JPH02109993A - ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法 - Google Patents
ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法Info
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- JPH02109993A JPH02109993A JP26061988A JP26061988A JPH02109993A JP H02109993 A JPH02109993 A JP H02109993A JP 26061988 A JP26061988 A JP 26061988A JP 26061988 A JP26061988 A JP 26061988A JP H02109993 A JPH02109993 A JP H02109993A
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合技術を用
いて、ヒト細胞膜、特にヒト腫ｆＩｉ！ＩＩ胞膜上の蛋
白に特異的に反応するモノクローナル抗体を製造する方
法に関する。更に詳しくは、免疫動物に、糖鎖抗原に対
する免疫不全マウス、特に雄のＣＢＡ／Ｎマウスを用い
ることにより、ヒト腫瘍の病理的・血清学的診断のみな
らず、ヒト踵壇の細胞膜上に限局する蛋白を標的にした
ミサイル療法、腫瘍の位置を決定する体内診断用として
有用な、ヒト腫瘍の細胞膜上の蛋白に特異的に反応する
モノクローナル抗体を製造する方法に関する。
いて、ヒト細胞膜、特にヒト腫ｆＩｉ！ＩＩ胞膜上の蛋
白に特異的に反応するモノクローナル抗体を製造する方
法に関する。更に詳しくは、免疫動物に、糖鎖抗原に対
する免疫不全マウス、特に雄のＣＢＡ／Ｎマウスを用い
ることにより、ヒト腫瘍の病理的・血清学的診断のみな
らず、ヒト踵壇の細胞膜上に限局する蛋白を標的にした
ミサイル療法、腫瘍の位置を決定する体内診断用として
有用な、ヒト腫瘍の細胞膜上の蛋白に特異的に反応する
モノクローナル抗体を製造する方法に関する。
［従来技術］
近年、Ｋｏｈｌｅｒらが考案した細胞融合技術［Ｎａｔ
ｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）コを利用したモノ
クローナル抗体の作成が盛んに行われるようになった。
ｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）コを利用したモノ
クローナル抗体の作成が盛んに行われるようになった。
腫瘍細胞を免疫原としたモノクローナル抗体の作成もＫ
ｏｐｒｏｗｓｋｒらによる大腸癌を免疫原として作成し
たＮ−１９−９抗体［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｇｅ
ｎｅｔ、、５：９５７（１９７９）、５ｃｉｅｎｃｅ、
２１２：５３（１９８１）］をはじめとし、Ｌｉｎｄｈ
ｏ１ｗらによる大腸癌でのＣ−５０抗体［１ｎｔ。
ｏｐｒｏｗｓｋｒらによる大腸癌を免疫原として作成し
たＮ−１９−９抗体［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅ１ｌ Ｇｅ
ｎｅｔ、、５：９５７（１９７９）、５ｃｉｅｎｃｅ、
２１２：５３（１９８１）］をはじめとし、Ｌｉｎｄｈ
ｏ１ｗらによる大腸癌でのＣ−５０抗体［１ｎｔ。
＾ｒｃｈｓ ＾Ｉｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ、１ｍｇ＋
ｕｎ、、７１：１７８（１９８３）］ 。
ｕｎ、、７１：１７８（１９８３）］ 。
ｅａｓｔらによる卵巣癌でのＱＣ−＋２５抗体［Ｎ、Ｅ
ｎｇ、Ｊ。
ｎｇ、Ｊ。
Ｍｅｄ、、３０９：８８３（１９８３）］ 、 Ｍｅｔ
ｚｇｅｒらによる膵癌でのＤＵ−ＰＡＮ−２抗体ＣＣａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４２：５ｏｌ（１９８２）］ ＋
（ｈｕｎｇらによる膵癌での５Ｐａｎ−１抗体ＣＤｉｇ
、Ｄｉｓ、Ｓｃｉ、。
ｚｇｅｒらによる膵癌でのＤＵ−ＰＡＮ−２抗体ＣＣａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４２：５ｏｌ（１９８２）］ ＋
（ｈｕｎｇらによる膵癌での５Ｐａｎ−１抗体ＣＤｉｇ
、Ｄｉｓ、Ｓｃｉ、。
３０：９６？（＋９８５）］等が次々に樹立された。こ
れらのモノクローナル抗体を用いて、担癌患者の血中に
当該モノクローナル抗体が認識する癌抗原の存在を証明
し、いくつかの抗体は既に癌の血清学的診断に利用され
ている。
れらのモノクローナル抗体を用いて、担癌患者の血中に
当該モノクローナル抗体が認識する癌抗原の存在を証明
し、いくつかの抗体は既に癌の血清学的診断に利用され
ている。
Ｋｏｐｒｏｗｓｋ ｉらをはじめとした研究者の腫瘍特
異的モノクローナル抗体の作成方法は、癌細胞ないしは
癌細胞膜をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、抗体産生細胞
と骨髄ｍ＊胞を融合し、抗体産生クローンの中で、癌細
胞とよく反応し且つ正常細胞と反応しない性質のクロー
ンを選び出す方法である。
異的モノクローナル抗体の作成方法は、癌細胞ないしは
癌細胞膜をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、抗体産生細胞
と骨髄ｍ＊胞を融合し、抗体産生クローンの中で、癌細
胞とよく反応し且つ正常細胞と反応しない性質のクロー
ンを選び出す方法である。
ところが彼等の方法には、癌細胞抗原のうち、糖鎖抗原
、脂質抗原、蛋白抗原等を分別する操作が含まれておら
ず、結果として彼等が作成した方法でのモノクローナル
抗体はすべて、糖鎖に対するものであった。 本発明者
らのａ験でも、子宮内膜癌細胞株であるＩｓｈｉｋａｗ
ａ！１胞もしくはｌ０Ｃ−２１細胞を用いてＢ Ａ Ｌ
Ｂ 、／ Ｃマウスに免疫する方法で、得られたモノ
クローナル抗体が認識する抗原は、Ｌｅ”、Ｌｅ’やＨ
抗原のフコースを含む血液型抗原が多く、蛋白を認識す
るものはほとんど得られなかった。これは腺癌より分泌
される血液型糖鎖抗原活性を有するムチンの免疫原性が
強いために、生成したモノクローナル抗体のほとんどが
ムチン上の糖鎖を認識するものとなり、ムチンに比べ細
胞膜上で免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得られに
くいためで、これまでにヒト腺癌の細胞膜上の蛋白を認
識するモノクローナル抗体は得ろたという報告は殆どな
い。
、脂質抗原、蛋白抗原等を分別する操作が含まれておら
ず、結果として彼等が作成した方法でのモノクローナル
抗体はすべて、糖鎖に対するものであった。 本発明者
らのａ験でも、子宮内膜癌細胞株であるＩｓｈｉｋａｗ
ａ！１胞もしくはｌ０Ｃ−２１細胞を用いてＢ Ａ Ｌ
Ｂ 、／ Ｃマウスに免疫する方法で、得られたモノ
クローナル抗体が認識する抗原は、Ｌｅ”、Ｌｅ’やＨ
抗原のフコースを含む血液型抗原が多く、蛋白を認識す
るものはほとんど得られなかった。これは腺癌より分泌
される血液型糖鎖抗原活性を有するムチンの免疫原性が
強いために、生成したモノクローナル抗体のほとんどが
ムチン上の糖鎖を認識するものとなり、ムチンに比べ細
胞膜上で免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得られに
くいためで、これまでにヒト腺癌の細胞膜上の蛋白を認
識するモノクローナル抗体は得ろたという報告は殆どな
い。
［発明が解決しようとする課題］
腫瘍細胞を免疫原としたＮ−１９−９抗体、 Ｃ−５０
抗体。
抗体。
ＱＣ−＋２５抗体、 ＤＵ−ＰＡＮ−２抗体、 ５Ｐａ
ｎ−１抗体等の抗体が認識する抗原決定基は全て血液型
物質類似の癌関連糖鎖であり、通常のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スを用いたヒト腫瘍細胞、特に腺癌細胞の免疫方法では
、腺癌より分泌される血液型ｖｉａ抗原活性を有するム
チンの免疫原性が強いため、生成したモノクローナル抗
体のほとんどがムチン上の糖鎖を認識するものとなり、
ムチンに比べ免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得ら
れなかった。
ｎ−１抗体等の抗体が認識する抗原決定基は全て血液型
物質類似の癌関連糖鎖であり、通常のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スを用いたヒト腫瘍細胞、特に腺癌細胞の免疫方法では
、腺癌より分泌される血液型ｖｉａ抗原活性を有するム
チンの免疫原性が強いため、生成したモノクローナル抗
体のほとんどがムチン上の糖鎖を認識するものとなり、
ムチンに比べ免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得ら
れなかった。
血液型物質類似の癌関連糖鎖を認識する抗体の開発は進
み、癌の診断に臨床上有用であるとの評価は定着した。
み、癌の診断に臨床上有用であるとの評価は定着した。
ところがヒト腺癌の細胞膜上の蛋白と特異的に反応する
抗体はいまだ得られず、当該抗体を製造する方法の開発
が望まれていた。
抗体はいまだ得られず、当該抗体を製造する方法の開発
が望まれていた。
［課屈を解決するための手段］
本発明は、糖鎖抗原に対する抗体産生が免疫不全となっ
ていると言われている雄のＣＢＡ／ＩＩＪマウス［Ａｓ
ｓｂａｕｇｈ＋Ｄ、Ｆ、、ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、＋３６：９３１、（＋９７２）、 ５ｃｈｅ
ｒ、１．＋ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４
１ニアＢＢ（＋９７５）、 Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ、、ｅ
ｔ ａｌ、、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．．１１５：８９８（
＋９７５）］にヒト腫腫細胞を免疫することにより、ヒ
ト腫瘍細胞、特にムチンの免疫原性が極めて強いとされ
るヒト腺癌においても、腫瘍細胞収上の蛋白を認識する
モノクローナル抗体が得られることを見出して本発明を
完成した。
ていると言われている雄のＣＢＡ／ＩＩＪマウス［Ａｓ
ｓｂａｕｇｈ＋Ｄ、Ｆ、、ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、＋３６：９３１、（＋９７２）、 ５ｃｈｅ
ｒ、１．＋ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４
１ニアＢＢ（＋９７５）、 Ｃｈａｒｌｅｓ Ａ、、ｅ
ｔ ａｌ、、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．．１１５：８９８（
＋９７５）］にヒト腫腫細胞を免疫することにより、ヒ
ト腫瘍細胞、特にムチンの免疫原性が極めて強いとされ
るヒト腺癌においても、腫瘍細胞収上の蛋白を認識する
モノクローナル抗体が得られることを見出して本発明を
完成した。
即ち本発明は、
ａ）糖鎖抗原に対して免疫不全を有する先天的免疫不全
マウスをヒト細胞またはヒト細胞膜で免疫する工程； ｂ）該被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスの抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを融合させる工程；Ｃ）該ヒト細胞膜蛋
白に特異的に反応する抗体を産生ずる融合細胞株を選択
する工程； ｄ）該選択融合細胞株をクローン化する工程；及びｅ）
該クローン化融合細胞株を培養し、培養液中より抗体を
分取する工程； よりなることを特徴とするヒト細胞膜上の蛋白に特異的
に反応する抗体を作成する方法である。
マウスをヒト細胞またはヒト細胞膜で免疫する工程； ｂ）該被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスの抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを融合させる工程；Ｃ）該ヒト細胞膜蛋
白に特異的に反応する抗体を産生ずる融合細胞株を選択
する工程； ｄ）該選択融合細胞株をクローン化する工程；及びｅ）
該クローン化融合細胞株を培養し、培養液中より抗体を
分取する工程； よりなることを特徴とするヒト細胞膜上の蛋白に特異的
に反応する抗体を作成する方法である。
以下、本発明について詳細に説明する。
モノクローナル抗体は、抗体を産生ずる能力と細胞培ｉ
液中で永久的に増殖できる能力を有している抗体産生細
胞が産生ずる予め曝露、規定された抗原にス（して特異
的なモノクローンな免疫グロブリンであり、その製造法
としては、哺乳動物に抗原を免疫した後、１）Ｋｏｈｌ
ｅｒらにより考案された瑚胞融合技術、即ち抗体産生細
胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコール、センダイ
ウィルス等の存在下で融合する方法、２）Ｓｔｅｉｎｉ
ｔｚらによるＥＢＶ等のウィルスに抗体産生細胞を感染
させ形質転換する方法［Ｎａｔｕｒｅ、２６９：４２０
（＋９７７）］がある。
液中で永久的に増殖できる能力を有している抗体産生細
胞が産生ずる予め曝露、規定された抗原にス（して特異
的なモノクローンな免疫グロブリンであり、その製造法
としては、哺乳動物に抗原を免疫した後、１）Ｋｏｈｌ
ｅｒらにより考案された瑚胞融合技術、即ち抗体産生細
胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコール、センダイ
ウィルス等の存在下で融合する方法、２）Ｓｔｅｉｎｉ
ｔｚらによるＥＢＶ等のウィルスに抗体産生細胞を感染
させ形質転換する方法［Ｎａｔｕｒｅ、２６９：４２０
（＋９７７）］がある。
後者はウィルスの管理、形質転換細胞作成の困難性によ
り、前者の細胞融合法によるモノクローナル抗体作成方
法が一般的である０本発明は細胞融合法によるモノクロ
ーナル抗体を製造するものであるが、糖鎖抗原に対して
免疫不全を有する先天的免疫不全マウス、特に雄のＣＢ
Ａ／Ｎマウスを免疫動物とする上記方法により、腫瘍細
胞膜上の蛋白を認識するモノクローナル抗体を効率よく
作成するものである。
り、前者の細胞融合法によるモノクローナル抗体作成方
法が一般的である０本発明は細胞融合法によるモノクロ
ーナル抗体を製造するものであるが、糖鎖抗原に対して
免疫不全を有する先天的免疫不全マウス、特に雄のＣＢ
Ａ／Ｎマウスを免疫動物とする上記方法により、腫瘍細
胞膜上の蛋白を認識するモノクローナル抗体を効率よく
作成するものである。
本発明方法において、免疫するヒト細胞としては、子宮
内膜癌、卵巣癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胆管癌、胃癌、
乳癌および肺癌等のヒトＢ瘍纏胞が例示される。
内膜癌、卵巣癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胆管癌、胃癌、
乳癌および肺癌等のヒトＢ瘍纏胞が例示される。
（１）抗体産生細胞の製造
３〜１０週齢、好ましくは８週齢の雄のＣＢＡ／Ｎマウ
スの皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、標準懸濁液
または繍織培養培地中のＩＩＪＩ細胞をそのまま或いは
ホモジナイズして、適当なアジュバントと共にｌＸｌ０
’〜Ｉ Ｘ １０７個を注射し、必要に応じて追加免疫
する。−最終免疫後３〜７日に、これらマウスより抗体
を産生ずるリンパ球を含む牌臓またはリンパ節等末梢す
ンパ系＆ｌ織を摘出する。得られた組織からリンパ球を
単細胞として分離する方法としては、例えば免疫実験操
作法Ｂ［１９７４年、日本免疫学会発行１２５３ページ
］に記載されている方法による。
スの皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、標準懸濁液
または繍織培養培地中のＩＩＪＩ細胞をそのまま或いは
ホモジナイズして、適当なアジュバントと共にｌＸｌ０
’〜Ｉ Ｘ １０７個を注射し、必要に応じて追加免疫
する。−最終免疫後３〜７日に、これらマウスより抗体
を産生ずるリンパ球を含む牌臓またはリンパ節等末梢す
ンパ系＆ｌ織を摘出する。得られた組織からリンパ球を
単細胞として分離する方法としては、例えば免疫実験操
作法Ｂ［１９７４年、日本免疫学会発行１２５３ページ
］に記載されている方法による。
（２）融合細胞の製造
融合細胞の作成方法としては、例えばＧａ ｌ ｆ ｒ
ｅらの方法ＣＮａｔｕｒｅ、２６６：５５０（＋９７７
）］に準じて行われる。マウス骨髄ｌ！細胞１〜２０Ｘ
１０７個に対して１０倍量の上記抗体産生リンパ球細胞
とを混合して、ポリエチレングリコールの存在下、３０
〜４０℃の温度で約１〜３分閏程度反応させ融合する。
ｅらの方法ＣＮａｔｕｒｅ、２６６：５５０（＋９７７
）］に準じて行われる。マウス骨髄ｌ！細胞１〜２０Ｘ
１０７個に対して１０倍量の上記抗体産生リンパ球細胞
とを混合して、ポリエチレングリコールの存在下、３０
〜４０℃の温度で約１〜３分閏程度反応させ融合する。
融合の後、２４１．／ｅｌｆの培養プレートあるいは９
６Ｗｅｌ＋の培養プレートに融合細胞（牌臓纏胞が１〜
２ Ｘ １０’／Ｗｅｌｌとなる量）を分注し、ＨＡＴ
培地（ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン添加
培地）を添加し３０〜４０℃の温度で、１０〜１４日培
養する。ＨＡＴ培地で培養後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地か
らアミノプテリンを除いた培地）で培養し、完全ｔａ
ｔｔＩ！に交換する。
６Ｗｅｌ＋の培養プレートに融合細胞（牌臓纏胞が１〜
２ Ｘ １０’／Ｗｅｌｌとなる量）を分注し、ＨＡＴ
培地（ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン添加
培地）を添加し３０〜４０℃の温度で、１０〜１４日培
養する。ＨＡＴ培地で培養後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地か
らアミノプテリンを除いた培地）で培養し、完全ｔａ
ｔｔＩ！に交換する。
ＨＡＴ培地での融合細胞の選択培養は、例えばＬｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄら［５ｃｉｅｎｃｅ、＋４５ニア０９（
＋９６４）コの方法に準じて行える。
ｌｅｆｉｅｌｄら［５ｃｉｅｎｃｅ、＋４５ニア０９（
＋９６４）コの方法に準じて行える。
（３）特異抗体産生性融合細胞株の選択およびクローニ
ング Ｗｅｌｌ中でコロニー状に成した融合細胞の培Ｉｔα中
の抗体を蛍光、酵素あるいはラジオアイソトープで標識
した第二抗体と反応させ、標識物の活性を測定すること
により、特異抗体産生性融合細胞株を選択する。この方
法としては、例えばＰｏｐｅらの方法ＣＪ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、、＋２０：１２１（１９６４）］に準じて行うこ
とができる。マイクロタイタープレートに免疫に用いた
腫瘍細胞をアセトン固定し、培養上清中の抗体と反応、
蛍光ｔＩＡｖａ抗マウスＴｇＧ抗体を反応させ、蛍光を
測定して蛍光を発する細胞株を選択する。活性を認めた
融合細胞株は、限界希釈法等により複数回のクローニン
グを行いクローンを確立する。 限界希釈法としては、
例えば免疫実験操作法ＩＸ［１９８０年、日本免疫学会
発行２９６３ページ］に記載されている方法による。す
なわち、融合細胞が３個／麿１くらいになるように通常
培地で希釈し、９６シｅｌｆの培養プレートに０．２ｍ
ｌ／Ｗａｌｌとなるように分注する。その際に、フィー
ダーレイヤー（ｆｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ）として同系
マウスの胸腺細胞を２Ｘ１０’個／Ｗｅｌｌとなるよう
に加えておく、ときどき培地交換を行いながら、クロー
ンを増殖させる。
ング Ｗｅｌｌ中でコロニー状に成した融合細胞の培Ｉｔα中
の抗体を蛍光、酵素あるいはラジオアイソトープで標識
した第二抗体と反応させ、標識物の活性を測定すること
により、特異抗体産生性融合細胞株を選択する。この方
法としては、例えばＰｏｐｅらの方法ＣＪ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、、＋２０：１２１（１９６４）］に準じて行うこ
とができる。マイクロタイタープレートに免疫に用いた
腫瘍細胞をアセトン固定し、培養上清中の抗体と反応、
蛍光ｔＩＡｖａ抗マウスＴｇＧ抗体を反応させ、蛍光を
測定して蛍光を発する細胞株を選択する。活性を認めた
融合細胞株は、限界希釈法等により複数回のクローニン
グを行いクローンを確立する。 限界希釈法としては、
例えば免疫実験操作法ＩＸ［１９８０年、日本免疫学会
発行２９６３ページ］に記載されている方法による。す
なわち、融合細胞が３個／麿１くらいになるように通常
培地で希釈し、９６シｅｌｆの培養プレートに０．２ｍ
ｌ／Ｗａｌｌとなるように分注する。その際に、フィー
ダーレイヤー（ｆｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ）として同系
マウスの胸腺細胞を２Ｘ１０’個／Ｗｅｌｌとなるよう
に加えておく、ときどき培地交換を行いながら、クロー
ンを増殖させる。
（１）抗体の製造
クローンのつくるモノクローナル抗体は一般に抗体価が
高く、クローン化した融合細胞を培養し、細胞培養液の
上清を分ｍ＃１ａｔ、て使用できる抗体が得られるが、
マウス好ましくはブリスタン処理（２，６，ＩＯ，１４
−テトラメチルペンタデカン）を投与し、２週間程度飼
育）マウスの腹腔にクローンを注入して生じる腹水、又
は血清中に存在する抗体を使用する方法が、得られる抗
体量も多く有用である。ｒＡえば、Ｃｅｄｕｒａｌらの
方法（Ｊ、１ｓｓｕｎｏ１．。
高く、クローン化した融合細胞を培養し、細胞培養液の
上清を分ｍ＃１ａｔ、て使用できる抗体が得られるが、
マウス好ましくはブリスタン処理（２，６，ＩＯ，１４
−テトラメチルペンタデカン）を投与し、２週間程度飼
育）マウスの腹腔にクローンを注入して生じる腹水、又
は血清中に存在する抗体を使用する方法が、得られる抗
体量も多く有用である。ｒＡえば、Ｃｅｄｕｒａｌらの
方法（Ｊ、１ｓｓｕｎｏ１．。
１１８：１９５１（＋９７７）］に準じて実施できる。
これらの抗体はざらに塩析、イオン交換ゲル濾過、アフ
イニティ力ラムクロマト等で精製して製する。
イニティ力ラムクロマト等で精製して製する。
（５）モノクローナル抗体が認識する抗原の解析方法
本発明による製造方法によって製造したモノクローナル
抗体が抗原（腫瘍細胞）の認識部位を決定する方法とし
て、抗原をシアリダーゼ、過沃素酸、トリプシン等の試
薬で処理した後、モノクローナル抗体と反応させ、これ
らの処理をしない場合と比較して、抗体の認識部位を解
析する。
抗体が抗原（腫瘍細胞）の認識部位を決定する方法とし
て、抗原をシアリダーゼ、過沃素酸、トリプシン等の試
薬で処理した後、モノクローナル抗体と反応させ、これ
らの処理をしない場合と比較して、抗体の認識部位を解
析する。
シアリダーゼ処理により抗原性が消失すればシアル酸が
、過沃素酸処理により抗原性が消失すれば糖鎖が、トリ
プシン処理により抗原性が消失すれば蛋白を認識する抗
体と決定できる。
、過沃素酸処理により抗原性が消失すれば糖鎖が、トリ
プシン処理により抗原性が消失すれば蛋白を認識する抗
体と決定できる。
［実施ｒ１４］
以下の実施例は本発明を更に詳細に説明する目的で示す
ものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
ものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１゜
子宮内膜癌腺癌細胞株であるｌｓｈｉｋａｗａ細胞［百
円ら１日本産科婦人科学会雑誌、 ３７：＋１０３（１
９８５）］を５Ｘ１０’個をＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩ
ＢＣＯ社製）培ＩＩ液で洗浄後、０．２ｍｌの同液に浮
遊させ、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊ
ｕｖａｎｔと共に、適齢８週の雄のＣＢＡ／Ｎマウス（
静岡実験動物共同組合より購入）皮下に投与、更に２週
間隔で腹腔内に２回の免疫を行った。３回目の免疫終了
後、３日目にこのマウスより無菌的に牌臓を摘出し、摘
出した膵臓は裁断しさらにメツシュを通してリンパ球懸
濁液を得た。マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ １−
Ａｇ４／ １株）は、融合の２日前より１０％牛脂児血
清（ＦＣＳ’）を含むＲＰＭＩ−１６４ＯｔＳ ａ液中
５％Ｃｏ２．３７℃の条件で増殖させた。
円ら１日本産科婦人科学会雑誌、 ３７：＋１０３（１
９８５）］を５Ｘ１０’個をＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩ
ＢＣＯ社製）培ＩＩ液で洗浄後、０．２ｍｌの同液に浮
遊させ、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊ
ｕｖａｎｔと共に、適齢８週の雄のＣＢＡ／Ｎマウス（
静岡実験動物共同組合より購入）皮下に投与、更に２週
間隔で腹腔内に２回の免疫を行った。３回目の免疫終了
後、３日目にこのマウスより無菌的に牌臓を摘出し、摘
出した膵臓は裁断しさらにメツシュを通してリンパ球懸
濁液を得た。マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ １−
Ａｇ４／ １株）は、融合の２日前より１０％牛脂児血
清（ＦＣＳ’）を含むＲＰＭＩ−１６４ＯｔＳ ａ液中
５％Ｃｏ２．３７℃の条件で増殖させた。
上記膵臓細胞Ｉ Ｘ １０８個とマウスミエローマ細胞
２Ｘ １０７個を含む培ｌＩ液を混合し、１５００ｒｐ
ｍで３０分遠心後、上清を捨て、５０％ポリエチレング
リコール１０００（和光純薬社ｉｔ）１ｍを１滴づつ滴
下しながらゆっくりと細胞をほぐした。１分後、ＦＣ５
含有ＲＰＭＩ−１６４０培養１１ｍ１ゆっくりと滴下し
ながら細胞を混合させ、同様の操作を繰返した。さらに
ＦＣ９を含むＲＰＭｌ−１６４０培ｉ液７１を３分閏か
けてゆつくりと遠心管を回転させながら加えた。この時
点で培養液をさらに加え１０”個の細胞が１０■！の培
養液に含むように調製し、この細胞懸濁液０．２■１づ
つを９６１Ｊｅｌｌのマイクロプレートに分注し、５％
ＣＯ２，３７℃で培１１シた。培ＩＩｒｆ！Ｉ始２日後
。
２Ｘ １０７個を含む培ｌＩ液を混合し、１５００ｒｐ
ｍで３０分遠心後、上清を捨て、５０％ポリエチレング
リコール１０００（和光純薬社ｉｔ）１ｍを１滴づつ滴
下しながらゆっくりと細胞をほぐした。１分後、ＦＣ５
含有ＲＰＭＩ−１６４０培養１１ｍ１ゆっくりと滴下し
ながら細胞を混合させ、同様の操作を繰返した。さらに
ＦＣ９を含むＲＰＭｌ−１６４０培ｉ液７１を３分閏か
けてゆつくりと遠心管を回転させながら加えた。この時
点で培養液をさらに加え１０”個の細胞が１０■！の培
養液に含むように調製し、この細胞懸濁液０．２■１づ
つを９６１Ｊｅｌｌのマイクロプレートに分注し、５％
ＣＯ２，３７℃で培１１シた。培ＩＩｒｆ！Ｉ始２日後
。
３日後、５８１．７日後、１１日後に培養上清０゜１ｍ
ｌを廃棄し、ヒボキサンチン、アミノプテリン。
ｌを廃棄し、ヒボキサンチン、アミノプテリン。
チミジンおよびＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４００，１
■１を加えた。増殖限界になったところで、Ｉｓｈｉｋ
ａｗａｌｌ胞に対する培養上清中の抗体活性を閉接蛍光
抗体法で検討した。コロニーを通常の培養器に移し替え
増殖させる。増殖限界に達した融合細胞は、予めｆｖｅ
ｌｌあたり５Ｘ１０’個のマウス胸腺細胞を播種してお
いた９６Ｗａｌｌのマイクロプレートに移し、更に培養
した。増殖限界にたした融合細胞は３個／ｍｌ＜らいに
なるように通常培地で希釈し、２４Ｗｅｌｌの培養プレ
ートに０．２ｍｌ／Ｗｅｌｌとなるように分注し、クロ
ーンをｌＸ１０７個になるまで増殖させた。モノクロー
ナル抗体産生クローン細胞を０．２１１リスタン処理し
たＣＢＡ／ＮマウスとＢＡＬＢ／Ｃマウスとの雑種第１
代のマウス腹腔内に注射し、２週問後に腹水を採取した
。採取した腹水を１５００ ｒｐ−で３０分間遠心分離
し上清を得た。上清に生理食塩水を加えて２倍量とし、
この希釈腹水に飽和硫安を徐々に加えて硫安４０％飽和
とし、室温で３０分静かに攪拌後５０００ ｒｐ■で３
０分間遠心分離して沈渣を得た。この沈渣をざらに３回
４０％飽和硫安溶液で洗浄しγ−グロブリン分画を得た
。このγ−グロブリン分画をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィー法にて精製抗体を回収した。
■１を加えた。増殖限界になったところで、Ｉｓｈｉｋ
ａｗａｌｌ胞に対する培養上清中の抗体活性を閉接蛍光
抗体法で検討した。コロニーを通常の培養器に移し替え
増殖させる。増殖限界に達した融合細胞は、予めｆｖｅ
ｌｌあたり５Ｘ１０’個のマウス胸腺細胞を播種してお
いた９６Ｗａｌｌのマイクロプレートに移し、更に培養
した。増殖限界にたした融合細胞は３個／ｍｌ＜らいに
なるように通常培地で希釈し、２４Ｗｅｌｌの培養プレ
ートに０．２ｍｌ／Ｗｅｌｌとなるように分注し、クロ
ーンをｌＸ１０７個になるまで増殖させた。モノクロー
ナル抗体産生クローン細胞を０．２１１リスタン処理し
たＣＢＡ／ＮマウスとＢＡＬＢ／Ｃマウスとの雑種第１
代のマウス腹腔内に注射し、２週問後に腹水を採取した
。採取した腹水を１５００ ｒｐ−で３０分間遠心分離
し上清を得た。上清に生理食塩水を加えて２倍量とし、
この希釈腹水に飽和硫安を徐々に加えて硫安４０％飽和
とし、室温で３０分静かに攪拌後５０００ ｒｐ■で３
０分間遠心分離して沈渣を得た。この沈渣をざらに３回
４０％飽和硫安溶液で洗浄しγ−グロブリン分画を得た
。このγ−グロブリン分画をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィー法にて精製抗体を回収した。
上記操作により、ハイブリドーマｌｌ−１を樹立し、そ
の抗体をＴｌ−１と命名した。この抗体はＩｇＧ２ｍの
サブクラスに属していた。
の抗体をＴｌ−１と命名した。この抗体はＩｇＧ２ｍの
サブクラスに属していた。
実施例２゜
実施例１．と同様な操作をｌ０Ｃ−２１，＊胞。
０ＶＡ−１細胞で実施し、得られた抗体が認識する抗原
を解析するためにｌｓｈｉｋａｗａｍ胞、ＨＯＣ−２１
纏胞、０ＶＡ−１細胞の成分をシアリダーゼ、過沃素酸
、トリプシンおよびミックストグリコシダーゼで処理し
た後、抗体の反応性を調べた。
を解析するためにｌｓｈｉｋａｗａｍ胞、ＨＯＣ−２１
纏胞、０ＶＡ−１細胞の成分をシアリダーゼ、過沃素酸
、トリプシンおよびミックストグリコシダーゼで処理し
た後、抗体の反応性を調べた。
（試薬）
シアリダーゼ （シグマ社ＩＩ）
１０ Ｕ／ｓｌ、 ５０■阿酢酸緩衝液中過沃素酸
（和光純薬社ＩＩ） １０ｇ＋Ｍ、２５膳阿酢酸ナトリウム液中トリプシン
（シグマ社！り ５０μ８／■１，５０■門トリス塩酸ｍ衝液中ミックス
トグリコシダーゼ （生化学工業）５０μ８７■１．５
０ｍＭクエン酸緩！酸液中１０６個／１のｌｓｈｉｋａ
ｗａ細胞またはＩ ＯＣ−２１纏胞（または○ＶＡ−１
纏胞）の成分を１０μｍ／Ｗｅｌｌづつ、マイクロプレ
ートに入れ０．５％グルタルアルデヒド１００μｍを；
ｎ加し室温で７分間静置する。ＰＢＳで３回洗浄後０．
３％過酸化水素メタノール溶液１００μｍを加え３０分
閘室温で静置する。ＰＢＳで３回洗浄後、上記試薬を５
０μＩ／讐ｅｌｆづつ分注し−、３７℃で１時間反応さ
せた０反発後Ｔ Ｂ Ｓ （Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２０
、 Ｂ ＳＡ、ＰＢＳ）で３回洗；↑後、パーオキシ
ダーゼ標識抗−マウスＩｇＣを５０μｍ／讐ｅ１１加え
室温で１時間反応させた。ＴＢＳで３回洗浄後オルトフ
ェニレンジアミン基質１００μｍを加え３０分間反応後
、ＩＮ硫酸ｌＯＯμｍを加え反応を停止し、４９２ｎ−
における吸光度を測定した。
（和光純薬社ＩＩ） １０ｇ＋Ｍ、２５膳阿酢酸ナトリウム液中トリプシン
（シグマ社！り ５０μ８／■１，５０■門トリス塩酸ｍ衝液中ミックス
トグリコシダーゼ （生化学工業）５０μ８７■１．５
０ｍＭクエン酸緩！酸液中１０６個／１のｌｓｈｉｋａ
ｗａ細胞またはＩ ＯＣ−２１纏胞（または○ＶＡ−１
纏胞）の成分を１０μｍ／Ｗｅｌｌづつ、マイクロプレ
ートに入れ０．５％グルタルアルデヒド１００μｍを；
ｎ加し室温で７分間静置する。ＰＢＳで３回洗浄後０．
３％過酸化水素メタノール溶液１００μｍを加え３０分
閘室温で静置する。ＰＢＳで３回洗浄後、上記試薬を５
０μＩ／讐ｅｌｆづつ分注し−、３７℃で１時間反応さ
せた０反発後Ｔ Ｂ Ｓ （Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２０
、 Ｂ ＳＡ、ＰＢＳ）で３回洗；↑後、パーオキシ
ダーゼ標識抗−マウスＩｇＣを５０μｍ／讐ｅ１１加え
室温で１時間反応させた。ＴＢＳで３回洗浄後オルトフ
ェニレンジアミン基質１００μｍを加え３０分間反応後
、ＩＮ硫酸ｌＯＯμｍを加え反応を停止し、４９２ｎ−
における吸光度を測定した。
Ｉｓｈｉｋａｗａ纏胞、ＨＯＣ−２１細胞および０ＶＡ
−１細胞とも過沃素酸、ミックストグリコシダーゼで反
応性の増強が起こり、シアリダーゼでは変化なし、トリ
プシンでは反応性が消失したので、得られた３槌類の抗
体が認識する抗原の認識部位は蛋白抗原であることが確
認された。
−１細胞とも過沃素酸、ミックストグリコシダーゼで反
応性の増強が起こり、シアリダーゼでは変化なし、トリ
プシンでは反応性が消失したので、得られた３槌類の抗
体が認識する抗原の認識部位は蛋白抗原であることが確
認された。
実施例３゜
実施例で得た抗体の各種組織、癌細胞株との反応性より
特異性を調べた。
特異性を調べた。
方法はアビジン−ビオチン免疫ｍｍ染色法を用いたくフ
ナコシ薬品社製試薬）。
ナコシ薬品社製試薬）。
表１は正常各組織２表２は各種癌に対するｌｌ−１抗体
の反応性を示す。
の反応性を示す。
！！−１抗体は正常腺上皮に特異的に反応し、それ以外
の正常＆ｌＩ織成分成分反応しながフた（表１）。
の正常＆ｌＩ織成分成分反応しながフた（表１）。
癌細胞に対する反応性は腺癌細胞株においてのみ反応し
、扁平上皮癌細胞株で反応するものはなかった（表２）
。
、扁平上皮癌細胞株で反応するものはなかった（表２）
。
表１．正常各組織に対するＩ Ｉ−１抗体の反応性（免
疫組織染色法）表２．各種癌組織に対するｌｌ−１抗体
の反応性（免疫組織染色法）実施例４゜ 当該実施例で得たＴｌ−１抗体が認識する抗原蛋白の解
析を二次元０’Ｆａｒｒｅｌ法によるイムノブロッティ
ング法および５ＯＳ−ＰＡＧＥによる一次元イムノブロ
ツティング法によって行った（図１゜２）、方法はいず
れも免疫実験法【右田浚介ら監訳、西村書店、ｐ１９〜
６４］に準じて実施した。
疫組織染色法）表２．各種癌組織に対するｌｌ−１抗体
の反応性（免疫組織染色法）実施例４゜ 当該実施例で得たＴｌ−１抗体が認識する抗原蛋白の解
析を二次元０’Ｆａｒｒｅｌ法によるイムノブロッティ
ング法および５ＯＳ−ＰＡＧＥによる一次元イムノブロ
ツティング法によって行った（図１゜２）、方法はいず
れも免疫実験法【右田浚介ら監訳、西村書店、ｐ１９〜
６４］に準じて実施した。
１１−１抗体が認識する抗原蛋白は、分子量６万２００
０に中心をもつ、１０本程度のバンドを形成する等電点
６〜６．２の蛋白であり、これは従来の糖鎖に対する抗
体が高分子分画に均等に広く広がる分子を認識するとの
報告［Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ、。
０に中心をもつ、１０本程度のバンドを形成する等電点
６〜６．２の蛋白であり、これは従来の糖鎖に対する抗
体が高分子分画に均等に広く広がる分子を認識するとの
報告［Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ、。
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、４７：３５４３（＋９８７）
］と明らかに異なるものであった。
］と明らかに異なるものであった。
【図面の簡単な説明】
図１ａは、ｌ０Ｃ−２１の膜抽出物の二次元電気泳動蛋
白銀染色の結果を示し、 図１ｂは、ＨＯＣ−２１の膜抽出物の二次元電気泳動を
ニトロセルロースメンブランにトランスプロットし、！
■−１抗体で免疫染色した結果を示し、 図２は、各種処理による抗原の変化、−次元電気泳動イ
ムノブロッティング法の結果を示す。 図１ｂにおいて、（１）〜（６）はそれぞれ、１３０に
ホスホリラーゼ Ｂ。 ７５Ｋ 牛血清アルブミン。 ５０Ｋ 卵アルブミン。 ３９Ｋ 炭酸脱水素酵素。 ２７Ｋ 大豆トリプシンインヒビター１７Ｋ リゾチ
ームを示し、 図２において、 ａｎｅ １は、Ｉｓｈｉｋａｗａ！ｌ胞膜抽出物。 Ｉａｎｅ２は、ＨＯＣ−２１１胞膜抽出物を。 １ａｎｅ３〜Ｉａｎｅ９はそれぞれｌ０Ｃ−２１！ｌ胞
膜抽出物の ミックストグリコシダーゼ処理物。 シアリダーゼ処理物。 トリプシン処理物（１時間）。 トリプシン処理物（１６時間） プロナーゼ処理物（１時間） プロナーゼ処理物（ １６６時間 過沃素酸処理物 く ６時間） を示す。 ↓・ 榮Ｎ 勧 む 煩 払 外。 ヘ ベ 鎚 回１ 戊 圀 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第２６０６１９号 ２発明の名称 ３補正をする者 事件との関係
白銀染色の結果を示し、 図１ｂは、ＨＯＣ−２１の膜抽出物の二次元電気泳動を
ニトロセルロースメンブランにトランスプロットし、！
■−１抗体で免疫染色した結果を示し、 図２は、各種処理による抗原の変化、−次元電気泳動イ
ムノブロッティング法の結果を示す。 図１ｂにおいて、（１）〜（６）はそれぞれ、１３０に
ホスホリラーゼ Ｂ。 ７５Ｋ 牛血清アルブミン。 ５０Ｋ 卵アルブミン。 ３９Ｋ 炭酸脱水素酵素。 ２７Ｋ 大豆トリプシンインヒビター１７Ｋ リゾチ
ームを示し、 図２において、 ａｎｅ １は、Ｉｓｈｉｋａｗａ！ｌ胞膜抽出物。 Ｉａｎｅ２は、ＨＯＣ−２１１胞膜抽出物を。 １ａｎｅ３〜Ｉａｎｅ９はそれぞれｌ０Ｃ−２１！ｌ胞
膜抽出物の ミックストグリコシダーゼ処理物。 シアリダーゼ処理物。 トリプシン処理物（１時間）。 トリプシン処理物（１６時間） プロナーゼ処理物（１時間） プロナーゼ処理物（ １６６時間 過沃素酸処理物 く ６時間） を示す。 ↓・ 榮Ｎ 勧 む 煩 払 外。 ヘ ベ 鎚 回１ 戊 圀 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第２６０６１９号 ２発明の名称 ３補正をする者 事件との関係
Claims (5)
- （１）ａ）糖鎖抗原に対して免疫不全を有する先天的免
疫不全マウスをヒト細胞またはヒト細胞膜で免疫する工
程； ｂ）該被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスの抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを融合させる工程；ｃ）該ヒト細胞膜蛋
白に特異的に反応する抗体を産生する融合細胞株を選択
する工程； ｄ）該選択融合細胞株をクローン化する工程；ｅ）該ク
ローン化融合細胞株を培養し、培養液中より抗体を分取
する工程； よりなることを特徴とするヒト細胞膜上の蛋白に特異的
に反応する抗体を作成する方法。 - （２）被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスが雄のＣＢＡ／
Ｎマウスであることを特徴とする請求項１に記載の方法
。 - （３）該ヒト細胞膜蛋白に特異的に反応する抗体を産生
するクローンを、培地中に培養するかマウスに投与して
該マウスで腹水化し、該培養物または腹水より分取する
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - （４）免疫するヒト細胞が腫瘍細胞である請求項１に記
載の方法。 - （５）免疫するヒト腫瘍細胞が子宮内膜癌、卵巣癌、大
腸癌、肝癌、膵癌、胆管癌、胃癌、乳癌および肺癌から
なる群から選択される請求項４に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26061988A JPH02109993A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26061988A JPH02109993A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02109993A true JPH02109993A (ja) | 1990-04-23 |
Family
ID=17350442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26061988A Pending JPH02109993A (ja) | 1988-10-18 | 1988-10-18 | ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02109993A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998033817A1 (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human membrane protein |
-
1988
- 1988-10-18 JP JP26061988A patent/JPH02109993A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J EXP MED V160N2=1984 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998033817A1 (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human membrane protein |
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