JPH02122266A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫学的凝集反応により抗原又は抗体の存在
を検出し判定するための方法に関する。

〔従来の技術及び課題〕

免疫学的な凝集反応に基ついて凝集又は非凝集粒子の分
布パターンを形成し分析する方法においては、サンプル
中の抗原又は抗体を特定の指標粒子に固定された抗原又
は抗体と混合して結合させると共に、これら反応成分を
反応容器の壁面に移動させ、かつ未結合の指標粒子を同
壁面の一部に集めて分離している。このような方法は、
一般に混合凝集法（ｍｉｘｅｄ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔ
ｉｏｎ　）と呼ばれ、Ｗｉｃｎｓｒ、　　Ａ、Ｓ、とｌ
ｌｅｒｍａｎ、　　Ｍ、、　　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
　３Ｇ。

２５５　　（１９３９）において報告されて以来、Ｃｏ
ｏｍｂｓ。

Ｒ、Ｒ、Ａ　、と１３ｅｄｆｏｒｄ　、　　Ｄ、、　　
Ｖｏｘｓａｎｇ、、　　５　　１１１（１９５５）及び
Ｃｏｏｍｂｓ、　Ｒ，Ｒ，Ａ、ら、　Ｌａｎｃｅｔ、　
＋４６１、　　（１，９５６）の報告により血液型の判
定を行なうまでに発展確立された。例えば、各種血液型
について応用したものにＵＳＰ　４６０８２４６号明細
書、ＵＳＰ４２７５０５３号明細書（特公昭１３２−４
４２２１号）やＵＳＰ４３２８１８３号明細書かある。

また、固体表面で血液型の判定を行なって感度の向−に
を図ったものにＵＳＰ　２７７０５７２号明細書がある
。更に、Ｒｏｓｅｎｒｉｅｌｄ１？　、　ＩＥ　、　　
ら、　　Ｐａｒｉｓ　、　　Ｐｒｏｃ、　　１５Ｔｈ　
Ｃｏｎｇ、Ｉｎｔｌ、　　５ｏｃＢｌｏｏｄ　Ｔｒａｓ
ｆ’ｕｓｉｏｎ、　２７　（１９７Ｇ）では混合凝集法
の原理を利用して固体表面で赤血球抗原と抗体との反応
を行なっている。

ところで、従来の混合凝集法の多くは底面に収束部を有
する形状の反応容器中での指標粒子の自然沈降によるも
のである。従って、指標粒子か底面に一様に沈降し、な
おも未反応の粒子が収束部に沈積してパターンを形成す
るまでに多大な時間を要していた。単に沈降速度を高め
るためならば粒径を大きくしたり、比重の大きな祠質を
利用することが考えられるが、パターンが荒くならない
程度に粒径及び比重を選定しなければならない点に限界
を生じ、大幅な時間の短縮は望めない。

そこで、ＵＳＰ　４２９７１０４号明細書（特公昭６２
３１２９９号）では対称軸」−に収束点を有する容器壁
面及び指標粒子としての赤血球表面に抗体（例えばＩｇ
Ｇ　）を固定し、予めサンプル中の抗原と赤血球表面及
び容器壁面の抗体に対する抗１ｇＧ抗体を加え、更に第
１及び第２の遠心処理により抗原と未反応である赤血球
とを容器の収束点に集めることによりパターンの形成を
行なっている。しかしながら、遠心による凝集反応は粒
子の沈降を促進させる点て有効であるものの、遠心機が
必要となること自体に操作」−の制約が生じてしまう。

即ち、サンプリングから反応、判定、廃棄等を実施する
際に、反応容器のハンドリングの流れがスムーズになら
ず、特に遠心力のかかる方向に対して反応容器の対称軸
を精密に一致させなければならない。

また、異なる項目の分析においては夫々粒子の沈降条件
を変える必要があるか、同一の遠心処理中に遠心の精度
やタイミングを複数設定することは困難であるから、そ
の都度工程をやり直すか、或いは複数の遠心機に接続す
る等の構成を必要とする。更に、遠心機を用いることで
不可避的に装置が大型になる。

本発明は、」二記従来の課題を解決するためになされた
もので、遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間
を短縮すると共に、凝集パターンの明瞭化を達成するこ
とか＋ｉｆ能な免疫学的測定方法を提供しようとするも
のである。

〔課題を解決するだめの手段及び作用〕本発明は、反応
容器の壁面に測定すべき物質と特異的に反応するかもし
くは競合する物質を０．２×１００セル／ｃＴＡ〜１．
２　Ｘ１０６セル／護の密度で固定し、この容器内に測
定すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは競
合する磁性粒子を含む反応液を入れた後、前記磁性粒子
か前記反応容器の内面に固定された物質に沿って収束す
るような磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パ
ターンを形成して前記容器内面に固定された物質と測定
すべき物質との結合状態を測定することを特徴とする免
疫学的測定方法である。

以下、本発明を第１図（Ａ）、（Ｂ）及び第２図〜第４
図を参照して詳細に説明する。ここで、第１図（Ａ）は
本発明の免疫学的測定方法に使用されるマイクロプレー
ト及びマグネット等からなる装置を示す平面図、同図（
Ｂ）は同図（Ａ）の正面図である。図中の１は、」二面
に複数の円板状フェライトマグネット２を支持した支持
台である。

この支持台１の」二方には、反応容器としてのマイクロ
プレート３が配置されており、かつ該マイクロプレー１
・３は前記各マグネソｌ−２に対応して配置された底部
がＵ字形をなす有底円筒形の複数のウェル４をイ１ｉｉ
ｉえている。

まず、測定すべき物質、例えばウィルス、細菌、タンパ
ク質等の抗原ないし抗体に対して特異的に反応するか又
は競合する物質、例えば抗体ないし抗原等を公知の磁性
体を含む磁性粒子の表面に固定する。磁性粒子としては
、市販のＤＹＮＡＢＥＡＤＳＭ　−４５０（ＤＹＮＡＩ
社製）又は磁性ラテ・ソクス（ｃｓｔａｐｏｒ　）　　
［Ｒ１１ＯＮＥ−ＰＯＵＬＥＮＣ社製］等や磁性体を含
むゼラチン粒子（特開昭５９−１９５１６１号参照）等
を使用することが可能である。また、前記磁性粒子に前
記物質を固定化する方法は種々の公知の方法を適用でき
る。

次いで、第１図（Ａ）、（、Ｂ　）に示すマイクロプレ
ート３の各ウェル４内にサンプル中の測定すべき物質と
特異的に反応するかもしくは競合する物質を入れ、第２
図に示すように該ウェル４内面に前記物質５を固定する
。かかる物質５のウェル４内面への固定にあたっては、
０．２ＸＩＯ’セル／ｃｒｊ〜１２×１０６セル／　ｃ
Ｊの密度となるように固定する。前記物質の固定密度を
限定した理由は、その密度を０．２ＸＩＯ′−′セル／
　ｃｉ未満にすると本来、磁性粒子の分布パターンか陽
性パターンとなるものか陰性パターンとなり、一方その
密度を１，２×１０　’セル／　ｃｒｄを越えると本来
、磁性粒子の分布パターンが陰性パターンとなるものか
偽陽性バタンとなるからである。なお、ウェル壁面への
測定すべき物質と特異的に反応するかもしくは競合する
物質の固定化法は従来の公知方法を使用できる。

つづいて、前記各ウェル４内にサンプルを加え、該サン
プル中の測定すべき物質と該ウェル内面に固定した物質
との反応を行ない、更に前述した磁性粒子を加える。こ
の後、マイクロプレート３とマグネット２か支持された
支持台１とを相対的に移動させ（例えば支持台１をその
−にの各マグネット２が前記マイクロプレート３の各ウ
ェル４の底部に接近するように移動させ）、磁性粒子を
つエル４の少なくとも一部壁面に沿って収束するような
磁場をかける。

上記磁場をかけることにより、第３図に示すようにウェ
ル４の壁面に引き寄せられた磁性粒子６はサンプル中の
測定ずへぎ物質７を介してウェル４内面に固定された物
質５と結合してウェル４の内面に一様に広かった分布パ
ターンを形成する。

これに対し、サンプル中に測定すべき物質が存在しない
場合には、磁性粒子６は磁場によりウェル４の壁面に引
き寄せられ、更に内面に沿って移動して第４図に示すよ
うに内面の一部に収束して集められる。なお、磁性粒子
にはサンプル中の測定すべき物質と競合する物質を固定
しておき、一定量の測定すべき物質と結合反応する物質
を添加して行なう公知の凝集抑制反応を用いてもよい。

従って、反応容器の内面に測定すべき物質と特異的に反
応するかもしくは競合する物質を特定の密度で固定し、
この容器内に測定すべき物質と該物質に特異的に反応す
るかもしくは競合する磁性粒子を含む反応液を入れた後
、前記磁性粒子が前記反応容器の壁面に固定された物質
に沿って収束するような磁場をかけることにより、磁性
粒子の反応容器壁面への移動を促進できるため、反応容
器内面に固定された物質とサンプル中の測定すべき物質
を介して結合した磁性粒子の分布パターンを迅速に形成
できる。また、前記反応容器内面にサンプル中の測定す
べき物質と反応するかもしくは競合する物質を特定の密
度で固定することによって、前記磁性粒子の分布パター
ンを明瞭に形成できる。その結果、凝集反応の判定に要
する時間を短縮できると共に、その明瞭な分布パターン
からサンプル中の測定すべき物質の存在を高感度で検出
できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を詳細に゛説明する。

く赤血球固定化のためのＷＧＡ　　（小麦胚芽レクチン
）プレートの作製〉 ＮＵＮＣ社のＵ型プレート　（Ｍｉｃｒｏ　ｗｅｌｌ　
Ｍｏｄｕｌｅ　２Ｘ　８　ｗｅｌｌ　ｒｏｕｎｄ　ｂｏ
ｔｔｏｍ　Ｈｉｇｈ　ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｃａｐａｃｉｔ
ｙＮｏ、４６９２６４　）にＷＧＡ　　（生化学工業・
製造番号９２１０７　）を０．ＯＩＭ　ＰＩ３５　、　
ｐＨ７，０で３μｇ／厭に溶解したものを５０μｌ／ウ
ェル分注し、室温で３０分間インキュベー１・後、０．
０１Ｍ　ＰＢＳでウェルを満たして２回洗浄した。つづ
いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＯ，ＤＩＭ　
ＰＢＳで１回洗浄し、水切りした後、風乾し、冷蔵保存
した。

＜　ＷＧＡプレートへの赤血球の否定〉測定すべき物質
であるＩｇＧが未感作の血球としてサージスクリーン（
ｏｒｔｈｏ社、製造番号３ＳＳ８８８）と測定すべき物
質であるＩｇＧが感作された血球としてクームスコン！
・ロール（ｏｒｔｂｏ社、製造番号に８０４）を用いた
。各々の血球懸濁液を０．０１％サルコシネートＬＮに
ッコーケミカル社、製造番号５０８３）を含むＩｊｓｓ
、　ｐＨ６，７を用いて希釈し、１．０％、０９％、ｆ
］、７％、０５％、０．３％、０．２％、０１％、０．
０８％、０．０６％、００４％、０．０２％、０．０１
％に調整した。希釈した各々の血球を前記ＷＧＡプレー
１・に５０μＪ！／ウエルずつ分注し、室温で１０分間
インキュベートシ、０．０１Ｍ　ＰＢＳを用いて２００
μア／ウエルで３回洗浄した。洗浄後、０　、０１．　
Ｍ］０ ＰＢＳを２００μｉ／ウェル分注し、血球が乾燥しない
ように冷蔵保存した。こうして作製した赤血球コーティ
ングプレートを顕微鏡にて２００倍で鏡検し、ウェル底
面への結合セル数をカランｌ−Ｌ、１ｄ当りの赤血球数
を求めた。その結果を下記第１表に示した。

く抗ヒＩ−１ｇＧ感作磁性ビーズの調製〉粒径１．７μ
ｍ１磁性ラテツクス（ｅｓｔａｐｏｒ　）［ＲＯ１１Ｎ
　Ｅ　−Ｐ　ＯＵ　Ｌ　Ｅ　Ｎ　０社、製造番号ＬＭＰ
２３３］にＡｎｔｉ−ＨｕｍａｎｌｇＧ　　［Ｃａｐｐ
ｅ１社、Ａｆｒｉｎｊｔｙ　　Ｐｕｒｒｊｆ。

Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−１１Ｍｍａｎ　ＩｇＧ製造番号２
９９７＋　）とＡｎｔｉ−１１Ｍｍａｎ１ｇＧ　Ｆ　（
ａｂ’　）　２［Ｃａｐｐｅ１社、Ｆ（ａｂ’　）　２
　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｒＡｆ’ｒｊｎｉｔｙ　Ｐｕｒ
ｒｉｆ、Ｇｏａｔａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ製造番
号２９５９Ｂ　）を夫々感作させた。即ち、Ｏ，１Ｍ　
Ｃ１ｙ−ＮａＯＨ、ｐＨ８，３に前記ビズは０４％、抗
体は２０Ｍｇ／厭に希釈し、各ＩＩＩＬｌを混合して３
７°Ｃて１時間反応させた。つづいて、０．２％ＢＳＡ
　、　Ｏ，１４Ｍ　ＮａＣｌを含む０．０２ＭのＧｌｙ
−ＮａＯＩＩ、ｐＨ８，５，２ｍｌで各々のビーズを３
回洗浄し、同バッファ２鮮に懸濁して抗ヒトＩｇＧ磁性
ピース及び］　１ 抗ヒトＩｇＧ　Ｆ　（ａｂ’　）　２磁性ビーズを冷蔵
保存した。

また、未感作磁性ピースは抗体を用いずに同様な操作を
行なった。

く抗ヒｌ−１ｇＧピースを用いた分析〉前記赤血球コー
ティングプレー１・に２種の抗ヒトＩｇＧ磁性ピース［
抗ヒトＩｇＧ磁性ピース、抗ヒｌ□　ＩｇＧ　Ｆ　（ａ
ｂ”）２磁性ビースコと未感作ビーズの懸濁液を２５μ
ｌ／ウエルずつ分注した。つづいて、第１図（Ａ）、（
Ｂ）に示す支持台１をその」−のマグネット（直径ｇ　
ｍｍ、厚さ３　ｍｍ、残留磁束密度２０００ガウス）２
か前記マイクロプレート３の各ウェル４の底部に接近す
るように移動させて、各ウェル４底而の垂直方向に磁界
を作用させ、室温で２分間反応させた。

しかして、各ウェル底面に形成された抗ヒトＩｇＧ磁性
ピース、抗ヒトＩｇＧ　Ｆ　（ａｂ’　）　２磁性ビス
及び未感作ピースの分布パターンを調べたところ、同第
１表に示す結果を得た。なお、第１表中の反応パターン
は第５図（Ａ）のようにビーズ］２ がウェル底面に一様に広がったものを陽性（＋）、同図
（Ｂ）に示すようにビーズの分布が中心か薄く、その回
りか少し濃く分布して陰性、陽性のどちらかとも区別て
きないものを偽陽性（±）、同図（Ｃ）に示すようにウ
ェル底面に中心にビーズが集まったものを陰性（−）と
して判定した結果である。

第１表から明らかなように、ウェル底面に固定する血球
の密度を０．２Ｘ１０ｂセル／　ｃＭ〜１．２×１０６
セル／　ｃｉの範囲とすることによって、陽性、陰性の
判別か明瞭となることかわかる。これに対し、ウェル底
面に固定する血球のセル密度を０．２×１０６セル／ｃ
１ｊ未満では本来、陽性（＋）パタンになるものが陰性
（−）パターンになってしまい、一方、同血球の密度か
１．２　×１０６セル／　ｃｉを越えると本来、陰性（
−）パターンになるものが偽陽性（±）パターンになり
不明瞭となる。

〔発明の効果〕

以上詳述した如く、本発明の免疫学的測定方法によれば
遠心機を用いずに凝集反応の判定に要する時間を短縮す
ると共に、凝集パターンを明瞭化をでき、ひいては検出
時間の短縮と陽性、陰性の検出感度の向」二を達成でき
、更に反応容器内面に固定するための測定すべき物質と
特異的に反応もしくは競合する物質（赤血球など）の使
用量を低減できる等顕著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図（Ａ）、（Ｂ）はマイクロプレー！・及びマグネ
ットを備えた免疫学的測定装置を示し、同図（Ａ）は平
面図、同図（Ｂ）は同図（Ａ）の正面図、第２図は前記
装置のウェルに測定すべき物質と特異的に反応するかも
しくは競合する物質を固定した状態を示す模式図、第３
図は本発明による陽性時での粒子間の結合状態を示す模
式図、第４図は本発明による陰性時での粒子間の結合状
態を示す模式図、第５図は（Ａ５）は陽性時におけるビ
ーズの反応パターンを示す模式図、同図（Ｂ）は偽陽性
時におけるビーズの反応パターンを示す模式図、同図（
Ｃ）は陰性時におけるビーズの反応パターンを示す模式
図である。 ■・・・支持台、２・・・円板状フェライトマグネット
、３・・・マイクロプレート、４　・・ウェル、５・・
・測定すべき物質と特異的に反応するかもしくは競合す
る物質、６・・・磁性粒子、７・・・測定すべき物質。 出願人代理人　弁理士　坪井　　淳 ］　６ 第５図 （Ｃ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 反応容器の壁面に測定すべき物質と特異的に反応するか
   もしくは競合する物質を０．２×１０＾６セル／ｃｍ＾
   ２〜１．２×１０＾６セル／ｃｍ＾２の密度で固定し、
   この容器内に測定すべき物質と該物質に特異的に反応す
   るかもしくは競合する磁性粒子を含む反応液を入れた後
   、前記磁性粒子が前記反応容器の内面に固定された物質
   に沿って収束するような磁場をかけることにより前記磁
   性粒子の分布パターンを形成して前記容器内面に固定さ
   れた物質と測定すべき物質との結合状態を測定すること
   を特徴とする免疫学的測定方法。