセテート、セルロースブチレート、セル
   ロースアセテートブチレート、セルロースプロピオネー
   ト、セルロースアセテートプロピオネート及びセルロー
   ストリアセテートから成る群から選ばれたものである請
   求項１に記載の試験装置。 ５、該分散性カットファイバーがセルロース有機エステ
   ル類、ポリエステル類、木材パルプ、ガラス、ポリアミ
   ド類、ポリオレフィン類及びポリベンズイミダゾール類
   の繊維からなる群から選ばれたものである請求項１に記
   載の試験装置。 ６、試験装置が、反応室と該反応室内の支持体とを有し
   、該支持体は約５〜約９５重量％のセルロースアセテー
   トフィブレットと約９５〜約５重量％の分散性カットフ
   ァイバーとの混合物からなり、該支持体には検体から抗
   原を抽出することができる抗体の事前に決められた量が
   結合せしめられ、検体を該支持体の上側の表面上に置き
   、検体の抗原と結合せしめられている抗体との間の複合
   体を形成させ、該支持体を洗滌して検体の残留物をすべ
   て取り除き、該支持体を既知量の標識抗体と接触させ、
   該支持体上の抗原に結合しない標識抗体をすべて取り除
   き、検体中の抗原量を測定することからなる該試験装置
   を用いろ血液、血漿、尿及びその他の液体の検体中の抗
   原を検知するための免疫分析法。 ７、該分散性カットファイバーがセルロース有機エステ
   ル類、ポリエステル類、木材パルプ、ガラス、ポリアミ
   ド類、ポリオレフィン類及びポリベンズイミダゾール類
   の繊維からなる群から選ばれたものである請求項６に記
   載の試験装置。 ８、約５〜約９５重量％のセルロース有機エステルフィ
   ブレットと約９５〜約５重量％の分散性カットファイバ
   ーとの混合物からなり、事前に決められたかたちに型に
   入れられ圧縮された免疫分析用支持体。 ９、該セルロース有機エステルは、セルロースホルメー
   ト、セルロースアセテート、セルロースブチレート、セ
   ルロースアセテートブチレート、セルロースプロピオネ
   ート、セルロースアセテートプロピオネート及びセルロ
   ーストリアセテートから成る群から選ばれたものである
   請求項８に記載の支持体。 １０、該セルロース有機エステルフィブレットがセルロ
   ースアセテートフィブレットである請求項８に記載の支
   持体。 １１、該分散性カットファイバーがセルロース有機エス
   テル類、ポリエステル類、木材パルプ、ガラス、ポリア
   ミド類、ポリオレフィン類及びポリベンズイミダゾール
   類の繊維からなる群から選ばれたものである請求項８に
   記載の支持体。 １２、該事前に決められたかたちが、ウェハー形のディ
   スクである請求項８に記載の支持体。 １３、約５〜約９５重量％のセルロースアセテートフィ
   ブレットとセルロース有機エステル類、ポリエステル類
   、木材パルプ、ガラス、ポリアミド類、ポリオレフィン
   類及びポリベンズイミダゾール類の繊維からなる群から
   選ばれた約９５〜約９０重量％の分散性カットファイバ
   ーとの混合物からなり、ウェハー形のディスクの型に入
   れられ圧縮された免疫分析用支持体。 １４、試験装置が、反応室と該反応室内の支持体とを有
   し、該支持体は約５〜約９５重量％のセルロース有機エ
   ステルフィブレットと約９５〜約５重量％の分散性カッ
   トファイバーとの混合物とからなり、該支持体には抗原
   を検体から抽出することができる抗体の事前に決められ
   た量が結合されている血液、血漿、尿及びその他の液体
   の検体についての免疫分析法に用いられる試験装置。 １５、該分散性カットファイバーがセルロース有機エス
   テル類、ポリエステル類、木材パルプ、ガラス、ポリア
   ミド類、ポリオレフィン類及びポリベンズイミダゾール
   類の繊維からなる群から選ばれたものである請求項１４
   に記載の試験装置。 １６、該結合されている抗体が、モノクローナル抗体で
   ある請求項１４に記載の試験装置。 １７、該モノクローナル抗体が、抗−ＨＣＧである請求
   項１４に記載の試験装置。 １８、セルロース有機エステルフィブレットを液状分散
   媒質中に分散させ；カットファイバーを該液状分散媒質
   中に分散させて、混合物を形成し；分散媒質を該セルロ
   ース有機エステルフィブレット／カットファイバー混合
   物から分離して、ケーキ状物を形成し、圧力下、事前に
   決められた形状に該ケーキ状物を成型する工程からなる
   免疫分析用支持体の製造法。 １９、該セルロース有機エステルフィブレットがセルロ
   ースアセテートフィブレットである請求項１８に記載の
   方法。