JPH0211517A - マイコプラズマ汚染の防止または除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｍ業上の利用分野 本発明はヒトや動物の抗マイコプラズマ剤および動物や
植物の培？ｉ細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止な
いし除去剤に関するものである。

従来技術および解決ａ題 マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐ＋ａｓｍａ　）は、細胞壁
を欠く三層からなる細胞膜で包まれており、細石（Ｓｈ
ｉｚｏｍｙｃｅｔｅｓ網）とウィルス（ＲＨｃｒｏｔａ
ｔｏｂｉｏｔｅｓ網）との中間的な位置に分類されてい
る［岩波生物学事典第３版、第１２４０頁（１９８５）
、合波書店］。

マイコプラズマはヒトの肺炎や関節炎、ウシの乳房炎や
ニワトリの慢性呼吸器病などの起因となる。

このようなマイクプラズマ感染尿に有効な薬剤は少ない
。ピリドンカルボン酸系抗マイコプラズマ剤としてはオ
フロキサシンが報告（特開昭　６０−１８４０１４　）
されている。しかし、その抗マイコプラズマ作用は必ず
しも十分に強いものではない。

また、培養された多くの動物や植物の細胞はマイコプラ
ズマで汚染されている。マイコプラズマで汚染された細
胞は形態学的にも、遺伝学的にも、生理学的にも変化を
受けている。細胞の大規模培養や長期培養でのマイコプ
ラズマの汚染率は８０〜９０％にも達するといわれてい
る。ワクチン、ホルモン、抗体、酵素の如き生理活性物
質を生産せしめる場合、マイコプラズマで汚染されてい
ない細胞を用いることが要請される。

そこで、マイコプラズマに対する最小発育阻止ｆｉｌｆ
（ＭＩＣ）が低いミノサイクリ／やチアムリ／を用いて
マイコプラズマの汚染ないし防止を行うことが考えられ
る。しかし、これらの薬剤は、静マイコプラズマ的に作
用するだけで殺マイコプラズマ的に作用せず、そのため
−旦発育が阻止されたマイコプラズマが一定時間後には
再生育する（すなわち再汚染される）。またキノロン系
抗菌剤の一種であるシプロフロキサシ／の単独使用また
はチアムリノ、ミノサイクリンとの併用によりマイコプ
ラズマ汚染の除去が試みられている（特開昭６２−１５
１１７８　）　、　Ｌかし、シプロフロキサシンの使用
濃度は高＜（１０〜５０μｇ／■ｌ）、その細胞毒性と
抗マイコプラズマ活性との比、すなわち安全係数も高く
ない、従って、−旦マイコプラズマに汚染されると有効
な汚染除去法がないため、その培養ロフトを廃棄して析
らたに培養をやり直す以外に辺当な方法がないのが現実
である。

そこで本発明者らは、優れた抗マイコプラズマ活性を存
するのみならずマイコプラズマ汚染の除去ないし防止に
も顕著な効果を示す薬剤を種々探索し、本発明を完成し
た。

なお、後記−最大（Ｉ）で表わされるピリド／カルボン
酸誘導体は特開昭６２−２７７３６２に！ｉ！口されて
いるが、そこにはこの化合物のマイコプラズマに対する
作用は勿論のこと、培養細胞におけるマイコプラズマ汚
染の防止ないし除去作用について全く開示されていない
。

課題を解決するための手段 本発明は、−最大（Ｉ） （式中、Ｒは水素原子を意味するか、あるいはハロゲン
原子または水酸基もしくはアミノ基で置換されていても
よい炭素数１〜５の低級アルキル基を意味する。） で表わされるピリド／カルボン酸またはその塩を「効成
分とする抗マイコプラズマ剤および培養細胞におけるマ
イコプラズマ汚染の防止ないし除去剤に関する。

ここにおいて、ピリド／カポｙ１９ｊｌ（Ｉ）の塩とし
ては、例えば塩酸、リン酸等の無Ｉ！酸との塩；酢酸、
乳酸、シュウ酸、コハク酸、メタンスルホ／ｒ１ｉ、マ
レイアｒｔ！、マロン酸、グルコ／酸等の仔ｖＡｆｆｉ
との塩；アスパラギ：／！１．　　グルタミン酸等の酸
性アミノ酸との塩；または化合物（１）のナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム。

等の金属塩：リジン、アルギニ／等の塩基性アミノ酸と
の塩；トリエチルアミンの如きａ機塩基との塩などが挙
げられる。また、置換基Ｒの例としてはクロロメチル、
ヒドロキシメチル、アミノメチルなどが挙げられる。

一般式（Ｉ）に包含される化合物の具体例として以下の
化合物が挙げられ、特に化合物１およびその塩が好まし
く用いられる。

化合物　１ ５−アミノ−７−（２−アミノメチルモルホリノ）−１
−シクロプロピル−６，８−ジフルオロ−１，４−ジヒ
ド０−４−オキソキノリ／３−カルボン酸 化合物　２ ５−アミノ−７−（２−クロロメチルモルホリノ）−１
−シクロプロピル−６，８−ジフルオロ−１，４−ジヒ
ドロ−４−オキソキノリ／３−カルボン酸 化合物　３ ５−７ミ／−１−シクロプロピル−８，８−ジフルオロ
−７−（２−ヒドロキシメチルモルホリ／）−１，４−
ジヒドロ−４−オキソキノリン−３−カルボ／酸 化合物　４ ５−アミノ−１−シクロプロピル−６，８−ジフルオ口
−７−モルホリ／−１，４−ジヒドロ−４−オキソキノ
リン−３−カルボ７Ｗｔこれらの化合物は、後記参考例
や特開昭６２−２７７３６２に記載の方法またはこれら
に準する方法により容易に製造することができる。

（以下、余白） 試験例 以下に試験例を挙げて抗マイコプラズマ剤ならびにマイ
コプラズマ汚染の防止ないし除去剤としての諸性質を更
に詳細に説明する。

試験例１　　抗マイコプラズマ作用（ＭＩＣ）寒天希釈
法により供試薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ：μｇ／
■ｌ）を測定した。

（１）接種用マイクプラズマ液の調製 マイクプラズマ凍結保存液０．２〜０．３■Ｉを前培養
用培地［マイコプラズマ　ニュモニエおヨヒアコレプラ
ズマ　レイドロライの場合は０．５％ブドウ糖添加チャ
ノブク　（Ｃｈａｎｏｃｋ）液体培地ｐＨ６，８（細菌
学ｇｉ書２、「ヒト・動物および植物マイコプラズマの
分ｍと同定」日本細苗学会教育委員会編、第８頁（１９
８２）　、菜種出版）、マイコプラズマヒョライニスの
場合はマイコプラズマ　ヒョライニス分離用液体培地ｐ
　Ｈ７，８（８獣会誌３２．３４〜３ｇ　（１９７９）
）　、その他のマイコプラズマ種の場合は０．２％アル
ギニ／添加チャノック液体培地ＰＨ６，８］の２〜３薦
！に接種し、これを１ｉｉＩ液とじて前培養用培地で１
０倍希釈により１万倍まで連続希釈を行う。これらの希
釈液を３７℃で２〜７日間培養し、マイコプラズマの増
殖により培地の変色が認められたものの内、希釈倍数の
最も高いものを前培養用培地で１００倍希釈し、これを
接種用マイコプラズマ液とする。

（２）　供試桑剤含「寒天板の：Ａ製 供試薬剤の１．０００μｇ／ｍｌ　　水溶液を：Ａ製す
る（難溶性供試薬剤の場合は等モルの水酸化ナトリウム
を加えて溶解する。以下同様）。これを原液として２倍
連続希釈系列を作成し、プラスチックシャーレに１ｍｌ
ずつ分注する。重比の「ヒト・動物および植物マイコプ
ラズマの分離と同定」第９頁に記載のチャノック寒天培
地（マイコプラズマ　ヒョライニスの場合には更に０．
５％ムチン添加）を加ｌｌ！！溶解後、５５℃に保温し
、前記の供試薬剤含有シャーレに９　■！ずつ分注して
供試薬剤と十分混合し供試薬剤含有寒天平板を調製する
。

（３）ＭＩＣｏ）測定 （１）項で：Ａ製した接種用マイコプラズマ液をキャサ
ラレプリケーター（３ｍｍピン）を用いて３μβずつ供
試薬剤含有寒天平板上に接種する。マイコプラズマ　ニ
ュモニエ、マイコプラズマ　アルギニ二、アコレプラズ
マ　レイドロライおよびマイコプラズマ　ヒョライニス
を接種した平板は、水を含んだ脱脂綿を入れたプラスチ
ック　シャーレと一緒にビニル袋に入れて密封する。マ
イコプラズマ　ニュモニエは７日間、マイコプラズマ　
アルギニｍ；およびアコレプラズマ　レイドロライは２
日間、高湿度条件のもとに３７℃で好気培養する。その
ほかのマイコプラズマ種はガスパック嫌気システム（Ｂ
ＯＩＬ）を用いて２日間嫌気培養を行う。

培養後、オリノバス実体顕微鏡にて２０〜！００倍で観
察し、マイコプラズマの増殖の認められない供試薬剤の
最小濃度をＭＩＣとした。

その結果を次の？ｉ１表に示す。

（以下余白） 強い。

１マイコプラズマ種 マイクプラズマニユそニエ（Ｉｆ、　ｐｎｅｕｍｏｎｌ
ｉｅ）　　Ｍａｃマイコプラズマ　オラーレ（Ｍ、ｏｒ
ａｌｅ）　　Ｃｌｌ−１９２９９マイコプラズマ　オミ
ニス（Ｍ、ｈｏｍｌｎｌｓ）　　ＰＧ−２１？　（：ｙ
　フラＸ　？　　７　ｙ　−／　７９　／Ｘ　（Ｍ、ｆ
ｅｒｓｅｎｔａ＋＋＋＋）　　ＰＧ−１８マイコプラズ
マ　サリバリウム（Ｉｌ、ｇ為目マａｒｌｕｍ）　　Ｐ
Ｃ−２０マイコプラズマ　ブカレ（Ｍ、ｂｕｃｃａｌｅ
）　　Ｃｌｌ−２０２４７アコレプラズマ　レイドロラ
イ（＾、ｌａｌｄｌａｗｌｌ）　　ＰＣｉ−８マイコプ
ラズマ　アルボ＝　−＝　（Ｍ、ａｒｇｌｎｌｎｌ）　
　に−２３０マイコプラズマ　ヒョライニス（Ｍ、ｈｙ
ｏｒｈｌｎｌｓ）但し、Ａ〜Ｆはヒト由来のものであり
、ＧおよびＨはつ／由来のものであり、■はブタ由来の
ものである。

第１表に示すように化合物１の抗マイコプラズマ作用（
ＭＩＣ）は、同じピリドンカルボ／酸であるシプロフロ
キサシンやオフロキサシ／よりも試験例２　抗マイコプ
ラズマ作用（ＭＩＣ，ＭＭＣ）液体希釈法により最小発
育阻止濃度（ＭＩＣ，μｇ／ｍｌ＞および最小殺マイク
プラズマｉＨ［１ｔ　（ＭＭＣ。

μｇ／ｍｌ）を測定した。なお本項におけるＭＩＣの測
定法は試験例１の場合とは異なる。

供試薬剤の１，０００μｇ／■！水溶液を調製し、これ
を前培養用培地で５倍希釈し、つづいて更に２倍希釈系
列を調製する。この希釈液の５０μ！ずつをマイクロプ
レートのウェルに分注する。なお、供試薬剤無添加のウ
ェルを対照とした。

試験例１と同様にして調製した接種用マイコプラズマ液
をマイクロピペットを用いて上記供試薬剤含仔各ウェル
に５０μβずつ滴下する。マイクロプレートをプレート
シールで密封し、マイクロミキサーで振盪後、３７℃で
５日間培養する。供試薬剤無添加の対照では培養２日後
にマイコプラズマの増殖による培地の変色が認められる
。この時点でキャサラレプリケーターを用いて液体培養
液３μｌを供試薬剤を含まないチャノブク寒天培地上に
接種する。上記液体培地および寒天培地を更に３７℃で
３日間培養［マイコプラズマ　オラーレの場合は嫌気培
養、アコレプラズマ　レイドロライおよびマイコプラズ
マ　アルギニｍ；の場合は好気培？ｉ］する。５日目の
観察結果からＭＩＣおよびＭ　Ｍ　Ｃを決定する。すな
わち、液体培地でマイコプラズマの増殖が認められない
供試薬剤の最小濃度をＭ　Ｉ　Ｃとし、寒天培地でマイ
コプラズマの増殖が認められない供試薬剤の最小濃度を
ＭＭＣとした。

その結果を次に示す。

第２表に示すように化合物１やシプロフロキサシンのＭ
ＩＣ値とＭＭＣ値とは一致する。すなわち化合物１およ
びシプロフロキサシンはＭ　Ｉ　Ｃ（ａにおいて殺マイ
コプラズマ的に作用する。

一方、ミノサイクリ／はＭＩＣ値において静マイコプラ
ズマ的に作用し、殺マイコプラズマ的には作用しない。

試験例３　マイコプラズマ汚染の除去・防止作用実験的
にマイコプラズマで汚染せしめた動物細胞に供試薬剤を
４日間作用させ、その後供試薬剤無添加の培地で継代培
養を行い、マイクプラズマが再び成育（すなわち再汚染
）するかどうかをみた。

（１）　　　マイコプラズマ汚染細胞の：Ｊ！ｉ製下記
第３表記載のマイコプラズマを試験例１（１）の如く前
培養を行い、その培養液２諺！を１　、５００　ｘｇ１
３０分間遠心してマイコプラズマを分ｍする。

イーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必須培地に１０％のウシ
胎児血清とペニシリン６１００単位ハ２を添加した培地
、すなわち１０％−Ｆ　Ｂ　Ｓ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地の２
曹ｌ中に前記の分層マイコプラズマを懸濁する。

一方、マウス繊維芽細胞Ｌ　−９２９を１０％−ＦＢＳ
　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中に２．５ＸＩＯ’個／ｍｌの４度
になるように懸濁し、この４ｍｌずつを２枚の円形カバ
ーグラス（直径１．８　ｃｍ）を入れた組は培養用シャ
ーレ（直径６　ｃｍ）に分注し、つづいて前記マイコプ
ラズマ懸濁液１ｍｌを更に加える。これを３７℃、５％
炭酸ガス中で３日間培養後、継代培養を２回行う。ＤＮ
Ａ結合・蛍光色素染色法（重比の［ヒト・動物および植
物マイコプラズマの分離と同定」第９５〜９７頁）−に
よりマイコプラズマ汚染を確認し、マイコプラズマ汚染
細胞とした。

（２）　マイコプラズマ汚染の除去実験対数増殖期のマ
イコプラズマ汚染Ｌ　−９２９細胞を前項のように培養
する。供試薬剤の１　、０００μｇ／■２水Ｍ、Ｉｆを
：Ａ！ｉ２し、これをイーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必
須培地で所定ｃＪＩ！１′に希釈したものを培地中に添
加する。シャーレは各供試薬剤濃度あたり２枚を使用し
、１枚には円形カバーグラスを２牧人れてマイコプラズ
マ検査用とし、他の１枚にはカバーグラスを入れずに継
代培養用とした。供試薬剤添加期間での培養は４日間行
い、その後３週間は供試薬剤を含まない培地で培養を続
ける。培地交換は３〜４日毎に行い、継代は毎週−回行
う。

マイコプラズマの検査は４日目、７日目、その後は１週
間毎に行う、マイコプラズマの検出はＤＮＡ結合・蛍光
色素染色法で行う。

その結果を次に示す。

“第１表のＧ、　Ｈと同じマイコプラズマ種″”帯〜８
０％以上の細胞がマイコプラズマ陽性便ｗ−−〜マイコ
プラズマ陰性 第３表に示すように化合物１の添加系ではＧ１１−１い
ずれのマイクプラズマ種においても培養３日後にマイコ
プラズマ陰性になり、その後は薬剤無添加で継代培養を
してもマイコプラズマの再発Ｎは全く認められない。シ
プロフロキサシン添加系ではＧのマイコプラズマ種のみ
培養３日以降マイコプラズマ陰性となった。ミノサイク
リン添加系でも培養３日後にマイコプラズマ陰性となる
が、その後に薬剤を除去すると顕著なマイクプラズマの
再発育がろられる。

試験例４マイコプラズマ汚染の防止・除去作用自然感染
されたヒト肺カルシ／−マ細胞［１］およびヒトメラン
ーマ細胞［■］に対するマイコプラズマ汚染の防止・除
去作用を試験例３に準じて行い、第４表の結果を得た。

なお、供試薬剤添加期間は７日間であり、細胞に感染し
たマイコプラズマ種は不明である。

（以下、余白） 化合物１は０．２μｇ／ｍｌの低濃度でマイコプラズマ
を完全に除去したのに対し、シプロフロキサシ７は６，
２５μｇ／■！の高濃度を必要とした。最小マイコプラ
ズマ除去濃度と第５表に示す細胞毒性０度（Ｉ　Ｃ５０
）との比は、化合物１では３６であり、シプロフロキサ
シンでは４．５である。

試験例５　　　　培養細胞に対する影響供試薬剤が細胞
の増殖を阻害するかどうかを調べた。

１　、０００μｇ／ｍｌ供試薬剤水溶液をイーグル（Ｅ
ａｇＩｅ）の最少必須培地で２倍系列希釈する。

１０％ＦＢＳ−ＭＥＭ培地３．６諺ｌにヒト羊膜由来細
胞ＰＬを２ＸＩＯ’個懸濁し、組織培養用シャーレ（１
１！径ＧＯ＊ｉ）にまき、３７℃、５％炭酸ガス中で４
８時間培養する。先に：Ａ製した供試薬剤溶液０．４ｍ
ｌずつを各シャーレに添加して所定４度となし、更に３
日間培養する。培養終了後、培地を除去し、ダルベフ：
１Ｉ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）のリン酸緩衝液（ｐ）１７
．４）で１回洗浄する。２，５％トリプシン−０，０２
％ＥＤＴ＾混液（１：９）の０．２■！を加えて細胞を
はがし、１０％ＦＩＩＳ−ＭＥＭ培地で適当に希釈した
後、エルマ血球計算盤で細胞数を測定する。細胞増殖率
は供試薬剤無添加対照群の５日日の平均細胞数から２日
日のそれを差し引いたものを１００％とし、同様に計算
した供試薬剤添加群の細胞数の百分率を求めて算出する
。５０％細胞増殖阻害０度（ＩＣ５０：μｇ／ｍｉ＋）
は濃度−百分率回帰直線から算出する。　その結果を次
に示す。

第５表 ＰＬ細胞に対する細胞毒性 化合物　１　　　　　　　１８　　　　　　　１８０〜
１４４０シプロフロキサシ７　　　　２８　　　　　　
　９〜２８０第５表に示すように供試薬剤の５０％細胞
増殖阻害濃度（ＪＣｓｏ；μｇ／ｍｌ＞は、これらのマ
イコプラズマに対するＭＩＣよりも高い、ＩＣ５０値と
第１表におけるＭＩＣ値との比は、化合物１では１８０
〜Ｉ４４０、シプロフロキサシ／では９〜２８０であり
、安全域は化合物１の方が広すった。

試験例６　　　　　　急性毒性 ｄｄＹ−３系雄性マウスに対する化合物１の経口毒性を
常法により調べ、ＬＤｓｏ値（μｇ／ｗ＋１）をベーレ
／ス・ケルバー法により算出し、ＬＤ５０（ｍｇ／ｋｇ
　）値が２０００以上との結果を得た。

本発明の有効成分（Ｉ）は、前記第１表および第２表に
示すように強い抗マイコプラズマ作ＩＴＪを任し、また
前記試験例６に示すように毒性も弱いのでヒトを含む動
物に対する抗マイクプラズマ剤として作用である。本発
明の抗マイコプラズマ剤の投与量は年令１体重、症杖、
投与経路により異なるが、有効成分として通常１ｏ■ｇ
〜３ｇ１好ましくは５０〜２５０ｍｇ７日であり、１回
ないし数回に分けて投与（一般的には経口投与）される
。本発明の有効成分（Ｉ）またはその塩は通常、製剤用
担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤の
具体例としては錠剤、カプセル剤、ｍｌｊｌＭ、　　シ
ロップ剤などが挙げられる。これらの製剤は通常の製剤
用担体を用いて常法により！ｉ製できる。

また、第１〜５表に示すように本発明の「効成分（Ｉ）
は強い抗マイコプラズマ作用ならびに優れたマイコプラ
ズマ汚染の防止・除去作用を存し、更には抗マイコプラ
ズマ活性と培養細胞の増殖阻害濃度との間には大きな開
きがある。従って、化合物１またはその塩は培養細胞の
マイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤としても極めて
有用である。マイコプラズマ汚染の防止・除去剤たる化
合物（Ｉ）：ｌたはｌＤｍは、０．２〜Ｊｏｕｇ　／　
ｍｌ　、　ｋＶましくは０．４〜３μｇ／ｍｌの濃度に
なるように通常試薬の形で、培養前または培養中の培地
に添加される。このような試薬は用時溶解型固形剤の形
であってもよいが、水溶液のような液状剤の形をとるの
が取り扱いに便利である。試薬が液状剤であるときは凍
結保存するのがよい。試薬中には有効成分（１）のはか
リン酸塩の如き緩衝剤、アルカリの如き溶解補助剤、細
胞培養用培地の一成分などを更に介在していてもよい。

（以下、余白） 具体例 次に実施例ならびに参考例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。

実施例　１　　　　カプセル剤の製造 化合物１ スターチ ラクトース タルク 上記成分をよく混合し顆粒とした後、 す１，０００個のカプセルに充填する。

２５ｇ ０ｇ ５ｇ ５ｇ 常法によ 実施例　２　　　　　錠剤の製造 化合物１　　　　　　　　　　１２５ｇスターチ　　　
　　　　　　　５４ｇ 力ルンウム　カル４キシメチル　七ルトス　　　　　　
　　　　　　４０ｇ微細結晶性セルロース　　　　５０
ｇ ステアリン酸マグネシウム　　　６ｇ 上記成分をよく混合し、常法により打錠して１．０００
個の錠剤を調製する。

実施例　３　　　　　試薬の製造 ミリポアフィルタ−により除閉した化合物ｌの０．０５
ｍｇ／　ｓ　ｌ水溶液を１０■！容の褐色バイアルに分
注し凍結保存する。この溶液の０．１■！中には化合物
１が５μｇ含有される。

参考例　　化合物１およびその塩酸塩の製造（１）Ｉｇ
の５−アミ７〜１−シクａプロピル−６、７，８−）リ
フルオロ−！、４−ジヒドロー４−オキソキノリン−３
−カルボン酸、１．１５ｇの２−アセチルアミノメチル
モルホリン、１ｇのトリエチルアミンおよびＩＯｍ　１
のピリジ／の混合物を１６時間加熱還流する。反応液を
減圧で濃縮乾固し、残渣に酢酸エチルを加えて結晶を濾
取する。結晶を水２０ｍ　ｌに２濁させ、りｏａホルム
で抽出する。

抽出液を乾燥後Ｑ縮し、残渣をエタノールから再結晶し
て７２０　ｍ　ｇの５−アミ／−７−（２−アセチルア
ミノメチルモルホリノ）−１−シクロプロピル−６，８
−ジフルオロ−１，４−ジヒドロ−４−オキフキ／リン
−３−カルボン酸を得る。

ｍ　、　　Ｐ　　、　　２２８〜２２９℃。

（２）Ｔｌ）で得たカルボン酸の６ｏｏ　ｍ　ｇにｌθ
％塩ｆｆ１１５ｍ１を加え９０分間加熱還流する。反応
液を減圧下に濃縮した後、残渣を水−エタノールより再
結晶して化合物ｌの塩酸塩３００　ｍ　ｇを得る。

ｍ、９．２７０〜２７５℃（分解） （３）　　■で得た化合物１の塩酸塩２００　ｍ　ｇを
水に溶解し、これを１０％アンモニア水で中和し、クロ
ロホルムで抽出する。抽出液を乾燥後０縮し、残渣をエ
タ／−ルから再結晶して１２０　ｍ　ｇの化合物１を得
る。ｍ　、　　Ｉ）　、　２１５〜２１７℃。

手続補正書印ヵ １、事件の表示 昭和６３年特許ＨＪｔｔｇ　１８２９１８号２発明の名
称 マイコプラズマ汚染の防止または除去 （新名称） 特許出願人　　　大日本製薬株式会社 代　理　人　　　小島　−晃 ３、補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 住所大阪市中央区道修町２丁目６番８号名称２９１　　
大日本製薬株式会社 住所大阪府吹田市江の本町３３番９４号大日本！！！薬
株式会社　総合研究所内電話　大阪（０８）−３３７−
（５９３１）＆補正の対象 全　　文 訂　　正 明　　細 書 「マイコプラズマ汚染の防止または除去」明細書の全文
を別紙のとおり補正する。

以上 １、発明の名称 マイコプラズマ汚染の防止または除去 ２特許請求の範囲 は除去剤。

（５１０，４〜３μｇ／ｍ　ｌの濃度になるように化合
ａ発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明は特定のピリド／カルボン酸を有効成分とする動
植物の培養細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止また
は除去剤ならびに動植物細胞の培養方法に関するもので
ある。

従来技術と解決課ぷ マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓ■ａ）は細菌（Ｓｈ
ｉｚ。

ｍｙｃｅｔｅｓ網）とウィルス（Ｍ！ｃｒｏｔａｔｏｂ
＋ｏｔｅｓ　ｔｉ４　）との中間的な位置に分類されて
いる。培養された動物や植物の細胞は、はとんどの場合
マイコプラズマの汚染が認められる。マイコプラズマで
汚染された細胞は形態学的にも、遺伝学的にも、生理学
的にも変化を受けている。細胞の大規模培養や長期培養
でのマイコプラズマの汚染率は８０〜９０％にも達する
といわれている。そして、分離されるマイコプラズマ種
としてはマイコプラズマ　オーラレ、マイコプラズマ　
ザリバリウム、アコレプラズマ　レイドロウイイ、マイ
コプラズマ　アルギニ一二、マイコプラズマ　ヒョライ
ニスが大部分を占める。

細胞を培養してワクチン、ホルモン、抗体、酵素の如き
生理活性物質を生産せしめる場合、マイコプラズマで汚
染されないように細胞を培養することが要請される。

そこで、マイコプラズマに対する最小発育阻止０度（Ｍ
ＩＣ）が低いミノサイクリンやチアムリンを用いて、マ
イコプラズマ汚染の除去または防止を行うことが考えら
れる。しかし、これらの薬剤は、静マイコプラズマ的に
作用するだけで殺マイコプラズマ的に作用せず、そのた
め−旦発育が阻止されたマイコプラズマが一定時間後に
は再増殖する（すなわち再汚染される）。

また、ミノサイクリ／やチアムリンの代りにピリドンカ
ルボン酸系抗菌剤を用いることも試みられている。例え
ば、特開昭６３−１５２３１８には次式で表わされるピ
リド／カルボン酸がマイコブラズマ汚染の防止または除
去剤として作用であると記載されている。

（式中、Ｒ１は１個または２個のｒａ換ＭＲで置換され
ていてもよい１−ピペラジニル基もしくは１−ピロリジ
ニル基を意味する。

ここにおける置換基Ｒはフッソ原子またはアミ７基もし
くは炭素数１〜５の低級アルキルアミ７基で置換されて
いてもよい炭素数１〜５の低級アルキル基を意味するか
、あるいはアミン基またはフッソ原子を意味する。Ｒ２
はシクロプロピル基を意味するか、あるいは１個または
２個のハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基
を意味する。ＡはＮまたはＣ−ＨらしくはＣ−Ｙを意味
し、ここにおけるＹはハロゲン原子を意味する。Ｘは水
素原子またはアミノ基もしくは７ツソ原子を意味する。

） またピリド７カルボン酸の一種であるシプロフロキサシ
ンの単独使用またはチアムリン、ミノサイクリ／との併
用による細胞培養物のマイコプラズマ汚染の除去が試み
られている（　Ｅ　Ｐ　２２１４９３Ａ　＞。

更に、特開昭ｅｏ；＋ａ４ｏ＋ｔには抗マイクプラズマ
剤たるオフロキサシンが開示されている。

しかし、後記試験例に示すように、このようなピリド／
カルボン酸は、その使用１３度が高いし、その細胞毒性
と抗マイフプラズマ活性との比、すなわち安全係数が低
く、マイコプラズマ汚染の防止または除去剤としては本
発明の特定のピリドンカルボン酸よりも劣る。

発明の構成 本発明は、下記式で表わされるピリドンカルボン酸たる
５−アミ／−７−（２−アミノメチルモルホリノ）−１
−シクロプロピル−６，８−ジフルオＩ：Ｉ−１．４−
ジヒドロ−４−オキソキノリン−３−カルボンＷ！！（
以下、化合物Ａ）またはその塩を有効成分とする動物や
植物の培養細胞におけるマイコプラズマ汚染の防止また
は除去剤ならびに動物細胞や植物細胞の培養方法に関す
るものである。

ことにおいて、化合物Ａの塩としては、例えば塩酸、リ
ン酸等の無機酸との塩：酢酸、乳酸、シュウ酸、コハク
酸、メタ／スルホン酸、マレイノ酸、マロン酸、グルコ
ン酸等の存機酸との塩；アスパラギン酸、グルタミン酸
等の酸性アミノ酸との塩：または化合物Ａのナトリウム
、カリウム。

カルシウム、マグネシウム等の金属塩；リジン。

アルギニ７等の塩基性アミノ酸との塩；トリエチルアミ
ンの如き有機塩基との塩などが挙げられる。

なお、本発明の化合物Ａまたはその塩ならびにその製造
方法は特開昭６２−２７７３６２に記載されている。し
かし、そこにはこの化合物Ａまたはその塩のマイフプラ
ズマに対する作用は勿論のこと、培養細胞におけるマイ
コプラズマ汚染の防止または除去作用について全く開示
されていない。

以下に試験例を挙げてマイコプラズマ汚染の防止または
除去剤たる化合物Ａまたはその塩の諸性質について説明
する。

なお、以下の試験例では、化合物Ａとともに先に挙げた
文献に具体的に開示されている次の化合物も対照として
試験に供した。

（シプロフロキサシン） 化合物３ ０Ｈ （ミ／サイタリン） （オフロキサシン） （以下、余白） 試験例１　抗マイコプラズマ作用（ＭＩＣ）寒天希釈法
により供試薬剤の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ：μｇ／璽
ｌ）を測定した。

（１）　接種用マイコプラズマ竪濁液の調製マイコプラ
ズマ凍結保存懸濁液０．２〜０．３　ｍ　ｌを後述の前
培養用培地の２〜３ｍｌに接種し、これを原液として後
述の前培養用培地で１０倍希釈により１Ｈ倍まで連続希
釈を行う、これらの希釈液を３７℃で２〜７日間培養し
、マイコプラズマの増殖により培地の変色が認められた
ものの内、希釈倍数の最も高いものを前培養用培地で１
００倍希釈し、これを接種用マイコプラズマ懸濁液とす
る。

なお、前培養用培地としては次のものを用いた。

すなわち、マイコプラズマ　ニューモニエおよびアコレ
プラズマ　レイドロウイイの場合は０．５％ブドウ糖添
加チャノック（Ｃｈａｎｏｃｋ）液体培地ｐｌ＋７．８
（細菌学叢書２、「ヒト・動物および植物マイコプラズ
マの分離と同定」日本細菌学会教育委員金偏、第８頁（
＋９８２）　、菜種出版）、マイコプラズマ　ヒョライ
ニスの場合はマイコプラズマ　ヒフライニス分離用液体
培地Ｐ　Ｈ７，８ｒ日獣会誌３２．３４〜３８　（＋９
７９）　　］、その他のマイコプラズマ種の場合は０．
２％アルギニン添加チャノック液体培地１）Ｈ６，８を
用いた。

（２）　供試薬剤介在寒天板のＩＪＩ製供試薬剤の１　
、０００μｇ／ｗｌ＊溶液を調製する（難溶性供試薬剤
の場合は等モルの水酸化ナトリウムを加えて溶解する。

以下同様）。これを原液として２倍連続希釈系列を作成
し、プラスチックシャーレに１ｍｌずつ分注する。前出
の「ヒト・動物および植物マイコプラズマの分離と同定
」茅９頁に記載のチャノック寒天培地（マイコプラズマ
　ヒョライニスの場合には更に０．５％ムチン添加）を
加温溶解後、５５℃に保温し、前記の供試築剤介在シャ
ーレに９　　ｍｌずつ分注して供試薬剤と十分混合し供
試薬剤含を寒天平板を調製する。

（３）ＭＩＣの測定 （１１項で：Ａ製した按稚用マイコプラズマ懸濁液をキ
ャサラレプリケーター（３■■ビ／）を用い、て３μβ
ずつ供試薬剤含育寒天平板上に接種する。マイコプラズ
マ　ニューモニエ、マイコプラズマ　アルギニ一二、ア
コレプラズマ　レイドロウィイおよびマイコプラズマ　
ヒョライニスをｔｆｆｉ［した平板ハ、水を含んだ脱脂
綿を入れたプラスチックシャーレと一緒にビニル袋に入
れて密封する。マイコプラズマ　ニューモニエは７　Ｅ
ｌ　間、マイコプラズマ　アルギニｍ；およびアコレプ
ラズマ　レイドロウィイは２日間、高湿度条件のもとに
３７℃で好気培養する。そのほかのマイコプラズマ種は
ガスバック嫌気システム（ｎｌｌＬ）を用いて２日間嫌
気培養を行う。培養後、オリンパス実体顕微鏡にて２０
〜１００倍で観察し、マイコプラズマの増殖の認められ
ない供試薬剤の最小濃度をＭ　Ｉ　Ｃとした。

その結果を次のＨ１表に示す。

（以下余白） １マイコプラズマ種 ｌＬ、マイコプラズマ　ニ、−そニエ（Ｉｌ、　ｐｎｅ
ｕｍｏｎｌａｅ）　　Ｍ＆Ｃｂ、マイコプラズマ　オラ
ーレ（１，ｏｒｍｌｅ）　　ＣＭ−１９２９９Ｃ：マイ
コプラズマ　サリバリウム（Ｉｌ、９１■マ慕ｒｌｕ雷
）　　ＰＧ−２０ｄニアコレプラズマ　レイドロウイイ
（＾、ｌＮｄ１１ｗ１ｌ）　　ＰＣ−８８：マイコプラ
ズマ　アルギニ−ニ（１，ａｒｇｌｎｌｎｌ）　　Ｇ−
２３０ｆｌマイコプラズマ　ヒョライニス（１，ｈｙｏ
ｒｈｌｎｌｓ）　　ＢＳＴ−７但し、λ〜Ｃはヒト由来
のものであり、ｄおよびｅはラン由来のものであり、ｆ
はブタ由来のものである。

第１表に示すように本発明の化合物Ａの抗マイクプラズ
マ作用（ＭＩＣ）は、対照化合物１〜４よりも強い、対
照化合物１の抗マイコプラズマ作用は優れているが、本
発明の化合物Ａの方が更に２〜８倍も強い。

試験例２　抗マイコプラズマ作用（旧Ｃ，Ｍ！１ｌｃ）
液体希釈法により最小発育阻止濃度（ＭＩＣ，μｇ／ｍ
ｌ）および最小殺マイコプラズマ濃度（ＭＭＣ。

μｇ／■ｌ）を測定した。なお本項における旧Ｃの測定
法は試験例１の場合とは異なる。

供試薬剤の１，００σμｇ／■ｌ水溶液をｇ製し、これ
を前培養用培地で５倍希釈し、つづいて更に２倍希釈系
列を調製する。この希釈液の５０μ！ずつをマイクロプ
レートのウェルに分注する。なお、供試薬剤無添加のウ
ェルを対照とした。

試験例１と同様にして！ｌｌ製した接種用マイコプラズ
マ懸濁液をマイクロピペットを用いて上記供試薬剤無添
加ウェルに５０μβずつ滴下する。マイクロプレートを
プレートシールで密封し、マイクロミキサーで振盪後、
３７℃で５日間培養する。供試薬剤無添加の対照では培
養２日後にマイコプラズマの増殖による培地の変色が認
められる。この時点でキャサラレプリケーターを用いて
液体培養液３μｌを供試薬剤を含まないチャノック寒天
培地上に接種する。上記液体培地および寒天培地を更に
３７℃で３日間培ｆｔ［マイコプラズマ　オラーレの場
合は嫌気培養、アコレプラズマ　レイドロウイイおよび
マイコプラズマ　アルギニｍ；の場合は好気培ｆ！］す
る。５日目の観察結果からＭＩＣおよびＭＭＣを決定す
る。すなわち、液体培地でマイコプラズマの増殖が認め
られない供試薬剤の最小濃度をＭＩＣとし、寒天培地で
マイコプラズマの増殖が認められない供試薬剤の最小濃
度をＭＭＣとした。

その結果を次に示す。

第２表 抗マイコプラズマ作用（ＭＩＣ，ＭＭＣ：　ｕｇ／ｍ！
り第２表に示すように化合物Ａ。

ｌおよび２のＭ ＩＣ値とＭＭＣ値とは一致する。すなわち、これらの化
合物はＭＩＣ値において殺マイコプラズマ的に作用する
。

一方、化合物３（ミノサイクリン）はＭ　Ｉ　Ｃ（ｄに
おいて静マイコプラズマ的に作用し、殺マイコプラズマ
的には作用しない。

本発明化合物の抗マイコプラズマ作用は、いずれの対照
化合物よりも優れている。

試験例３　マイコプラズマ汚染の除去・防止作用実験的
にマイコプラズマで汚染せしめた動物細胞を供試薬剤を
含む培地で４日間培養し、その後、供試薬剤無添加の培
地で継代培養を行い、マイコプラズマが再び増殖（すな
わち再汚染）するかどうかをみた。

０）　　マイコプラズマ汚染細胞の調製上記第３表記載
のマイコプラズマを試験例１（１）の如く前培養を行い
、その培養液２ｍｌをＩ　、　５００　ｘｇ１３０分間
遠心してマイコプラズマを分離する。

イーグル（Ｅａｇｌｅ）の最少必須培地に１０％のウシ
胎児血１ｎとペニシリンＧ１００単位ｌ■ｌを添加した
培地、すなわち１０％−ＦＢＳ−ＭＥＭ培地の２■！中
に前記の分離マイコプラズマを懸濁する。

一方、マウス繊維芽細胞Ｌ　−９２９を１０％−ＦＢＳ
　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中に２．５ＸＩＯ’個／■！の濃度
になるように懸濁し、この４ｍｌずつを２枚の円形カバ
ーグラス（直径１．８　ｃｍ）を入れた組織培養用シャ
ーレ（直径６Ｃ１）に分注し、つづいて前記マイコプラ
ズマ懸濁液１ｍｆを更に加える。これを３７°Ｃ９５％
炭酸ガス−空気（加湿）中で３日間培養後、継代培養を
２回行う。ＤＮＡ結合・蛍光色素染色法（前出の「ヒト
・動物および植物マイコプラズマの分離と同定」第９５
〜９７頁）により細胞がマイコプラズマで汚染（８０％
以上の細胞がマイコプラズマ陽性）されたことを＆ｌ！
認した。

■　マイコプラズマ汚染の除去実験 対数増殖期のマイコプラズマ汚染Ｌ　−９２９細胞を前
項のように培養する。供試薬剤の１．０００μｇ／ｍｌ
水溶液を調製し、これを１０％−Ｆ　ｎ　Ｓ　−Ｍ　Ｅ
Ｍで所定０度に希釈したものを培地中に添加する。

シャーレは各供試薬剤４度あたり２枚を使用し、１枚に
は円形カバーグラスを２牧人れてマイコプラズマ検査用
とし、他の１枚にはカバーグラスを入れずに継代培養用
とした。供試薬剤含を培地での培養は４日間行い、その
後３週間は供試薬剤を含まない培地で培養を続ける。培
地交換は３〜４日毎に行い、継代は毎週−回行う。マイ
コプラズマの検査は４日目、７日目、その後は１週間毎
に行う。マイコプラズマの検出はＤＮＡ結合・蛍光色素
染色法で行う。

その結果を次に示す。

第　３　表　　マイコプラズマ汚染の防止・除去作用子
　：　マイコプラズマ陽性 −；　マイコプラズマ陰性 第３表に示すように本発明化合物Ａの０．２μｇ／　ｍ
　ｌ　＞Ｆｉ加系では両マイコプラズマ種において、培
？ｉ４日後にマイコプラズマ陰性になり、その後は薬剤
無添加で継代培養をしてもマイコプラズマの再増殖は全
く認められない。対照化合物ｌも優れたマイコプラズマ
汚染の防止・除去作用を示すが、その有効濃度は０．３
９μｇ／ｍｌであり、本発明化合物Ａ（７）場合よりも
約２倍濃い０度が必要である。　対照化合物２（シプロ
フロキサシン）の３．１３μｇ／ｍｌ添加系ではＡ、レ
イドロウイイＰＧ−８のマイコプラズマ種のみ培′ａ４
日以降マイコプラズマ陰性となった。対照化合物３（ミ
ノサイクリ／）の１２．５μｇ／ｍｌ添加系でも培養４
日後にマイコプラズマ陰性となるが、その後に薬剤を除
去して培養すると顕著なマイコプラズマの再増殖がみら
れる。

試験例４マイコプラズマ汚染の防止・除去作用自然感染
されたヒト肺カルシノーマ細胞［Ｉ］およびヒトメラン
ーマ細胞［■］に対するマイコプラズマを５染の防止・
除去作用を試験例３に窄じて行い、第４表の結果を得た
。

なお、供試薬剤添加期間は７日間であり、細胞に感染し
たマイコプラズマ種は不明である。

第　４　表　　　マイコプラズマ汚染の防止・除去作用
−；　マイコプラズマ陰性 ＋　；　マイコプラズマ陽性 第４表に示すように本発明化合物Ａのマイコプラズマ除
去濃度は０．２μｇ／ｍｌであり、対照化合物１の１／
２、対照化合物２（シプロフロキサシ／）のｌ／３２で
ある。

試験例５　　　　培養細胞に対する影響供試薬剤が細胞
の増殖を阻害するかどうかを調べた。

１．０００μｇ／ｍｌ濃度の供試薬剤水溶液を１０９Ａ
−ＦＵＳ−ＭＥＭで２倍系列希釈する。

＋θ％−ＦＢＳ−ＭＥＭ培地３．６■ｌにヒト羊膜由来
細胞Ｆ　Ｌを２ＸＩＯ’個セ濁し、組織培養用シャシ（
直径６０ｍｍ）にまき、３７℃、５％炭酸ガス−空気（
加Ｉｌり中で４８時間培養する。先にＩ製した供試薬剤
溶液０．４ｍ　ｌずつを各シャーレに添加して所定濃度
となし、更に３日間培養する。培養終了後、培地を除去
し、ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のり／酸緩衝液（
ｐｔ１７．４　＞で１回洗浄する。２．５％トリプシン
−０，００２％ＥＤＴ＾混液（１：９）の０．２■！を
加えて細胞をはがし、１０％−ＦＢＳ−ＭＥＭ培地で適
当に希釈した後、エルマ血球計算盤で細胞数を測定する
。

細胞増殖率は次式に従って計算した。

細胞増殖率＝Ｘ／Ｙ　　Ｘ　　１００ Ｘ；供試薬剤添加系の平均増殖細胞数“Ｙ：供試薬剤非
添加系の平均増殖細胞数６”平均増殖細胞数＝［５日目
の平均細胞数］−［２日目の平均細胞数］５０％細胞増
殖阻害濃度（ＩＣｓｏ：μｇ／＋＋１）は濃度−百分率
回帰直線から算出する。その結果を次に示す。

Ａ　　　　　　　　　　　１８　　　　　　　　　　１
８０〜１４４０１　　　　　　　　　　１３．２　　　
　　　　　　６０〜５２８２　　　　　　　　　２８　
　　　　　　　　　９〜７２第５表に示すように供試薬
剤の５０％細胞増殖阻害ｄｌｆ（Ｉ　Ｃ５０；　ｕｇ／
ｍｌ　）は、これらのマイコプラズマに対するＭＩＣよ
りも高い。ＩＣ５０値と第１表におけるＭＩＣ値との比
は、本発明化合物へでは１８０〜＋４４０、対照化合物
１では６６〜５２８、対照化合物２（シプロフロキサシ
ン）↑は９〜７２であり、安全域は本発明化合物Ａが最
も広い。

このほか、マイコプラズマ汚染の防止または除去剤の条
件としては動物や植物の染色体に悪い影響を与えないこ
とが要請され、この点においても本発明化合物Ａは優れ
ている。

また、細胞を培養するとき細菌、特にダラム陽性菌の汚
染を防止するためにペニシリンＧやストレプトマイシン
の如き抗生物質が培地に添加されるのが一般的である。

ところで抗菌活性においても化合物Ａは対照化合物１〜
４よりも優れている。

ちなみに、化合物Ａのスタフィロコフカス・アウレウス
に対するＭＩＣ値は０．００６３μｇ　／　ｍ　ｌであ
り、化合物１のそれは０．０２５μｇ／ｍｌであり、化
合物Ａの方が約４借も強い抗菌力を仔している。

従って、化合物Ａまたはその塩の添加によりべ二ンリ／
Ｇやストレプトマイシンの使用を省略することができる
。

一般に動物や植物細胞の培養は、液体培地に細胞を接種
し、その３〜５日後に培地の交換を行い、培養開始約７
日後に継代培養を行い、これらの操作を操り返すことに
より実施される。

培地としては、公知の培地、例えば、最小必須培地、Ｉ
９９培地、ハム培地、Ｌ−１５培地、マツコイ５Ａ培地
、ＣＭＲＬ　１０６０培地、ＲＰＭＩ　１０４０培地、
ＮＣＴＣ１３５培地、ウィリアムＥ培地、ウェイマウス
培地、トロウェルＴ−８培地などが挙られる。

マイコプラズマ汚染ｉ染の防止または除去は、培養前ま
たは培養中の任意の時点で、化合物Ａまたはその塩を培
地に添加することにより実施できる。

化合物Ａまたはその塩は、培ｒ１＠の培地や交換用培地
にあらかじめ加えておいでもよいし、培養の途中で加え
てもよい。化合物Ａまたはその塩は、培養の全期間を通
じて存在していてもよいし、−部の期間だけ存在してい
てもよい。例えば、化合物へまたはその塩を含有する培
地に細胞を接種し、培養し、培地交換のときに化合物Ａ
またはその塩を含有しない培地を用いて培養してもよい
。しかし、化合物Ａまたはその塩は培養の全期間を通じ
て存在せしめるのが一般的である。マイコプラズマ汚染
が除去されたかどうかは、例えば、ＯＮ八へ合・蛍光色
素染色法などの方法によりチエツクできる。

培地中の化合物Ａまたはその塩の０度は、培地の種類や
汚染の程度によって変化するが、０．２〜１０μｇ　／
　ｍ　ｌ　ｓ好ましくは０．４〜ａ　ｕ　ｇ／ｍ　ｌの
範囲から選択される。

化合物Ａまたはその塩は、所望の濃度となるように溶液
または粉末の形で培地に添加される。化合物Ａまたはそ
の塩を含む溶液（以下、試薬溶液という）の添加液量は
、液体培地容量の２％以下、特に好しくは１％以下の範
囲から選択するのがよい。なぜならば、大量の溶液を培
地に加えることは、培地を希釈することになり、細胞の
増殖に悪い影響を与えることもあるからである。一般に
試薬溶液中の化合物Ａまたはその塩の１０度は１５ｇｇ
／ｍ１以上、好ましくは３０ｇｇ／ｍ１以上、特に好ま
しくは４０〜７０μｇ／ｍｌの範囲内から選択するのが
よい。試薬溶液は、化合物Ａまたはその塩を小量の希ア
ルカリ溶液や希ｌ！１［溶液またはメタノール、エタノ
ール、ジメチルスルホキサイドの如きａ機溶媒に溶解し
、水を加えて希釈することにより調製できる。試薬溶液
は培地成分の一部や緩衝液、安定化剤などを更に介在し
ていてもよい。

また、化合物Ａまたはその塩は細胞培養用培地の一成分
として、予じめ培地に加えておいてもよい。この場合、
ペニシリンＧやストレプトマイシンの如き抗生物質の添
加を省略することもできる。

次に実施例ならびに参考例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。

実施例　　　　　　　試薬溶液の′ｇ！Ｊ造５０ｍ　ｇ
の化合物Ａを２．４　ｍ　ｌの０．Ｉ　Ｎ　−ＮａＯＨ
水溶液に溶解する。この溶液に水を加えて１０１００Ｏ
となし、これをミリポアフィルタ−により濾過し、その
５ｍｌづつを褐色バイアルに分注する。

この溶液の１ｍｌ中には化合物Ａが５０ｇｇ含存されて
いる。

参考例　　化合物Ａおよびその塩酸塩の製造（１）Ｉｇ
の５−アミノ−１−シクロプロピル−６、７，８−トリ
フルオロ−１，４−ジヒドロ−４−オキソキノリン−３
−カルボン酸、１．１５ｇの２−アセチルアミノメチル
モルホリン、１ｇのトリエチルアミンおよびＩＯｍ　ｌ
のビリジ／からなる混合物を１６時間加熱還流する。反
応液を減圧でｔ５縮乾固し、残渣に酢酸エチルを加えて
結晶を濾取する。

結晶を水２０ｍ　ｌに懸濁させ、クロロホルムで抽出す
る。抽出液を乾燥後濃縮し、残渣をエタノールから再結
晶して７２０　ｍ　ｇの５−アミノ−７−（２−アセチ
ルアミノメチルモルホリノ）−１−シクロプロピル−６
、８−ジフルオロ−１，４−ジヒドロ−４−オキソキノ
リン−３−カルボン酸を得る。

ｍ、　　Ｐ、　２２８〜２２９℃。

■　（１）で得たカルボン酸の６００　ｍ　ｇに１０％
塩ｆｆ１１５ｍ１を加え９０分間加熱還流する。反応液
を減圧下に濃縮した後、残渣を水−エタノールより再結
晶して化合物Ａの塩酸塩３００　ｍ　ｇを得る。

ｍ、９．２７０〜２７５℃（分解） （３）　　■で得た化合物Ａの塩酸塩２００　ｍ　ｇを
水に溶解し、これを１０％アンモニア水で中和し、クロ
ロホルムで抽出する。抽出液を乾燥後濃縮し、残渣をエ
タノールから再結晶して！２０　ｍ　ｇの化合物Ａを得
る。ｍ　、　　ｐ、　２１５〜２１７℃。

発明の効果 本発明の化合物Ａまたはその塩は優れた抗マイコプラズ
マ作用を有するとともに培養細胞に対する毒性が弱い。

従って、本発明の化合物Ａまたはその塩はマイコプラズ
マ科やアコレプラズマ科、スピロプラズマ科などを含む
マイコプラズマ目に属するマイコプラズマにより汚染さ
れた培養細胞からマイコプラズマを確実に除去する。ま
た、本発明の化合物Ａまたはその塩はこれらのマイコプ
ラズマ汚染の防止を達成するものであり、本発明は動植
物細胞のいずれの培養に適用できる。

特許出願人　　　大日本製薬株式会社 代　　理　　人 小　　島　　　　−晃

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは水素原子を意味するか、ある いはハロゲン原子または水酸基もしくはア ミノ基で置換されていてもよい炭素数１〜 ５の低級アルキル基を意味する。） で表わされるピリドンカルボン酸またはその塩を有効成
   分とする抗マイコプラズマ剤。
2. （２）Ｒがアミノメチル基である請求項１記載の抗マイ
   コプラズマ剤。
3. （３）Ｒがモルホリノ基の２位と結合するアミノメチル
   基である請求項２記載の抗マイコプラズマ剤。
4. （４）請求項１記載の一般式（ I ）で表わされるピリ
   ドンカルボン酸またはその塩を有効成分とする培養細胞
   におけるマイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤。
5. （５）Ｒがアミノメチル基である請求項４記載の培養細
   胞におけるマイコプラズマ汚染の防止ないし除去剤。
6. （６）Ｒがモルホリノ基の２位と結合するアミノメチル
   基である請求項５記載の培養細胞におけるマイコプラズ
   マ汚染の防止ないし除去剤。