JPH06501469A - サイトケラチン断片の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サイトケラチン断片の精製 本発明は、上皮起源の腫瘍細胞の腫瘍マーカー、さらに詳しくはサイトケラチン ＣｃｙｔｏｋｅｒａＮｎｓ＞に関する。本発明において細胞株抗原／免疫原の再 現性のある産生方法が与えられる。

患者が手術不可能な腫瘍または転移に移行する前に、腫瘍を初期に検出し診断て きることに対する大きなニーズか存在する。さらに局所的治療または手術の前に 腫瘍を局所的に食い止めることができることは好ましい。

局所的腫瘍治療の例では、公知の方法によりサイトトキシン（ｃｙｔｏｔｏｘｉ ｎ）または放射性アイソトープに結合した抗体で腫瘍か死滅させられる。腫瘍を 標的とするこれらの物質は腫瘍細胞を死滅させるカが強（、また腫瘍てのサイト ド牛シン濃度か高く、従って通常の細胞増殖抑制性の治療の副作用を軽減する。

免疫組織学的および免疫細胞学的試験から、ある種の腫瘍（すなわち上皮起源の 腫瘍組織）は、異なる種類のサイトケラチンの形で腫瘍マーカーを含有すること が知られている。１９個の異なるサイトケラチンか性状解析されており、すへて 蛋白でてきている。これらのサイトケラチンは、細胞内でいわゆる中間体繊維を 形成する。

サイトケラチン対の８と１８は単純な上皮細胞中にしばしば見られる。

本発明は、腫瘍組織内で不溶性の細胞内サイトケラチンが放出され、断片化され ることにより、多くのサイトケラチン断片が可溶性となるという発見に基づく。

可溶性サイトケラチン断片は、回りの体液（例えば血液、尿、腹水および真水） に漏れ出る。

米国特許４７７４６２０ては、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の組織培養培地中に放出され るサイトケラチン断片か、モノクローナル抗体を産生させるのに使用される。し かし実際の腫瘍マーカーが正確にわかっていないため、この方法は再現性かなく 特異性が低い。また特定されていない細胞物質が検査の標準物質として用いられ ているため、この試験は定量性と特異性において信頼性か低い。

ヨーロッパ特許出願公開公報（ＡＩ）３３７０５７ではサイトケラチンかクロマ トグラフィーで精製され、酵素で消化されて「そのアルファらせん中心部分」が 得られ、これが次にクロマトグラフィーで精製されて、免疫試験およびモノクロ ーナル抗体産生の抗原として使用される。ここでは抗原／免疫原は再現性のある 方法で得られる。これらの公知の方法は体液中のサイトケラチン断片を検出し、 腫瘍か属する細胞カテゴリー／型を性状解析するのに充分である。しかしヨーロ ッパ特許出願公開公報（ＡＩ）３３７０５７て得られるモノクローナル抗体は、 試験すべき試料をまず可溶化する必要かある。

従ってインビボで腫瘍を検出して局在化し、モノクローナル抗体療法で腫瘍を治 療することに対するニーズがいまだに存在する。また腫瘍か進行性であるか否か 、または治療を評価するためにモノクローナル抗体療法を続けるか否かを決める ために、先行技術よりも簡便で高感度な検査に対するニーズか存在する。本発明 はこのようなニーズを満たすものである。

本発明により産生されるサイトケラチン断片は、動物に注射された時先行技術よ りも強い免疫応答を引き起こす。本発明はまた、特異性を維持しているいくつか の異なるサイズのサイトケラチン断片により、さらに適切な反応を与える。

以下に非限定的な方法で本発明を記載する。使用した略語は本文の後に記載され ている。

サイトケラチン（ＣＹＫ）８．１８および１９の産生真水からのヒトの乳ガンの 腺癌細胞株である、腫瘍細胞株ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ，ｎｏ、ＨＴＢ２２）を、 公知の方法で調製した（ゲイスラー、ウェーバ−（Ｇｅｉｓｌｅｒ　Ｎ、、Ｗｅ ｂｅｒ　Ｋ、＞　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１　１　］巻、４２５−４ ３３頁、１９８０年）。上皮起源の他の腫瘍細胞株も使用することかできる（例 えば、ＤＵＩ４５　（ＡＴＣＣ，ｎｏ、ＨＴＢ８１）　、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ５ ｎｏ、ＣＣＬ２）など）。

この物質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで精製され、サイトケラチン８．１８および１９の 分子量は分子量標準物質に対してそれぞれ５３．４５および４１Ｋｄてあった。

これらのサイトケラチンについてこのパターンはすてに報告されている（モル、 フラツグ、シラー（Ｍａｉｌ　Ｒ，、ＦｒａｎｋｅＷＷ、、　５ｃｈｉｌｌｅｒ 　ＤＬ、）ら、Ｃｅ１ｌ、３１巻、１１−２４頁、１９８２年）。

サイトケラチン８．１８および１９に対応するバントかゲルから切断され、従来 技術により０，１％ＳＤＳ、ＰＢＳ　ｐＨ７，５で抽出された。この試料を分析 ５ＤＳ−Ｐ　Ａ、　Ｇ　Ｅにかけて純度を証明した：結果はサイトケラチン８． １８および１９のそれぞれについて、最初の物質の３つのバンドと同じ移動度を 示す単一のバンドてあった。これはサイトケラチン８．１８および１９か精製さ れ、そのサイズか維持されていることを示している。

精製されたサイトケラチン８．１８および１９の断片化本発明においては、サイ トケラチン断片の分子量が約ＩＯから約５０Ｋｄの範囲で再現性のあるパターン か得られるのであれば、サイトケラチンの断片化は酵素的にまたは化学的に行っ てもよい（例えばキモトリプシン、ｖ８プロテアーゼ、ベブンン、ＴＰＣＫトリ プシン、ＢｒＣＮ、部分的加水分解、ＢＮＦＳサクトールα （Ｓテｋｔｏｌｅ）なと）。本発明においては、使用した精製法のため断片か凝 集せずモノマー型で維持される。凝集物はエピトープをマスクしてしまうため、 断片か抗体産生に使用される場合、これは重要である。

本発明の好適な実施態様において、精製されたサイトケラチン８．１８およびＩ ９はそれぞれ調節可能な方法で、キモトリプシンとサイトケラチンの重量比約１ ＝５０−１：１０００でキモトリプシンにより断片化されるが、好適な重量比は １　：　４００　（ＣＹＫ８）、１・１０ｏ　（ＣＹＫＩ　８）および１　：　 ７５　（ＣＹＫＩ　９）である。

酵素の活性は蛋白１ｍｇ当り４０−６０単位である。サイトケラチンの濃度は０ ．２ｍｇ／ｍｌである。サイトケラチン溶液と酵素溶液はそれぞれ、別々に３７ °Ｃの水浴中て５分ブレインキュベートされる。次に酵素溶液がサイトケラチン 溶液に加えられ、混合物は３７°Ｃの水浴中でさらに５分インキュベートされる 。２０％のＳＤＳを少量加え、９５°Ｃの湯浴中で最後に５分インキュベートし て消化を停止させる。最終のＳＤＳ濃度は２％になるであろう。

消化後断片の最適な精製が行われる。断片を調製５ＤＳ−ＰＡＧＥで精製し、電 気泳動の後ゲルのストリップをゲルから切取り、クマノーブルー（Ｃｏｏｍａｓ ｓｉｅＢｌｕｅ）溶液中で短時間染色する。脱色の後異なる断片の位置を決め、 残りのケルのこれらの部分をゲルから切取り、リン酸緩衝液、ｐＨ７，５中の０ ．１％ＳＤＳで抽出される。分析５ＤＳ−ＰＡＧＥを繰り返すことにより純度が 確認される。

１０−５０Ｋｄの範囲のサイズの断片は上記のように精製される。また断片のこ の最適な５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、特異的断片か選択される。この考えられる応 用は、わずか１つまたは数個のサイトケラチン断片で哺乳動物を免疫することで ある。これらを注射した動物からの特に反応性の抗体の配列を決定する。この配 列に基づき、合成ヌクレオチド配列が作成され、これはベクター（例えばプラス ミツド）に挿入されて、目的の断片の大規模な産生のために例えば細菌中でクロ ーン化される。

断片化サイトケラチン８．１８および■９に対するモノクローナル抗体の産生 ＣＹＫ８．１８および１９からの１Ｏ−５０Ｋｄのサイズのサイトケラチン断片 は、ＰＢ中の０．１％ＳＤＳに対して透析され、次に標準的方法（ＦＣＡのマウ ス１匹当り１０μｇの断片（ｓ、ｃ、）、ＦＩＡのマウス１匹当り１０μｇ、次 にＦＩＡ中のマウス１匹当り１μｇで２回で、これらはすへて１週間の間隔て行 われる）に従いＢａ１ｂ／ｃマウス中て免疫される。融合までの日にマウスに３ 回追加免疫をする。

最後の追加免疫の７２時間後、マウスの膵臓のリンパ球を集め、１１の比率てＳ 　ｐ　２　／　Ｏミエローマ細胞で融合する。もちろん他のマウス種やミエロー マ細胞を使用することも可能である。ハイブリドーマ細胞を増殖させ、公知の方 法により希゛釈法を用いて２回クローン化した。顕微鏡下にマイクロタイターブ レー１〜を調へて、１ウェル当り細胞１つにした、ハイブリトーマ細胞を増殖さ せ、安定化し確立した。以下の特異性と反応性を存するモノクローナル抗体を産 生ずる１５個のクローンのすへてを確立した。

得られたモノクローナル抗体の特異性と反応性の試験Ａ、全サイトケラチン８． １８および１９を抗原として用いてＥＬＩＳＡ試験 ｐＨ９，０で吸着によりマイクロタイタープレートに結合した、精製したサイト ケラチン８．１８および１９に対する得られたモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ で試験する時、あるモノクローナル抗体は１つ、２つまたは３つのサイトケラチ ンに対して特異性を存するよってあるか、反応性は異なる。

モノクローナル抗体の濃度１０ｎｇ／ｍｌで上記１５個の得られたクローンを試 験した結果は図１と２に示してあり、反応性はＹ軸上で吸光度（４９０ｎｍ）で 表しである。図１はサイトケラチン８（左の捧）、および１８（右の棒）に対す る、ＥＬＴＳＡでの１５個の異なるモノクローナル抗体の特異性と反応性を示す 棒グラフである。

プレートに結合した抗原（すなわちサイトケラチン８．１８および＋９）の濃度 はそれぞれ０．３μｇ／ｍ１であった。モノクローナル抗体との最初のインキュ ベートは室温でわずか１時間であった。従って反応性の最も高いモノクローナル 抗体のみが選択された。２次抗体はＨＲＰに結合した抗マウスＩｇＧ抗体（すな わちダコパッツコード（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　Ｃｏｃｌｅ）Ｐ２６０）　（１： 　ｌ　０００希釈）であり、室温でさらに２時間インキュベートし、基質０−フ ェニレンジアミンを加えた後、通常のＥＬＩＳＡ法により４９０ｎｍでの吸光度 を読んだ。図１から明らかなように、８個のクローンはサイトケラチン８に対し て最も強い反応性を有していたが、他の７つはサイトケラチン１８に対して強い 反応性を有していた。

図２の俸グラフはＥＬＩＳＡ（前述）でのサイトケラチン１９に対して５個のモ ノクローナル抗体の特異性と反応性を示す。５個のクローンはサイトケラチン１ ９に対して反応性であると考えられた。

図から明らかなように、異なるサイトケラチンの間に交差反応性かあり、これは おそらくサイトケラチン８．１８および１９間に存在する大きなアミノ酸の相同 性によるものであろう（リューベ、ボッシュ、ロマノ（ＬｅｕｂｅＲＥ、、Ｂｏ ｓｃｈ　ＦＸ、、Ｒｏｍａｎｏ　Ｖ、）　ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｊｏｎ 　。

３３巻、６９−８５頁、１９８６年；ロマノ、ハッツフエルト、マギン（Ｒｏｍ ａｎｏ　Ｖ、、　Ｈａｔｚｆｅｌｄ　Ｍ、、　Ｍａｇｉｎ　ＴＭ、）ら、Ｄｉｆ ｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、　３０巻、２４４−２５３頁、１９８６年：ハデル 、マギン、ハッッフエルト、フランテ（Ｂａｄｅｒ　ＢＬ、、　Ｍａｇｉｎ　Ｔ Ｍ、、　Ｈａｔｚｆｅｌｄ　Ｍ、、　Ｆｒａｎｋｅ　ＷＷ、）、ＥｌｉｔＢＯＪ 、　、５巻、＋８６５−１８７５頁、１９８６年）。

Ｂ、断片化サイトケラチン８．１８および１９を抗原として用いるウェスタンプ ロット サイトケラチン断片のウェスタンプロットを以下のようにして行った。すなわち 上記のように酵素消化したサイトケラチンをＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅにか け、次に公知の方法によりニトロセルロースフィルターにプロットした。

こうして各サイトケラチンからのサイトケラチン断片の大多数がモノクローナル 抗体により同定された。

図３は、本発明の方法によりキモトリプシンで断片化された精製されたサイトケ ラチン８の５ＤＳ−ＰＡＧＥの後のニトロセルロースフィルター上のウェスタン プロットを示す。ニトロセルロースの各ストリップは、上記のように産生された 異なるモノクローナル抗体と反応させた。次に２次抗体（ＨＲＰと結合したウサ ギ抗マウスＩｇＧ）を加え、モノクローナル抗体の反応を、公知の方法に従い基 質ＤＡＢ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　Ｄ　−５９０５）で可視化した。この結果 はいくつかのモノクローナル抗体は、サイズ範囲が約１０−５０Ｋｄのいくつか のサイトケラチン８断片と反応することを示している。

図４は、キモトリプシンて断片化した精製サイトケラチン１８の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ後のニトロセルロース上のウェスタンプロットを示す。ニトロセルロースの各 ストリップは、上記のように産生された異なるモノクローナル抗体と反応させた 。次に２次抗体（ＨＲＰに結合したウサギ抗マウスＩｇＧ）加え、モノクローナ ル抗体の反応を、公知の方法に従い基質ＤＡＢ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　Ｄ− ５９０５）で可視化した。この結果はいくつかのモノクローナル抗体は、サイズ 範囲が約１０−４４Ｋｄのいくつかのサイトケラチン１８断片と反応することを 示している。

図５は、キモトリプシンで断片化した精製サイトケラｆン１９（７）ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ後のニトロセルロース上のウェスタンプロットを示す。ニトロセルロース の各ストリップは、上記のように産生された異なるモノクローナル抗体と反応さ せた。次に２次抗体（ＨＲＰに結合したウサギ抗マウスＩｇＧ）を加え、モノク ローナル抗体の反応を、公知の方法に従い基質ＤＡＢ　（シグマ（Ｓｉｇｍａ） Ｄ−５９０５）で可視化した。この結果をいくつがのモノクローナル抗体は、サ イズ範囲が約１Ｏ−３８Ｋｄのいくつかのサイトケラチン１９断片と反応するこ とを示している。

すべてをまとめるとこれらのモノクローナル抗体は、７クローンについてはサイ トケラチン８からの大多数の断片に、７クローンについてはサイトケラチン１８ からの大多数の断片に、そして５クローンについてサイトケラチン１９からの大 多数の断片に対して良好な反応性と特異性を示す。これは全サイトケラチンに対 する１５個のクローンの特異性と一致する（図１−２を参照）。

抗体の上記試験および抗体は他のヒト蛋白と反応しないという試験により、モノ クローナル抗体は選択される。

本発明のモノクローナ／［、抗体か固相（プラスチックチューブ）に結合してお り、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体はヨード−１２５またはＨＲ Ｐて標識されているＩＲＭＡまたはＥＬＩＳＡて、見かけ１健常人（血液ドナー ）の血清と腫瘍患者の血清を試験した。

標準物質として、緩衝液中の本発明の可溶性サイトケラチン断片とヒト血清を使 用した。異なる群のレベルはサイトケラチン断片の異なる量（ｎｇ／ｍｌ）を明 確に示した。

図６の結果は、見かけ１健常人の血清は、試験では応答性か低く、広がりも小さ かった。この集団の大多数（９５％）は０．９ｎｇ／ｍ１以下に入る。腫瘍患者 の大多数（５４％）の血清は、有意に高値てあった。

上記の結果は、本発明は前処理をすることなく腫瘍患者の腫瘍から分散した血清 中のサイトケラチンを、本出願で記載された抗体と試薬を用いて検出できること を示している。本発明の抗体は、ヒトの体液中の上記のサイトケラチンからの最 も代表的な断片と反応することができる。

さらに本発明の抗体は、インタクトの細胞や組織試料と反応することができる。

図７は、メタノールで固定し、次に本発明のモノクローナル抗体の１つ（Ｍｌ） でインキュベートし、そしてＦ　ＩＴＣ結合結合２休抗インキュベートした、培 養した腫瘍ｍ胞（ＭＣＦ−７）を示す。

紫外線顕微鏡で光を当てると、細胞のいくつかで細胞内に細胞骨格の典梨的パタ ーンが見られる。

さらに本発明の抗体は、面倒な前処理をせずに組織切片の免疫組織学、および例 えば子宮頚部の免疫細胞学試験を可能にする。図８は、大腸の腺癌の免疫組織切 片を示す。この切片は標準的方法で調製され、試料中のサイトケラチンは、ペル オキシダーゼ染色により現れる。単純な上皮と腫瘍細胞が示されている。

、図９は、ＤＵ１４５細胞を接種されたが、腫瘍を発症していないマウスを示す 。この実験の目的は、放射能標識モノクローナル抗体は、マウスで移植されたＤ Ｕ１４５腫瘍は局在化することかできることを示している。細胞株ＤＵＩ４５は サイトケラチン８と１８よりなることは照明されている（シャーウッド、バーブ 、メッチェル（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　Ｅ、　Ｒ１、Ｂｅｒｇ　Ｌ、　Ａ、、　Ｍｉ ｔｃｈｅｌｌ　Ｎ、　、１．　：Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｕｒｏｌｏｇ ｙ、１４３巻、１９９０．１６７−１７１頁）。

５ＤＳ−ＰＡＧＥのプロットで、試験した抗体は以下のサイトケラチンやその断 片に結合することは証明されホムフルツ（Ｂｏｍｈｕｌｔｓ）農場（チンマーク ）から得られた平均体重約２５ｇのＮＭＲＩ型の１２匹のマウスの皮下に、ｌ　 Ｏ％ＦＣ３を含むＲＰ〜１１１６４０中の１ｏ。

Ｏ方何のＤＵ＋４５細胞を接種した。ＤＵＩ　４１Ｈ胞はアカデミス力（Ａｋａ ｄｅｍｉｓｄａ）病院研究所（スエーデン、ウプサラ（ＵＰＰＳＡＬＡ）　）か ら得られた。

腫瘍細胞を１４日間増殖させ、次にマウスをランダムに３匹ずつの４群に分けた 。

従来法によりクロラミンＴを用いて、モノクローナル抗体や正常マウスＩｇＧ（ 対照として）を１２５■て標識した。

各群に以下の放射能標識抗体を、マウス１匹当り０．３ｍｌずつ与えた。

１　６Ｄ７　２，５　１２．６　５．０　４２２２ＤＩ　２．７　２２．５　８ ．５　７５３　３Ｆ３　０．７１　４．３　６．０　１４．２４ＸＸＸ　２．８ 　＋４．４　５．１　４８ＸＸＸ＝正常マウスＩｇＧ 抱水クロラールで約２０分間麻酔したマウスのシンチグラフィーを、３．５およ び９日後に行った。９日後にマウスを殺し、異なる臓器の重量と放射能を測定し た。

シンチグラムを評価して以下の結果を得た：１−２匹のマウスは別の理由により 死んだＸ＝行なわれなかった ｍ＝腫瘍の局在化は見られなかった ＋＝肺腫瘍弱い局在化 ＋＋＝腫瘍の局在化 千手＋＝腫瘍の著しい局在化 図１０は図９のマウスのシンチグラフィーを示し、腫瘍のインヒポでの局在化を 示す。

図１１はヒトの免疫シンチグラフィーを示す。抗体６Ｄ７は精製され、薬剤の要 求に対応する性質に調整される。次に放射性同位元素Ｊ１３１で標識される。さ らに精製した後、腫瘍か局在化していることかわかっている患者に注射される。

次に患者は、放射能を測定する装置中で測定され、色のスケールか放射能の量を 示す・明るい色は放射能が多いことを意味し、暗い色は放射能がないことを意味 する。注射の２４時間後（２４ＨＰｒ）、腫瘍が局在化しだすへての例で放射能 か増加しており、胸の上部に対応する像からほんのわずかのサイズの範囲がＩｃ ｍの小さな転移もこの放射標識抗体６Ｄ７て検出されることは明らかなようであ る。像の大きな明るい部分は、血液を含む心臓に対応する。２４時間後において も血液はいくらかの標識抗体を有する。放射性Ｊ１３１は抗体から離れ、尿中に 分泌され、抗体は身体により時間とともにアミノ酸に分解される。

本発明のモノクローナル抗体は、抗体が腫瘍内に局在化している時腫瘍細胞を死 滅させるために、サイトトキシンまたは放射性アイソトープに結合することによ りインビボでの腫瘍治療に使用することもできる。

本発明のＣＹＫ断片の応用 本発明のサイトケラチン断片は抗体の産生用に使用される以外にニ ーそれ自身または他の治療法と組合せて、腫瘍患者のワクチン接種用に、 一免疫化学的試験（例えばＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、Ｉ　ＲＭＡ、Ｌ　Ｉ　Ａ）の実 施のためのキットに使用することかできる。

本断片がワクチン、免疫学的試験の抗原／標準物質として使用されるなら、随時 上記の５ＤＳ−ＰＡＧＥが実施され、断片溶液を血清または、好ましくは（特に ワクチン）アルブミン溶液で希釈することにより、ＳＤＳの好ましくない影響を 避けることができる。蛋白の添加によっても断片の凝集が避けられ、不活性の蛋 白にエピトープ上で「分散Ｊ効果を与える。ワクチンとして断片の精製と使用は 、各国の申請方法の特別な純度の要求を満たさなければならないてあろう。

「サンドイッチ」測定法すなわち「２部位測定法」ては、サイトケラチン断片は 標準物質として使用され、標準物質および抗体は固相（例えばマイクロタイター プレート）に結合した補足抗体、または被分析物（すなわちサイトケラチン断片 ）を検出するための適当な方法で標識された微量抗体として使用される。「１部 位測定法」では、サイトケラチン断片は固相に結合され、抗体は目的の物質（す なわちサイトケラチン断片に対するヒト抗体）を検出するために使用される。

本発明の断片で行われる免疫学的試験の感度は図１２と図１３に示されている。

図１２は投与量一応答曲線と、標準物質として本発明の断片とマイクロタイター プレートにコーティングされたモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡ試験の 感度プロフィールを示す。感度（平均値＋２３Ｄとして計算）は０．１ｎｇ／ｍ ｌという低濃度てあり、これは非常に高感度であることを示している。

同様の優れた結果かＩＲＭＡ試験で得られており、これは図１３に示されている 。

これらの感度試験は、上皮腫瘍患者の体液中の増殖速度を調・＼、モノクローナ ル抗体療法の効果を評価するのに、大きな応用性かある。

略語 八ＴＣＣアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨンｃｐｍ：カウント７分 ＦＩＡ：フロイントの不完全アジュバントＦＣＡ：フロイントの完全アジュバン トＦＣ３胎児牛血清 ｒＲＭＡ　イムノランオメトリックアッセイＥＬ　Ｉ　ＳＡ　：酵素結合免疫吸 着測定法ＬＩＡ：ルミネセンス免疫測定法 Ｋｄ：キロダルトン ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキソダーゼ Ｆ　ＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネートＰＢＳ−ＥＤＴＡ　ニリン酸緩 衝化生理食塩水−エチレンジアミン四酢酸 ＲＩＡニラジオイムノアッセイ ＲＴ・室温 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ニドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動 ＦＩにＯＲＥ　１ ＦＩＧＬＩＲＥ　２ Ｆ’ＩにＵＲＥ　３ ＦＩにＩＪＥ　４ ＦＩＧＬＪＲＥ　５ ＦＩＧＵＲＥ　６ ＦＩＣＬＩＲＥ　９ ＦＩＧＵＲＥ　１１ ＦＩＧ；ＯＲＥ　１２ 田ＬＩ０６シ　″ｉＩ某金 ＦＩＧＵＲＥ　１３ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特軸組８４条）８）平成　５　年　３　月　２ ３　日−

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上皮腫瘍細胞からサイトケラチンを精製し、サ イトケラチン８、１８および１９に対応するバンドをゲルから溶出することを含 む、サイトケラチン抗原／免疫原の再現性のある産生法であって、サイトケラチ ンを消化して１０−５０Ｋｄのサイズ範囲の断片の混合物を産生することを特徴 とする、上記方法。
2. ２．消化は酵素的に行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. ３．消化は、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、ペプシンおよびＴＰＣＫトリ プシンよりなる群から選択される酵素により行われることを特徴とする、請求項 ２に記載の方法。
4. ４．サイトケラチンはキモトリプシン（４０−６０Ｕ／ｍｇ蛋白）で、酵素：サ イトケラチンの重量比が１：５０から１：１０００で酵素消化されることを特徴 とする、請求項３に記載の方法。
5. ５．酵素消化の酵素：サイトケラチンの重量比は、サイトケラチン８については １：４００、サイトケラチン１８については１：１０００、そしてサイトケラチ ン１９については１：７５であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. ６．消化は、ＢｒＣＮ、加水分解またはＢＮＰＳ−スカトールで、化学的に行わ れることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. ７．産生された断片は第２の調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥで精製され、選択された断片 はゲルから溶出されることを特徴とする、請求項１−６に記載の方法。
8. ８．調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上皮腫瘍細胞からサイトケラチンを精製し、サ イトケラチン８、１８および１９に対応するバンドをゲルから溶出し、サイトケ ラチンを消化して１０−５０Ｋｄのサイズ範囲の断片の混合物を産生することに よりサイトケラチン断片混合物は産生されることを特徴とする、サイトケラチン 断片混合物。
9. ９．動物をサイトケラチン断片を含む溶液で免疫し、動物から該断片に対する抗 体を回収することを含む、サイトケラチン断片に対する抗体を産生する方法であ って、調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上皮腫瘍細胞からサイトケラチンを精製し、 サイトケラチン８、１８および１９に対応するバンドをゲルから溶出し、サイト ケラチンを消化して１０−５０Ｋｄのサイズ範囲の断片の混合物を産生すること によりサイトケラチン断片を産生することを特徴とする、上記方法。
10. １０．マウスをサイトケラチン断片を含む溶液で免疫し、該マウスの脾臓からリ ンパ球を回収し、該リンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞 をクローン化し増殖させ、単一クローンを安定化し確立することを含む、サイト ケラチン断片に対するモノクローナル抗体の産生方法であって、調製ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより上皮腫瘍細胞からサイトケラチンを精製し、サイトケラチン８、１ ８および１９に対応するバンドをゲルから溶出し、サイトケラチンを消化して１ ０−５０Ｋｄのサイズ範囲の断片の混合物を産生することによりサイトケラチン 断片を産生することを特徴とする、上記方法。
11. １１．体液中の上皮起源の腫瘍を検出する免疫化学的試験キットであって、請求 項８の方法により産生されるサイトケラチン断片の混合物と、請求項１０の方法 により産生される断片に対するモノクローナル抗体とを含むことを特徴とする、 上記キット。
12. １２．上皮腫瘍の治療用の薬剤の調製のためのサイトケラチンまたは放射性同位 元素に結合した、請求項１０により産生されるモノクローナル抗体の使用。
13. １３．免疫組織学または免疫細胞学用の検出可能な標識物に結合した、請求項１ ０の方法により産生されるモノクローナル抗体の使用。