FR2635779A2 - Nouveaux derives de l'acide glutamique, leurs sels, procede de preparation, application a titre de medicaments et compositions les renfermant - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet les composés répondant à la formule générale I de la revendication 1 de la demande de brevet principal, à savoir : l'acide 2-amino 4-méthylène 6-[[N-[N-(1-oxo octadécyl) L-alanyl] gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioque (isomère B) et l'acide 2-amino 4-méthylène 6-[[N-(1-oxo octadécyl) gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioque (isomère A et isomère B), ainsi que leurs sels d'addition avec les acides organiques et minéraux. Les composés de l'invention présentent d'intéressantes propriétés pharmacologiques qui justifient leur utilisation en thérapeutique.

Description

Dans sa demande de brevet français déposé le 26.02.1987 sous le n' 87-

02547, intitulé "Nouveaux dérivés de l'acide glutamique, leurs sels, procédé de préparation, application à titre de médicaments et compositions les renfermant", la société demanderesse a décrit et revendiqué: des dérivés de l'acide glutamique ainsi que leurs sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques ou avec les bases, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule générale I:

CO - R3

Z -C-NH - CO - CH2 - CH2- CH - COOR5 (I)

I I

Y NH-R1

dans laquelle l'acide glutamique est de configuration D ou L, R1 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés ou un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés dont l'amine est estérifiée par un acide aliphatique saturé ou

insaturé renfermant de 6 à 24 atomes de carbone, ou R1 repré-

sente le reste d'un acide aliphatique saturé ou insaturé renfermant de 6 à 24 atomes de carbone, R5 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, R3 représente un radical hydroxy, alkyloxy renfermant de 1 à 5 atomes de carbone ou un acide aminé dont l'amine peut être substituée par un radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, Z représente un groupement de formule:

CO - R4

I

R2 - NH - C - U -

dans lequel R2 représente un atome d'hydrogène, un acide aminé

ou un peptide constitué de 2, 3 ou 4 acides aminés, R4 repré-

sente un radical hydroxy, alkyloxy renfermant de 1 à 5 atomes de carbone ou un acide aminé dont l'amine peut être substituée par un radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, U représente une chaîne -CH2-C-CH2, -CH=CH-CH2- (E ou Z), CH2 -CH2-CH=CH-(E ou Z) ou -CH2-CH-CH2- ou U représente ensemble

CH3

avec X une chaîne =CH-CH2-CH2- (E ou Z) ou U représente ensemble avec Y une chaine -CH2-CH2-CH= (E ou Z) et X et Y

représentent un atome d'hydrogène ou une liaison supplémen-

taire avec U.

Dans la formule générale I, l'acide aminé est de préfé-

rence un acide alpha-aminé et peut être choisi dans le groupe constitué par Ala, Val, Ival, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, Cys, Met, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His et Pro, Nva, Nle, Hyp, Orn, ces acides étant sous la forme D ou L ainsi que par Sar et Gly, tous les acides précédemment nommés pouvant être N estérifiés ou N-alkylés dans le cas d'un peptide comprenant 2, 3 ou 4 acides aminés, ceux-ci sont choisis dans

le groupe constitué par les acides aminés ci-dessus.

On admettra par convention que les symboles des acides alpha-amino carboxyliques représentent ces acides sous leur configuration D ou L (par exemple, le terme Ala signifie

Alanine sous forme D ou sous forme L).

L'acide aliphatique saturé ou insaturé renfermant de 6 à 24 atomes de carbone à de préférence de 12 à 22 atomes de carbone; on peut citer par exemple les acides stéarique, palmitique, laurique, caprylique, myristique, alpha ou gamma

linolénique, linoléique, arachidonique ou docosopentaénoique.

L'expression radical alkyle renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, désigne par exemple, les radicaux pentyle, isobutyle, butyle, isopropyle et de préférence les radicaux propyle,

éthyle ou méthyle.

Le terme radical alkyloxy renfermant de 1 à 5 atomes de carbone, désigne par exemple, les radicaux pentoxy ou butoxy,

mais de préférence propoxy, éthoxy ou méthoxy.

Les sels des dérivés de l'invention peuvent être formés

avec des bases organiques et minérales. Parmi les bases miné-

rales, on peut citer les hydroxydes alcalins et alcalino-

terreux, tels que par exemple, les hydroxydes de sodium, de potassium, de lithium et de calcium, l'hydroxyde de magnésium ou d'ammonium. Parmi les bases organiques, on peut citer les amines alkylées substituées ou non substituées, telles que

par exemple, la triméthylamine, la méthylamine, la propylami-

ne, la N,N-diméthyléthanolamine ou la tris(hydroxyméthyl)

méthylamine; on peut citer également des acides aminés basi-

ques tels que, par exemple, la lysine ou l'arginine; on peut

citer encore d'autres bases telles que, par exemple, la gluco-

samine ou la procaine.

Les sels d'addition avec les acides minéraux ou organiques peuvent être, par-exemple, les sels formés avec les acides

chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, sulfurique, phosphori-

que, acétique, formique, propionique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, alcanesulfoniques tels que les acides méthane ou éthanesulfoniques, arenesulfoniques, tels que les

acides benzène ou para-toluènesulfoniques et arylcarboxy-

liques.

Dans se demande de brevet principal, la société demande-

resse a également décrit et revendiqué: un procédé de prépa-

ration de dérivés tels que définis par la formule I ainsi que de leurs sels, caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé de l'acide glutamique de formule II: HOOC - CH2 - CH2 - CH - COO - Alk (II)

NH - R'1

dans laquelle Alk représente un radical alkyle renfermant de 1 à 3 atomes de carbone et R'1 a la signification de R1 déjà

indiquée, à l'exception de l'hydrogène ou représente un grou-

pement protecteur d'une amine, avec un dérivé de formule III COO-Alk2 COOAlkl

R'2 - NH - C - U C - NH2 (III)

I -

X' Y'

dans laquelle U a la signification déjà indiquée, Alk1 et Alk2 représentent un radical alkyle renfermant de 1 à 3 atomes de carbone, X' et Y' représentent un atome d'hydrogène ou un radical -COO-Alk3, Alk3 ayant la signification de Alk1 et Alk2 et R'2 représente un groupement protecteur d'une amine ou un acide aminé ou un peptide constitué de 2,3 ou 4 acides aminés dont l'amine est protégée par un groupement protecteur, pour obtenir un produit de formule IA: COO-Alk2 COO-Alk1 (IA) I i R'2 - NH - C - U C - NH - CO - CH2 - CH2 - CH - COO-Alk i I!

X' Y' NH-R'1

dans laquelle R'1, R'2, Alk, Alkl, Alk2, X', Y' et U ont la signification déjà indiquée, que l'on isole et, si désiré, salifie, ou l'on soumet si nécessaire et si désiré, à l'une des réactions suivantes, dans un ordre quelconque:

a) si X' ou Y' représente un radical COO-Alk3: décarboxy-

lation b) déprotection des fonctions amines c) hydrolyse des fonctions esters, d) amidification des fonctions amino libres par un acide aminé ou un peptide constitué de 2, 3 ou'4 acides aminés dont la

fonction amine est protégée, puis déprotection de cette fonc-

tion amine, e) estérification ou salification par une base des fonctions carboxy,

f) salification par un acide des fonctions amines.

Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, le dérivé de l'acide glutamique est activé par la présence d'agents de condensation tels que le dicyclohexylcarbodiimide, le N,N'-carbonyl diimidazole ou des amides bis-alkylés d'acides sulfurés tels que SO(N(CH3)2)2 ou N,N'sulfinyl-bis (diméthylamine) ou encore par formation d'anhydride mixte

avec le chloroformiate d'isobutyle.

La décarboxylation est de préférence réalisée par l'action d'un acide minéral concentré tel que l'acide chlorhydrique 12N.

Une décarboxylalkylation directe peut être réalisée direc-

tement par la procédure de Krapcho.

La déprotection des fonctions amines (formyle ou BOC par exemple) est réalisée de préférence par action d'un acide

minéral dilué tel que l'acide chlorhydrique.

L'hydrolyse des fonctions esters est réalisée de préfé-

rence par saponification à l'aide d'une base minérale comme la potasse et notamment la soude. Elle peut, si nécessaire être opérée en deux fois au cas o elle serait incomplète. Dans ce dernier cas, la seconde hydrolyse est de préférence réalisée

après la déprotection des fonctions amines et/ou la décarboxy-

lation. L'amidification des fonctions amines libres est réalisée

par exemple à l'aide d'un dérivé fonctionnel tel qu'un halogé-

nure de l'acide aminé ou du peptide, ou en présence d'un agent

de condensation tel que ceux ci-dessus.

L'estérification des fonctions carboxy, est réalisée par exemple dans les mêmes conditions que ci-dessus (agents de condensation).

Les dérivés de formule I présentent selon le cas un carac-

tère basique ou acide. On peut avantageusement préparer les sels d'addition des dérivés de formule I en faisant réagir en proportions sensiblement stoechiométriques, selon le cas, un

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acide ou une base minérale ou organique, avec ledit dérivé de formule I. Dans des conditions préférentielles l'on effectue sur le dérivé de formule IA, les opérations suivantes et dans cet ordre: - hydrolyse des fonctions esters, - déprotection des fonctions amines et décarboxylation, amidification ou salification par un acide des fonctions amines et/ou estérification ou salification par une base des

fonctions carboxy.

Certains dérivés de formule III sont connus. Lorsqu'ils ne sont pas connus, ils peuvent être préparés comme suit; on fait réagir un dérivé de formule IV: COO-Alk2 COO-Alkl

I I

R'2 - NH -C - U C - OH (IV)

I I

X' Y'

dans laquelle Alkl, Alk2, U, X', Y' et R'2 ont la signification déjà indiquée, avec un halogénure d'alcane

sulfonyle renfermant de 1 à 3 atomes de carboxyle, de préfé-

rence le chlorure de méthanesulfonyle, en présence d'un agent de condensation telle que la pyridine, puis avec un azoture

alcalin comme l'azoture de sodium ou le diphényl phosphoryla-

zide, pour obtenir un dérivé de formule V: COO-Alk2 COO-Alk1

I I

R'2 - NH - C - U C - N3 (V)

I I

X' Y'

dans laquelle Alkl, Alk2, U, X', Y' et R'2 ont la signifi-

cation déjà indiquée, que l'on réduit, par exemple, par action

de triphénylphosphine suivie d'hydrolyse aqueuse, ou hydrogé-

nation catalytique, par exemple en présence de palladium sur charbon empoisonné (catalyseur de Lindlar) pour obtenir le

dérivé de formule III recherché.

Les dérivés de formule IV et de formule II sont connus.

Ils peuvent notamment être préparés comme indiqué dans les

exemples.

Dans sa demande de brevet principal, la société demande-

resse a décrit et revendiqué les composés dé formule I et

leurs sels comme médicaments utiles notamment dans le traite-

ment des maladies auto-immunes.

La présente demande de ler certificat d'addition a pour but d'illustrer la formule générale I par de nouveaux

exemples.

L'invention a pour objet l'acide 2-amino 4-méthylène 6-[[N-[N-(l-oxo octadécyl) L-alanyl] gam=a-D-glutamyl] amino] heptanedioïque (isomère B) et l'acide 2-amino 4-méthylène

6-[[N-(l-oxo octadécyl) gamma-D-glutamyl amino] heptane-

dioïque (isomère A et isomère B), ainsi que leurs sels d'addi-

tion avec les acides organiques et minéraux.

Les produits de l'invention peuvent être préparés selon le procédé de la demande de brevet principal rappelé ci-dessus; des exemples détaillés de préparation des produits sont donnés

ci-après dans la partie expérimentale.

Les produits de l'invention possèdent de très intéressan-

tes propriétés pharmacologiques, ils sont doués notamment de remarquables propriétés immunomodulatrices, notamment par activation des monocytes humaines et production de monokines telles le TNF (Tumor Necrosis factor) et l'IL-1 (Interleukine-l). L'invention a donc pour objet les produits cités ci-dessus

et leurs sels comme médicaments utiles notamment dans le trai-

tement des maladies auto-immunes qu'il s'agisse d'atteintes non spécifiques d'organes (polyarthriterhumatoide, lupus érythémateux, anémie hémolytique, leucopénie auto-immune etc...) ou qu'il s'agisse de maladies spécifiques d'organes

(thyroidite, maladie de Basedow, d'Addison, sclérose en pla-

ques, pemphigus, rectocolite hémorragique, certaines néphro-

pathies, etc...). Ces médicaments peuvent également être utilisés dans le traitement des hémopathies, du cancer, du

sida, des affections virales et microbiennes, surtout chroni-

ques et recurrentes (bronchite, grippe etc...); des maladies

des cavités buccales, etc.. Ils peuvent constituer des adju-

vants de la thérapie virale, de l'antibiothérapie ou de la

chimiothérapie anticancereuse.

Ils trouvent également leur application dans le traitement

de nombreux déficits immunitaires secondaires ou acquis obser-

vés au cours d'affections très diverses: déficits associés aux troubles métaboliques, déficits d'origine iatrogène, (corticoides, radiations ionisantes...) déficits observés chez les grands brûlés, etc. La dose usuelle, variable selon le dérivé utilisé, le sujet et l'affection en cause peut être par exemple de 0,05 mg à 50 mg par jour. Par voie orale, chez l'homme, les produits peuvent être administrés à la dose quotidienne de 0,5 mg & 50

mg, par exemple, pour le traitement de la polyarthrite rhuma-

toide, soit environ de 0,007 mg à 0,7 mg par kilogramme de

poids corporel.

L'invention a enfin pour objet les compositions pharmaceu-

tiques qui renferment au moins un dérivé précité ou l'un de

ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement accep-

tables, à titre de principe actif.

A titre de médicaments, les produits de l'invention et

leurs sels d'addition avec les acides ou les bases pharmaceu-

tiquement acceptables peuvent être incorporés dans des compo-

sitions pharmaceutiques destinées à la voie digestive ou

parentérale.

Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme, par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations

injectables, elles sont préparées selon les méthodes usuelles.

Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toute-

fois la limiter.

Exemple 1: Acide 2-amino 4-méthylène 6-r rN-rN-(l-oxo octadécyl) Lalanyll] qamma-D-glutamyl] amino] heptanediocque

(isomère B) et son sel trisodique.

Le produit est l'un des diastéréoisomères du produit décrit à

l'exemple 3 de la demande de brevet principal.

Il peut être préparé comme suit: Stade A: 5-(tert-butoxycarbonylamino) 1formamido 3-méthylène

1,1,5-pentanetricarboxylate de triéthyle.

On ajoute 13,65 g de pyrocarbonate de di-tert-butyle (Boc20) en solution dans 25 ml de dichlorométhane, dans une

solution de 19,5 g de 5-amino l-(formamido) 3-méthylene 1,1,5-

pentanetricarboxylate de triéthyle préparé comme indiqué ci-

après à la fin de l'exemple 1, dans 75 ml de dichlorométhane.

on maintient le mélange réactionnel sous agitation pendant 36 heures, après l'avoir ramené & la-température ambiante à

l'aide d'un bain d'eau.

On dilue le mélange réactionnel avec 150 ml de dichloromé-

thane. On lave à l'eau, filtre et sèche. On obtient ainsi

25,8 g de produit recherché (F = 68'C).

Stade B: 6-(tert-butoxycarboxylamino) 2-formamido 4-méthylène

heptanedioate de diéthyle.

On dissout 17,25 g de produit obtenu au stade A dans 250 ml de diméthylformamide. On ajoute en une fois 2,21 g de carbonate de césium et 9,42 g de para-amino thiophénol. On chauffe le mélange réactionnel pendant 3 heures à 85C. On

laisse revenir à la température ambiante: on filtre la solu-

tion et évapore le solvant sous pression réduite. On reprend l'huile obtenue avec 300 ml de dichlorométhane. On lave la solution obtenue à l'acide chlorhydrique et avec une solution saturée de bicarbonate de sodium. L'huile obtenue est purifiée par HPLC (éluant: cyclohexaneacétate d'éthyle 6-4). On

obtient le produit recherché.

Stade C: 2-amino 6-(formamido) 4-méthylène heptanedioate de

diéthyle.

On ajoute dans une solution renfermant 6,4 g de produit obtenu au stade précédent 200 ml de chlorure de méthylène, ml d'une solution d'acide chlorhydrique dans l'éther anhydre (2,6 N). On agite pendant 1 heure à la température ambiante. On effectue un barbotage d'azote. On amène à sec sous pression réduite à 30C. On reprend le résidu obtenu par le chlorure de méthylène, on neutralise et concentre à sec. On obtient 4,6 g de produit recherché brut que l'on purifie par chromatographie sur silice en éluant par le mélange acétate

d'éthyle-éthanol (9-1). rf = 0,06.

Stade D: 2-formamido 4-méthylène 6-[[0-méthyl N-[N-(l-oxo octadécyl) Lalanyl] gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioate de diéthyle. On refroidit à 14'C 14C une solution renfermant 0,992 g de N-[N-(l-oxo octadécyl) Lalanyl] D-glutamate acide de (1) méthyle, 50 cm3 de dioxanne et 50 cm3 de tétrahydrofuranne. On ajoute 0,58 cm3 de triéthylamine et 0,3 cm3 de chloroformiate d'isobutyle. On agite 35 minutes à 14'C. On ajoute 0,572 g du

produit obtenu au stade C en solution dans 10 ml de tétrahy-

drofuranne. On agite 2 heures à la température ambiante. On

amène à sec sous pression réduite à 30'C. On obtient un pro-

duit que l'on chromatographie sur silice en éluant par le mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (2,5-7,5). On obtient

480,6 mg du diastéréoisomère A et 476 mg du diastéréo-

isomère B. Stade E: 2-amino 6-[[0-éthyl N-[N-(l-oxo octadécyl) L-alanyl] gamma-D-glutamyl] amino] 4-méthylène heptanedioate de diéthyle. On agite à 80 C durant 45 minutes, une solution étanolique renfermant 403 mg de produit obtenu au stade précédent et une solution d'acide chlorhydrique concentré (0,41 cc) dilué au dixième dans l'éthanol. On refroidit, ajoute 2 cm3 d'eau, neutralise au bicarbonate de soude. On extrait au chlorure de méthylène, sèche sur sulfate de magnésium et amène à sec le

filtrat. On chromatographie et obtient le produit recherché.

Stade F: Acide 2-amino 4-méthylène 6-[[EN-[N-(l-oxo octadécyl) L-alanyl] gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioique et son sel trisodique. On dissout 107 mg de produit obtenu au stade précédent, diastéréoisomère B, dans 5 cm3 d'éthanol. On refroidit à 0'C et ajoute 0,43 cm3 de soude. On agite pendant une nuit à la température ambiante. On évapore à sec et obtient 117 mg de produit auquel on ajoute 10 cm3 d'eau apyrogène. On filtre et

lyophylise. On obtient 50 mg de produit recherché.

[alpha]D = -25 2' (c = 1 % H20).

Préparation du 5-amino 1-formamido 3-méthylène 1,1,5-pentane-

tricarboxylate de triéthyle de départ de l'exemple 1.

Stade i: 2-formamido (2-méthyl 2-propényl) propanedioate de diéthyle.

On ajoute 40 g de carbonate de potassium, 0,380 g de cata-

lyseur éther couronne 18 crown 6 et 39,9 g de chlorométhyl propène à une solution de 30 g de formamido-malonate d'éthyle dans 300 cm3 d'acétonitrile, agite au reflux pendant 3 heures, filtre, amène à sec, refroidit à 0'-5'C, reprend dans 10 cm3 d'éther isopropylique, filtre, lave à l'éther isopropylique, sèche sous pression réduite et obtient 25,2 g du produit

attendu. F: 72 C.

Stade 2: 1-formamido 5-hydroxy 3-méthylène 1,1,5-pentane-

tricarboxylate de triéthyle (mélange d'isomères).

On ajoute goutte à goutte en dix minutes une solution de

26,5 g de glyoxylate d'éthyle dans 180 cm3 de chlorure de.

méthylène, à une solution de 84 g de chlorure ferrique dans cm3 de chlorure de méthylène, agite une heure, refroidit à -20 C, ajoute goutte à goutte en vingt minutes une solution de 34 g de produit tel qu'obtenu au stade A dans 180 cm3 de chlorure de méthylène et agite une heure à - 20'C. On verse sur 300 cm3 d'eau glacée, extrait au chlorure de méthylène, lave

avec HCI 2N puis à l'eau salée, sèche, amène à sec sous pres-

sion réduite et obtient 56,5 g du produit attendu (mélange d'isomères). F: 68'C après purification par chromatographie

sur silice (éluant: acétate d'éthyle - cyclohexane 6-4).

Stade 3: 5-azido l-formamido 3-méthylène 1,1,5-pentanetricar-

boxylate de triéthyle.

On dissout 46 g du produit (mélange d'isomères) obtenu au stade 2 dans 500 cm3 de pyridine, refroidit à -0'C, ajoute goutte à goutte à 0C, 12 cm3 de chlorure de méthanesulfonyle, agite 3 heures à température ambiante, verse sur 400 cm3 d'acide chlorhydrique 4N glacé et 200 cm3 de chlorure de méthylène, extrait au chlorure de méthylène, lave avec de

l'acide chlorhydrique 4N avec une solution saturée de bicar-

bonate de soude et avec de l'eau salée, sèche et évapore à sec

sous pression réduite.

On dissout les 56 g de résidu obtenus dans 250 cm3 de diméthylformamide, ajoute 9,98 g d'azoture de sodium, agite 16 heures à température ambiante, élimine le solvant, reprend dans du chlorure de méthylène, lave avec une solution saturée en bicarbonate de sodium puis à l'eau salée, sèche, amène à sec et obtient 59 g de produit attendu (mélange d'isomères) que l'on purifie par chromatographie sur silice (éluant: cyclohexane - acétate d'éthyle 8-2) pour obtenir 26 g du

produit attendu.

Stade 4: 5-amino l-formamido 3-méthylène 1,1,5-pentanetricar-

boxylate de triéthyle.

On ajoute 10,9 g de triphénylphosphine à une solution de 13 g du produit ci-dessus dans 250 cm3 de tétrahydrofuranne à

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ll environ -5'C, agite 5 heures à température ambiante, ajoute 8,5 cm3 d'eau, agite 24 heures à température ambiante, évapore

le tétrahydrofuranne, reprend le résidu au chlorure de méthy-

lene, verse sur de l'acide chlorhydrique 2N glacé, extrait à l'acide chlorhydrique 2N, neutralise au bicarbonate de sodium, extrait au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche,

amène à sec et obtient 10 g du produit attendu.

F < 50 C après recristallisation dans l'éther isopropylique.

Préparation du N-[N-(l-oxo octadécyl) L-alanyll D-glutamate de (1) méthyle utilisé au stade D.

Stade 1: N-(l-oxo octadécyl) L-alaninate de méthyle.

A une solution de 10 g de chlorhydrate du L-alaninate de méthyle dans 250 cm3 de chlorure de méthylène, on ajoute 24,9 cm3 de triéthylamine, puis goutte à goutte en 30 minutes, une solution de 21,7 g de chlorure de stéaryle dans 50 cm3 de chlorure de méthylène, agite pendant deux heures 30, filtre, lave avec de l'acide chlorhydrique 2N, puis à l'eau salée, sèche, amène à sec sous pression réduite, empâte le résidu à l'éther isopropylique, essore et recristallise dans le

méthanol. On obtient 22 g du produit attendu.

F: 84C [alpha]D = -15* (c = 1 % pyridine).

Stade 2: N-(l-oxo octadécyl) L-alanine.

On refroidit à O'C une suspension de 21 g de produit ci-

dessus dans 500 cm3 de méthanol, ajoute goutte à goutte 62.cm3 de potasse N, agite pendant 16 heures à température ambiante, ajoute 500 cm3 de méthanol, agite pendant quatre heures, refroidit à 0'C, amène à pH 3 à l'aide d'acide chlorhydrique 2N, évapore, reprend au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, amène à sec sous pression réduite, empâte le résidu à l'éther isopropylique, essore, recristallise dans le

méthanol et obtient 11,8 g du produit attendu. F: 102'C.

[alpha]D = -18 (c = 0,9 % pyridine).

Stade 3: N-tN-(l-oxo octadécyl) L-alanyl] D-glutamate de (5)

1,1-diméthyléthyle et de (1) méthyle.

On refroidit à' 0C une suspension de 1,77 g de N-(l-oxo

octadécyl) L-alanine et 1,08 g de D-glutamate de (5) 1,1-dimé-

thyléthyle et de (1) méthyle dans 170 cm3 de diméthoxyéthane, ajoute goutte à goutte en dix minutes une solution de 1,23 g

de N,N-dicyclohexyl carbodiimide dans 5 cm3 de diméthoxyétha-

ne, agite 3 heures à température ambiante, refroidit, filtre amène à sec, reprend dans 250 cm3 d'éther à chaud, filtre,

amène à sec sous pression réduite, empâte dans l'éther isopro-

pylique, essore et obtient 2,4 g du produit attendu.

F: 100'C après recristallisation dans le méthanol.

[alpha]D = -32 l1 (c = 1 % CH2C12) Stade 4: N-[N-(l-oxo octadécyl) Lalanyl] D-glutamate de (1) méthyle. On ajoute goutte à goutte 31 cm3 d'acide trifluoroacétique à une solution de 11,4 g du produit ci-dessus dans 150 cm3 de chlorure de méthylène, laisse pendant 16 heures sous agitation, amène à sec sous pression réduite, reprend au chlorure de méthylène, lave à l'eau salée, sèche, filtre, amène à sec sous pression réduite, cristallise, recristallise

dans l'éthanol et obtient 6,8 g du produit attendu. F - 110 C.

[alphalD = -16 1' (c = 0,9 % pyridine).

Exemple 2: Acide 2-amino 4-méthylène 6-[rN-(1-oxo octadécvl)

gamma-D-qlutamyl] aminol heptanedioîaue.

Stade A: 2-formamido 4-méthylène 6-[[0-méthyl N-(1-oxo

octadécyl) gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioate de diéthyle.

Dans une solution de 615 mg de N-(l-oxo octadécyl) gluta-

mate acide de (1) méthyle, dans un mélange THF-dioxanne 50-50,

refroidi à 14'C, on ajoute en 5 minutes 0,62 cm3 de triéthy-

* lamine, 0,3 cm3 de chloroformate d'isobutyle. On agite la suspension obtenue à 14*C pendant 35 minutes. On ajoute alors 915 mg de produit préparé au stade C de l'exemple 1 dans

cm3 de tétrahydrofuranne. On maintient le mélange réaction-

nel sous agitation pendant 2 heures à la température ambiante.

On ajoute de la glace, extrait au chlorure de méthylène, lave, sèche, filtre et concentre par évaporation à 300C. On obtient

2,1 g de mélange de diastéréoisomères A et B que l'on chroma-

tographie sur silice en éluant par le mélange cyclohexane

acétate d'éthyle (2,5-7,5). On obtient 588 mg de diastéréoiso-

mère A et 580 mg de aiastéréoisomère B. Stade B: 2-amino 4-méthylène 6[[0-méthyl N-(l-oxo

octadécyl) gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioate de diéthyle.

a) Diastéréoisomère A On ajoute 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré, dans une solution renfermant 470 mg de diastéréoisomère A obtenu au stade précédent dans 4,7 cm3 d'éthanol. On chauffe à 80 C durant 45 minutes. On ajoute 20 cm3 d'eau, amère à PH=7, 263577c extrait au chlorure de méthylène, sèche, filtre porte à sec le filtrat. On obtient 500 mg de diastéréoisomère A que l'on purifie par chromatographie sur silice; on obtient 251 mg de diastéréoisomère A. RMN (CDC13, 250 MHz). 3,64: H en position 2 de la chaine principale 4,99: H du groupe méthylène substitué en position 4 de la

chaine principale.

b) Diastéréoisomère B On opère de la même façon qu'au stade A, et obtient 243 mg de diastéréoisomère B à partir de 580 mg de produit de départ

(diastéréoisomère B).

RMN (CDC13, 250 MHz).

1,65: H du groupe amino substitué en position 2 de la chaine principale

3,61: H en position 2 de la chaîne principale.

4,96 - 4,98: H du groupe méthylène substitué en position 4 de

la chaîne principale. Stade C: Acide 2-amino 4-méthylène 6-[[N-(l-oxo octadécyl) gamma-D-

glutamyl] amino] heptanedioïque et son sel trisodique

(diastéréoisomère A et diastéréoisomère B).

On introduit à 0'C, 1,02 cm3 d'une solution de soude

0,00102M dans une solution renfermant 233 mg de produit pré-

paré au stade précédent dans l'éthanol. On agite la solution obtenue pendant une nuit à la température ambiante. On amène à sec sous pression réduite, on dissout le résidu obtenu dans cm3 d'eau. On filtre et lyophilise. On obtient 133 mg de diastéréoisomère A.

[alpha]D -9 2 (c = 0,7 %).

RMN (D20).

4,16 et 4,33: H en position 6 de la chaîne principale et H du

CH du groupe gamme-D-glutamyl.

3,41: H en position 2 de la chaîne principale.

0,89: H en position 18 du groupe octadécyl.

On obtient en opérant dans les mêmes conditions 194,4 mg de diastéréoisomère B, à partir de 234 mg de produit de départ

(diastéréoisomère B).

[alpha]D -8,5' 2' (c - 0,7 %).

RMN (D20)

4,15 et 4,32: H en position 6 de la chaine principale et H du 263577c

CH du groupe gamma-D-glutamyl.

3,46: H en position 2 de la chaine principale.

0,88: H en position 18 du groupe octadécyl.

Préparation du N-(l-oxo octadécvl) qlutamate acide de (1) méthyle utilisé comme produit de départ de l'exemple 2. Il est préparé selon le schéma réactionnel suivant: C02Me

I TEA

CH3(CH2)16COCl + H2N CH

|I CH2C12

CH2CH2CO2tBu CO2Me CO2Me

I| CF3CO2H

CH3(CH2)16CONHCH > CH3 (CH2)16CONHCH

|J CH2Cl2 CH2CH2CO2tBu Ta CH2CH2CO2H

PF = 70'C PF = 100 C

[alpha]D20 = 10 1 [alpha]D20 = +15' 1 c = 0,8 % pyridine c = 1 pyridine

Exemple 3:

On a préparé des comprimés répondant à la formule: Produit de l'exemple 1.

................... 50 mg Excipient q.s. pour un comprimé terminé à... 250 mg (Détail de l'excipient: lactose, amidon, talc, stéarate de magnésium)...DTD: ETUDE PHARMACOLOGIQUE

Stimulation des cellules monocytaires par un immunostimulant.

Les cellules mononuclées du sang circulant de donneurs normaux sont séparées suivant la technique classique décrite par Boyum utilisant un gradient de Ficoll. Après lavage, les mononucléaires sont mis à incuber à 37C pendant une heure à raison de 5.106 monocytes (cellules NSE+) par ml de milieu de culture, 5 ml par flacon de culture. Le milieu de culture utilisé dans cette expérience se compose de RPMI 1640 additionné d'antibiotiques et de tampon Hépès. Au bout d'une heure, les cellules non adhérentes sont enlevées par lavage

263577?

des flacons à l'aide de milieu précédemment porté à 37'C, les cellules adhérentes se composant essentiellement de monocytes (>90 %) sont remises en culture en présence de différentes

quantités de produits à tester dans un tampon P.B.S.

(Dulbecco) sans Ca2+, ni Mg2+. La culture est poursuivie pendant 24 ou 48 heures et les surnageants des cellules sont alors prélevés, centrifugés, aliquotés et conservés soit à -80'C soit.à -20'C. Les surnageants de culture sont remplacés,

dans les flacons par la même quantité d'eau distillée apyro-

gène afin de lyser les cellules. Le lysat est récupéré, ali-

quoté et conservé également a -20 C. Les expériences suivantes ont été réalisées en présence ou en l'absence d'Interferon gamma recombinant (103 U/ml) à une dose o l'IFN gamma seul

est inactif.

Tests de la présence dans les surnageants de monokines (Inter-

leukine-l et Tumor Necrosis Factor) par leur activité biologi-

que. Test Interleukine-l (IL-1): Ce test a été décrit la première fois par I. Gery et Waksman en 1972 (Gery I and B.H. Waksman 1972. Potentiation of the T lymphocyte response to mitogens. II. Thé cellular source of

potentiating mediator (s) J.Exp.Med., 136-143.

I1 est basé sur l'action co-mitogène de l'IL-l en présence d'un antigène (mimé par la phytohémaglutinine dans le test) sur des thymocytes de souris. 1,5 x 106 thymocytes de souris

C3H/HeJ (provenant du C.S.E.A.L. d'Orléans) sont mis en cul-

ture pendant trois jours en présence de différentes dilutions de surnageants et de lysats cellulaires susceptibles de contenir de l'activité IL-1 et de PHA-P Wellcome (1 yg/ml) dans des plaques de culture 96 puits fond plat, dans un volume final de 200 p1 de milieu composé de RPMI I640 contenant outre des antibiotiques (pénicilline lU/ml streptomycine 1000 U/ml du tampon Hépès 1 mM de glutamine, 2 mM 5 % de sérum de veau et 5 x 10-5M de 2-mercaptoéthanol. Au bout de 68 heures de culture, 1 pCi de thymidine tritiée est ajoutée à chaque puits (3H-méthylthymidine, CEA Saclay, TMM79A activité spécifique lpCi/mM), la radioactivité incorporée par les cellules est évaluée après avoir filtré les cultures sur appareil collecteur semi-automatique de type Skatron et compté

les filtres dans un compteur à scintillation (LKB). Les résul-

tats sont exprimés par la différence entre les impulsions par minute incorporées par les cultures en présence de surnageants et les impulsions par minutes incorporées par les cultures témoins. Test Tumor Necrosis Factor (TNF): L'activité TNF est mise en évidence par la toxicité de ce facteur sur des cellules cibles L-929 (sous-clone alpha). La technique a été sensibilisée en ajoutant dans le test de l'actinomycine D. Les cellules L sont distribuées à raison de 2 x104 cellules par puits d'une microplaque à fond plat dans 100 y 1 de milieu RPMI 1640 enrichi avec 5 % de sérum de veau, de la glutamine, du tampon Hépès et des antibiotiques. Au bout de 24 heures, différentes dilutions des surnageants à tester sont

ajoutées dans un volume de 100 p1 ainsi qu'une dose d'acti-

nomycine D de 1,g/ml. Au bout de 24 heures de culture, la

quantité de cellules viables non lysées est évaluée en colo-

rant les plaques au violet crystal et en mesurant la densité

optique des différents puits sur lecteur multiscan.

RESULTATS:

Les produits des exemples stimulent les monocytes et leur production d'ILl et de TNF. De plus, il y a synergie entre

les produits des exemples et l'Interféron gamma et/ou le LPS.

Stimulation des cellules lymphocytaires par un immunosti-

mulant.

Test de transformation lymphoblastique: Les cellules mononucléées du sang circulant sont mises en culture, à raison de 2.106 cellules/ml dans des microplaques 96 puits à fond plat (Nunc) dans 100i 1 de milieu RPMI 1640

enrichi de 10 % de sérum de veau foetal (Hyclone), d'antibio-

tiques, de glutamine et d'Hépès. Les produits à tester sont rajoutés dans les puits à raison de 100 1 aux dilutions finales de 1,10 ou 100 /g/ml soit seuls, soit en présence de

phytohémaglutinine PHA-P (Welcome labs) à 1 et/ou 101g/ml.

Les plaques sont mises à 37C dans un incubateur à C02 en atmosphère saturée en humidité. Au bout de 2 et 5 jours, les cultures sont arrêtées une incorporation de thymidine tritiée est réalisée dans les conditions décrites ci-dessus dans le test de détection de l'Interleukine-1. Les résultats sont

exprimés en impulsions par minutes.

En résumé, les produits des exemples chimiques se sont révélés ni cytotoxiques pour les lymphocytes en culture, ni

mitogènes pour ces mêmes cellules. Par contre, ajoutés en même -

temps qu'un produit réputé mitogène T non spécifique comme la PHA, ils se sont révélés capables d'inhiber en partie (surtout

à 100 pg/ml) les effets de ce produit (voir figure ci-jointe).

Ces résultats ont pu être reproduits sur tous les donneurs

essayes (entre 3 et 30 par produit).

Production d'immunoglobulines: Les mêmes cellules ont été cultivées pendant une semaine en présence des différents produits à tester à la dose de 0.1,1 et 10 eg/ml seuls ou en présence de deux doses de bactéries Staphylococcus aureus Cowan (SAC) (10-3 et 10-4)

bactéries connues pour stimuler la production d'immunoglobu-

lines par les lymphocytes B humains de manière non spécifique.

Les surnageants sont récoltés à la fin de la culture, et leur contenu en immunoglobulines est évalué par des techniques

classiques de détection par méthode ELISA utilisant un anti-

corps anti-immunoglobulines humaines du commerce. Les résul-

tats sont exprimés en ng d'immunoglobulines par ml de surnageant. Les expériences nous ont montré que les produits utilisés seuls ne sont pas capables de provoquer la stimulation des

lymphocytes de type B (ni leur prolifération, ni leur diffé-

renciation en plasmocytes) mais en présence de SAC le produit

de l'exemple i est capable d'augmenter la production d'immu-

noglobulines. Par contre, le produit de l'exemple ne donne pas le même résultat (voir figure'de la planche 1/1) le Activité in vivo

Activation des macrophages.

La capacité d'activer les cellules du compartiment monocy-

taire macrophagique a été confirmé in vivo chez la souris.

Après injection par voie intrapéritonéale de différentes doses des produits à tester, les cellules péritonéales des souris

BALB/c ont été recueillies; la quantité de cellules retrou-

vées n'a pas augmentée et ce sont essentiellement des macro-

phages, ce qui montre que ces produits ne sont pas chimiotac-

tiques dans les conditions utilisées tout au moins. Les macrophages présentent la particularité de pouvoir mieux

répondre à une stimulation membranaire qui "mime" une phagocy-

tose; en effet, ces cellules ne produisent pas spontanément

des anions surperoxydes ou de l'eau oxygénée, mais ce m4tabo-

lisme oxydatif a été préparé et se déclenche dès le signal phagocytaire. Les expériences ont été réalisées avec les différents produits, l'exemple proposé sur la figure ci-jointe est le produit #1, la mise en évidence du métabolisme oxydatif a été faite par une technique de chimiluminescence en présence

de luminol, en utilisant un chimiluminomètre Berthold LB950.

La cinétique de la réaction montre que ce phénomène d'activation dure de 24 & 48 heures suivant l'injection unique

de produit.

Claims (3)

REVENDICATIONS

1) Les composés répondant à la formule générale I de la reven-

dication 1 de la demande de brevet principal, à savoir:

l'acide 2-amino 4-méthylène 6-[EN-[N-(l-oxo octadécyl) L-

alanyl] gamma-D-glutamyl] amino] heptanedioïque (isomère B) et

l'acide 2-amino 4-méthylène 6-[[N-(1-oxo octadécyl) gamma-D-

glutamyl] amino] heptanedioique (isomère A et isomère B), ainsi que leurs sels d'addition avec les acides organiques et minéraux.

2) A titre de médicaments, les composés définis à la reven-

dication 1, ainsi que leurs sels d'addition avec les acides

organiques et minéraux pharmaceutiquement acceptables.

3) Les compositions pharmaceutiques renfermant comme principe

actif au moins un médicament défini à la revendication 2.