JPH02111748A - グルタミン酸の新誘導体、それらの塩、それらの薬剤としての使用及びそれらを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、グルタミン酸の新誘導体、それらの塩それら
の薬剤としての使用及びそれらを含む組成物に関する。

［発明の背景］ １９８８年２月２６日付けのヨーロッパ特許出願箱０２
８４４６１号において、本出願人は、次の一竣成Ｉ Ｏ４ｓ 」 Ｙ　　　　　　　　　　　　　Ｎ）ｌ−ＲＩ［ここで、
グルタミン酸はＤ又はＬ配置であり、ＲＩは水素原子、
アミノ酸若しくは２．３若しくは４個のアミノ酸よりな
るペプチド、又はアミノ酸若しくは２．３若しくは４個
のアミノ酸よりなるペプチドであってそのアミンが６〜
２４個の炭素原子を含有する飽和若しくは不飽和脂肪酸
でエステル化されているものを表わし、成るいはＲ１は
６〜２４個の炭素原子を含有する飽和若しくは不飽和脂
肪酸塩を表わし、 Ｒ６は水素原子又は１〜５個の炭素原子を含有するアル
キル基を表わし、 Ｒ５はヒドロキシル基、１〜５個の炭素原子を含有する
。アルキルオキシ基又はアミノ酸（そのアミンは１〜５
個の炭素原子を含有するアルキル基で置換されていてよ
い）を表わし、 Ｚは次式 ％式％ （ここで、Ｒ８は水素原子、アミノ酸又は２．３若しく
は４個のアミノ酸よりなるペプチドを表わし、Ｒ４はヒ
ドロキシル基、１〜５個の炭素原子を含有するアルキル
オキシ基又はアミノ酸（そのアミンは１〜５個の炭素原
子を含有するアルキル基で置換されていてよい）を表わ
し、Ｕは−ＣＬ−Ｃ−Ｃｌｌａ−−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ）Ｉ
＊−（Ｅ若しくはＺ）、ＣＨ。

−ＣＨｚ−ＣＨ＝ＣＨ−（Ｅ若しくはＺ）又は−Ｃ）＋
２−Ｃ）Ｉ−ＣＩ（２−ＣＨ３ 鎖を表わし成るいはＵはＸと一緒になって・ＣＨ−ＣＩ
（ｉ−ＣＨｚ−（Ｅ若しくは２）を表わし、或ルイはＵ
はＹと一緒になって−ＣＨａ−Ｃｕｔ−Ｃ）Ｉ・を表わ
し、Ｘは水素原子又はＵと一緒に追加の結合を表わす） の基を表わし、 Ｙは水素原子又はＵと一緒になって追加の結合を表わす
］ に相当するグルタミン酸の誘導体並びに無機若しくは有
機酸又は塩基との付加塩を記載した。

上記の一般式において、アミノ酸は好ましくはα−アミ
ノ酸であり、Ａｌａ、Ｖａｌ、　Ｔｖａｌ、　Ｌｅｕ、
　Ｉｌｅ、Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｇ　ｌｕ、　Ｇｌｎ、
　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｃｙｓ、　Ｍｅｔ、　Ｌｙｓ、
　Ａｒｇ、　Ｐｈｅ。

Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ、旧Ｓ及びＰｒｏ、Ｎｖａ、Ｎｌｅ、
Ｈｙｐ、叶ｎ　（これらのアミノ酸はＤ又はＬ形である
）並びにＳａｒおよびＧｌｙよりなる群から選ぶことが
でき、そして上記の酸の全てはＮ−エステル化又はＮ−
アルキル化されていてよく、２．３又は４個のアミノ酸
よりなるペプチドの場合にはこれらの酸は上記のアミノ
酸よりなる群から選ばれる。

ａ−アミノカルボン酸の記号はこれらの酸をＤ又はＬ配
置で表わすことは約束によって認められている（例えば
、用語’ＡｌａｊはＤ又はＬ形のアラニンを表、わす）
。

６〜２４個の炭素原子を含有する飽和又は不飽和脂肪酸
は、好ましくは１２〜２２個の炭素原子を有し、例えば
ステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸、カプリル酸
、ミリスチン酸、α若しくはγ−リルン酸、リノール酸
、アラキドン酸又はドコサペンタエン酸があげられる。

表現「１〜５個の炭素原子を含有するアルキル基」とは
、例えば、ペンチル、イソブチル、ブチル、イソプロピ
ル基、好ましくはプロピル、エチル又はメチル基を意味
する。

用語「１〜５個の炭素原子を含有するアルキルオキシ基
」は、例えばペントキシ又はブトキシ基を表わすが、好
ましくはプロポキシ、エトキシ又はメトキシを意味する
。

誘導体の塩は、有機又は無機塩基で形成させることがで
きる。無機塩基としては、水酸化アルカリ又はアルカリ
土金属、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、リチウ
ム及びカルシウム、そして水酸化マグネシウム又は水酸
化アンモニウムである。有機塩基としては、置換又は非
置換アルキルアミン、例えばトリメチルアミン、メチル
アミン、プロピルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルエタノール
アミン又はトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンが
あげられる。また、塩基性アミノ酸、例えばリジン又は
アルギニンがあげられる。さらに、例えばグルコサミン
又はプロカインのようなその他の塩基もあげられる。

無機又は有機酸との付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素
酸、硝酸、硫酸、りん酸、酢酸、ぎ酸、プロピオン酸、
安息香酸、マレイン酸、フマル酸、こはく酸、酒石酸、
くえん酸、し少う酸、グリオキシル酸、アスパラギン酸
、メタン及びエタンスルホン酸のようなアルカンスルホ
ン酸及びベンゼン及びｐ−）ルエンスルホン酸のような
アリールスルホン酸並びにアリールカルボン酸で形成さ
れた塩であってよい。

また、本出願人は、上記のヨーロッパ出願において、次
式ＩＩ ＨＯＯＣ−Ｃｕｔ−ＣＨｉ−ＣＨ−ＣＯＯ−Ａｌｋ　　
　　　　（ＩＩ　）ＮＨ−Ｒ’。

（ここで、Ａｌｋは１〜３個の炭素原子を含有するアル
キル基を表わし、Ｒ’＋は水素を除いてＲ３について既
に示した意味を有し又はアミンの保護基を表わす）のグ
ルタミン酸誘導体を次式■ｘ’　　　　　　　　ｙ’ （ここで、Ｕは既に示した意味を有し、Ａｌｋ、及びＡ
Ｉｋ２は１〜３個の炭素原子を含有するアルキル基を表
わし、Ｘ′及びＹｏは水素原子又は−ＣＯＯ−Ａｌｋｓ
　　（ＡｌｋｓはＡｌｋ＋及びＡｌｋｚの意味を有する
）を表わし、Ｒ’ｉはアミンの保護基又はアミノ酸若し
くは２．３若しくは４個のアミノ酸よりなるペプチドで
あってそのアミンが保護基で保護されているものを表わ
す） の誘導体と反応させて次式ＩＡ Ｘ’　　　　　　Ｙ’　　　　　　　　　　　　　ＮＨ
−Ｒ’。

（ｒＡ　） （ココテ、Ｒ’＋、Ｒ’ａ、ＡＩｋ、Ａｌｋ＋、Ａｌｋ
ｚ、Ｘ’、Ｙ’及びＵは既に示した意味を有する） の化合物を得、この化合物を単離し、所望ならば塩形成
し、又は必要により及び所望により、下記の反応の一つ
、 ａ）　Ｘ　’又はＹｏが−ＣＯＯ−Ａｌｋｓ基を表わす
場合には脱炭酸、 ｂ）アミン官能基の脱保護、 Ｃ）エステル官能基の加水分解、 ｄ）アミノ酸又は２．３若しくは４個のアミノ酸よりな
るペプチドであってそのアミン官能基が保護されている
ものによる遊離アミノ官能基のアミド化、次いでこのア
ミン官能基の脱保護、 ｅ）カルボキシル官能基のエステル化又は塩基による塩
形成、 ｆ）アミノ官能基の酸による塩形成 を任意の順序で行うことを特徴とする式Ｉで規定される
誘導体並びにそれらの塩類の製造法を記載している。

好ましい製造条件において、グルタミン酸誘導体は、ジ
シクロへキシルカルボジイミド、Ｎ。

Ｎ゛−カルボニルジイミダゾール、又は硫酸のビスアル
キル化アミド、例えばＳｏ　（Ｎ　（ＣＨｓ）　ｚ）　
を又はＮ、Ｎ’−スルフィニルビス（ジメチルアミン）
のような縮合剤の存在により成るいはクロルぎ酸イソブ
チルとの混合無水物を形成させることにより活性化され
る。

脱炭酸は、好ましくは、１２Ｎ塩酸のような濃無機酸を
作用させることによって行われる。

クラブチョ法によって直接脱炭酸を行うことができる。

アミン官能基（例えばホルミル又はＢＯＣ）の脱保護は
、好ましくは、塩酸のような希無機酸を作用させること
によって行われる。

エステル官能基の加水分解は、好ましくは、無機塩基、
例えば水酸化カリウム、特に水酸化ナトリウムによろけ
ん化によって行われる。これは不完全な場合には必要に
より２回行うことができる。後者の場合において、第二
加水分解は、好ましくはアミン官能基の脱保護及び（又
は）脱炭酸後に行われる。

遊離アミン官能基のアミド化は、例えばアミノ酸又はペ
プチドのハロゲン化物のような官能性誘導体により、成
るいは上記したような縮合剤の存在下で行われる。

カルボキシル官能基のエステル化は、例えば上記したの
と同じ条件下で（縮合剤）行われる。

式Ｉの誘導体は塩基性又は酸性を有する。式Ｉの誘導体
の付加塩は、無機又は有機酸又は塩基と式Ｉの誘導体と
をほぼ化学量論的割合で反応させることによって有利に
製造することができる。

弐■のある種の誘導体は知られている。これらが知られ
ていないときは、上記のヨーロッパ特許出願に記載のよ
うに製造することができる。

式ＩＩの誘導体は知られている。それらは特に実施例又
は上記特許出願に記載のように製造することができる。

また、本出願人は、上記特許出願において、特に、自己
免疫病の治療に有用な薬剤としての式Ｉの化合物並びに
それらの塩類を記載した。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、上記の特許出願の一般式に相当するが、しか
しそこに記載されていない新規な化合物に関する。

［課題を解決するための手段］ しかして、本発明の主題は、２−アミノ−４−メチレン
−６−［［Ｎ−［Ｎ−（ｔ−オキソオクタデシル）−Ｌ
−アラニル］−γ−Ｄ−グルタミル］アミノ］ヘプタン
二酸（異性体Ｂ）及び２−アミノ−４−メチレン−６−
［［Ｎ−（１−オキソオクタデシル）−γ−Ｄ−グルタ
ミル］アミノ］ヘプタン二酸（異性体Ａ及び異性体Ｂ）
並びにそれらの有機又は無機酸又は塩基との付加塩にあ
る。

本発明の化合物は、上記のヨーロッパ特許出願第０２８
４４８１号に記載の方法に従って製造することができる
。化合物の詳細な製造例は以下の実験の部に示す。

本発明の化合物は非常に有益な薬理学的性質を有する。

それらは、特に、ヒト単球の活性化及びＴＮＦ　（腫瘍
壊死因子）及びＩＬ−１（インターロイキン−１）のよ
うなモノカインの産生による顕著な免疫調節性を付与さ
れている。

したがって、本発明の主題は、器官に対する非特異的な
疾病が問題であろうと（リウマチ用多発関節炎、紅斑性
狼癒、溶血性貧血、自己免疫性白血球減少症など）、ま
た器官の特異的な疾病が問題であろうとも（甲状腺炎、
バセドウ氏病、アジソン氏病、多発性硬化症、天庖癒、
出血性直腸結腸炎、ある種の腎臓病症など）自己免疫病
の治療に特に有用な薬剤としての前記式■の化合物及び
それらの塩類にある。また、これらの薬剤は、血液病、
癌、エイズ、ウィルス性及び微生物性感染症、特に慢性
及び再発性のもの（気管支炎、インフルエンザなど）、
口腔の病気などの治療に使用することができる。さらに
、それらはウィルス療法、抗生物質療法又は抗癌化学療
法の補助剤ともなる。

また、それらは多くの二次的免疫不全又は広範な疾病の
間にもたらされると思われる不全、即ち代謝障害と関連
した免疫不全、医原性（コルチコイド、電離性放射線な
ど）の免疫不全、大きな火傷を患っている場合にみられ
る免疫不全の治療に使用することができる。

通常の薬量は、使用される誘導体、患者及び問題の病気
によって変り得るが、例えば１日当り０、０５　ｍ　ｇ
〜５０ｍｇである。男性の場合に経口投与で、本発明の
化合物は、例えばリウマチ様多発関節炎の治療に対して
は、０．５　ｍ　ｇ〜５０ｍｇの１日の薬量で、即ち体
重１ｋｇ当りＯ，ＯＯ７ｍｇ〜０．７　ｍ　ｇの薬量で
投与することができる。

最後に、本発明の主題は、前記の誘導体の少なくとも１
種成るいはそれらの製薬上許容できる酸又は塩基との付
加塩の少なくとも１種を活性成分として含有する製薬組
成物にある。

薬剤としての本発明の化合物及びそれらの製薬上許容で
きる酸又は塩基との付加塩は、消化器経路で又は非経口
的に投与するための製薬組成物に配合することができる
。

これらの製薬組成物は、例えば固体又は液体であってよ
く、人の医薬に普通に使用される製薬形態、例えば錠剤
又は糖衣錠、カプセル、顆粒、生薬、注射用調合物の形
で提供できる。それらは通常の方法により製造される。

活性成分は、これらの製薬組成物に一般に使用される補
助剤、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、でん
粉、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又
は非水性ビヒクル、動物又は植物起源の脂肪物質、パラ
フィン誘導体、グリコール、各種の湿潤、分散若しくは
乳化剤及び（又は）保存剤中に配合することができる。

（実施例］ 下記の例は本発明を例示するものであって、これを何ら
制限しない。

：程Ａ：２−ホルムアミドー４−メチレン−６−［［０
−メチル−Ｎ−［Ｎ−（１−オキソオクタデシル）−Ｌ
−アラニル］−γ−Ｄ−グルタミル］アミノ］ヘプタン
二酸ジエチル ０．９９２ｇの（１）メチルＮ−［Ｎ−（１−オキソオ
クタデシル）−Ｌ−アラニル］−Ｄ−グルタメート（前
記ヨーロッパ特許出願に記載のように製造）、５０ｃｃ
のジオキサン及び５０ｃｃのテトラヒドロフランを含有
する溶液を１４℃±１℃に冷却する。０．５８ｃｃのト
リエチルアミンと０．３ｃｃのクロルぎ酸イソブチルを
加える。これを１４℃で３５分間かきまぜる。０．５７
２ｇの２−アミノー６−ホルムアミド−４−メチレンヘ
ブタンニ酸ジエチルを１０ｃｃのテトラヒドロフランに
溶解してなる溶液を加える。全体を周囲温度で２時間か
きまぜ、次いで３０℃で減圧下に乾固する。得られた生
成物をシリカでクロマトグラフィーし、シクロヘキサン
−酢酸エチル混合物（２゜５−７．５　’）で溶離する
。４８０．６ｍｇのジアステレオマーＡ及び４７６ｍｇ
のジアステレオマーＢを得た。

二丘旦：２−アミノ−６−［［０−エチル−Ｎ−［Ｎ−
（１−オキソオクタデシル）−Ｌ−アラニル］−γ−Ｄ
−グルタミル〕アミノ］−４−メチレンヘプタン二酸ジ
エチル ４０３ｍｇの上記工程Ａで得た生成物及びエタノールで
１０位に希釈した濃塩酸（０，４１ｃｃ）溶液を含有す
るエタノール溶液を８０℃で４５分間かきまぜる。この
溶液を冷却し、２ｃｃの水を加え、重炭酸ナトリウムで
中和する。塩化メチレンで抽出した後、抽出物を硫酸マ
グネシウムで乾燥し、乾固させる。残留物をクロマトグ
ラフィーし、所期化合物を得た。

二五工：２−アミノー４−メチレン−６−［［Ｎ−［Ｎ
−（１−オキソオクタデシル）−Ｌ−アラニル］−γ−
Ｄ−グルタミル］アミノ］へブタン二酸及びそのトリナ
トリウム塩 １０７ｍｇの上記工程Ｂで得た化合物（ジアステレオマ
ーＢ）を５ｃｃのエタノールに溶解し、０℃に冷却し、
０．４３ｃｃの水酸化ナトリウムを加える。この混合物
を周囲温度で一夜かきまぜ、次いで蒸発乾固させ、１１
７ｍｇの生成物を得、これに１０ｃｃの非発熱性の水を
加える。濾過し、凍結乾燥した後、５０ｍｇの所期化合
物を得た。

［ａ］　ｏ　　＝−２５”　　±２°　（ｃ＝１％、Ｈ
２Ｏ）例１の開始剤に使用した２−アミノ−６−ホルム
アミド−４−メチレンヘブタンニ酸ジエチルの製造 前記ヨーロッパ特許出願に記載のように製造した異性体
の混合物としての６．４ｇの６−　（ｔ−ブトキシカル
ボニル）アミノ−２−ホルムアミド−４−メチレンヘブ
タンジ酸ジエチルを含有する溶液に、２００ｃｃの塩化
メチレン及び１００ｃｃの塩酸の無水エーテル溶液（２
，６Ｎ）を添加する。これを周囲温度で１時間かきまぜ
、次いで窒素を吹き込み、混合物を３０℃で減圧下に乾
固させる。得られた残留物を塩化メチレンに溶解し、中
和し、濃縮乾固する。４．６ｇの粗製の所期生成物を得
、これをシリカでクロマトグラフィーし、酢酸エチル−
エタノール混合物（９−１）で溶離することにより精製
する。Ｒｆ＝０．０６゜ｍ：　２−ホルムアミド−４−
メチレン−６−［［０−メチル−Ｎ−（１−オキソオク
タデシル）−γ−Ｄ−グルタミル］アミノ］ヘプタン二
酸ジエチル ６１５ｍｇの（１）メチルＮ−（１−オキソオクタデシ
ル）グルタメートをテトラヒドロフラン−ジオキサン混
合物に溶解し、１４℃に冷却してなる溶液に０．０６２
ｃｃのトリエチルアミンと０．３ＣＣのクロルぎ酸イソ
ブチルを５分間で添加する。°得られた懸濁液を１４℃
で３５分間かきまぜ、次いで９１５ｍｇの２−アミノ−
６−ホルムアミド−４−メチレンヘブタンニ酸ジエチル
を１０ｃ、ｃのテトラヒドロフランに溶解してなる溶液
を添加する０反応混合物を周囲温度で２時間かきまぜ続
ける。氷を加え、塩化メチレンで抽出し、洗浄し、乾燥
し、濾過し、３０℃で蒸発濃縮させた後、２．１ｇのジ
アステレオマーＡとＢとの混合物を得、これをシリカで
クロマトグラフィーし、シクロヘキサン−酢酸エチル混
合物（２，５−７，５）で溶離する。５８８ｍｇのジア
ステレオマーＡ及び５８０ｍｇのジアステレオマーＢを
得た。

工程１：２−アミノー４−メチレン−６−［［０−メチ
ル−Ｎ（１−オキソオクタデシル）−γ−Ｄ−グルタミ
ル］アミノ］ヘプタン二酸ジエチルａ）ジアステレオマ
ーＡ ４７０ｍｇの上記工程で得たジアステレオマーヲ４．７
　ｃ　ｃのエタノール中に含む溶液に０．５　ｃ　ｃの
濃塩酸を添加する。これを８０℃に４５分間加熱し、２
０ｃｃの水を加え、ｐＨ値７に調節し、次いで塩化メチ
レンで抽出し、乾燥し、濾過し、を２液を乾固させる。

５００ｍｇのジアステレオマーＡを得、これをシリカで
のクロマトグラフィーにより精製する。２５１ｍｇのジ
アステレオマーＡを得た。

ＮＭＲ（ＣＤＣＩ　３．２５０ＭＨｚ）３．６４：主鎖
の２位のＨ ４，９９：主鎖の４位の置換メチレン基のＨｂ）ジアス
テレオマーＢ 操作は工程Ａにおけるように行う、５８０ｍｇの出発物
質（ジアステレオマーＢ）より出発して２４３ｍｇのジ
アステレオマーＢを得た。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃ１ｓ　、２５０　Ｍ　Ｈｚ　）１
．６５：主鎖の２位の置換アミン基のＨ３，６１：主鎖
の２位のＨ ４，９６−４，９８：主鎖の４位の置換イチレンの二皿
工：２−アミノー４−メチレン−６−［［Ｎ−（１−オ
キソオクタデシル）−γ−Ｄ−グルタミル３アミン］ヘ
プタンニ酸及びそのトリナトリウム塩（ジアステレオマ
ーＡ及びＢ） ２３３ｍｇの上記工程で製造した化合物な０℃のエタノ
ール中に含む溶液中に１．０２ｃｃの０．００１０２Ｍ
水酸化ナトリウム溶液を導入する。得られた溶液を周囲
温度で一夜かきまぜ、次いで減圧下に乾固させる。得ら
れた残留物を１５ｃｃの水に溶解し、濾過し、凍結乾燥
する。

１３３ｍｇのジアステレオマーＡを得た。

［α］Ｉ、＝−９°±２°　（ｃ　＝　０．７％）。

ＮＭＲ（Ｄ、Ｏ） ４．１６及び４．３３：主鎖の６位のＨ及びγ−Ｄ−グ
ルタミル基のＣＨのＨ ３，４１：主鎖の２位のＨ Ｏ，８９：オクタデシル基の１８位のＨ同一の条件で実
施し、２３４ｍｇの出発物質（ジアステレオマーＢ）よ
り出発して１９４．４ｍｇのジアステレオマーＢを得た
。

［ａｌｏ＝−ｓ、５°　±２　＠（ｃ　＝　０．７％）
。

ＮＭＲ（Ｄｉ　　Ｏ） ４．１５及び４．３２：主鎖の６位のＨ及びγ−Ｄ−グ
ルタミル基のＣＨのＨ ３，４６：主鎖の２位のＨ ０，８８：オクタデシル基の１８位のＨキソオり　デシ
ル　グルタミン　メチルの　４Ｃ）ＩａＣＩｌａＣＯａ
ｔＢｕ ｒｈＭｅ ／ ＣＨ，（ｃｎｓ）ｌａｃＯＮＨｃＩｌ ＼ ＣＨａＣＨ＊ＣＯｉ）Ｉ ＭＰ＝７０℃　　　　　　　　ＭＰ＝１００℃［α］Ｄ
・１０″　±　１”　　　（α］ＤＩＩ＋１５″　±　
１＠（ｃ＝０．８　％、　ピリジン）（ｃ＝１　　％、
　ピリジン）賑Ｊｄ九上 下記の処方に相当する錠剤を調製した。

例１の化合物・・・・・・・・・・・・５０ｍｇ賦形剤
・・・・１錠２５０ｍｇとするに要する量（賦形剤の詳
細：ラクトース、でんぷん、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム） 正常な供血者からの循環血液の単核細胞を、フィニル（
Ｆｉｃｏｌｌ）の勾配を使用するボユム氏により報告さ
れた標準技術に従って分離する。洗浄後、単核細胞を、
培養フラスコ１個当り５ｍＪ２の培地を使用してその培
地１ｍρ当り５Ｘ１０’個の単核細胞（ＮＳＥ＋細胞）
の割合で３７℃で１時間インキュベートさせる。この実
験で使用した培地は、抗生物質とヘペス（Ｈｅｐｅｓ）
の緩衝剤を添加したＲＰＭＩ　１６４０からなる。１時
間後に、フラスコを３７℃の上記培地で洗うことによっ
て非付着性細胞を除き、そして本質的に単核細胞からな
る（〉９０％）付着性細胞はＣａ”又はＭｇ”を含まな
いＰ、　Ｂ、　Ｓ、緩衝剤溶液［ジュルベコ（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ）　］中で種々の量の被検化合物の存在下に再
びインキュベートする。培養は２４又は４８時間続け、
次いで細胞上澄液を取り出し、遠心分離し、等量のロッ
トに分け、−８０℃か一２０℃で保存する。培養上澄液
を同量の非発熱性蒸留水とともにフラスコに入れて細胞
を溶解させる。細胞溶解物を集め、等量のロットに分け
、−２０’Ｃに保持する。γ−ＩＦＮのみでは不活性で
ある量の組換えγ−インターフェロン（１０’Ｕ／ｍｌ
りの存在下又は不存在下に下記の実験を行った。

生物学的活性に基づく上澄液中にモノ力イン（インター
ロイキン−１及び腫瘍壊死因子）が存在するかについて
の試験 インターロイキン−Ｉ　　ＩＬ−１ この試験は、■、ゲリー及びＢ、Ｈ，ウォークスマン両
氏により１９７２年に最初に報告された（Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、　１３６−１４３．１９７２゜「ミトゲンに対
するＴリンパ球応答の増強、ＩＩ　、調停器を増強させ
る細胞源」）、この試験は、マウスの胸腺細胞に対する
抗原の存在下でのＩ’Ｌ−１の共有系分裂作用に基いて
いる（試験ではフィトヘマグルチニンにより開始）　、
　１．５×１０’個のマウス胸腺細胞Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（
オーリアンスのＣ，Ｓ。

Ｅ、　Ａ、　Ｌ、に由来）を、９６個の平底のウェルを
有する培養マルチプレートにおいて、抗生物質（ペニシ
リンＩ　　Ｕ／ｎｕ及びストレプトマイシン１０００Ｕ
／ｍｌ　）の他にへペスの緩衝剤、１ｍＭのグルタミン
、２ｍＭの５％牛血清及び５Ｘ１０−＠Ｍの２−メルカ
プトエタノールを含有する　ＲＰＭＩ　１６４０よりな
る最終容量２００μρの媒質中で、ＩＬ−１及びＰＨＡ
−Ｐウェルカム（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）　（ｌｕ　ｇ　／
ｍｆｌ　）の活性を含むことができる種々の希釈度の細
胞上澄液及び細胞溶解物の存在下に３日間培養させる。

６８時間培養させた後に、１μＣ４のトリチウム化チミ
ジンを各ウェルに添加する（　ｓＨ−メチルチミジン、
ＣＥＡサクレイ、７ＭＭ７９Ａ。

比放射能ｌμＣｉ　／　ｍ　Ｍ　）　＠培養物をスカト
ロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）型の自動コレクター装置で濾過
し、フィルターをシンチレーションカウンター（ＬＫＢ
）で計数した後°、細胞によって取込まれた放射能を評
価する。結果は、上澄液の存在下での培養物により取込
まれた１分間当りのパルスと対照側培養物により取込ま
れた１分間当りのパルスとの間の差によって表わされる
。

ＮＦ ＴＮＦ活性は、ターゲット細胞Ｌ−９２９（サブクロー
ンα）に対するこの因子の毒性によって証明される。こ
の方法は、試験中アクチノマイシンＤを添加することに
よって増感させた。

このＬ細胞を、５％の牛血清、グルタミン、へ／ ベスの緩衝剤及び抗生物質を加えた１００μ℃のＲＰＭ
Ｉ　１６４０媒質中に、平底ミクロプレートのウェル−
個あたり２Ｘ１０’個の細胞の割合で分配する。２４時
間後に種々の希釈度の被検上澄液を１００μでの量で添
加し、そしてｌｕｇ　１ｍＭ量のアクチノマイシンＤを
添加する。２４時間培養した後、マルチプレートをクリ
スタルバイオレットで着色させ、マルチスキャンリーダ
ーで種々のウェルの光学濃度を測定することによって生
きた溶解していない細胞の数を評価する。

級思 例１及び２の化合物は、単核細胞並びにＩＬ−１及びＴ
ＮＦの産生を刺激する。さらに、例１及び２の化合物と
γ−インターフェロン及び（又は）ＬＰＳとの間に相乗
作用が存在する。

２）　　　　　による１ンパ　　　の リンパ芽球変換試験 循環血液の単核細胞を、９６個のウェルな有する平底マ
イクロプレートにおいて、１０％の脂性中血清［ハイク
ロン　（）ｌｙｃｌｏｎｅ）　］　、抗生物質、グルタ
ミン及びヘペスの緩衝剤を加えた１００μρのＲＰＭＩ
　１６４０媒質中で１ｍ１２当り２ｘｌＯ’個の細胞の
割合で培養する。被検化合物をウェルに、１．１０又は
１００μｇ　／ｍｊｔの最終希釈度に対して１００μβ
の割合で単独で又は１及び（又は）１０μｇ　７ｍＢの
フィトヘマグルチニンＰＨＡ−Ｐ［ウェルカム・ラブ（
Ｗｅｌｃｏｍ　Ｊａｂｓ）］の存在下に添加する。プレ
ートをインキュベーターにおいて湿度飽和雰囲気中Ｃｏ
ｔとともに３７℃の温度にする。２日及び５日後に、培
養を停止し、トリチウム化チミジンの取込みを、インタ
ーロイキン−１の検出試験において前記した条件で実施
する。

結果は１分間当りのインパルスで与えられる。

要約すれば、例１及び２の化合物は、培養中にリンパ球
に対して細胞毒性でないしまたこれら同一細胞に対して
有糸分裂性でもないことが示された。他方、それらは、
ＰＨＡのような非特異的Ｔ有糸分裂性であると知られた
一つの物質と同時に添加されると、この物質の効果を部
分的に抑止する（特に１００μｇ　７ｍ１２において）
ことができることが示された（添付の図面を参照）、こ
れらの結果は全ての被検供給者について再現できた（１
物質当り３〜３０人）。

免疫グロブリンの産生 上記と同じ細胞を、ｏ、　ｉ、１及び１０％ｇ／ｍｌｉ
量の各種被検化合物単独の存在下に又は非特異的態様で
ヒトＢ型リンパ球による免疫グロブリンの産生な刺激す
る既知の細菌であるスタフィロコッカス・オウレウス・
クロン　（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ
　Ｃｏｗａｎ　（ＳＡＣ））の二つの量（１０−’及び
１０−’）の存在下に１週間培養した。培養終了後に上
澄液を集め、商業的に入手できるヒト抗免疫グロブリン
抗体を使用するエリザ　（εＬＩＳＡ）法による標準検
出技術によって免疫グロブリンを評価する。結果は、上
澄液１ｍβ当りの免疫グロブリンのｎｇ数で示される。

この実験は、それ自体で使用した被検化合物はＢ型のリ
ンパ球の刺激を生じさせることができない（増殖も形質
細胞の分化も）が、例１の化合物はＳＡＣの存在下では
免疫グロブリンの産生を増大させることができることを
示した。他方、例の化合物は同じ結果を与えない（添付
の図面を参照）。

３）（：／旦ヱエ辺皿上 マクロファージの活性化 単核細胞マクロファージコンパートメントの細胞を活性
化する力をマウスにおいてインビボで確認した０種々の
薬量の被検化合物を腹腔内経路で注射した後、マウスの
腹腔細胞Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃを集めた。見出された細胞
の量は増加せず、本質的にマクロファージであった。こ
のことはこれらの化合物が少なくとも使用した条件下で
化学走性でないことを示す、マクロファージは、あたか
も食作用のような膜刺激に対して良好に応答できるとい
う特性を有する。事実、これらの細胞は超酸化物陰イオ
ン又は過酸化水素を自然に生じないが、しかし食細胞の
信号を受けてこの酸化的代謝が準備され、開始される。

実験を各種化合物を用いて行った。添付の図面に示した
化合物は化合物阻１である。酸化物代謝が、ベルトホル
ト（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）ＬＢ９５０ケミルミノメータ−
を使用してルミノールの存在下に化学ルミネセンス技術
によって立証される。

反応速度論から、被検化合物の１回の注射の後に活性化
現象が２４〜４８時間続（ことが示された。

４．　　の　　な１日 添付の図面は、 ヒト循環リンパ球による免疫グ ロブリン産生の刺激に対する本発明の化合物の効果を表
わすグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）下記の命名 ２−アミノ−４−メチレン−６−［［Ｎ−［Ｎ−（１−
   オキソオクタデシル）−Ｌ−アラニル］−γ−Ｄ−グル
   タミル］アミノ］ヘプタン二酸（異性体Ｂ）及び２−ア
   ミノ−４−メチレン−６−［［Ｎ−（１−オキソオクタ
   デシル）−γ−Ｄ−グルタミル］アミノ］ヘプタン二酸
   （異性体Ａ及び異性体Ｂ） を有する化合物並びにそれらの有機及び無機酸又は塩基
   との付加塩。 ２）請求項１記載の化合物並びにそれらの製薬上許容で
   きる有機及び無機酸又は塩基との付加塩よりなる薬剤。 ３）請求項２記載の薬剤の少なくとも１種を活性成分と
   して含有する製薬組成物。