JPH02111792A - 抗体精製法に有用なヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）ペプチド - Google Patents

抗体精製法に有用なヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）ペプチド

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JPH02111792A
JPH02111792A JP1187233A JP18723389A JPH02111792A JP H02111792 A JPH02111792 A JP H02111792A JP 1187233 A JP1187233 A JP 1187233A JP 18723389 A JP18723389 A JP 18723389A JP H02111792 A JPH02111792 A JP H02111792A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗体精製技術に関する。さらに詳しくは、ポリ
クロナル抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）抗体
精製のための合成ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈ　Ｃ
Ｇ）に関する。
従来の技術および解決すべき課題 種々の分析方法および手段が生体体液あるいは池の物質
中に存在し得る興味あるかつ臨床上重要な物質の存在お
よび／あるいは濃度の測定分析に利用されている。その
ような物質は一般に分析物（ａｎａｌｙｔｅｓ）と称さ
れ、抗体、抗原、薬物、ホルモン等が含まれる。血清、
血漿、尿および脳を’ｆｆ１ｉｌｌ１等生体体液中の特
殊な分析物の検出は、近年研究および臨床両分野におい
て重要になっている。興味ある分析物の検出は種々の病
的状況に関係し得、従って、病気の診断および治療の効
果を知るうえで、非常に有効である。分析物が抗原ある
いは抗体の場合には、これらの物質と特殊づける免疫学
的反応性を利用して検定が行なわれる。一般にこのよう
な検定は総して免疫学的検定法と称される。
免疫学的検定法は、生物にとって病原性かあるいは異質
である抗原の存在に感応して抗体が生成されるという、
高等生物の免疫系の機構を利用するものである。特定の
抗原に感応して１個以上の抗体か生成され、それらは該
特定の抗原と反応して高特異性反応機構を創製するもの
で、それによって、インビトロで生物学的検体中のその
抗原の存在およびその濃度の測定か行なわれる。
しかしなから、免疫学的検出法の測定結果は使用する抗
体の型と、特定の抗原に対するその抗体の特異性によっ
て変化し得る。ｈＣＧの定量においては、使用される特
定の抗ｈＣＧ抗体は、第２の糖蛋白抗原、たとえばヒト
黄体ホルモン（ｈＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）
あるいは甲状腺刺激ホルモンと交叉反応する可能性があ
り、そのため、検定の精度が低下する。たとえば、ｈＣ
Ｇを認識し結合する抗体は一般にｈＣＧと特異的に結合
するというよりもＬＨ，ＦＳＨおよびＴＳＨとも結合す
るであろう。抗体精製法は交叉反応を最小にするように
工夫されている。このような従来法の代表例として、ｈ
ＣＧの全分子を含有して１ｇ０分子の特異な部分を濃縮
する第１アフイニテイーカラムと、ＬＨまたはＦＳＨを
含みｈＣＧと交叉反応する抗体を除くようにした第２ア
フイニテイーカラムからなる２力ラム方式を使う方法が
ある。この従来法で得られるｈＣＧポリクロナル抗体は
、なお、著しい交叉反応性を有している。
さらに、この２力ラム方式は時間がかかり、かつ高価で
ある。
ｈＣＧやｈＬＨのような分析物の化学的分析によれば、
これらのホルモンの交叉反応性は構造的に類似している
それらのα−サブユニットに負うことが判明した。従っ
て、ｈＬＨと構造上比較的穴なっているｈＣＧのβ−サ
ブユニット（β−ｈＣＧ）の分離、精製が試みられてい
る。しかしながら、その分離法では依然不純物を含み、
ｈＣＧとｈＬＨ両者に共通のアミノ酸配列を含んでいる
。
β−ｈＣＧのＣ０ＯＨ末端に位置するペプチド部はおよ
そ４５のアミノ酸から成る。この部分はｈＬＨに対する
ｈＣＧの顕著な識別を可能にすることがわかっている（
マツウラら、Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１０４：
３９６．．１９７９）。また、イワサらも、抗ｈＣＧ抗
体調製に有用なβ−ｈＣＧのＣ０ＯＨ末端ペプチド（以
下、ＣＴＰと略す）の特異性を持つ部分を再生成する合
成ペプチド配列の製造について報告している（米国特許
筒４．５１７．２９０号）。このβ−ｈＣＧのＣＴＰの
アミノ酸配列は４５のアミノ酸から成り、式 ％式％ で表わされる［モルガンら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　
　Ｂｉ。
Ｃｈｅｍ、２（１）、９７　９９（１９７３）］。イワ
サによって報告されたポリクロナル抗体精製のための合
成ペプチド配列は式： ％式％ から式： Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ”’−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｌｅｕ
−Ｐｒ。
Ｓｅｒ”−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ”
５Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ”０−　
Ｐｒｏ　−１１ｅＬ　ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ’
　”までの１０から２３までのアミノ酸残基のＣＴＰフ
ラグメントあるいはアミノ酸配列から成る。
上記の文献いずれも抗体の交叉反応性を軽減するために
２３以上のアミノ酸残基のＣＴＰ配列を示唆していない
。
課題を解決するための手段 特殊な合成アミノ酸配列が高特異性のある抗ｈＣＧ抗体
の生成に有効に使われるということがわかり、本発明は
この知見に基づいてなされたものである。従って、本発
明はｈＣＧ分析物類似物を用いる抗ｈＣＧ抗体の精製法
を目的とし、さらにはｈＣＧ分析物類似物の生成を目的
とする。この精製法は式： ＡｓｐＨ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ”　　−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−３ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ１２’−３ｅｒ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ｐｒ。
Ｐ　ｒｏ１２５−　Ｐｒｏ　−Ｓ　ｅｔ　−Ｌｅｕ　−
Ｐ　ｒｏ−３ｅｔＩ３’　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ１３’−Ｇ　ｌｙ　−Ｐｒ。
５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ”０−　Ｐｒｏ　−Ｉ　Ｉｅ　
−Ｌｅｕ　−Ｐｒ。
ＧｌｎＩ′５ のペプチド配列を持つｈＣＧ分析物類似物を担体あるい
は支持体上に不溶化したアフィニティーカラムを使う。
またペプチド配列に同じ様にエピトープを持つ抗ｈＣＧ
抗体は、特異的に抗ｈＣＧ抗体を含有する体液から吸着
される。
本発明の他の好ましいｈＣＧ分析物類似物は式；％式％ ［式中、ΔｓｘがＡｓｐ、ＧｌｘがＧｌｕ］で示される
Ｃ末端ペプチドの変異体も含む。さらに本発明の好まし
いペプチド配列は、アフィニティーカラムでの使用に際
し支持体へのペプチドの固定を促進するために１つある
いはそれ以上の末端Ｌｙｓ残基を含有し得る。たとえば
ｈＣＧ分析物類似物は式； ％式％ ［式中、ＡＳＸはＡｓｐ、　ＧＩＸはＧｉｎ］で示され
、またそのペプチド配列は少なくとも１つの末端Ｌｙｓ
残基を含む。さらに２３以下のアミノ酸残基のペプチド
配列および変異体配列体も使われ得る。
本発明により生成される抗ｈＣＧ抗体は、以下に詳述す
るように、検定に有効に使用される。
本発明はｈＣＧ分析物類似物を用いて抗ｈＣＧ抗体の精
製法を提供することを目的とする。本発明の方法はモノ
クロナル抗ｈＣＧ抗体の特異性に匹敵する特異性を持つ
積装ポリクロナル抗ｈＣＧ、抗体の生成を可能とする。
本発明の方法は、上記の従来の方法に比べて時間節約や
低装造コストの点で非常に有利である。
ここで用いる語句を以下に説明する。
［決定因子Ｊ　（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）とは、抗
原と抗体の免疫学的結合で象徴される特殊な結合反応に
密接に関与する分析物や他の特殊結合因子の部位である
。すなわち、本質的に決定因子は、免疫学的特異性に基
づいて、抗原を、従って抗体を他のものと区別する因子
である。
［分析物類似物Ｊ（ａｎａｌｙｔｅ　−ａｎａｌｏｇ）
とは、実質的に対照の分析物の１以上の決定因子と同じ
空間的極性的機構を有する分子である。この決定因子の
′ｆ９製は、分析物類似物が分析物の特異的結合特性を
模倣するのを可能にする。従って、分析物類似物は分析
物の特異的結合因子に結合できる。さらに分析物類似物
は、分析物と同一てないが、分析物の特異的結合因子に
結合するのに必要な決定因子を含むよう改変され得る。
「特異的結合因子Ｊ（ｓｐｅｃｉｒｉｃ　ｂｉｎｄｉｎ
ｇ　ｍｅｍｂｅｒ）とは、特異的結合ペアーの一員、す
なわち、１つの分子が化学的あるいは物理的手段により
もう１つの分子に結合する２つの異なった分子のうちの
一方である。免疫学的特異的結合因子には、抗原、ハプ
テン、抗体およびそれらのＤＮＡ組換え法やペプチド合
成により形成された複合体が含まれる。
抗体はモノクロナルあるいはポリクロナル抗体、組換え
蛋白あるいはその混合物やフラグメント、さらに抗体と
他の特異的結合因子との混合物である。このような抗体
の調製およびそれらの特異的結合因子としての適合性は
この分野で公知である。
「標識」とは、特異的結合因子に結合し、可視的にある
いは機器による手段によって検出可能な信号を生成する
ことのできる物質である。本発明に使用される種々の好
ましい標識は色素源、触媒、蛍光物質、化学ルミネッセ
ンス化合物、放射性標識、コロイド状金属あるいは非金
属粒子などの直接可視標識、染色粒子、酵素あるいは基
質、有機重合体粒子、リポソームあるいは信号生成物質
を含有した小胞体等である。
標識として好ましく使用される多くの酵素が米国特許第
４，２７５，１４９号、カラム１９−２３に報告されて
いる。また、本発明に有用な酵素／基質信号生成システ
ムの一例は、アルカリホスファターゼとニトロブルーテ
トラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドー
ルリン酸塩あるいはその誘導体あるいはその類似物であ
る。
もう１つの信号生成／ステムでは、標識は蛍光物質で、
この場合は測定可能な信号を生成するために標識の酵素
処理は必要としない。この反応では標識としてフルオレ
ノセイン、フィコビリン蛋白、ローダミンおよびそれら
の誘導体や類似物が好ましい。
可視的に測定可能な青色した粒子か指示試薬の（票識成
分として使用され、それによりさらに標識生成試薬の必
要もなくて、検体中の分析物の存在および濃度を測定し
得る直接的着色指標か提供される。着色粒子して使用で
きる物質には、米国特許第４．３１３，７３４号および
第４．３７３　９３２号に記載の金などの金属コロイド
や染料粒子が挙げられる。コロイド状セレン粒子なとの
非金属コロイドの調製、使用は１９８７年７月９日に出
願された米国特許出願第０７２０８４号に記載されてい
る。免疫クロマトグラフィーにおけるコロイド状粒子標
識の使用は、１９８７年７月１３日出願の米国特許出願
第０７２４５９号に記載されている。有機重合体ラテッ
クス粒子の使用は１９８８年９月２３日出願の米国特許
出願第２４８８５８号に記載されている。
「指示薬」とは特殊結合因子に結合している（瓢瀧を意
味する。指示薬は検体中の分析物の１ｕに相関したレベ
ルで測定可能信号を生成する。一般に指示薬は固相に捕
獲されたあと検出、測定されるか、非結合指示薬も測定
されて、分析結果に現れてくることもある。
指示薬の特殊結合因子は、サンドウィッチ検定法におけ
るように分析物に結合するか、競合法におけるように捕
獲試薬に結合するか、あるいは間接検定法におけるよう
に副特殊結合因子と結合することかできる。上記のごと
く、標識は指示薬が検体中の分析物の量に相関して測定
可能信号を生成するのを可能にする。指示薬の特殊結合
成分は、（学識か分析物や副特殊結合因子やあるいは捕
獲試薬に間接的に結合するのを可能にする。粒子標識の
選択は重大ではないが、しかし、標識は着色有機重合体
ラテックス粒子によって生じた可視的測定可能信号のよ
うな、それ自体によって測定可能信ぢを発生させること
もてきるし、あるいは酵素／基質信号生成システムのよ
うに、１つあるいはそれ以上の付加信号生成成分と結合
することにより測定可能信号を発生させることができる
。種々の異なった指示薬が標識や特殊結合因子を変える
ことによって得られる。これらの選択は検出すべき分析
物や検出方法を考慮してなされるということは、この分
野で自明である。
「捕獲試薬１（ｃａｐｔｕｒｅ　ｒｅａｇｅｎｔ）とは
、一般に、しかし、すべての場合ではないが、固相に付
着した非標識特殊結合因子である。成分の付着は本質的
には不可逆性で共有結合機構を含む。捕獲試薬は実質的
に分析物および／あるいは指示薬を他の分析試薬や残り
の検体と分離することにより、測定可能信号の観察を助
長するために使用される。
捕獲試薬の特殊結合因子はサンドウィッチ検定法におけ
るように分析物に特異的であるか、または競合法におけ
るように指示薬あるいは分析物に特５−￥的であり、あ
るいは間接検定法におけるようにそれ自体分析的に特異
性を示す副特殊結合因子に特巽性である。
「副特殊結合囚子Ｊ（ａｎｃｉｌｌａｒｙ　５ｐｅｃｉ
ｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｅｍｂｅｒ）とは、捕獲試
薬や指示薬の特殊結合因子に加えてさらに検定に使用さ
れる特殊結合ペアの一員である。たとえば間接検定法に
おいて副特殊結合因子は分析物自体が付着できない第２
の特殊結合因子と同様分析物を結合し、あるいは競合法
では副特殊結合因子は下記の如く参照結合因子かもしれ
ない。１つあるいはそれ以上の副特殊結合因子が１つの
検定に使用され得る。
「固相Ｊ（ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ）とは、不溶性であ
るかまたはのちの反応によって不溶化され得る物質であ
る。本発明の検定法は多くの形態かあり、そのいくつか
は固相の物質の選択に依存する。たとえば固相は適当な
多孔性物質を含む。多孔性とは、液体が流れたり容易に
通過できる性質である。本発明では同相は１つ以上の検
出試薬を含有する１つあるいはそれ以上の層を有する流
下式検定器具（ｐｏｕｒ　ａｎｄ　ｒｌｏｗ−ｔｈｒｏ
ｕｇｈ　ａｓｓａｙ　ｄｅｖｉｃｅ）に用いられるガラ
ス繊維、セルロース、あるいはナイロンパッド、浸漬読
み取り検定法（ｄｉｐ　ａｎｄ　ｒｅａｄ　ａｓｓａｙ
）で用いられるディソブスティソク、吸上法（ｖｉｃｋ
　ｉ　ｎｇ）用の試験片（紙等）あるいは薄層クロマト
グラフィー用の試験片にトロセルロース等）、あるいは
この分野で公知の多孔性物質を含む。しかしなから、固
相は多孔性物質に限定されない。同相は重合体あるいは
ガラスピーズ、マイクロパーティクル、チューフ、シー
ト、フレート、スライド、小孔、テープ、試験管など、
あるいは固有の充填物を有する物質または充填物を保持
することのできる他のいかなる物質をも含む。
本発明の説明に使用する略語は以下の通りである。
略語 ｌａ ｒｇ ｓｎ ｓｐ ｓｘ ｙｓ ｉｎ ｌｕ ｌｘ ｌｙ ｉｓ ｉｅ ｅｕ ｙｓ ｅｔ ｈｅ Ｐｒ。
アミノ酸 アラニン アルキニン アスパラギン アスパラギン酸（アスパラキン酸塩） アスパラギン酸あるいはアスパラギン システィン グルタミン グルタミン酸（グルタミン酸塩） グルタミンあるいはグルタミン酸 グリシン ヒスチジン インロイシン ロイシン リシン メチオニン フェニルアラニン グリシン Ｓｅｒ　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｔｒｐ　　　トリプトファン ’Ｆｙｒ　　　チロンン Ｖａｌ　　バリン Ｘａａ　　　未知あるいはその他 船釣方法と材料 合成ペプチド 本発明は抗ｈＣＧ抗体の精製のための化学的に合成され
たＣＴＰフラグメントつまり分析物類似物を含む。好ま
しい態様においてそのようなフラグメントは式 ％式％ ［） のアミノ酸配列から成る。この配列はモルガンら（こ、
上って報告された。［Ｍｏ１．　　Ｃａ１１．　　Ｂｉ
ｏｃｈｃｍ。
２（１）、９７−９９（１９７３）］。本発明の合成フ
ラグメントにおいて１１２位から１２２位のペプチド部
分の含有は少なくとも１ｆ１７１Ｉあるいは３個の、該
ｈＣＧ分析物類似物を他の糖蛋白や他のＣＴＰペプチド
配列と有効に区別せしめる付加的決定因子を提供するこ
とがわかった。さらに好ましく態様においては、本発明
の分析物類似物は配列の両末端において１個あるいはそ
れ以上のＬｙｓ残基を含有する。Ｌｙｓ残基の付加はカ
ラムクロマトグラフィーの際にペプチドの不溶化を助長
する。
たとえばこの発明によれば、ＣＴＰ１１２〜１４５分析
物類似物を含有するペプチド配列は５個の付加リシン残
基を有するように合成され、抗ｈｃＧ抗体の精製のため
のアフィニティーカラムを形成するため樹脂支持体に結
合させられた。ＣＴＰ分析物類似物のＣ０ＯＨ末端への
ポリリ／ンユニノトの付加はアフィニティーカラムにお
いて、アフィーケルｌ　Ｏ（Ａｆｒｉｇｅｌ−１０）の
ような支持体への分析物類似物の結合を、抗体作用に悪
影響与えることなく、助けることがわかった（７２−７
８％結合能）。
さらにもう１つの態様においては、本発明で提供された
分析物類似物は式： ％式％ のように変化されたＣＴＰ配列の変異体である。
そのような配列はバールらによって報告されている［Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、
　　４８（２）、　　４１６　４２２　（１９７２）］
。このＣＴＰ変異体は１２０位からＳｅｒアミノ酸残基
１つが除かれ１３８位のＳｅｔがＰｒ。
に置き換わりさらにペプチド配列に一３ｅｒ−ＬｅｕＰ
ｒｏ基が加わった点で上記の第一の態様と異なっている
。さらに好ましい態様においては、ＡｓｘがＡｓｐＳＧ
ｌｘがＧｉｎであり、分析物類似物はペプチド配列のど
ちらの末端にもさらに！あるいはそれ以上のＬｙｓ残基
の付加を含有する。
ペプチド合成あるいは他の化学的方法によるペプチド配
列決定因子の合成は本発明が実施される唯一の方法では
ない。個々の実施者にとってその技術の程度、利用出来
る材料、そして複製すべき決定因子の型によって他の方
法がさらに有効だということもある。例えば、Ｄ　Ｎ　
Ａ　ｉｆｆ換え技術が結合に必要な決定因子を改造する
ことに利用され得る。
方、必要な分析物類似物決定因子は分析物を小片やフラ
グメントに細断（ｍｉｎｃｉｎｇ）　したり消化（（１
ｉｇｅｓｔｉｎｇ）することより生成され得る。そのよ
うなフラグメントは例えば音波破砕のような機械的方法
、化学的方法あるいは酵素を用いた方法により装造され
る。結果として生じたフラグメントとなった分析物物質
は抗原決定因子が付着てきる適当な抗体が固定化されて
いるアフィニティークロマトグラフィーカラムを通過さ
せ得る。そのあと分析物類似物はカラムから適当な溶媒
により溶出され得る。
抗体精製 抗体はやぎに免疫源に対する感応を誘発させて生成され
る。免疫源はこの分野で公知の方法により一連の接種に
より動物に投与された。ここで述べる実験ではやぎが免
疫動物として使用されたかインビトロ、インビボ、いず
れにおいても免疫ｆＡｊに対して抗体を生成可能な動物
か使用できる。抗ｈＣＧ抗体は免疫源としてｈＣＧ全分
子を使用したり、または免疫源として合成β−サブユニ
ットあるいは本発明のＣ末端ペプチド配列などのｈｃＧ
分析物類似物を使用して誘発される。
ｈＣＧ分子のβ−サブユニｙ　＋−に対して生じた抗体
をｃ′ｒｐペプチドあるいは本発明のＣＴＰ変１１１、
ｌ＊か固定化されているアフィニティーカラムに通した
。カラムを洗浄後、ＣＴＰ決定因子に特異性の抗体をカ
ラムから溶出した。本発明に従って生成されたこれらの
ポリクロナル抗体はｈ　Ｌ　Ｉ−（に対して無視できる
程の交差反応性を有していることが判明し、従来の生成
抗体に比へてｈＣＧ全分子の検出に異種サンドイッチ免
疫学的検出法なとの免疫学的検出法において有効に使用
され得る。
使用にあたっては結果として生じた精製抗体は免疫学的
検出法においては指示試薬および捕（足試薬を生成する
ために適当な機能的部分例えば標識あるいは固相などに
結合され得る。正確な使用条件は個々の検出法の型およ
びその独自の要求条件に基づき日常作業者により決定さ
れるたろう。
本発明の好ましいＣＴＰ変異体の使用は、ｈｃＧ類似物
のβ−サブユニットを認識するがｈＬＨとは反応しない
高特異的ポリクロナル抗体の精製のために、簡単に再生
可能な１工程のアフィニティーカラムクロマトグラフィ
ー操作の生成を可能にしそれによってそのような抗体が
使用される検出法の特異性を強化することが判明した。
さらに本発明のＣＴＰ変異体を用いて精製されたポリク
ロナル抗体はＣＴＰペプチドを使用する場合に比べ検出
感度を増加させることが判明している。
本発明の他の利点は、分析物類似物を用いてペプチドア
フィニティーカラムが容易に調整されること、また従来
の方法に比べてそのようなカラムを用いて容易に特異性
抗体が生成されることである。こうして先行文献にある
ような２本のｈＣＧの全分子のアフィニティーカラムと
ｈ　Ｌ　Ｈのアフィニティーカラムの必要がないアフィ
ニティーカラムが本発明により製造され得、またそのカ
ラムはｈ　Ｌ　Ｈに対して実質的に交差反応性を示さな
い抗体溶液を生成することか判明している。さらにこの
方法は迅速で信頼でき再生可能で製造経費は低い。また
本発明により精製されたポリクロナル抗体は従来使用さ
れているモノクロナル抗ｈＣＧ抗体に観察される特異性
に近い特異性を有することが判明している。この驚くへ
き結果はＣＴＰに存在する限定された数のエピトープに
帰する（ビダルトら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、　　１３４：
４５７．　１９８５）。
本発明により提供される分析物類似物はまた分析物類似
物決定因子に特異性の抗体を誘発するための免疫源を生
成するために使用され得る。このような免疫源は分析物
類似物を担体蛋白例えばヘモグロビンあるいは牛血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）なとに結合させることにより生成さ
れる。例えばそのような免疫源にはｈＣＧのβ−サブユ
ニットに結合した担体蛋白およびＣＴＰ配列あるいはそ
の一部や変異体に結合した担体蛋白がある。ペプチドと
担体はカルバミン酸塩、アミド、アミノ、チオエーテル
およびエーテルなどの連結基により連結している。
本発明の好ましい態様は下記の実験例により詳細に説明
するがそれに限定されるものではない。
実施例 実施例１ ヘルペスペプチドの合成 ヘルペスペプチド分析物類似物は本発明により生成され
、下記のように１１０８−１１４０位塩基対の間の部分
に暗号化された単純ヘルペスウィルスＩ製糖蛋白Ｄ（Ｈ
３ＩＧＤ）の２９０−３００位アミノ酸に対応している
［ワトソンら、　　５ｃｉｅｎｃｅ、２１８：　３８１
−３８４　　（１９８２）］。その分析物類似物のペプ
チド配列は式； ％式％ て示される。アミノ酸グリ／ンはペプチドのＣ末端で連
結されており、ペプチドと樹脂支持体の間の連結基とし
て作用する。
Ｂｏａ−Ｇｌｙ−ＯＣＩ−（２−Ｐａｍ−樹脂はミノチ
ェルらの報告した下記の方法により合成された［ＪＯｒ
ｇ、Ｃｈｅｍ、、４３：　２８４５　３８５２　　（１
９７８）お、上びＪ、　　、Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　
Ｓｏｃ、、　　９８：　７３５７−７３６２　（１９７
６）］、２．３６ｇのアミンメチル樹脂（０、２５ｍＭ
／　ｇ）を反応器に入れ塩化メチレン中で３０分間静か
に膨潤させた。その＋’ｔ　０　、８９　ｍＭのジシク
ロへキシルカルボジイミド（１）ＣＣ）を添加して塩化
メチレン中で０．８９ｍＭのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２
Ｃ＋＋Ｈ，Ｃｌ−ｌ２ＣＯ７ｌ（と結合させた。
（Ｖ護されたアミノ酸は、アスパラキン酸とグルタミン
の場合を除いて、既存の対称無水物法により段階的に樹
脂支持体に結合させた。すへての末端アミノ残基はｔ−
ブトキンカルボニール（ｔ−ＢＯＣ）により保護され、
線種のアミノ酸残基の側ｒＬｌｉはΔｓｐはサイクロヘ
キ／ル基（ＯＣｈｘｌ）で、ＧｌＵはベンジル基（ＯＢ
ｚｌ）で保護された。アミノ酸Ｇｌｕ、　　Ｐｒｏ、　
　ＬｅｕおよびＡｌａには下記の結合実験プロトコール
か用いられた。
１　塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
した。（この工程は６回繰り返した。）２．５０％トリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩化メチレン溶液を添加し１
分間振盪させたのち濾過した。
３．５０％トリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液を添加
し２０分間振盪させたのち濾過した。
４　塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
した。（この工程は６回繰り返した。）５．５％ジエチ
ルチミン（ＤＩＥＡ）の塩化メチレン溶液を添加し２分
間振盪させたのちｍ過した。
（この工程は２回繰り返した。） ６、塩化メチレンを添加し、１分間振盪さＵたのち濾過
した。（この工程は３回繰り返した。）７．８当量の保
護アミノ酸を塩化メチレンに溶解し、０°Ｃに冷却した
。この溶液に４当量のＮＮ−ジシクロへキシルカルボジ
イミド（ＤＣＣ）の塩化メチレン溶液を添加した。Ｏ′
Ｃで１０分間撹拌した後、溶液を濾過した。最終濃度が
０．０５モルから０．１モルになるようにこの対称無水
物を樹脂が入った反応器に加えた。この反応器を室温で
２時間振盪したのち反応液を濾過した。
８、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
する。（この工程は３回繰り返した。）９．５％ジエチ
ルアミン（ＤＩＥＡ）の塩化メチレン溶液を添加し２分
間振盪させたのち濾過した。
１０、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾
過した。（この工程は３回繰り返した。）１１、工程７
を繰り返し、４当量の１−ハイドロオキシベンゾトリア
シーＡＯ（ＯＢ′Ｆ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）に溶解しＯ′Ｃに冷却した。
この溶液に４当量のＤＣＣの塩化メチレン溶液を添加し
次いで４当量の保護アミノ酸のＤＭＦ：塩化メチレン−
１：ｌ混液溶液を添加した。この反応混合液をＯ′Ｃで
１０分間撹拌した。次に反応混合液を樹脂を含んだ反応
器に移し室を晶で２時間振盪した。
１２、ＤＭＦ・塩化メチレン−１：１混液を添加し、１
分間振盪させたのち濾過する。（この工程は３回繰り返
した。） １３、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾
過した。（この工程は３回繰り返した。）反応の終了は
サリンらの報告した定量ニンヒドリン試験により監視し
た［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ１畦群、１土
７：　　１４７−１５７　　（＋９８１）］。
保護アミノ酸Ａｓｐの場合は工程１から６までは上記と
同じでその後下記の工程を続けた。
７．４当量の保護アミノ酸の塩化メチレン溶液を４当量
のＤＣＣの塩化メチレン溶液と反応器に加え、室温で２
４〜７２時間振盪した。
８、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
する。（この工程は６回繰り返した。）反応の終了は定
量ニンヒドリン分析により監視した。
グルタミンの場合はコニックとガイガーが報告したＤＣ
Ｃ／ＨＯＢＴ結合実験プロトコールを用いた［Ｃｈｅｍ
、Ｂｅｒ、＋　　１０３：　７８８−７９８　（１９７
０）］。
完全保護ペプチド−樹脂を塩化メチレン中で５分間静か
に膨潤させ下記のプロトコールを用いてＮ−α−ＢＯＣ
保護基を除いた。
１、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
した。（この工程は６回繰り返した。）２．５０％ＴＦ
Ａの塩化メチレン溶液を加え１分間振盪させたのち濾過
した。
３６５０％ＴＦＡの塩化メチレン溶液を加え２０分間振
小させたのち、濾過した。
４、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
した。（この工程は６回繰り返した。）５．５％ＤＩＥ
Ａの塩化メチレン溶液を加え３分間振通させたのち濾過
した。
６、塩化メチレンを添加し、１分間振盪させたのち濾過
した。（この工程は４回繰り返した。）７、樹脂を乾燥
した。
ペプチド−樹脂は２個の分離した反応器に分けあらかじ
め１５ｍｌのｐ−クレゾールを添加した１３．５ｍｌの
無水フッ化水素酸でＯ′Ｃで６０分間処理した。フッ化
水素酸はＯ′Ｃで真空留去する。分離した遊離ペプチド
と樹脂は各１０ｍ１のジエチルエーテルで４回洗った。
ペプチドは１０％および２０％の酢酸水溶液でおのおの
３回抽出した。抽出した水溶液を集め各ＩＱｍｌのジエ
チルエーテルと酢酸エチルで３回ずつ洗浄した。水層を
凍結乾燥しふわふわした白いペプチドを得た。ポリペプ
チドは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
よりリビエルらの報告した常法により精製した［Ｊ　ｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　
　２８８　：　　３０３−３２８　（１９８４）］。精
製ペプブチの組成はｔｔｏ’ｃで２４時間真空加水分解
したあとアミノ酸分析機により確認した。
実施例２ β−ｈＣＧのＣ末端ペプチドの合成 β−ｈＣＧのＣＴＰの１１２ｉ４５位に対応して下記の
ようにｈＣＧ分析物類似物を本発明に従って生成した。
ペプチド配列は式； ％式％ Ｐｒｏ”５−　Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−３
ｅｒＩ３’−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
１３５−Ｇｌｙ−Ｐｒ。
５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ”’　−Ｐｒｏ　−Ｉ　ｌｅ　
−Ｌｅｕ　−Ｐｒ。
Ｇ　Ｉｎ”５ で示される。
分析物類似物をカルボン酸残基から段階固相合成法によ
り樹脂支持体」二で合成した。実質的にはこの合成には
バラニーやメリーフィールドが報告した方法と（Ｔｈｅ
　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　　２　：　　ｌ　９８４）、　
　グロスやマインホノファーか報告した方法［Ｊ、　ｅ
ｄｓ。
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
、　　Ｎ、　　Ｙ、　（１９８０卸を使用した。ＢＯＣ
−Ｌ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ７樹脂を反応器、ベックマンノン
セサイザ−（Ｂｅｅｋｍａｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
）モデル９００に移した。保護アミノ酸を実質的に実施
例１に述べた方法に従い樹脂支持体に段階法により結合
した。１２８．１３４位のアミノ酸Ｌｅｕを結合反応の
終了を確実にするため二重に結合させた。１２６位のＰ
ｒｏを取り込んだあと、すべての残りのアミノ酸を二重
に結合させた。
完全なペプチドは実施例１で述べたプロトコールを用い
て無水フッ素水素酸により完全保護ペプチド−樹脂から
分離された。粗ペプチドはＣ４カラム（１０ｍｍＸ２５
ｃｍ）て逆相ＨＰＬＣにより精製された［流速：３ｎ＋
ｌ／分、溶媒系：０暑％ＴＦＡ／Ｈ，０（Ａ）と１００
％アセトニトリル（Ｂ）の勾配溶出］。使用した勾配は
１０％Ｂから３５％Ｂまで３０分間を要して行った。Ｈ
Ｐ　Ｌ　Ｃカラムからのポリペプチド溶出液は２２５ｎ
ｍと２８０　ｎｍの吸光度により監視した。精製ペプチ
ドの組成は実施例１の方法で確認した。
実施例３ β−ｈＣＧポリリシンＣ末端ペプチドの合成Ｃ末端に付
着した５個の付加リシン残基（ポリリシンＣＴＰと略す
）も含めたポリリジン分析物類似物を下記の工程により
本発明により生成した。
付加リシンは抗ｈＣＧ抗体の精製のためのアフィニティ
ーカラムにおける使用においてペプチド免疫吸着剤の生
成を促進した。付加アミノ酸はたとえば式； ％式％ のようなペプチド配列のいずれかの末端に付加され得る
。
ペプチドはアプライドパイオンステムシンセサイザー（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｃｍｓ　５ｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ）モデル１１３０Ａで合成された点を除いて
」二重と同様に、集められ、分離され、精製された。Ｂ
ｏｃ−Ｌ−１−ｙｓ（２ＣＩ−Ｚ）＝−ＯＣＩ−１２−
Ｐａｍ−樹脂を反応器に移し、（７護アミノ酸を対称無
水物法により段階的に樹脂支持体に結合した（ＤＣＣ／
ＨＯＢＴ結合実験プロト結合実験プロト上コールのアル
キニン、グルタミノ添加の場合は除く）。完全保護ペプ
チド−樹脂は無水フッ化水素酸で処理し次いで上記のよ
うにペプチドの抽出精製を行った。
実施例４ ポリリシンＣＴＰ変異体の合成 式 ％式％ （式中ＡＳＸはＡｓｐ、　ＧｌｘがＧｉｎ、および配列
の末端に５個の付加リシン残基を含む）の配列を有する
ポリリシンＣＴＰ変異体分析物類似物を本発明により合
成した。ペプチドをアミノ酸の側鎖官能基がＬｙｓを２
−Ｃ１−Ｚ　；　ＳｅｒをＢｚｌ　；　Ａｓｐを０Ｂｚ
ｌ；Ａｒｇをｔｏｓｙｌ（Ｔ　ＯＳ　）　；　Ｔ　ｈｒ
をＢｚｌの結合反応で保護されている点を除いて実質的
には実施例３の工程と同じように、集め、分離し、精製
した。１１２，１２３，１２４，１２７，１３３゜１３
５．１３６，１４１．１４２および１４６位のアミノ酸
を対称無水物法を用いて塩化メチレン中で実質的には実
施例１のおなしように再結合した。
完全保護ペプチド−樹脂を無水フッ化水素酸で処理し次
いでさらに４０％酢酸水溶液で抽出すること以外は実質
的には実施例１の工程に従いペプチドの抽出を行った。
粗ペプチドはＣ４カラム（Ｖｙｄａｃ　２２ｍｍＸ２５
ｃｍ、　Ｔｈｅ　Ｓ　ｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｇｒｏｕｐ
Ｈｅｓｐｅｒｉａ、　　ＣＡ　）で逆相ＨＰＬＣにより
実質的に実施例１の工程により精製された［流速：１２
ｍ１／分、溶媒系＝０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ／ｌ−１、Ｏ（
Ａ）と１００％アセトニトリル（Ｂ）の勾配溶出］。勾
配は１９％Ｂで始まり３分間保ち次にウォーターの自動
勾配コントローラー（Ｗａｔｅｒ’ｓ　Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　ｉｏｎ、　　Ｂ　ｅｄｆｏｒ
ｄ、　Ｍ　Ａ　）の曲線７番を用いて４０％Ｂまで２０
分間を要して変化させた。勾配は４０％Ｂを１分間保持
し次いで１分間を要して１９％Ｂまで戻した。ＨＰＬＣ
カラムからのポリペプチド溶出液は同時に２２５ｎｍと
２５４　ｎｍの吸光度により監視した。精製ペプチドの
組成は実施例１の方法で確認した。
実施例５ ＣＴＰ：ヘモシアニン免疫源 実施例２の工程により実質的に生成されたＣ′ＦＰをヘ
モシアニン（リムルス・ポリフェムス・ヘモリンフ■型
起源、シグマ社製）に１−エチル−３−（３−ジメチル
アミ／プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）法により結
合した。１ｍｇのＣＴＰをリン酸緩衝生理食塩水１．０
ｍｌに溶解した。２．０ｍｇのヘモシアニンを秤量しＣ
ＴＰ溶液に移した。２０ｍｇのＥＤＣを計り水２００μ
ｍに溶解した。ＥＤＣ溶液をゆっくりと撹拌下ＣＴＰヘ
モシアニン溶液に加えた。混合液は１時間反応させそれ
からセルロース透析膜（Ｓ　ｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ　、
スペクトラム・メディカル・インダストリーズ・インク
、ロスアンゼルス、カルフォルニア；−分子ｆｆｌ　１
２．０００−１４．０００）を用いて水に対し透析した
。透析は透析外液を３回変えて２４時間行った。透析後
、遠心分離により溶液を透明にした。結果として生じた
接合体をビュウレット法での蛋白金回測定で検定した。
実施例６ 抗ｈＣＧ抗体精製 抗体精製用のアフィニティーカラムを下記の工程により
本発明の分析物類似物を用いて作った。
実質的には実施例４に記載の工程により製造された本発
明のＨＰＬＣによる精製ポリリンンＣＴＰ変異体ペプチ
ドを０．１Ｍ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸（ＭＯｐ　ｓ　＞緩衝液、Ｐ　Ｈ７。
５に溶解した。その溶液をあらかじめ洗浄しＯＩ　Ｍ　
Ｍ　ＯＰ　Ｓ　、　　Ｐ　ｔ（７、５中で活性化してお
いたチフィ−ゲル１０樹脂（／Ｍｆｉｇｅｌ　　ｌ　Ｏ
１］ぐイオラッド社製）のスラリーと結合した。ペプチ
ド（ｍｇ）とアフィーゲル１０　（ｍｌ）の割合は約７
・ｌだった。
２〜８°Ｃで一晩結合反応させた後、樹脂と結合したペ
プチドを０．１Ｍ　ＭＯＰＳ、ＰＨ７，５で３回洗浄し
０．１Ｍ　トリス−（）＼イドロオキシーメチル）−ア
ミノエタン（ＰＨ７，５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、
０１％窒化ナトリウム含有のトリス緩衝生理食塩液中で
平衡させ、２８０ｎｍの初期吸光度（Ａ　、、、）を測
定した。
やぎに生じたｈＣＧのβ−サブユニットに対する抗血清
を２〜８°Ｃて硫酸アンモニウムで沈澱させた。沈澱し
た抗体を遠心分離で集めその沈澱をトリス緩衝生理食塩
液に再懸濁させた。再懸濁した抗体を２〜８°Ｃでトリ
ス緩衝生理食塩液に徹底的に透析し、−１５℃で凍結保
存した。
抗体のカラムクロマトグラフィーによるＬ’ｆ　Ｔｉｙ
工程は室温で行った。凍結抗体は解凍し自然に室温に戻
した。抗体は１．５ｍｌ／分の流速でアフィニティーカ
ラムに通した。非結合物質をトリスｒ）ｄ５１生理食塩
液で洗浄液の初期Ａ　２８Ｑ値が基準値に戻るまでが洗
浄して除いた。結合抗体を０．１Ｍグリ／ン塩酸緩衝液
、Ｐ　Ｈ２゜５で１．５ｍｌ／分の流速で溶出させた。
抗体を含んだ分画を集め直しに０５Ｍ　トリスで中和し
た。中和した抗体溶液は０１５Ｍ塩化ナトリウム含有の
０．０２Ｍ　　リン酸ナトリウム、ＰＨ７，２に２〜８
°Ｃて徹底的に透析した。透析後の抗体溶液は約１０ｍ
ｇ／ｍｌまで濃縮し、−１５°Ｃで凍結保存した。
精製抗体の比較 ＣＴＰペプチド精製抗体と実質的に実施例６に記載の工
程により生成されたＣＴＰ変異体精製抗体の当量蛋白量
を本発明の原理を用いる抗体生成を実施するために用い
た。上記を完成するために、ＣＴＰペプチド抗体および
ＣＴＰ変異体抗体を下記のように異種サンドインチ免疫
学的検定法において２個の異なる抗体／酵素指示薬を作
るためにアルカリホスファターゼと結合させた。
アルカリホスファターゼの酸化は２５ｍＭ過ヨウ素酸ナ
トリウム、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、および０．２Ｍ
　　リン酸ナトリウム混合液、ＰＨ４゜５中で暗所、室
温下３時間行った。酸化はグリセロールを添加して終了
させ、生成物はｌｏｏｍＭ塩化ナト！Ｊウム、１ｍＭ塩
化マグネシウム、および１ｍＭ塩化亜鉛含有の１０ｍＭ
酢酸ナトリウム、Ｐ　ｌ−＋　４　、５に１晩透析した
。透析したアルカリホスファターゼを最終抗体濃度か１
．５から２．０ｍｇ／ｍｌになるように各精製抗体とｌ
＝１の割合で結合させた。溶液のＰＨを炭酸水素ナトリ
ウムを添加してＰＨ９，５まで上げ、その溶液を暗所室
温下で５時間静かにインキュベイトした。各指示薬を２
〜８°Ｃにして水素化ホウ素ナトリウムを添加して３間
抜還元した。還元した指示薬は１晩２〜８°Ｃで０．１
ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛および０．
１％（ｔｖ／い窒化ナトリウム含有の５０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液、ＰＨ７，５に透析した。
生じた指示薬をアボットＩＭＸＴＭ自動微粒子酵素免疫
学的検定システム（アボット・インダストリーズ社製）
を用いてｈＣＧサンドイッチ免疫学的検定において使用
される当量の信号を生成するために滴定した。捕獲試薬
は微粒子上に、０．５ｍＭ塩化ナトリウム、０川％窒化
ナトリウム、および用３．６％シヨ糖含有の５０ｍＭ　
　トリス塩酸緩衝液、ＰＨ７，５中で被膜されたモノク
ロナル抗β−ｈＣＧ抗体であった。検体（５０μｌ）と
捕獲試薬（５０μｍ）および１種の指示薬（５０μ＋）
　［溶媒：０．５Ｍ塩化ナトリウム、２．２５％ｈ／ｖ
）魚セラチン、１％（ｗ／ｖ）　Ｂ　ｒｉｊ　−３５，
１，０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０
川％（Ｗ／ｖ）窒化ナトリウムおよび正常ヒト血清；正
常やぎ血清−７５：　２５（ｖ／ｖ）混合液（ＩＯμｌ
）含有の５０ｍＭ　　トリス塩酸緩衝液、ＰＨ７，４１
、および希釈剤（０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％
窒化す）　ｌ）ラム含有の０．０５Ｍ１・リス塩酸緩衝
液、ＰＨ４７，５）（１０μｌ）と混合した。反応混合
液は反応小孔に分配し５分間インキュベイｌ−した。
反応混合液の一部（１１０μｍ）を微粒子の結合するカ
ラス繊維マトリックスに移し、マトリックスを希釈剤で
δし浄した。蛍光基質の４−メチルウンベノフェロルホ
スフエイト（６５μｍ）をマトリ。
クスに添加して検体を蛍光分析機で読み取る。マ］・リ
ノクスの表面から発光する蛍光度は検体中の分析物の濃
度に直接的に比例している。
正常子牛血清マトリックスにおいて既知型のｈＣＧを含
有しているキャリブレータ−を測定しそれを各指示薬の
標準曲線を計算するために１吏用した。計算結果は表１
に示した。ｌ／２０００力価の指示薬を特殊結合因子と
してＣＴＰ変異体抗体含有の試薬として用いた。ｌ／１
０００力価の指示薬を特殊結合因子としてＣＴＰペプチ
ド抗体含有の試薬として用いた。ＣＴＰ変異体抗体から
生成された指示薬はｈＣ（Ｊｉ度がＯμＩＵ／ｍｌでよ
り低いバックグラウンドを作ることによってよ°り高い
信号／雑音（Ｓ／Ｎ）比率を示すことが表１から判明し
た。カウント／秒／秒（ｃ／ｓ／ｓ）比率はフィオーレ
らの報告した酵素／基質反応により生じた蛍光発光の強
さの測定値てあ。［ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　　３４（９）；　　１７２６−１７３２　１９８
８１、Ｓ／ＮはＯ値キャリブレータ−の１ＪｌｌＩ定値
で割った各検体の測定値として定義される。
表１ 指示薬の効果の比較 度）でいいことも示している。
表２ 標準曲線を用いた対照群の測定 一群の対照群も測定し、キャリブレータ−により作成さ
れた標準曲線から得られた結果を表２に示す。対照はｈ
ＣＧを約２５，１５０．　および７５　Ｏｍｌ　Ｕ／ｍ
ｌ含有していた。結果は本発明により精製された抗体か
ら製造した２個の異なった指示薬が当量の信号を生成す
ること、および信号を生成するために必要なＣＴＰ変異
体を含有した指示薬の濃度はかなりの低濃度（２分の１
の濃（注）検体のｈｃｃ＞ａ度は標準曲線から求めた。
検定結果は本発明により製造された好ましい抗体すなわ
ちＣＴＰ変異体を用いて精製された抗体から作った指示
薬は検定感度をｈＣＧのＯｍｌ　Ｕ／ｍｌ濃度において
９５％信頼限界まで増加させたことを示している。
ざらにｈＬＨ交叉反応性は既知ｈＬＨ検体を用いた同じ
検査を行うこと、および結果として生じｈＣＧ値の測定
することによって決定される。ｈＬＨ交叉反応性は表３
に示すように指示薬にＣＴＰ変異体を用いた場合に比へ
て３倍から８倍低いことが判った。
表３ 交叉反応性 （注）検体のｈ　ＣＧ　濃度は標準曲線から求めた。
本発明の方法は分析物類似物の製造およびｈｃＧ以外の
分析物の抗体の精製に等しく適用できることは同業者に
は明白であろう。従って、上記の好ましい態様および提
示した他の態様は例示したものでそれに限定されるもの
ではない。つまり本発明の記載事項は記載の特別の態様
に限定されるものではなく上記の本発明の請求範囲内の
すへての同等物および目的主題を包含する。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）支持体上に固定化した式； 【遺伝子配列があります】 で示されるペプチド配列を有するｈＣＧ分析物類似物を
    、抗ｈＣＧ抗体含有体液と接触させて、該ペプチド配列
    に特異性の抗ｈＣＧ抗体を吸着させ、ついで（ｂ）特異
    的に吸着された該抗ｈＣＧ抗体を溶出させることを特徴
    とする抗ｈＣＧ抗体精製方法。
  2. （２）該ペプチド配列において、ＡｓｘがＡｓｐで、Ｇ
    ｌｘがＧｌｎである請求項第１項に記載の方法。
  3. （３）該ペプチド配列が、さらに少なくとも１つの末端
    Ｌｙｓ残基を含有する請求項第１項あるいは第２項に記
    載の方法。
  4. （４）該ペプチド配列が式； 【遺伝子配列があります】 を有する請求項第１項に記載の方法。
  5. （５）該ペプチド配列が式； 【遺伝子配列があります】 を有する請求項第１項に記載の方法。
  6. （６）式 【遺伝子配列があります。】 ［式中、ＡｓｘはＡｓｐ、ＧｌｘがＧｌｎである］で示
    されるペプチド配列を有し、さらに少なくとも１つの末
    端Ｌｙｓ残基を有するｈＣＧ分析物類似物ペプチド。
  7. （７）式 【遺伝子配列があります。】 で示される配列を有する請求項第６項のペプチド。
  8. （８）式 【遺伝子配列があります。】 で示される配列を有する請求項第６項のペプチド。
  9. （９）（ａ）支持体上に固定化された式； 【遺伝子配列があります。】 で示されるペプチド配列を有するｈＣＧ分析物類似物を
    抗ｈＣＧ抗体含有体液と接触させて、該ペプチド配列に
    特異的な抗ｈＣＧ抗体を吸着させ、ついで（ｂ）特異的
    に吸着された該抗ｈＣＧ抗体に溶出させる行程から成る
    抗ｈＣＧ抗体精製方法により製造される抗体。
  10. （１０）該ペプチド配列が、それを支持体に結合させる
    ために、さらに少なくとも１つの末端Ｌｙｓ残基を含ん
    でいる請求項第９項に記載の抗体。
  11. （１１）式 【遺伝子配列があります。】 で示される配列を有するｈＣＧ分析物類似物ペプチドが
    支持体上に固定されていることを特徴とする抗ｈＣＧ抗
    体精製用アフィニティーカラム。
  12. （１２）該ペプチド配列が、それを支持体に結合させる
    ために、さらに少なくとも１つの末端Ｌｙｓ残基を含ん
    でいる請求項第１１項に記載のアフィニティーカラム。
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