JPH02109992A - 感染特異的タンパク質遺伝子を利用した有用タンパク質生産方法 - Google Patents
感染特異的タンパク質遺伝子を利用した有用タンパク質生産方法Info
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- JPH02109992A JPH02109992A JP26064988A JP26064988A JPH02109992A JP H02109992 A JPH02109992 A JP H02109992A JP 26064988 A JP26064988 A JP 26064988A JP 26064988 A JP26064988 A JP 26064988A JP H02109992 A JPH02109992 A JP H02109992A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は感染特異的タンパク質遺伝子を利用したを用タ
ンパク質生産方法に関し、詳しくは誘導性のプロモータ
ーを有用遺伝子の構造遺伝子部分と融合させたキメラ遺
伝子を植物に形質転換させ、その植物における導入遺伝
子の発現による有用タンパク質の生産方法に関する。
ンパク質生産方法に関し、詳しくは誘導性のプロモータ
ーを有用遺伝子の構造遺伝子部分と融合させたキメラ遺
伝子を植物に形質転換させ、その植物における導入遺伝
子の発現による有用タンパク質の生産方法に関する。
植物に外来遺伝子を導入して新機能を有する形質転換植
物を作出する技術開発は食糧資源の確保にとって重要で
ある。従来、導入するキメラ遺伝子としては、そのプロ
モーターにカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ
）の３５Ｓ ＲＮへのプロモーターが主に使われてきた
。このプロモーターは、その発現が定常的に起こると＾
ノこ、その活性が強いことが知られており、この特性を
利用すべくこのプロモーターと植物ウィルスの外被タン
パク質遺伝子とのキメラ遺伝子をタバコなどに導入し、
ウィルス堆抗性植物を作出する試みが最近行われ、成功
している。
物を作出する技術開発は食糧資源の確保にとって重要で
ある。従来、導入するキメラ遺伝子としては、そのプロ
モーターにカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ
）の３５Ｓ ＲＮへのプロモーターが主に使われてきた
。このプロモーターは、その発現が定常的に起こると＾
ノこ、その活性が強いことが知られており、この特性を
利用すべくこのプロモーターと植物ウィルスの外被タン
パク質遺伝子とのキメラ遺伝子をタバコなどに導入し、
ウィルス堆抗性植物を作出する試みが最近行われ、成功
している。
しかし、このＣａＭＶプロモーターは常時働く特性を持
っているので、その発現を必要としないときも導入遺伝
子に由来する産−物を常時生産していることにおいて経
済的に効率が劣っている。
っているので、その発現を必要としないときも導入遺伝
子に由来する産−物を常時生産していることにおいて経
済的に効率が劣っている。
感染特異的タンパク質１ （ＰＲＩ ）遺伝子のプロモ
ーターは病原菌の感染による壊死環形成や傷害などのス
トレスのほか、サリチル酸などの特殊な薬剤によって誘
導することができる。そこで、このＰＲＩ遺伝子のプロ
モーターと有用タンパク質の構造遺伝子を融合させたキ
メラ遺伝子を植物に形質転換させれば、適当な誘導をか
けることにより望む時期に、望む場所に導入遺伝子産物
を作ることが可能である。これは効率的に有用タンパク
質の生産を行わせるための良い系となる。
ーターは病原菌の感染による壊死環形成や傷害などのス
トレスのほか、サリチル酸などの特殊な薬剤によって誘
導することができる。そこで、このＰＲＩ遺伝子のプロ
モーターと有用タンパク質の構造遺伝子を融合させたキ
メラ遺伝子を植物に形質転換させれば、適当な誘導をか
けることにより望む時期に、望む場所に導入遺伝子産物
を作ることが可能である。これは効率的に有用タンパク
質の生産を行わせるための良い系となる。
本発明は、ＰＲＩ遺伝子のプロモーターと他の構造遺伝
子との融合遺伝子またはリーダーシーフェンスを含むＰ
ＲＩ遺伝子のプロモーターと他の構造遺伝子との融合遺
伝子を植物に形質転換させ、形質転換植物により導入遺
伝子由来の有用タンパク質を生産する方法を提供するも
のである。
子との融合遺伝子またはリーダーシーフェンスを含むＰ
ＲＩ遺伝子のプロモーターと他の構造遺伝子との融合遺
伝子を植物に形質転換させ、形質転換植物により導入遺
伝子由来の有用タンパク質を生産する方法を提供するも
のである。
本発明に用いる誘導性のプロモーターであるＰＲＩ遺伝
子の１つであるＰＲｌａ （γ）遺伝子の塩基配を第１
図に示す、この遺伝子のタンパク質コード領域は下記の
とおりである（矢印から下流は成熟ＰＲ１ａタンパク質
コード領域）。
子の１つであるＰＲｌａ （γ）遺伝子の塩基配を第１
図に示す、この遺伝子のタンパク質コード領域は下記の
とおりである（矢印から下流は成熟ＰＲ１ａタンパク質
コード領域）。
ＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧ ＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＡＣＡＡ
ＴＴＧＣＣＴ ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴ
ＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ ＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡ
ＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣ◆ ＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡ
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Ｇ ＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡ ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡ
ＧＡＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡ Ｃ
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ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＧ ＧＣＴＧＣＡＧ
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ＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧ ＧＣＧＡＡＡＡＣＣＴ Ａ
ＧＣＴＧＡＧＧＧＡ ＡＧＴＧＧＣＧＡＴＴＴＣＡＴＧ
ＡＣＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＧＡＴＧＴ
ＧＧＧＴＣＧＡＴＧ八ＧＡＡＡＣＡＧへＡＴ Ｔ
ＡＴＧＡＣＣＡＴＧ ＡＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＧＴ
ＧＣＡＣＡ＾ＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴ ＧＴＧＧＡＣＡ
ＣＴＡ ＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧ ＧＴＴＴＧＧＣＧ
Ｔ八八ＣＴＣＧＧＴへへＧ ＴＧＴＴＧＧＡＴＧＴ
ＧＣＴＡＧＧＧＴＴＣＡＧＴＧＴＡＡＣＡＡＴＧＧＡ
ＧＧＡＴＡＴ ＧＴＴＧＴＣＴＣＴＴ ＧＣＡＡＣＴＡ
ＴＧＡ ＴＣＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＴＴＡＴＡＧＡＧ
ＧＣＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＣＴＡＡ該タンパク質コ
ード領域中のリーダー配列（シグナルペプチドをコード
する領域）は下記のとおりである。
ＴＴＧＣＣＴ ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴ
ＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ ＴＴＣＣＴＡＧＴＡＡ
ＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣ◆ ＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡ
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ＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ ＴＴＣＣＴＡＧＴＡ
Ａ ＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣ 本発明の方法に用いる形質転換体の作成法を例示すると
、大腸菌のプラスミドに、ＰＲｌａまたはＰＲ１ｂ遺伝
子の５′上流域断片（２，４〜０．３ Ｋｂ）に有用タ
ンパク質遺伝子の構造遺伝子と適当なターミネータ−を
接続したキメラ遺伝子を挿入する（プラスミドＡ）。さ
らに、薬剤耐性遺伝子を挿入したプラスミド（プラスミ
ドＢ）またはプラスミドＡに薬剤耐性遺伝子を挿入した
組換えプラスミド（プラスミドＣ）を用意し、プラスミ
ドＡとプラスミドＢの混合物またはプラスミドＣをエレ
クトロポレーションなどの遺伝子直接導入法（農業生物
資源研究所報告、第３号、昭和６２年１２月、第１０５
〜１１４頁、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ ら）により、または
バイナリ−ベクターを用いたアグロバクテリウム感染（
現代化学増刊５、植物バイオテクノロジー第１９７〜２
１２頁、１９８６年４月２５Ｅ１発行）により植物に形
質転換させる。形質転換体は薬物耐性を指標として選抜
し、目的によってカルス、懸濁培養細胞系または植物体
を得る。この場合、導入遺伝子産物を細胞内にとどめた
い場合には、プロモーターとしてＰＲｌａまたはＰＲ１
ｂ遺伝子の５′上流域断、片（２，４〜０．３ Ｋｂ）
のみを用い、該産物を細胞外に分泌させたい場合には、
上記断片にＰＲｌａまたはＰＲ１ｂ遺伝子のリーダー配
列を接続したＤＮＡ断片を用いる。また、カルスや懸濁
培養細胞を用いる場合には、形質転換植物を起源とする
こともできる。
ＡＴＴＧＣＣＴ ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴ
ＣＴＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡ ＴＴＣＣＴＡＧＴＡ
Ａ ＴＡＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＴＧＣＣ 本発明の方法に用いる形質転換体の作成法を例示すると
、大腸菌のプラスミドに、ＰＲｌａまたはＰＲ１ｂ遺伝
子の５′上流域断片（２，４〜０．３ Ｋｂ）に有用タ
ンパク質遺伝子の構造遺伝子と適当なターミネータ−を
接続したキメラ遺伝子を挿入する（プラスミドＡ）。さ
らに、薬剤耐性遺伝子を挿入したプラスミド（プラスミ
ドＢ）またはプラスミドＡに薬剤耐性遺伝子を挿入した
組換えプラスミド（プラスミドＣ）を用意し、プラスミ
ドＡとプラスミドＢの混合物またはプラスミドＣをエレ
クトロポレーションなどの遺伝子直接導入法（農業生物
資源研究所報告、第３号、昭和６２年１２月、第１０５
〜１１４頁、ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ ら）により、または
バイナリ−ベクターを用いたアグロバクテリウム感染（
現代化学増刊５、植物バイオテクノロジー第１９７〜２
１２頁、１９８６年４月２５Ｅ１発行）により植物に形
質転換させる。形質転換体は薬物耐性を指標として選抜
し、目的によってカルス、懸濁培養細胞系または植物体
を得る。この場合、導入遺伝子産物を細胞内にとどめた
い場合には、プロモーターとしてＰＲｌａまたはＰＲ１
ｂ遺伝子の５′上流域断、片（２，４〜０．３ Ｋｂ）
のみを用い、該産物を細胞外に分泌させたい場合には、
上記断片にＰＲｌａまたはＰＲ１ｂ遺伝子のリーダー配
列を接続したＤＮＡ断片を用いる。また、カルスや懸濁
培養細胞を用いる場合には、形質転換植物を起源とする
こともできる。
キメラ遺伝子作成のためにＰＲＩ遺伝子プロモーターと
接続させる遺伝子としては、たとえば抗菌性タンパク質
遺伝子、植物ウィルスの外被タンパク質遺伝子、植物ウ
ィルスのアンチセンスストランド断片、成長ホルモン遺
伝子、インターフェロン遺伝子などの有用タンパク質遺
伝子を挙げることができる。
接続させる遺伝子としては、たとえば抗菌性タンパク質
遺伝子、植物ウィルスの外被タンパク質遺伝子、植物ウ
ィルスのアンチセンスストランド断片、成長ホルモン遺
伝子、インターフェロン遺伝子などの有用タンパク質遺
伝子を挙げることができる。
上記の如くして得られた形質転換植物またはカルスや懸
濁培養細胞を用いて目的とする有用タンパク質を誘導的
に生産することができる。
濁培養細胞を用いて目的とする有用タンパク質を誘導的
に生産することができる。
次に、本発明を実施例によって詳しく説明するが、本発
明はこれらによって限定されるものではない。
明はこれらによって限定されるものではない。
実施例Ｉ
ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子の５′上流域断片（２，
４Ｋｂ）とグルクロニダーゼ遺伝子とのキメラ遺伝子の
作製 ■ＰＲ１ａおよびＰＲ１ｂ遺伝子のプロモーターの単離 サムスフＮＮタバコの核より調整した高分子ＯＮへのＥ
ｃｏＲ１断片をファージクローニングベクターλｇｔ１
１に結合してタバコのゲノミツクライブラリーを作製し
た。このライブラリーよりＰＲ１ａ遺伝子のｃＤＮ＾ク
ローンをプローブとし、これと相同性を有するゲノミッ
ククローンλｐｒ−γおよびλｐｒ−εを得た。 これ
らの塩基配列を比較すると、それぞれＰＲｌａおよびＰ
ＲｌｂのｃＤＮＡのタンパク質コード部分と完全に一敗
する配列部分を含んでしするので、これらがＰＲｌａお
よびＰＲ１ｂ遺伝子であることが確認できた。
４Ｋｂ）とグルクロニダーゼ遺伝子とのキメラ遺伝子の
作製 ■ＰＲ１ａおよびＰＲ１ｂ遺伝子のプロモーターの単離 サムスフＮＮタバコの核より調整した高分子ＯＮへのＥ
ｃｏＲ１断片をファージクローニングベクターλｇｔ１
１に結合してタバコのゲノミツクライブラリーを作製し
た。このライブラリーよりＰＲ１ａ遺伝子のｃＤＮ＾ク
ローンをプローブとし、これと相同性を有するゲノミッ
ククローンλｐｒ−γおよびλｐｒ−εを得た。 これ
らの塩基配列を比較すると、それぞれＰＲｌａおよびＰ
ＲｌｂのｃＤＮＡのタンパク質コード部分と完全に一敗
する配列部分を含んでしするので、これらがＰＲｌａお
よびＰＲ１ｂ遺伝子であることが確認できた。
これらのクローンにはタンパク質をコードする領域の５
′上流側約２４０００塩基対および約４０００塩基対が
含まれていた。クローニングされた断片全体、をプラス
ミドベクターＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳに（＋）に再ク
ローニングし、これをｐＰＲ−γ、 ｐＰＲ−εとした
。これらの制限酵素地図を第２図に示す。
′上流側約２４０００塩基対および約４０００塩基対が
含まれていた。クローニングされた断片全体、をプラス
ミドベクターＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳに（＋）に再ク
ローニングし、これをｐＰＲ−γ、 ｐＰＲ−εとした
。これらの制限酵素地図を第２図に示す。
ｐＰＲ−７をヘルパーファー！ｊＫＯ１の存在下に大腸
菌に導入し、センスストランドの１本鎖ＤＮＡを調整し
た０次に、この１本鎖ＤＮＡに対しアンチセンスストラ
ンドのコード領域の真上、またはリーダーシークェンス
との境界から作製した合成オリゴヌクレオチドをアニー
ルさせ、これをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ・
フレナラ断片によって再び２本鎖とした。
菌に導入し、センスストランドの１本鎖ＤＮＡを調整し
た０次に、この１本鎖ＤＮＡに対しアンチセンスストラ
ンドのコード領域の真上、またはリーダーシークェンス
との境界から作製した合成オリゴヌクレオチドをアニー
ルさせ、これをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼ・
フレナラ断片によって再び２本鎖とした。
この再生２本鎖はコード領域の真上に１個所のニックを
有している。該ニック部分をＳ、ヌクレアーゼにより切
断し、直鎖状分子とし、切断点を平滑化した後、合成り
ａｌｌａｌリッカーを介して再環化させた。
有している。該ニック部分をＳ、ヌクレアーゼにより切
断し、直鎖状分子とし、切断点を平滑化した後、合成り
ａｌｌａｌリッカーを介して再環化させた。
以上の処理によりｐＰＲ−７はそのコード領域を欠失し
た。これらのプラスミドをｐＰＲｐｒｏ（＋）およびｐ
ＰＲ”ｐｒｏ（＋）とした。同様にｐＰＲ−εについて
も操作し、これらに対応する２種のプラスミドを得た。
た。これらのプラスミドをｐＰＲｐｒｏ（＋）およびｐ
ＰＲ”ｐｒｏ（＋）とした。同様にｐＰＲ−εについて
も操作し、これらに対応する２種のプラスミドを得た。
■ 遺伝子発現量測定用プラスミドｐＰＲ−ＧＵＳおよ
びｐＰＩ’１ｌｌ−ＧｔｌＳ（７）作製ｐＰＲ−７由来
の、およびｐＰＲ−ｅ由来のｐＰＲｐｒｏ （＋ ）お
よびｐＰＲ’ｐｒｏ（＋）をＨｉｎｄＩＩ［とＢａ１ｌ
Ｉｌｌで処理し、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子の５′
上流域断片約２．４ Ｋｂおよび該断片にリーダー配列
が付加された断片約２，５ Ｋｂを電気泳動的に単離し
た。これらの断片をｐＢ１２２１の旧ｎｄＩｎ／Ｂａｍ
旧切断により得た断片と結合した。これらの処理により
ｐＢＩ２２Ｌに存在したカリフラワーモザイクウィルス
３５ Ｓ遺伝子プロモーターはＰＲｆａおよびＰＲ１ｂ
遺伝子のプロモーターおよびリーダー配列を含むＰＲｌ
ａおよびＰＲ１ｂ遺伝子のプロモーターにより置換され
た。
びｐＰＩ’１ｌｌ−ＧｔｌＳ（７）作製ｐＰＲ−７由来
の、およびｐＰＲ−ｅ由来のｐＰＲｐｒｏ （＋ ）お
よびｐＰＲ’ｐｒｏ（＋）をＨｉｎｄＩＩ［とＢａ１ｌ
Ｉｌｌで処理し、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子の５′
上流域断片約２．４ Ｋｂおよび該断片にリーダー配列
が付加された断片約２，５ Ｋｂを電気泳動的に単離し
た。これらの断片をｐＢ１２２１の旧ｎｄＩｎ／Ｂａｍ
旧切断により得た断片と結合した。これらの処理により
ｐＢＩ２２Ｌに存在したカリフラワーモザイクウィルス
３５ Ｓ遺伝子プロモーターはＰＲｆａおよびＰＲ１ｂ
遺伝子のプロモーターおよびリーダー配列を含むＰＲｌ
ａおよびＰＲ１ｂ遺伝子のプロモーターにより置換され
た。
すなわち、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子遺伝子タモ−
タークロニダーゼ（ＣＵＳ ）の構造遺伝子とのキメラ
遺伝子およびリーダー配列を含むＰＲｌａおよびＰＲ１
ｂ遺伝子とＧＵＳ構造遺伝子とのキメ・う遺伝子が作製
された。これらのプラスミドをｐＰＲ−ＧＵＳおよ、び
ｐＰＲ”−ＧＬＩＳとした。
タークロニダーゼ（ＣＵＳ ）の構造遺伝子とのキメラ
遺伝子およびリーダー配列を含むＰＲｌａおよびＰＲ１
ｂ遺伝子とＧＵＳ構造遺伝子とのキメ・う遺伝子が作製
された。これらのプラスミドをｐＰＲ−ＧＵＳおよ、び
ｐＰＲ”−ＧＬＩＳとした。
■ 植物形質転換用プラスミドｐＴＲＡ４１５／ ＰＲ
ｌａ−ＧｔｌＳ、 ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵ
Ｓ、 ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ａ” −ＣＵＳおよび
ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ”−ＧＩＩＳの作製ｐＰＲ−
ＧＩＪＳおよびｐＰＲ” −ＧｔｌＳをＩ！ｃｏＲＩに
よって処理し、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子の５′上
流域とＧυＳ／ＮＯＳターミネータ−からなる複合遺伝
子断片およびリーダー配列を含むＰＲｌａおよびＰＲ１
ｂ遺伝子の５′上流域とＧｔｌＳ／ＮＯＳターミネータ
−からなる複合遺伝子断片を単離した。これらの断片を
ＥｃｏＲＩ処理によって開環したｐＴＲＡ４１５ベクタ
ーに組み込んでｐＴＲＡ４Ｌ５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳ、
ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵＳ、 ｐＴＲＡ４１５
／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳおよびｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ
”−Ｇ［ＩＳとした。これらのうちプラスミドｐＴＲＡ
４１５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳの構造模式図を第３図に示す
。
ｌａ−ＧｔｌＳ、 ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵ
Ｓ、 ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ａ” −ＣＵＳおよび
ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ”−ＧＩＩＳの作製ｐＰＲ−
ＧＩＪＳおよびｐＰＲ” −ＧｔｌＳをＩ！ｃｏＲＩに
よって処理し、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子の５′上
流域とＧυＳ／ＮＯＳターミネータ−からなる複合遺伝
子断片およびリーダー配列を含むＰＲｌａおよびＰＲ１
ｂ遺伝子の５′上流域とＧｔｌＳ／ＮＯＳターミネータ
−からなる複合遺伝子断片を単離した。これらの断片を
ＥｃｏＲＩ処理によって開環したｐＴＲＡ４１５ベクタ
ーに組み込んでｐＴＲＡ４Ｌ５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳ、
ｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵＳ、 ｐＴＲＡ４１５
／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳおよびｐＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ
”−Ｇ［ＩＳとした。これらのうちプラスミドｐＴＲＡ
４１５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳの構造模式図を第３図に示す
。
■ 形質転換植物の作製
植物の形質転換は通常のバイナリ−ベクター／リーフコ
カルチベーシッン法（現代化学増刊５、植物バイオテク
ノロジー、゛第１９７〜２１２頁、１９８６年４月２５
日発行）により行った。まず、（ｊ ） ｐＴＲ，＋１
４１５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳまたはｐＴＲＡ４１５／ＰＲ
１ａ”−ＧＵＳを持つ大腸菌、（ｉｉ）伝達性プラスミ
ドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌および（ｉｉｉ）本来の
Ｔ −ＤＮＡ領域を欠損し、感染性決定領域のみを残し
たＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４を持つ根頭ガン腫病菌
の３者を３０℃にして１晩培養した後、それぞれの培養
液を混合し、さらにｌ昼夜培養した。
カルチベーシッン法（現代化学増刊５、植物バイオテク
ノロジー、゛第１９７〜２１２頁、１９８６年４月２５
日発行）により行った。まず、（ｊ ） ｐＴＲ，＋１
４１５／ＰＲ１ａ−ＧＵＳまたはｐＴＲＡ４１５／ＰＲ
１ａ”−ＧＵＳを持つ大腸菌、（ｉｉ）伝達性プラスミ
ドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌および（ｉｉｉ）本来の
Ｔ −ＤＮＡ領域を欠損し、感染性決定領域のみを残し
たＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４を持つ根頭ガン腫病菌
の３者を３０℃にして１晩培養した後、それぞれの培養
液を混合し、さらにｌ昼夜培養した。
続いて、ｐＴＲＡ４１５／ ＰＲｌａ −ＧＵＳまたは
ｐＴＲ＾４１５／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳとｐＡＬ４４０４
を共に持つ根頭ガン腫病菌を薬剤選択により得た。この
菌を１昼夜培養して無菌的に生育させた後、タバコの葉
片と混合し、感染を起こさせた。この葉片をＭＳ培地に
３％シｇ糖を加えた培地上で２７°Ｃにて連続照明下で
培養し、ｐＴＲＡ４１５によりカナマイシン耐性を付与
された形質転換カルスを得た。
ｐＴＲ＾４１５／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳとｐＡＬ４４０４
を共に持つ根頭ガン腫病菌を薬剤選択により得た。この
菌を１昼夜培養して無菌的に生育させた後、タバコの葉
片と混合し、感染を起こさせた。この葉片をＭＳ培地に
３％シｇ糖を加えた培地上で２７°Ｃにて連続照明下で
培養し、ｐＴＲＡ４１５によりカナマイシン耐性を付与
された形質転換カルスを得た。
これらのカルスから植物体を再分化させ、導入遺伝子の
存在をサザンブロッティングにより確認し、実験に供し
た。また、ρＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵＳまたはｐ
ＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ”−ＧＵＳニツ（ｒ’でも上記
と同様に操作して植物体を、実験に供した。
存在をサザンブロッティングにより確認し、実験に供し
た。また、ρＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ−ＧＵＳまたはｐ
ＴＲＡ４１５／ＰＲ１ｂ”−ＧＵＳニツ（ｒ’でも上記
と同様に操作して植物体を、実験に供した。
■、形質転換植物における導入遺伝子の発現カナマイシ
ン耐性により選抜した植物より葉ディスクを３組打ち抜
き、第１組は直ちにリン酸緩衝液と共に磨砕して得た粗
抽出液中のＧＵＳ活性を測定した。一方、他の２組は水
または２ｎＭサリチル酸溶液中に２０°Ｃで２日間保温
したのち、第１組と同様にしてＣＵＳ活性を測定した。
ン耐性により選抜した植物より葉ディスクを３組打ち抜
き、第１組は直ちにリン酸緩衝液と共に磨砕して得た粗
抽出液中のＧＵＳ活性を測定した。一方、他の２組は水
または２ｎＭサリチル酸溶液中に２０°Ｃで２日間保温
したのち、第１組と同様にしてＣＵＳ活性を測定した。
その結果、第４図に示すように、ディスキング後２日間
の保温によって数倍のＧＵＳ活性が、またサリチル酸処
理と保温によって数十倍のＧＵＳ活性の増加を示す多数
の植物体が得られた。
の保温によって数倍のＧＵＳ活性が、またサリチル酸処
理と保温によって数十倍のＧＵＳ活性の増加を示す多数
の植物体が得られた。
上記の結果は、非形質転換体に元々存在するＧＵＳ活性
の１ｏｏｏｏ倍以上に相当する。また、ＴＭＶ惑染によ
る病斑や傷の周辺にＧＵＳ活性の強い発現が組織化学的
に認められた。
の１ｏｏｏｏ倍以上に相当する。また、ＴＭＶ惑染によ
る病斑や傷の周辺にＧＵＳ活性の強い発現が組織化学的
に認められた。
サザンブロッティングにより導入遺伝子の存在がｒＪ′
ｆｉ認された個体では、程度の差はあっても、傷害のス
トレス、病斑の形成およびサリチル酸処理によって、す
べての個体にＧＵＳ活性でみた導入遺伝子の発現が起こ
ることが確認された。
ｆｉ認された個体では、程度の差はあっても、傷害のス
トレス、病斑の形成およびサリチル酸処理によって、す
べての個体にＧＵＳ活性でみた導入遺伝子の発現が起こ
ることが確認された。
■ 形質転換植物由来のカルスを起源とした懸濁培養細
胞系における導入遺伝子の発現形質転換植物の茎由来の
カルスをムラシゲ・スクーグの寒天培地上で形成させた
のち、同液体培地に移して暗黒下１００回転／分で振と
う培養を行った。６ケ月後には、これらの懸濁培養細胞
中、週１回の植え継ぎで最高１０倍以上に増殖する株も
出現した。
胞系における導入遺伝子の発現形質転換植物の茎由来の
カルスをムラシゲ・スクーグの寒天培地上で形成させた
のち、同液体培地に移して暗黒下１００回転／分で振と
う培養を行った。６ケ月後には、これらの懸濁培養細胞
中、週１回の植え継ぎで最高１０倍以上に増殖する株も
出現した。
これらの懸濁培養細胞に、植え継ぎ５日後に２０μ阿に
なるようにサリチル酸を培地に加えたところ、その４日
後（植え継ぎ９日目）には培地全体に含まれるＧＵＳ活
性は非形質転換体由来の活性の約５０００倍以上に増加
する株が多数認められた。また、導入遺伝子としてｐＴ
ＲＡ４１５／ ＰＲｌａ−ＧＩＪＳとｐＴＲＡ４１５／
ＰＲＡ１ｂ−ＧＩＪＳを用いた場合には、誘導されたＧ
ＵＳ活性の殆んどが懸濁培養細胞内に、またｐＴＲＡ４
１５／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳおよびｐＴＲＡ４１５／ＰＲ
１ｂ” −ＧＵＳを用いた場合には、前記したサリチル
酸処理条件で植え継ぎ９日目には誘導されたＧＵＳ活性
の大部分が培地中に放出された。
なるようにサリチル酸を培地に加えたところ、その４日
後（植え継ぎ９日目）には培地全体に含まれるＧＵＳ活
性は非形質転換体由来の活性の約５０００倍以上に増加
する株が多数認められた。また、導入遺伝子としてｐＴ
ＲＡ４１５／ ＰＲｌａ−ＧＩＪＳとｐＴＲＡ４１５／
ＰＲＡ１ｂ−ＧＩＪＳを用いた場合には、誘導されたＧ
ＵＳ活性の殆んどが懸濁培養細胞内に、またｐＴＲＡ４
１５／ＰＲ１ａ”−ＧＵＳおよびｐＴＲＡ４１５／ＰＲ
１ｂ” −ＧＵＳを用いた場合には、前記したサリチル
酸処理条件で植え継ぎ９日目には誘導されたＧＵＳ活性
の大部分が培地中に放出された。
本発明によれば、ＰＲｌａおよびＰＲ１ｂ遺伝子のプロ
モーターの特性を有効に利用した有用タンパク質生産用
形質転換植物の作出が可能になる。
モーターの特性を有効に利用した有用タンパク質生産用
形質転換植物の作出が可能になる。
これらの植物は、プロモーターと接続する有用タンパク
質遺伝子の種類によって種々の目的に適合する植物とな
り得る。たとえば、植物ウィルスの外被タンパク質遺伝
子を用いれば、ウィルス感染による病斑形成に伴なって
病斑周辺に上記外被タンパク質が多量に生成するため、
それ以後のウィルスの増殖、移行が妨げられるため、ウ
ィルス抵抗性植物となり得る。また、植物に病斑を作ら
せるような病原菌感染に対しては、その病原菌増殖を制
御するタンパク性毒素遺伝子を用いることによって病斑
周辺でのそれ以上の病原菌感染を妨げるような形質転換
体を作出・することができる。
質遺伝子の種類によって種々の目的に適合する植物とな
り得る。たとえば、植物ウィルスの外被タンパク質遺伝
子を用いれば、ウィルス感染による病斑形成に伴なって
病斑周辺に上記外被タンパク質が多量に生成するため、
それ以後のウィルスの増殖、移行が妨げられるため、ウ
ィルス抵抗性植物となり得る。また、植物に病斑を作ら
せるような病原菌感染に対しては、その病原菌増殖を制
御するタンパク性毒素遺伝子を用いることによって病斑
周辺でのそれ以上の病原菌感染を妨げるような形質転換
体を作出・することができる。
さらに、形質転換カルスまたは形質転換植物体由来のカ
ルスを基にして調整した懸濁培養細胞を用いることによ
り、有用物質を生産させ培地中に放出させることが出来
るため、簡便な物質生産系として利用できる。
ルスを基にして調整した懸濁培養細胞を用いることによ
り、有用物質を生産させ培地中に放出させることが出来
るため、簡便な物質生産系として利用できる。
また、本発明の方法は従来のＣａＭＶ３５Ｓプロモータ
ーを用いる方法と組合せることによって、より有用な病
原抵抗性植物の作出に役立つものと考えられる。
ーを用いる方法と組合せることによって、より有用な病
原抵抗性植物の作出に役立つものと考えられる。
第１図はＰＲ１ａ遺伝子の塩基配列を示し、第２図はＰ
ＲｌａおよびＰＲ１ｂゲノミッククローンの制限酵素地
図を示す。第３図はプラスミドｐＴＲＡ４１５／ ＰＲ
ｌａ−ＧＩＩＳの構造模式図であり、第４図はｐＴＲＡ
４１５ ／ ＰＲｌａＧＵＳを形質転換させた植物（タ
バコ葉）における導入遺伝子発現を示すグラフである。 第２図においてＡはＡｃｃｌ 、ＢはＢｇｌｎ、ＣはＳ
ｃａ Ｉ 。 ＤはＤｒａｌ、［！はｔ！ｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄ Ｉ
［［、ＭはＢａｍＨＩ 、 ＰはＰｓｔｌおよびＸはＸ
ｈｏ Ｉをそれぞれ示し、ＰＲｌａ ｃＤＮＡ （ｐ
ＰＲ１１８３）のインサートおよびタンパク質コード領
域真上の合成オリゴマーとハイブリダイズする領域を□
および で示す。 第４図において■■■■は対照、ｍ は水で２日間の保温処理したもの、ｍはサリチル酸溶液
で２日間の保温処理したもの、←←はＰＲＩタンパク質
をそれぞれ示す。 第１ ’ｒｃｃＡＴＧＧｃＡＴ ＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡ
ＡＡＴＡ↑ＴＡ ＡＴＴＡＡＣＡＣＡＴＡＡＡＡＡＧＴ
ＧＴＴ ＴＡＡＣＴＴＧＡＴＧ（：ＡＡＴＴＧＧＴＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＴＡＣＡＴＴ Ｇ
ＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴ ＡＡＡＴＡ
にＣ：ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧ ＴＴＣＴＣＴＴ
ＴＴＣＴＡＴＣＧＣＡＣＴＣＴＴＧ（ｉｌｌ：ＧＴＧＣ
ＣＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡ ＧＡＡＣＧＴＴＴＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＣＡＴＧＡ（
：ＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡ
ＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧ ＡＧＴＧ
ＴＡＡ（：ＡＡＧＣＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＣＴＡＡＴ
ＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＡ
ＴＣＣＴＣＴＧ ＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＴ
ＧＡＴＧ ＴＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＡＣＴＴＧＣＧ
ＡＴＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＡ ＴＡＡ（：（：ＡＴＡＡｔ：： ＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴ ＡＡＧＴＴＴＡＡＴＡ ＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡ ＧＧＴＡＧＴＡＡＡＴ ＡＣＡＡＴＴＧＣＣＴ ＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧ （：ＣＴＧＧＧＡＣＧＡ ＡＣＡＴＴＣＴＣＡＴ ＧＴＴＧＡＧＡＴＧＴ ＧＴＧＧＡＣ：ＡＣＴＡ ＴＧＧＡＧＧＡＴＡＴ ＡＡＡＣＧＡＣＧＴＡ ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡ ＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣ： ＴＡＴＴＡＴＴＡＴＧ ＣＣＡＡＡＴＴＣ：ＴＴ ＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧ ＣＡＧＴＣＴＡＣＴＴ ＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴ ＴＧＧＴＡＡＣＣＴＡ ＴＴＴＡＧＴＡ ＣＴＡＧＴＴＩ ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣ ＡＡＣＡＡＧＡＣＴＡ ＣＣＡＧＧＴＡＧＣＡ ＧＧＴＣＡＡＴＡＣＧ ＧＧＧＴＣＧＡＴＧ＾ ＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧ ＧＴＴＧＴＣＴＣＴＴ ＣＧＴＣＣＡＴＴＴＣ ＧＧＡＡＣＴＴＡＡＡ （：ＡＡＧＴＧＧＴＣＡ ＡＡＣ：ＡＣＴＴＴＴＧ ＡＡＣＴＡＣＡＴＧＣ ＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴ ＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡ ＴＴＴＧＧＡＡＣＡＴ ＧＡＡＡＡＴＡＧＧＡ ＴＴＧＴＣＴＣＴＡＣ： ＴＴＴＧＧＡＴＧＣＣ ＧＣＣＴＡＴＧＣＧＣ ＧＣＧＡＡＡＡ（、ＣＴ ＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴ ＧＴＴＴＧＧＣＧＴＡ ＧＣＡＡＣＴＡＴＧＡ ＡＣＧＴＴＡＡＴＡＴ ＧＴＣＡＡＧＴＡＴＡ ＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧ ＴＡＣＴＣＡＴＡＣＧ ＣＴＴＡＧＧＡＡＣＡ ＡＴＴＡＴ ＴＡＡＴＣ：ＡＧＡＴＣ ＡＡＡＧＣＡＣＡＴＣ ＣＡＧＧＴＡＡＡＡＣ ＴＡＡＡＴＴＡＴＣＴ ＴＴＡＡＴＴ（：ＴＴＴ ＧＴＴＡＡＡＴＧＴＡ ＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡ ＴＡＴＴＴＴＡＣＡＡ ＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴ ＡＣＴＴ（：ＴＣＴＴＡ ＴＴＣ：ＣＴＡＧＴＡＡＣＡ
ＴＡＡＣＡＣＡＧ ＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴ
ＡＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡ
ＡＧＴＧＧ（：ＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ ＡＣ
ＴＣＡＡＡＴＡＣＡＣＴＣＧＧＴＴＣＧ ＴＧＴＴＧＧ
ＡＴＧＴＴＣＣＴＣ（：ＡＧＧＴ ＡＡＴＴＡＴＡＧＡ
ＧＧＴＡＴＧＧＡＴＴＧ ＴＴＧＴＧＣＴＴＧ＾ＴＡＧ
ＴＡＡＴＡＧＴ ＡＣＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴ
ＡＴＧ ＡＧＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＴＣ：ＡＴＧＴＧＧ
ＴＧＡＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＴ 第２ 図 第３ 図 Ｋｂ 第４ 図
ＲｌａおよびＰＲ１ｂゲノミッククローンの制限酵素地
図を示す。第３図はプラスミドｐＴＲＡ４１５／ ＰＲ
ｌａ−ＧＩＩＳの構造模式図であり、第４図はｐＴＲＡ
４１５ ／ ＰＲｌａＧＵＳを形質転換させた植物（タ
バコ葉）における導入遺伝子発現を示すグラフである。 第２図においてＡはＡｃｃｌ 、ＢはＢｇｌｎ、ＣはＳ
ｃａ Ｉ 。 ＤはＤｒａｌ、［！はｔ！ｃｏＲＩ、ＨはＨｉｎｄ Ｉ
［［、ＭはＢａｍＨＩ 、 ＰはＰｓｔｌおよびＸはＸ
ｈｏ Ｉをそれぞれ示し、ＰＲｌａ ｃＤＮＡ （ｐ
ＰＲ１１８３）のインサートおよびタンパク質コード領
域真上の合成オリゴマーとハイブリダイズする領域を□
および で示す。 第４図において■■■■は対照、ｍ は水で２日間の保温処理したもの、ｍはサリチル酸溶液
で２日間の保温処理したもの、←←はＰＲＩタンパク質
をそれぞれ示す。 第１ ’ｒｃｃＡＴＧＧｃＡＴ ＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＧＡＡ
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ＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＴ ＡＡＡＴＡ
にＣ：ＣＴＴＡＴＧＧＧＡＴＴＴＧ ＴＴＣＴＣＴＴ
ＴＴＣＴＡＴＣＧＣＡＣＴＣＴＴＧ（ｉｌｌ：ＧＴＧＣ
ＣＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡ ＧＡＡＣＧＴＴＴＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＡＣＣＴＣＧＴＴＣＡＴＧＡ（
：ＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＣＡＡ
ＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＡＧＧＧＴＴＧ ＡＧＴＧ
ＴＡＡ（：ＡＡＧＣＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＣＴＡＡＴ
ＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＡＡ
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ＴＧＡＴＧＧＴＣＴＡＧＣＴＴ 第２ 図 第３ 図 Ｋｂ 第４ 図
Claims (2)
- （１）感染特異的タンパク質１（ＰＲ１）遺伝子のプロ
モーターと他の構造遺伝子との融合遺伝子またはリーダ
ーシークェンスを含むＰＲ１遺伝子のプロモーターと他
の構造遺伝子との融合遺伝子を植物に形質転換させ、形
質転換植物により導入遺伝子由来の有用タンパク質を生
産する方法。 - （２）請求項１記載の融合遺伝子を植物細胞に導入した
のち得られた形質転換カルスまたは請求項１記載の形質
転換植物由来のカルスまたは懸濁培養細胞により導入遺
伝子由来の有用タンパク質を生産する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26064988A JPH02109992A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | 感染特異的タンパク質遺伝子を利用した有用タンパク質生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26064988A JPH02109992A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | 感染特異的タンパク質遺伝子を利用した有用タンパク質生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02109992A true JPH02109992A (ja) | 1990-04-23 |
Family
ID=17350851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26064988A Pending JPH02109992A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | 感染特異的タンパク質遺伝子を利用した有用タンパク質生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02109992A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0798381A3 (en) * | 1996-03-25 | 1998-06-17 | National Institute Of Agrobiological Resources, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries | Pathogen-resistant plants and method for production thereof |
-
1988
- 1988-10-18 JP JP26064988A patent/JPH02109992A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0798381A3 (en) * | 1996-03-25 | 1998-06-17 | National Institute Of Agrobiological Resources, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries | Pathogen-resistant plants and method for production thereof |
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